JP2794461B2

JP2794461B2 - ホスホアミダイト化合物及びそれを用いたオリゴリボヌクレオチドの固相合成法

Info

Publication number: JP2794461B2
Application number: JP1210706A
Authority: JP
Inventors: 洋高久; 修坂爪; 俊一山影; 隆小川
Original assignee: JUKI GOSEI YAKUHIN KOGYO KK
Current assignee: JUKI GOSEI YAKUHIN KOGYO KK
Priority date: 1989-08-17
Filing date: 1989-08-17
Publication date: 1998-09-03
Anticipated expiration: 2013-09-03
Also published as: JPH0374398A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は２′−水酸基を新規な保護基すなわち２−ク
ロロエトキシエチル基で保護した一般式〔Ｉ〕（式中、Ｂ′は保護基を有することもある核酸塩基残基
を、R¹は水酸基の保護基を、R²はリン酸の保護基を、Ｘ
は他のリボヌクレオシドまたはリボヌクレオチドの糖部
の水酸基と反応する基を表わす）で示されるホスホアミダイト化合物および該ホスホアミ
ダイト化合物を用いるホスファイト法によるオリゴリボ
ヌクレオチドの固相合成法に関する。

〔従来の技術〕

近年の遺伝子工学の進展に伴い、遺伝子工学における
重要な素材であるオリゴヌクレオチド合成についても迅
速で収率のよい化学合成技術の開発が望まれている。

従来、オリゴヌクレオチドの化学合成法としては、ｉ
ヌクレオシドの３′−水酸基にリン酸化剤を反応させて
得られるホスホアミダイト化合物と、他のヌクレオシド
の５′−水酸基とを（３′→５′）インターヌクレオチ
ド結合させるホスファイト法（ホスホアミダイト法とも
いう）、iiリン酸の解離基の一部を保護してトリエステ
ルにし、他のヌクレオシドの５′−水酸基とを縮合剤の
存在下に縮合させるホスホトリエステル法（リン酸トリ
エステル法ともいう）が知られている。そしてこれらの
なかで特にホスファイト法は反応時間が短く、反応収率
も優れているため、自動合成機による合成反応に最も適
した方法とされており、現在固相法による自動合成機に
より鎖長100程度までのデオキシリボ核酸（DNA）のオリ
ゴヌクレオチドが合成されている。

該方法に於ては、反応に関与しない塩基部のアミノ
基、糖部の水酸基は、反応時には保護基により保護して
おくものであるが、２′−位が水酸基であるリボ核酸
（RNA）の場合は、２′−水酸基も保護する必要があ
る。その２′−水酸基の保護基としてはトリチル基、メ
トキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、ベンゾイル
基、アセチル基、ピバロイル基、テトラヒドロピラニル
基、メトキシテトラヒドロピラニル基、ｏ−ニトロベン
ジル基、トリメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリ
ル基、イソブチルオキシカルボニル基が知られている
〔ジャーナルオブジアメリカンケミカルソサ
イェティー（Jornal of the American Chemical Societ
y），84,4329（1962）および89,3366（1967），カナデ
アンジャーナルオブケミストリイ（Canadian Jou
rnal of Chemistry），56,2230（1979），ヌクレイック
アシッドリサーチ（Nucleic Acids Reseach），１,
1351（1974）ほか〕。

〔発明が解決すべき問題点〕

現在ホスファイト法によるオリゴリボヌクレオチド合
成のさいに用いるホスホアミダイト化合物の２′−水酸
基の保護基としては前記の如き数多くの保護基が提案さ
れ、最近はテトラヒドロピラニル基、メトキシテトラヒ
ドロピラニル基が多く用いられている。

しかし、これらの保護基には、精製中に脱離してしま
うものや、２′−位から３′−位に転移するものがあ
り、またオリゴリボヌクレオチド合成のさい、鎖長延長
時の酸処理で一部脱離してしまうものがあるほか、オリ
ゴリボヌクレオチド合成後の脱保護のさい、２′−水酸
基の脱離が要因となるインターヌクレオチド結合の転移
あるいは切断、または２′−水酸基の保護基の脱保護試
薬がリン酸と反応するなどの副反応が起こるなど不満足
な点が多い。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、ホスファイト法によるオリゴリボヌク
レオチドを合成するさい、鎖長延長時に脱離することな
く、また脱保護時に副反応を起こさない２′−水酸基の
新規な保護基を得るべく検討を重ねた結果、本発明を完
成したものである。

