JP2800850B2 - 新生物形成の検出方法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 背景 本発明はCD44遺伝子またはCD44遺伝子の一部の発現を
利用して新生物形成を検査することに関するものであ
る。このような検査には、診断すべき患者から組織、体
液その他の試料を採取し、診断を与え、または既に実施
されている療法を評価することが含まれる。特に本発明
は、非侵襲的に得られる体液その他の試料を用いて新生
物形成のルーティンスクリーニングを実施するための簡
単な方法を提供することである。
利用して新生物形成を検査することに関するものであ
る。このような検査には、診断すべき患者から組織、体
液その他の試料を採取し、診断を与え、または既に実施
されている療法を評価することが含まれる。特に本発明
は、非侵襲的に得られる体液その他の試料を用いて新生
物形成のルーティンスクリーニングを実施するための簡
単な方法を提供することである。
現在腫瘍を診断するための普通の方法は、細胞または
薄い組織片を顕微鏡で観察すること、すなわち極めて有
効である場合が多いが、幾つかの重要な制限がある方法
によるものである。小規模の試料については診断が極め
て困難である可能性があるが、多数の細胞が得られない
場合が多く、または患者から多量の試料を得るのは望ま
しくないか、もしくは不可能である。50％にも及び症例
において信頼性のある診断が得られない；それは癌の陽
性の証拠がないが、患者が実際に癌ではないという確信
もない場合がありうる。その場合、診断を確立するため
にはより侵襲的な検査が要求される。
薄い組織片を顕微鏡で観察すること、すなわち極めて有
効である場合が多いが、幾つかの重要な制限がある方法
によるものである。小規模の試料については診断が極め
て困難である可能性があるが、多数の細胞が得られない
場合が多く、または患者から多量の試料を得るのは望ま
しくないか、もしくは不可能である。50％にも及び症例
において信頼性のある診断が得られない；それは癌の陽
性の証拠がないが、患者が実際に癌ではないという確信
もない場合がありうる。その場合、診断を確立するため
にはより侵襲的な検査が要求される。
予後の診断も顕微鏡下に観察した際の細胞の外観に依
存する。一般に原発性腫瘍における細胞が奇異な外観で
あるほど、それらはのちに転移しやすいが、関連性は決
して絶対的ではない。どれが最も有効な治療法であるか
を判定するためには、転移が起こりやすいか否かをより
正確に予想しうることが明らかに有利であろう。
存する。一般に原発性腫瘍における細胞が奇異な外観で
あるほど、それらはのちに転移しやすいが、関連性は決
して絶対的ではない。どれが最も有効な治療法であるか
を判定するためには、転移が起こりやすいか否かをより
正確に予想しうることが明らかに有利であろう。
ヒトCD遺伝子は種々の大きさの一群の可変性グリコシ
ル化された細胞表面蛋白質をコードし、その多数の機能
はまだ完全には確立されていないが、CD44モノクローナ
ル抗体（mAb）により認識されるエピトープを共有す
る。それは造血細胞および他の多数の細胞タイプ中にお
いて発現する標準的部分からなり、その中へ付加的なエ
キソンの産物が種々の組み合わせでスプライシングされ
て異なる蛋白質を産生しうることが知られている。これ
は真核細胞において同一遺伝子から数種類の、しばしば
機能的に無関係の蛋白質を産生するための十分に認識さ
れたメカニズムであり、選択的スプライシング（altern
ative splicing）として知られている。
ル化された細胞表面蛋白質をコードし、その多数の機能
はまだ完全には確立されていないが、CD44モノクローナ
ル抗体（mAb）により認識されるエピトープを共有す
る。それは造血細胞および他の多数の細胞タイプ中にお
いて発現する標準的部分からなり、その中へ付加的なエ
キソンの産物が種々の組み合わせでスプライシングされ
て異なる蛋白質を産生しうることが知られている。これ
は真核細胞において同一遺伝子から数種類の、しばしば
機能的に無関係の蛋白質を産生するための十分に認識さ
れたメカニズムであり、選択的スプライシング（altern
ative splicing）として知られている。