すなわち、本発明はホスホアミダイト化合物として、
一般式〔Ｉ〕（式中、Ｂ′は保護基を有することもある核酸塩基残基
を、R¹は水酸基の保護基を、R²はリン酸の保護基を、Ｘ
は他のリボヌクレオシドまたはリボヌクレオチドの糖部
の水酸基と反応する基を表わす）で示されるように２′−水酸基の保護基として、２−ク
ロロエトキシエチル基を選択したことにより所期の目的
を達成したものである。

一般式〔Ｉ〕で示されるホスホアミダイト化合物の塩
基部（アデニン、グアニン、シトシン）のアミノ基は、
ベンゾイル基、イソブチリル基で代表される保護基で保
護されているが、これ以外の保護基であってもよい。

５′−水酸基の保護基R¹としては通常の水酸基の保護
基であればよく、一般にはジメトキシトリチル基、テト
ラヒドロピラニル基、ベンゾイル基、トリメチルシリル
基などが用いられており、特にジメトキシトリチル基が
代表的な保護基である。なお、５′−水酸基の保護基は
２′−水酸基の保護基よりも緩和な条件で脱保護するも
のが望ましい。

３′−リン酸の保護基R²としては一般には置換基を有
することもあるアルキル基またはアリール基が用いられ
ており、シアノエチル基が代表的な保護基である。

また他のヌクレオシドまたはヌクレオチドの糖部の水
酸基と反応する基Ｘは、一般にはNR³R⁴（R³およびR⁴は
同一または異る基で、低級のアルキル基、アリール基、
アラルキル基、シクロアルキル基であり、R³とR⁴の両末
端がヘテロ原子（窒素、酸素または硫黄）を含みまたは
含まずに結合して飽和複素環を形成する）で示される基
が用いられ、通常はジ低級アルキルアミノ基が用いられ
ており、特にジイソプロピルアミノ基が代表的な保護基
である。

従来、２′−水酸基の保護基としてはテトラヒドロピ
ラニル基やエトキシエチル基が一般に多用されている
が、オリゴリボヌクレオチド合成操作中に、これらの
２′−水酸基保護基は５′−水酸基の保護基として汎用
されているジメトキシトリチル基の脱保護条件である強
酸性処理で、一部脱離するおそれがある。

本発明者は５′−水酸基保護基の脱保護条件下でも安
定であり、かつ２′−水酸基保護基自身が従来用いられ
ているテトラヒドロピラニル基と同程度の条件で脱保護
できる２′−水酸基の保護基としてアセタール基に着目
し検討した結果、２−クロロエトキシエチル基を２′−
水酸基の保護基として選択したものである。

２−クロロエトキシエチル基は５′−水酸基保護基で
あるジメトキシトリチル基の脱保護条件でテトラヒドロ
ピラニル基よりも安定であり、またpH2.0の酸性条件下
で容易に脱保護するものである。

本発明のホスホアミダイト化合物の製造法は、下記の
反応式（１）および反応式（２）にその１例を示すよう
に（反応式中、Ｂ′は保護基を有することもある核酸塩基
残基、Etはエチレン、iPrはイソプロピル、DMTrはジメ
トキシトリチルである）塩基部が保護されていることもあるリボヌクレオシド
例えばN⁶−ベンゾイルアデノシン、N²−イソブチリルグ
アノシン、N⁴−イソブチリルシチジンまたはウリジン
に、無水ピリジン（反応式中、Pyと省略）中で1,3−ジ
クロロ−1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサン
（反応式中、TIPDSiClと省略）を反応させて、３′−お
よび５′−水酸基を保護したリボヌクレオシドとした
後、３′,5′−ジシリル体のリボヌクレオシドを塩化
メチレン中で、ｐ−トルエンスルホン酸（反応式中、Ts
OHと省略）またはピリジニウム−ｐ−トルエンスルホネ
ート（反応式中、PPTsと省略）などの酸触媒の存在下
に、２−クロロエチルビニルエーテルを反応させて、
２′−水酸基も保護したリボヌクレオシドとする。次
いでこのリボヌクレオシドに1M−トリエチルアンモニ
ウムハイドロゲンフルオライド（反応式中、1M−TEAHF
と省略）を作用させて脱シリル化を行い２′−水酸基を
２−クロロエトキシエチル基で保護したりリボヌクレオ
シドとし、これにピリジン中でジメトキシトリチルク
ロライド（反応式中、DMTrClと省略）を反応させて、
５′−水酸基もジメトキシトリチル基で保護したリボヌ
クレオシドとする。さらに、この５′−ｏ−（ジメト
キシトリチル）−２′−ｏ−（２−クロロエトキシエチ
ル）ヌクレオシドにアミダイト化剤をテトラヒドロ
フラン（反応式中、THFと省略）中でトリエチルアミン
の存在下に反応させ、ホスホアミダイト化合物を得
る。この反応で用いるアミダイト化剤としてはクロロ
−２−シアノエトキシ−N,N−ジイソプロピルアミノホ
スファンが代表的なものであり、リボヌクレオシドと
アミダイト化剤との反応はヌクレイックアシッド
リサーチ（Nucleic Acids Research），12,4539（198
4）記載の方法により可能である。

又、本発明は前記の方法によって得られたホスホアミ
ダイト化合物を用いたホスファイト法によるオリゴリボ
ヌクレオチドの固相合成法に関するものである。

オリゴリボヌクレオチドの固相合成法は、下記の反応
式（３）および反応式（４）にその１例を示すように（反応式中、Ｂ′は保護基を有することもある核酸塩基
残基、Etはエチレン、DMTrはジメトキシトリチルであ
る）２′−水酸基を２−クロロエトキシエチル基で、５′
−水酸基をジメトキシトリチル基で保護したリボヌクレ
オシドと無水コハク酸とを、ジメチルシアノピリジ
ン（反応式中、DMAPと省略）の存在下に、例えば塩化メ
チレン中で反応させ、得られたリボヌクレオシドをジ
シクロヘキシルカルボジイミド（反応式中、DCCと省
略）を用い、シラノール水酸基がアミノプロピル化され
たコントロールポアドグラス（反応式中、CPGと省略）
に直接導入してCPG−リボヌクレオシド縮合物を得
る。この反応はヌクレオチドアンドヌクレオシド
（Nucleotides ＆ Nucleosides），５,363（1986）記載
の方法により可能である。

（反応式中、Ｂ′は保護基を有することもある核酸塩基
残基、Ｂは核酸塩基残基、Etはエチレン、iPrはイソプ
ロピル、DMTrはジメトキシトリチル、ｎは０または任意
の正の整数である）次にCPG−リボヌクレオシド縮合物を1.5％ジクロロ
酢酸（反応式中、DCAと省略）−塩化メチレン溶液で処
理することにより、５′−水酸基の保護基であるジメト
キシトリチル基を除去してとした後、反応式（２）で
得たホスホアミダイト化合物と５′−水酸基フリーの
CPG−リボヌクレオシド縮合物とを、縮合剤例えば1H
−テトラゾールの存在下にアセトニトリル溶媒中で縮合
させ、次いで0.1Mヨウ素−テトラヒドロフラン−ピリジ
ン−水溶液で酸化させてジリボヌクレオチドとする。
以後、この５′−水酸基保護基の除去、ホスホアミダイ
ト化合物との縮合、ヨウ素による酸化という操作を繰
り返すことにより、所望する塩基配列を有するオリゴリ
ボヌクレオチドを得ることができる。次いでアルカリ
性条件下に処理することで固定相CPGより分離したオリ
ゴリボヌクレオチドとした後、常法による脱保護処
理、例えば濃アンモニア水処理による塩基部保護基であ
るベンゾイル基、イソブチリル基およびリン酸部保護基
のシアノエチル基の除去、次いで0.01N塩酸処理により
５′−水酸基保護基であるジメトキシトリチル基および
２′−水酸基保護基である２−クロロエトキシエチル基
を除去し、精製することにより目的とするオリゴリボヌ
クレオチドを得るものである。

なお、これら反応式におけるリボヌクレオシドまたは
リボヌクレオチドの保護基として、塩基部はベンゾイル
基またはイソブチリル基、リン酸部はシアノエチル基、
５′−水酸基はジメトキシトリチル基を例示したが、こ
のほか周知の核酸合成に用いられている通常の保護基で
あっても差し支えない。

また、本発明のホスホアミダイト化合物を用いたホス
ファイト法によるオリゴリボヌクレオチドの固相合成
は、前記反応式（３）および反応式（４）の如くホスホ
アミダイト化合物を順次縮合させる手法のほか、あらか
じめホスホアミダイト化合物を用いて合成したジリボヌ
クレオチドやトリリボヌクレオチドなどのリボヌクレオ
チドブロックを用いて縮合させることも可能である。