２種類の共通CD44イソ型が現在までに精製され、かつ
解明されている（スタメンコビック（Stamenkovic）ら,
1989）。すなわちｉ）重度にグリコシル化された中心37
kDコアからなる90kD形、およびii）近位膜外ドメイン中
に挿入された135の余分なアミノ酸を含み、よりいっそ
う重度にグリコシル化された180kD形。免疫−細胞化学
的および免疫−沈殿研究により、両者が多数の異なる細
胞および組織内に広く分布することが示された。前者は
造血形または標準形として知られ、循環白血球、骨髄細
胞および他の多数の細胞タイプ上に存在する。他方の上
皮性変異型として知られるものは、数種類の上皮細胞タ
イプ上に検出される。両者ともホモタイプおよびヘテロ
タイプの付着性相互作用を仲介する受容体として機能
し、細胞を相互に、または隣接する細胞外骨格（extrac
ellular scaffolding）に付着させる。
解明されている（スタメンコビック（Stamenkovic）ら,
1989）。すなわちｉ）重度にグリコシル化された中心37
kDコアからなる90kD形、およびii）近位膜外ドメイン中
に挿入された135の余分なアミノ酸を含み、よりいっそ
う重度にグリコシル化された180kD形。免疫−細胞化学
的および免疫−沈殿研究により、両者が多数の異なる細
胞および組織内に広く分布することが示された。前者は
造血形または標準形として知られ、循環白血球、骨髄細
胞および他の多数の細胞タイプ上に存在する。他方の上
皮性変異型として知られるものは、数種類の上皮細胞タ
イプ上に検出される。両者ともホモタイプおよびヘテロ
タイプの付着性相互作用を仲介する受容体として機能
し、細胞を相互に、または隣接する細胞外骨格（extrac
ellular scaffolding）に付着させる。
少し前に、mAbヘルメス−３により認識される幾つか
のCD44エピトープが末梢リンパ節受容体を構成し、これ
により循環リンパ球が末梢リンパ節を認識し、かつそこ
を通過するのを可能にするものとして同定された。その
後この抗原に対する他のmAbが得られるようになり、ス
タメンコビック（Stamenkovic）ら（1989）はそれらの
うちの１つを、発現ライブラリーからCOS細胞中におい
て標準形の分子をコードするcDNA配列をクローニングす
るために用いた。彼らはさらにノーザンブロッティング
により、この遺伝子はリンパ球によってのみでなく、種
々の癌細胞系および代表的な充実性癌の試料によっても
発現し、それらのうち２種類の結腸癌は正常な結腸上皮
より強く発現することを見出した。
のCD44エピトープが末梢リンパ節受容体を構成し、これ
により循環リンパ球が末梢リンパ節を認識し、かつそこ
を通過するのを可能にするものとして同定された。その
後この抗原に対する他のmAbが得られるようになり、ス
タメンコビック（Stamenkovic）ら（1989）はそれらの
うちの１つを、発現ライブラリーからCOS細胞中におい
て標準形の分子をコードするcDNA配列をクローニングす
るために用いた。彼らはさらにノーザンブロッティング
により、この遺伝子はリンパ球によってのみでなく、種
々の癌細胞系および代表的な充実性癌の試料によっても
発現し、それらのうち２種類の結腸癌は正常な結腸上皮
より強く発現することを見出した。
バーチ（Birch）ら（1991）は、ヘルメス−３抗体に
より認識される80−90kD形のCD44抗原を強く発現する黒
色腫細胞クローンが、それを弱く発現するクローンよ
り、ヌードマウスにおいて実質的にいっそう転移性であ
ることを報告した。サイ（Sy）ら（1991）は、ヌードマ
ウスにおけるヒトリンパ腫細胞の転移能力が、細胞を標
準CD44遺伝子でトランスフェクトした後には中程度に上
昇するが、上皮性変異型をコードする構築体によるトラ
ンスフェクション後には上昇しないと記載している。ガ
ンタート（Gunthert）ら（1991）は、ラットCD44抗原に
対して形成された新たな抗体により認識されるリンパ球
ホーミング受容体の変異型が、ラット膵臓腺癌細胞の転
移挙動に必要であることを示す結果を得た。この抗体を
用いて、彼らは変異型のCD44に対応するcDNA配列をクロ
ーニングし、それがそれまで同定されていないエキソン
を含むことを見出した。転移性クローンにユニークなこ