〔実施例〕

以下、実施例および実験例により本発明を説明する。

実験例１ウリジンに1,3−ジクロロ−1,1,3,3−テトライソプロ
ピルジシロキサンを反応させて得られた３′,5′−ｏ−
（テトライソプロピルオキサジシリル）ウリジン7.8241
g（17.065mM）を無水ジクロロメタン85mlに溶解し、氷
冷下に酸触媒ピリジニウム−ｐ−トルエンスルホネート
2.9909g（11.9mM）と２−クロロエチルビニルエーテル1
7.3ml（170.6mM）を加えた後、室温で１時間反応させ
て、２′−水酸基をクロロエトキシエチル化する。反応
の終了は薄層クロマトグラフィーで確認する。反応終了
後、氷冷下にトリエチルアミン5mlを加え、水洗ののち
無水硫酸ナトリウムで有機層を乾燥し、減圧で濃縮す
る。残渣に1M−トリエチルアンモニウムハイドロゲンフ
ルオライド−アセトニトリル溶液40mlを加え、室温で１
時間反応して脱シリルした後、飽和炭酸ナトリウム水溶
液で水解し、減圧濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーで精製し、２′−ｏ−（２−クロロエトキシエ
チル）ウリジン5.0264g（14.33mM）を得た。収率84％。

元素分析理論値（％）:C44.50、H5.46、N7.99 実測値（％）:C44.22、H5.77、N7.64 ¹H−核磁気共鳴吸収（DMSO−d₆−TMS） δ:7.90（1H,ddJ5,6＝9Hz,H−６） 5.72（1H,dJ1′,2′＝6Hz,H−１′） 5.59（1H,dJ5,6＝9Hz,H−５） 5.35〜4.35（3H,m,OH−３′,OH−５′，−Ｏ−Ｃ
Ｈ−Ｏ−） 4.29〜2.50（9H,m,H−２′,H−３′,H−４′,H−
５′,H−５″，−CH₂−X2） 1.23〜0.86（3H,m,−CH₃）（DMSO−d₆−CD₃OD−TMS） δ:7.60（1H,ddJ5,6＝9Hz,H−６） 5.55（1H,dJ1′,2′＝6Hz,H−１′） 5.38（1H,dJ5,6＝9Hz,H−５） 4.71〜4.25（1H,m,−Ｏ−ＣＨ−Ｏ−） 4.01〜3.01（9H,m,H−２′,H−３′,H−４′,H−
５′Ｈ−５″，−CH₂−X2） 0.96〜0.75（3H,m,−CH₃）薄層クロマトグラフィー R_f＝0.25（CH₂Cl₂:MeOH＝9:1（v/v））実験例２実験例１のウリジンの代わりにN⁴−イソブチリルシチ
ジンを、酸触媒としてｐ−トルエンスルホン酸0.5当量
を用いたほかは、実験例１と同様の条件で１時間反応さ
せて、２′−水酸基のクロロエトキシエチル化を行っ
た。反応終了後、実験例１と同様の後処理を行い、収率
67％で２′−ｏ−（２′−クロロエトキシエチル）−N⁴
−（イソブチリル）シチジンを得た。

¹H−核磁気共鳴吸収（CDCl₃−CD₃OD） δ:9.50（1H,brs,−ＮＨibu） 7.60（1H,ddJ5,6＝8Hz,H−６） 7.08（1H,dJ5,6＝8Hz,H−５） 5.50（1H,dJ1′,2′＝6Hz,H−１′） 4.80（1H,m,−Ｏ−ＣＨ−Ｏ−） 4.10〜2.70（9H,m,H−２′,H−３′,H−４′,H−
５′,H−５″，−CH₂−X2） 2.55〜1.70（1H,m,−ＣＨ−） 1.70〜0.52（9H,m,−CH₃X3）薄層クロマトグラフィー R_f＝0.28（CH₂Cl₂:MeOH ＝9:1（v/v））実験例３実験例１のウリジンの代わりにN⁶−ベンゾイルアデノ
シンを、酸触媒としてｐ−トルエンスルホン酸0.5当量
を用いたほかは、実験例１と同様の条件で１時間反応さ
せて、２′−水酸基のクロロエトキシエチル化を行っ
た。反応終了後、実験例１と同様の後処理を行い、収率
83％で２′−ｏ−（２−クロロエトキシエチル）−N⁶−
（ベンゾイル）アデノシンを得た。

¹H−核磁気共鳴吸収（DMSO−d₆−D₂O） δ:9.42（2H,s,H−8,H−２） 8.90〜7.60（5H,m,Ar−Ｈ） 6.90（1H,dJ1′,2′＝6Hz,H−１′） 6.29（1H,s,−Ｏ−ＣＨ−Ｏ−） 5.80〜3.90（9H,m,H−２′,H−３′,H−４′,H−
５′,H−５″，−CH₂−X2） 1.89（3H,d,−CH₃）薄層クロマトグラフィー R_f＝0.33（CH₂Cl₂:MeOH 9:1（v/v））実験例４実験例１のウリジンの代わりにN²−イソブチリルグア
ノシンを、酸触媒としてピリジニウム−ｐ−トルエンス
ルホネート3.0当量を用いたほかは、実験例１と同様の
条件で72時間反応させて、２′−水酸基のクロロエトキ
シエチル化を行った。反応終了後、実験例１と同様の後
処理を行い、収率70％で２′−ｏ−（２−クロロエトキ
シエチル）−N²−（イソブチリル）グアノシンを得た。

¹H−核磁気共鳴吸収（DMSO−d₆−D₂O） δ:8.20（1H,s,H−８） 5.90（1H,dJ1′,2′＝6Hz,H−１′） 5.25〜2.6（11H,m,−Ｏ−ＣＨ−Ｏ−,H−２′,H
−３′,H−４′,H−５′,H−５″，−CH₂−X2,−ＣＨ
−） 1.40〜1.01（9H,m,−CH₃）薄層クロマトグラフィー R_f＝0.3（CH₂Cl₂:MeOH 9:1（v/v））実施例１実験例１で合成した２′−水酸基保護基が２−クロロ
エトキシエチル基（第１表ではCEEと省略）である２′
−ｏ−（２−クロロエトキシエチル）ウリジンおよび
２′−水酸基保護基がブトキシエチル基（第１表ではBE
と省略）、イソプロポキシエチル基（第１表ではIPEと
省略）、エトキシエチル基（第１表ではEEと省略）、テ
トラヒドロピラニル基（第１表ではTHPと省略）である
ウリジンを用い、1.5％ジクロロ酢酸および0.01N塩酸で
処理した時の各２′−水酸基保護基の脱離する時間を測
定した。脱離時間は使用した各２′−水酸基保護基の50
％および99％が脱離した時間とした。結果は第１表に示
すように２−クロロエトキシエチル基がきわめて良好な
安定性を示した。