のcDNA配列を過剰発現するように設計された構築体を用
いて、同じ細胞系からの非転移性クローンをトランスフ
ェクションすると、転移性挙動を誘導するように思われ
た（ガンタート（Gunthert）ら,1991）。
より認識される80−90kD形のCD44抗原を強く発現する黒
色腫細胞クローンが、それを弱く発現するクローンよ
り、ヌードマウスにおいて実質的にいっそう転移性であ
ることを報告した。サイ（Sy）ら（1991）は、ヌードマ
ウスにおけるヒトリンパ腫細胞の転移能力が、細胞を標
準CD44遺伝子でトランスフェクトした後には中程度に上
昇するが、上皮性変異型をコードする構築体によるトラ
ンスフェクション後には上昇しないと記載している。ガ
ンタート（Gunthert）ら（1991）は、ラットCD44抗原に
対して形成された新たな抗体により認識されるリンパ球
ホーミング受容体の変異型が、ラット膵臓腺癌細胞の転
移挙動に必要であることを示す結果を得た。この抗体を
用いて、彼らは変異型のCD44に対応するcDNA配列をクロ
ーニングし、それがそれまで同定されていないエキソン
を含むことを見出した。転移性クローンにユニークなこ
のcDNA配列を過剰発現するように設計された構築体を用
いて、同じ細胞系からの非転移性クローンをトランスフ
ェクションすると、転移性挙動を誘導するように思われ
た（ガンタート（Gunthert）ら,1991）。
これらの所見からみて、種々の組織遺伝学的由来の培
養された転移性および非転移性ヒト腫瘍細胞系がCD44産
物を鑑別的に発現するか否かを知ることが関心事となっ
た。細胞または組織における遺伝子の発現は、細胞メッ
センジャーRNAからcDNAを作成し、それらの遺伝子産物
に対応する部分のcDNAに優先的にアニーリングするよう
に選ばれた特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用い
て、目的領域をポリメラーゼ連鎖反応により増幅させる
ことによって、極めて効率的かつ高感度で研究すること
ができる。しかしホフマン（Hofmann）ら（1991）およ
び本発明者らによるこの方法を用いた研究は、CD44の発
現はヌードマウスにおけるこれらの培養細胞系の転移能
力に対して、または腫瘍形成能に対してすら、必ずしも
規則的かつ信頼性をもって相関してはいないことを示す
結果を与えた。ほぼこの時期に３つの別個のグループ
（ホフマン（Hofmann）ら,1991、スタメンコビック（St
amenkovic）ら,1991、およびジャクソン（Jacson）ら,1
992）が、種々のヒト細胞系においてこの遺伝子により
発現することを彼らが見出した他のスプライス変異型に
ついての配列データを公表した。
養された転移性および非転移性ヒト腫瘍細胞系がCD44産
物を鑑別的に発現するか否かを知ることが関心事となっ
た。細胞または組織における遺伝子の発現は、細胞メッ
センジャーRNAからcDNAを作成し、それらの遺伝子産物
に対応する部分のcDNAに優先的にアニーリングするよう
に選ばれた特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用い
て、目的領域をポリメラーゼ連鎖反応により増幅させる
ことによって、極めて効率的かつ高感度で研究すること
ができる。しかしホフマン（Hofmann）ら（1991）およ
び本発明者らによるこの方法を用いた研究は、CD44の発
現はヌードマウスにおけるこれらの培養細胞系の転移能
力に対して、または腫瘍形成能に対してすら、必ずしも
規則的かつ信頼性をもって相関してはいないことを示す
結果を与えた。ほぼこの時期に３つの別個のグループ
（ホフマン（Hofmann）ら,1991、スタメンコビック（St
amenkovic）ら,1991、およびジャクソン（Jacson）ら,1
992）が、種々のヒト細胞系においてこの遺伝子により
発現することを彼らが見出した他のスプライス変異型に
ついての配列データを公表した。
本発明 本発明は、乳房および結腸の腫瘍ならびにそれらの転
移を伴う患者から得た新鮮な組織および体液試料におけ
るCD44遺伝子の種々の部分の発現を調べる研究により得
た予想外の知見に基づくものである。これらの結果は、
ｉ）転移性（悪性）腫瘍、ii）非転移性の局所浸潤性腫