実施例２実験例３で得た２′−ｏ−（２−クロロエトキシエチ
ル）−N⁶−（ベンゾイル）アデノシンを常法に従いピリ
ジン中でジメトキシトリチルクロライドと反応させる。
得られた５′−ｏ−（ジメトキシトリチル）−２′−ｏ
−（２−クロロエトキシエチル）−N⁶−（ベンゾイル）
アデノシン1.5801g（1.97mM）に無水テトラヒドロフラ
ンを加え、減圧濃縮することで完全に無水にした後、無
水テトラヒドロフラン14mlに溶解し、ジイソプロピルエ
チルアミンの共存下に、窒素雰囲気下、クロロ−２−シ
アノエトキシ−N,N−ジイソプロピルアミノホスファン
0.84ml（4mM）を加え、室温で１時間反応させる。反応
の終了を薄層クロマトグラフィーで確認後、酢酸エチル
で抽出し、飽和食塩水で洗浄する。有機層を無水硫酸ナ
トリウムで乾燥後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルクロ
マトグラフィーで精製する。精製物を少量の塩化メチレ
ンに溶解し、−60℃で石油エーテルで再沈殿し、減圧乾
燥を行うことにより、５′−ｏ−（ジメトキシトリチ
ル）−２′−ｏ−（２−クロロエトキシエチル）−N⁶−
（ベンゾイル）アデノシン−３′−ｏ−（２−シアノエ
チル）−N,N−ジイソプロピルホスホアミダイト1.4943g
（1.52mM）を得た。収率77％。³¹ P−核磁気共鳴吸収（CDCl₃,85％H₃PO₄） δ:151.83、151.29、151.04、150.67 薄層クロマトグラフィー R_f＝0.76（CH₂Cl₂:EtOAc:Et₃N＝45:45:10（v/v/v））実施例３実験例１で得た２′−ｏ−（２−クロロエトキシエチ
ル）ウリジンを用い、実施例２と同様の反応を行い、
５′−ｏ−（ジメトキシトリチル）−２′−ｏ−（２−
クロロエトキシエチル）ウリジン−３′−ｏ−（２−シ
アノエチル）−N,N−ジイソプロピルホスホアミダイト
を収率75％で得た。³¹ P−核磁気共鳴吸収（CDCl₃,85％H₃PO₄） δ:151.22、151.10、150.52 薄層クロマトグラフィー R_f＝0.64（CH₂Cl₂:EtOAc:Et₃N＝45:45:10（v/v/v））実施例４実験例２で得た２′−ｏ−（２−クロロエトキシエチ
ル）−N⁴−（イソブチリル）シチジンを用い、実施例２
と同様の反応を行い、５′−ｏ−（ジメトキシトリチ
ル）−２′−ｏ−（２−クロロエトキシエチル）−N⁴−
（イソブチリル）シチジン−３′−ｏ−（２−シアノエ
チル）−N,N−ジイソプロピルホスホアミダイトを収率8
2％で得た。³¹ P−核磁気共鳴吸収（CDCl₃,85％H₃PO₄） δ:151.68、151.25、150.92、150.14 薄層クロマトグラフィー R_f＝0.58（CH₂Cl₂:EtOAc:Et₃N＝45:45:10（v/v/v））実施例５実験例４で得た２′−ｏ−（２−クロロエトキシエチ
ル）−N²−（イソブチリル）グアノシンを用い、実施例
２と同様の反応を行い、５′−０−（ジメトキシトリチ
ル）−２′−ｏ−（２−クロロエトキシエチル）−N²−
（トリブチリル）グアノシン−３′−ｏ−（２−シアノ
エチル）−N,N−ジイソプロピルホスホアミダイトを収
率83％で得た。³¹ P−核磁気共鳴吸収（CDCl₃,85％H₃PO₄） δ:151.62、150.89、150.52、150.22 薄層クロマトグラフィー R_f＝0.43（CH₂Cl₂:EtOAc:Et₃N＝45:45:10（v/v/v））実施例６実験例２で得た２′−ｏ−（２−クロロエトキシエチ
ル）−N⁴−（イソブチリル）シチジンの５′−水酸基を
ジメトキシトリチル化した後、塩化メチレン中でジメチ
ルシアノピリジンの存在下に無水コハク酸と反応させ、
さらにシラノール水酸基がアミノプロピル化された固定
化担体CPGと縮合させる。

次いで、第２表記載の操作手順に従い、この５′−ｏ
−（ジメトキシトリチル）−２′−ｏ−（２−クロロエ
トキシエチル）−N⁴−（イソブチリル）シチジンと縮合
したCPG（５μＭ）を、1.5％ジクロロ酢酸−塩化メチレ
ン溶液で２分間処理することにより５′−水酸基の保護
基であるジメトキシトリチル基を除去し（ステップ
１）、塩化メチレンによる洗浄（ステップ２）、アセト
ニトリルによる洗浄（ステップ３）ののち、真空乾燥に
より乾燥する（ステップ４）。次に、実施例２〜５で得
たリボヌクレオチドホスホアミダイト0.4ml（200μＭ）
を、縮合剤1H−テトラゾール0.6ml（400μＭ）の存在下
に20分間反応させる（ステップ５）。縮合反応終了後ア
セトニトリルで洗浄（ステップ６）し、次いで0.1Mヨウ
素を含むテトラヒドロフラン−ピリジン−水（44:3:3
（v/v/v））溶液3mlを加えて２分間放置（ステップ７）
した後、アセトニトリルで洗浄（ステップ８）する。次
に0.1M4−ジメチルアミノピリジンを含むテトラヒドロ
フラン−無水酢酸（9:1（v/v））溶液2mlを加え１分間
反応させた（ステップ９）後、塩化メチレンで洗浄（ス
テップ10）するという一連の操作を目的とする鎖長まで
繰り返すことで、塩基部、リン酸部、２′−水酸基、末
端ヌクレオチドの５′−水酸基を保護基で保護したテト
ラヒメナｒ−RNAのbox 9R部位（塩基配列^５′UGUCGGU
C³）を合成した。第３表に各縮合毎の収率および通算収
率を示すが、いずれもきわめて良好である。

（第３表において、C,GおよびＵはオリゴリボヌクレオ
チドを形成する単位リボヌクレオチドを、その塩基残基
により表示したもので、塩基残基がＣはシトシン、Ｇは
グアニン、Ｕはラウシルである。また、HOは鎖端ヌクレ
オチドの末端５′−水酸基であることを、DMTrは末端
５′−水酸基がジメトキシトリチル基により保護されて
いることを示す。−は固定化担体である。）次に、反応容器内に濃アンモニア水を注入し、１時間
放置した後、反応容器内のアンモニア水を別の容器に移
し、58℃で８時間処理して、オリゴリボヌクレオチドと
固定相担体との分離、塩基部の保護基であるベンゾイル
基、イソブチリル基およびリン酸部の保護基であるシア
ノエチル基を除去する。次いで減圧濃縮し、残渣に0.01
N塩酸を加え、pH2に調整後、室温で36時間処理して、
２′−水酸基の保護基である２−クロロエトキシエチル
基および鎖端リボヌクレオチドの５′−水酸基の保護基
であるジメトキシメチル基を除去する。その後、希アン
モニア水で中和し、減圧濃縮後、高速液体クロマトグラ
フィー（カラム:Tskgel oligo−DNA RP,溶離液：アセ
トニトリル（０〜25％,25分）、流速:1.0ml/分）で精製
して全ての保護基を除去した高純度のテトラヒメナｒ−
RNAのbox 9R部位（塩基配列^５′UGUCGGUC^３′）60O.D.u
nitを得た。

実施例７実施例６と同様の操作手順を繰り返し、第４表記載の
如き収率で、保護基を有するテトラヒメナｒ−RNAのbox
9R′部位（塩基配列^５′GACCGUCA^３′）を得た。次い
で実施例６と同様の脱保護処理および精製処理を行い、
全ての保護基を除去した高純度のテトラヒメナｒ−RNA
のbox 9R′部位（塩基配列^５′GACCGUCA^３′）66 O.D.u
nitを得た。

（第４表において、C,G,UおよびＡはオリゴリボヌクレ
オチドを形成する単位リボヌクレオチドを、その塩基残
基により表示したもので、塩基残基がＡはアデニン、C,
GおよびＵは第３表と同一である。また、HO,DMTrおよび
−は第３表と同一の意味を表わす。）〔発明の効果〕ホスファイト法によるオリゴリボヌクレオチドを固相
合成するさい、２′−水酸基を２−クロロエトキシエチ
ル基で保護したホスホアミダイト化合物を用いることに
より、鎖長延長時の５′−水酸基保護基の除去条件であ
る酸処理においても２′−水酸基保護基の脱離がなく、
またこの２′−水酸基保護基の脱離に伴う縮合時または
オリゴリボヌクレオチド合成後の脱保護時の副反応を防
止し得るものである。また２−クロロエトキシエチル基
を脱保護も従来のアセタールタイプの保護基と同条件で
完全に脱保護することができるので、高収率で高純度の
オリゴリボヌクレオチドの合成を可能とするものであ
る。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07H 19/04 C07H 21/02 C07H 19/10 C07H 19/20 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】２′−水酸基の保護基が２−クロロエトキ
シエチル基であることを特徴とする一般式〔Ｉ〕（式中、Ｂ′は保護基を有することもある核酸塩基残基
を、R¹は水酸基の保護基を、R²はリン酸の保護基を、Ｘ
は他のリボヌクレオシドまたはリボヌクレオチドの糖部
の水酸基と反応する基を表わす）で示されるホスホアミダイト化合物。
【請求項２】ホスファイト法によるオリゴリボヌクレオ
チドの固相合成法において、ホスホアミダイト化合物と
して、一般式〔Ｉ〕（式中、Ｂ′は保護基を有することもある核酸塩基残基
を、R¹は水酸基の保護基を、R²はリン酸の保護基を、Ｘ
は他のリボヌクレオシドまたはリボヌクレオチドの糖部
の水酸基と反応する基を表わす）で示される２′−水酸基の保護基が２−クロロエトキシ
エチル基であるホスホアミダイト化合物を用いることを
特徴とするオリゴリボヌクレオチドの固相合成法。