瘍および良性腫瘍、ならびにiii）正常組織から得た組
織間で、CD44発現の極めて明瞭な相異を示した。グルー
プｉ）とii）の区別は療法の判定に重要であり、グルー
プii）とiii）の区別は早期診断およびスクリーニング
に重要である。
移を伴う患者から得た新鮮な組織および体液試料におけ
るCD44遺伝子の種々の部分の発現を調べる研究により得
た予想外の知見に基づくものである。これらの結果は、
ｉ）転移性（悪性）腫瘍、ii）非転移性の局所浸潤性腫
瘍および良性腫瘍、ならびにiii）正常組織から得た組
織間で、CD44発現の極めて明瞭な相異を示した。グルー
プｉ）とii）の区別は療法の判定に重要であり、グルー
プii）とiii）の区別は早期診断およびスクリーニング
に重要である。
従って本発明は１観点においては、試料中のCD44遺伝
子の発現を分析することを含む、新生物形成の診断方法
を提供する。
子の発現を分析することを含む、新生物形成の診断方法
を提供する。
具体的態様において本発明は、試料中のメッセンジャ
ーRNA（mRNA）からcDNAを作成し、CD44遺伝子またはそ
の一部に対応する膨分の相補的DNA（cDNA）を増幅し、
この増幅されたcDNAを検出することを含む、CD44遺伝子
またはその一部の産物につき試料をアッセイする方法に
おいて、増幅されたcDNAを新生物形成の診断に利用する
ことを特徴とする方法を提供する。
ーRNA（mRNA）からcDNAを作成し、CD44遺伝子またはそ
の一部に対応する膨分の相補的DNA（cDNA）を増幅し、
この増幅されたcDNAを検出することを含む、CD44遺伝子
またはその一部の産物につき試料をアッセイする方法に
おいて、増幅されたcDNAを新生物形成の診断に利用する
ことを特徴とする方法を提供する。
新生物形成の診断とは、新生物形成組織の初期検出を
意味するか、またはそれは転移性腫瘍と非転移性腫瘍と
を区別する工程であってもよい。本明細書において用い
る“診断”という語に関してはこれに従って解釈すべき
である。
意味するか、またはそれは転移性腫瘍と非転移性腫瘍と
を区別する工程であってもよい。本明細書において用い
る“診断”という語に関してはこれに従って解釈すべき
である。
本方法は充実性腫瘍、特に悪性腫瘍、たとえば癌の診
断に特に適用しうる。アッセイを行う材料は、身体組織
または体液のものであり、インビトロで培養された細胞
のものではないことが好ましい。試料は充実性腫瘍から
得た組織小片、または細胞の微小注射針吸引液（fine n
eedle aspirate,FMA）であってもよい。あるいはそれは
血液もしくは尿もしくは他の体液、頚部切屑の試料、ま
たは非侵襲的に得た試料、たとえば喀痰、尿もしくは便
であってもよい。
断に特に適用しうる。アッセイを行う材料は、身体組織
または体液のものであり、インビトロで培養された細胞
のものではないことが好ましい。試料は充実性腫瘍から
得た組織小片、または細胞の微小注射針吸引液（fine n
eedle aspirate,FMA）であってもよい。あるいはそれは
血液もしくは尿もしくは他の体液、頚部切屑の試料、ま
たは非侵襲的に得た試料、たとえば喀痰、尿もしくは便
であってもよい。
上記cDNAは１または２以上の標識された特異的オリゴ
ヌクレオチドプローブを用いて検出することができ、こ
れらのプローブは増幅されたcDNA配列の一部にアニーリ
ングしうるように選ばれる。あるいは標識オリゴヌクレ
オチドプライマーおよび／または標識モノヌクレオチド
を用いることができる。放射性標識を含めて、使用しう
る適切な検出可能な多数の標識がある。
ヌクレオチドプローブを用いて検出することができ、こ
れらのプローブは増幅されたcDNA配列の一部にアニーリ
ングしうるように選ばれる。あるいは標識オリゴヌクレ
オチドプライマーおよび／または標識モノヌクレオチド
を用いることができる。放射性標識を含めて、使用しう
る適切な検出可能な多数の標識がある。
添付の図面につき述べる。
図１−５は、以下に報告する種々の実験の結果を示す
オートラジオグラフである。
オートラジオグラフである。
図６は、エキソン、プローブおよびプライマーを示し
たCD44遺伝子地図である。エキソンの番号はスクリート
ン（Screaton）ら（1992）が用いたものに対応する。
たCD44遺伝子地図である。エキソンの番号はスクリート
ン（Screaton）ら（1992）が用いたものに対応する。
図７は、エキソン６（図６に示したもの）の核酸配列
であり、対応するアミノ酸配列をも示す。
であり、対応するアミノ酸配列をも示す。
図８は、他の実験の結果を示す１組のオートラジオグ
ラフである。
ラフである。
図６はエキソン６−14を示したCD44遺伝子地図であ
る。基本的または標準的蛋白質を、理論的にはこれら９
つの余分なエキソンおにずれか１つ、幾つか、またはす
べてからの転写体の挿入により修飾することができる。
エキソン６は本出願の優先権主張日には未知であり、本
発明の他の観点をなす。エキソン６は腫瘍の場合は過剰
発現するが、正常組織では過剰発現せず、エキソン７−
９付近に位置する。エキソン６の配列を図７に示す。そ
れは129塩基対を含み、５′側は標準的CD44配列によ
り、かつ３′側は通常はエキソン７によりフランキング
されている。
る。基本的または標準的蛋白質を、理論的にはこれら９
つの余分なエキソンおにずれか１つ、幾つか、またはす
べてからの転写体の挿入により修飾することができる。
エキソン６は本出願の優先権主張日には未知であり、本
発明の他の観点をなす。エキソン６は腫瘍の場合は過剰
発現するが、正常組織では過剰発現せず、エキソン７−
９付近に位置する。エキソン６の配列を図７に示す。そ
れは129塩基対を含み、５′側は標準的CD44配列によ
り、かつ３′側は通常はエキソン７によりフランキング
されている。
エキソン９−11とは対照的に、エキソン６（新規に配
列決定されたエキソン）の産物は、正常組織の試料中で
は稀に検出されるにすぎない。これは、エキソン６が新
生物形成の診断に特に重要であろうということを示唆す
る。
列決定されたエキソン）の産物は、正常組織の試料中で
は稀に検出されるにすぎない。これは、エキソン６が新
生物形成の診断に特に重要であろうということを示唆す
る。
他の観点においては本発明は新規化合物として、図７
に示すエキソン６の核酸配列、その特徴的フラグメン
ト、縮重した（degenerated）、および／または対立遺
伝子変異型を表す配列、相同性核酸配列、ならびにこれ
らの配列または相同体とハイブリダイズしうるプロー
ブ、プライマーおよび他の試薬を提供する。これらの化
合物および試薬は、すべて上記方法に有用である。
に示すエキソン６の核酸配列、その特徴的フラグメン
ト、縮重した（degenerated）、および／または対立遺
伝子変異型を表す配列、相同性核酸配列、ならびにこれ
らの配列または相同体とハイブリダイズしうるプロー
ブ、プライマーおよび他の試薬を提供する。これらの化
合物および試薬は、すべて上記方法に有用である。
本発明の他の観点には下記のものが含まれる： −エキソン６に対応する、図７に示すペプチド配列、そ
れの対立遺伝子変異型およびその二次修飾体、たとえば
リン酸化およびグリコシル化生成物、ならびにその特徴
的フラグメント、たとえばそのポリペプチドがインビボ
で折りたたまれた場合にエピトープを構成するフラグメ
ント。
れの対立遺伝子変異型およびその二次修飾体、たとえば
リン酸化およびグリコシル化生成物、ならびにその特徴
的フラグメント、たとえばそのポリペプチドがインビボ
で折りたたまれた場合にエピトープを構成するフラグメ
ント。
−上記ペプチド配列、それの対立遺伝子変異型およびそ
の二次修飾体、たとえばリン酸化およびグリコシル化生
成物、ならびにその特徴的フラグメントに対する抗体。
それらの抗体は、たとえば放射性核種または殺腫瘍性化
合物で標識されてもよい。
の二次修飾体、たとえばリン酸化およびグリコシル化生
成物、ならびにその特徴的フラグメントに対する抗体。
それらの抗体は、たとえば放射性核種または殺腫瘍性化
合物で標識されてもよい。
−インビトロ診断のための、上記標識抗体の使用。
−ラジオイメージング（radioimaging）またはインビボ
診断のための、上記放射性標識抗体の使用。
診断のための、上記放射性標識抗体の使用。
−所望により殺腫瘍性化合物その他で標識された上記抗
体の、療法における使用。
体の、療法における使用。
これらのペプチド配列またはフラグメントは標準法に
より、たとえば自動合成装置を用いて合成することがで
きる。抗体は上記ペプチドを抗原の形で適切な宿主に投
与することにより形成しうる。ポリクローナルまたはモ
ノクローナル抗体を標準法により調製しうる。
より、たとえば自動合成装置を用いて合成することがで
きる。抗体は上記ペプチドを抗原の形で適切な宿主に投
与することにより形成しうる。ポリクローナルまたはモ
ノクローナル抗体を標準法により調製しうる。
他の観点において本発明は、CD44遺伝子のエトキン７
−９付近に位置するエキソンの過剰発現を測定すること
を特徴とする、新生物形成の免疫学的診断方法を提供す
る。好ましくはこのエキソンは図７に示す核酸配列を有
する。
−９付近に位置するエキソンの過剰発現を測定すること
を特徴とする、新生物形成の免疫学的診断方法を提供す
る。好ましくはこのエキソンは図７に示す核酸配列を有
する。
腫瘍においてCD44遺伝子の多数のスプライシングされ
た変異型が無秩序に過剰発現することは、特定の組織試
料により特定のエキソンが過剰発現する可能性がある
が、またはその可能性がない（または全く発現していな
い）ことを暗示する。従っていずれかの単一エキソンに
より発現するペプチドに対する抗体を用いるイムノアッ
セイは誤った結果を与える可能性がある。従って本発明
は、新生物形成の免疫学的診断のために２以上、好まし
くは９つ全部のCD44エキソンに対する抗体の混合物を用
いることを含む。
た変異型が無秩序に過剰発現することは、特定の組織試
料により特定のエキソンが過剰発現する可能性がある
が、またはその可能性がない（または全く発現していな
い）ことを暗示する。従っていずれかの単一エキソンに
より発現するペプチドに対する抗体を用いるイムノアッ
セイは誤った結果を与える可能性がある。従って本発明
は、新生物形成の免疫学的診断のために２以上、好まし
くは９つ全部のCD44エキソンに対する抗体の混合物を用
いることを含む。
詳細な記述 本発明の１態様においては、ポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）によりcDNAの増幅を行う。PCRについては、ヒト
CD44 cDNAに関する配列情報を利用してプライマーを選
ぶことができる。発現しうるCD44遺伝子のいずれかの部
分に対応するcDNAを増幅するプライマーを使用しうる。
これには挿入エキソンを含むか、もしくは含まない標準
的部分が包含され、またはそれは１もしくは２以上のエ
キソンのみの一部もしくは全部であってもよい。後者の
場合、試薬の浪費がより少なく、かつより良好なシグナ
ルが生じ、また標準配列に対するプローブを使用しな
い。
（PCR）によりcDNAの増幅を行う。PCRについては、ヒト
CD44 cDNAに関する配列情報を利用してプライマーを選
ぶことができる。発現しうるCD44遺伝子のいずれかの部
分に対応するcDNAを増幅するプライマーを使用しうる。
これには挿入エキソンを含むか、もしくは含まない標準
的部分が包含され、またはそれは１もしくは２以上のエ
キソンのみの一部もしくは全部であってもよい。後者の
場合、試薬の浪費がより少なく、かつより良好なシグナ
ルが生じ、また標準配列に対するプローブを使用しな
い。
本発明は直接的PCRの使用に限定されない。たとえば
集合した（nested）プライマーの系を使用しうる。当技
術分野で知られている他の適切な方法も適用しうる。
集合した（nested）プライマーの系を使用しうる。当技
術分野で知られている他の適切な方法も適用しうる。
本発明による他の方法においては、増幅されたcDNAを
電気泳動により分離する。次いでこの分離されたcDNAに
つきブロッティングおよびオートラジオグフィーを行う
ことができる。オートラジオグフィーは、電気泳動され
た増幅産物をナイロン膜にブロッティングすることによ
り固定して、32Pまたは他の適切な標識で標識された放
射性標識−特異的オリゴヌクレオチドプローブでプロー
ビングすることを伴い、このプローブは増幅されたcDNA
配列の一部にアニーリングしうるように選ばれる。次い
で検出工程は、標識され、分離されたcDNAをＸ線フィル
ムに露光することを伴う。
電気泳動により分離する。次いでこの分離されたcDNAに
つきブロッティングおよびオートラジオグフィーを行う
ことができる。オートラジオグフィーは、電気泳動され
た増幅産物をナイロン膜にブロッティングすることによ
り固定して、32Pまたは他の適切な標識で標識された放
射性標識−特異的オリゴヌクレオチドプローブでプロー
ビングすることを伴い、このプローブは増幅されたcDNA
配列の一部にアニーリングしうるように選ばれる。次い
で検出工程は、標識され、分離されたcDNAをＸ線フィル
ムに露光することを伴う。
以下の実施例において、ヒトCD44遺伝子の発現が正常
組織と対比して種々の充実性腫瘍において一貫して、か
つ明瞭に増大することが見出された。悪性（すなわち既
に転移性である）腫瘍は、局所湿潤性のものおよび良性
のものと、認められた変化のパターンおよび程度におい
て異なっていた。46例の腫瘍からの試料につき研究を行
った。そのうち44列は局所湿潤性または転移性であり、
２例は良性であった。新鮮な外科生検試料から抽出した
RNAの逆転写により調製されたcDNAを増幅するためにPCR
を採用することにより、CD44の発現の分析を行った。CD
44遺伝子の特定の部分に特異的にアニーリングするオリ
ゴヌクレオチドプライマーを選ぶことにより、これらの
結果からみて診断および予後において重要である部分の
遺伝子を増幅することが可能である。
組織と対比して種々の充実性腫瘍において一貫して、か
つ明瞭に増大することが見出された。悪性（すなわち既
に転移性である）腫瘍は、局所湿潤性のものおよび良性
のものと、認められた変化のパターンおよび程度におい
て異なっていた。46例の腫瘍からの試料につき研究を行
った。そのうち44列は局所湿潤性または転移性であり、
２例は良性であった。新鮮な外科生検試料から抽出した
RNAの逆転写により調製されたcDNAを増幅するためにPCR
を採用することにより、CD44の発現の分析を行った。CD
44遺伝子の特定の部分に特異的にアニーリングするオリ
ゴヌクレオチドプライマーを選ぶことにより、これらの
結果からみて診断および予後において重要である部分の
遺伝子を増幅することが可能である。
ここで見出された変化したCD44発現と新生物形成との
間の強い関連は、必ずしもこの遺伝子の個々のエキソン
のいずれかが新生物形成に際して、または転移性悪性腫
瘍への進行に際してのみ発現されることを意味するわけ
ではない。多数の研究室で最近得られた証拠（総説に関
してはクヌドソン（Knudson）,1985、タリン（Tarin）,
1992、ハイレ（Hayle）ら,1992を参照されたい）は、こ
れらの病理学的過程は恐らく正常な細胞活動、たとえば
細胞の増殖および移動をコードする遺伝子の調節が混乱
した結果であろうと指摘している。従っていずれかの遺
伝子または遺伝子異の一部が新生物形成または転移をプ
ログラミングするという唯一の機能をもつとは思われな
い。
間の強い関連は、必ずしもこの遺伝子の個々のエキソン
のいずれかが新生物形成に際して、または転移性悪性腫
瘍への進行に際してのみ発現されることを意味するわけ
ではない。多数の研究室で最近得られた証拠（総説に関
してはクヌドソン（Knudson）,1985、タリン（Tarin）,
1992、ハイレ（Hayle）ら,1992を参照されたい）は、こ
れらの病理学的過程は恐らく正常な細胞活動、たとえば
細胞の増殖および移動をコードする遺伝子の調節が混乱
した結果であろうと指摘している。従っていずれかの遺
伝子または遺伝子異の一部が新生物形成または転移をプ
ログラミングするという唯一の機能をもつとは思われな
い。
本発明の研究においてエキソン10/11からの転写体が
正常組織に見出されることは、転移しうる腫瘍からのPC
R産物において放射性標識プローブE4とハイブリダイズ
するバンドの数およびシグナル強度が著しく増大するに
もかかわらず、このエキソンは転移活性にのみ関与する
わけではないことを示す。従ってCD44エキソン10/11発
現が転移挙動をもたらすためには他の支持事象が要求さ
れると考えられる。それにもかかわらず、このエキソン
からの転写体が転写性腫瘍からの試料中において過剰発
現したという所見は、極めて有用な予後の指示体となる
ことを約束する。
正常組織に見出されることは、転移しうる腫瘍からのPC
R産物において放射性標識プローブE4とハイブリダイズ
するバンドの数およびシグナル強度が著しく増大するに
もかかわらず、このエキソンは転移活性にのみ関与する
わけではないことを示す。従ってCD44エキソン10/11発
現が転移挙動をもたらすためには他の支持事象が要求さ
れると考えられる。それにもかかわらず、このエキソン
からの転写体が転写性腫瘍からの試料中において過剰発
現したという所見は、極めて有用な予後の指示体となる
ことを約束する。
個々のいずれかのエキソンの自然の（突然変異してい
ない）産物が腫瘍細胞中にのみ存在し、正常な対細胞中
には存在しないことが、これ以上の研究により見出され
るとは期待されない。その代わり、本明細書においてCD
44遺伝子座につき報告するように、遺伝子の過剰発現お
よび産物の不適切な組み合わせからなる異常なパターン
の遺伝子活性が悪性状態において役割をもつと思われ
る。これらの変化はそれ自体が悪性変換に要求されるの
かも知れないし、またはこのような変換を引き起こす他
の遺伝的妨害の結果であるかも知れない。たとえそうで
あっても、この問題点を解決せずに観察者がこれらの技
術を用いて試料を新生物形成カテゴリーまたは非−新生
物形成カテゴリーに帰属させるのに関連した情報を得る
ことはできる。
ない）産物が腫瘍細胞中にのみ存在し、正常な対細胞中
には存在しないことが、これ以上の研究により見出され
るとは期待されない。その代わり、本明細書においてCD
44遺伝子座につき報告するように、遺伝子の過剰発現お
よび産物の不適切な組み合わせからなる異常なパターン
の遺伝子活性が悪性状態において役割をもつと思われ
る。これらの変化はそれ自体が悪性変換に要求されるの
かも知れないし、またはこのような変換を引き起こす他
の遺伝的妨害の結果であるかも知れない。たとえそうで
あっても、この問題点を解決せずに観察者がこれらの技
術を用いて試料を新生物形成カテゴリーまたは非−新生
物形成カテゴリーに帰属させるのに関連した情報を得る
ことはできる。
実施例 方法 乳房腫瘍および結腸腫瘍を伴う患者34人の治療に際し
て摘出した外科切除検体から、直径0.5−1cmの新鮮な組
織試料を得た。試料を病理検体受付区域に到着して10分
以内に液体窒素中で瞬間凍結し、使用時まで液体窒素中
に保存した。診断のために切除した組織中にリンパ節転
移体および血液由来の転移体が存在する場合には、それ
らの一度をも採取した。正常な乳房組織、正常な結晶粘
膜、乳房の腫瘍に隣接する正常なリンパ節、ならびに正
常な肝臓をも、外科切除試料から、および非−新生物形
成状態に関して摘出した他の試料から採取した。正常な
末梢結血白血球は10人のボランティアから、また骨髄は
３人のボランティアから得た。これらの腫瘍およびそれ
らの臨床段階の組織学的特徴を表１に記載する。
て摘出した外科切除検体から、直径0.5−1cmの新鮮な組
織試料を得た。試料を病理検体受付区域に到着して10分
以内に液体窒素中で瞬間凍結し、使用時まで液体窒素中
に保存した。診断のために切除した組織中にリンパ節転
移体および血液由来の転移体が存在する場合には、それ
らの一度をも採取した。正常な乳房組織、正常な結晶粘
膜、乳房の腫瘍に隣接する正常なリンパ節、ならびに正
常な肝臓をも、外科切除試料から、および非−新生物形
成状態に関して摘出した他の試料から採取した。正常な
末梢結血白血球は10人のボランティアから、また骨髄は
３人のボランティアから得た。これらの腫瘍およびそれ
らの臨床段階の組織学的特徴を表１に記載する。
組織試料からの全細胞RNA抽出を、コミジンスキーお
よびサッチ（Chomizynski,Sacchi）（1987）が記載する
方法に従って実施した。流体試料からの抽出はインビト
ロジェンが市販するマイクロファストトラック（Microf
asttrack）キットを用いて行った。cDNA合成およびそれ
に続くポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、スーパースク
リプト（Superscript、商標）予備増幅システム（BRLラ
イフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッド、英国ミ
ドルセックス）をこのキット中に供給される緩衝液およ
び試薬と共に用いて実施された。要約すると、これは鋳
型としての試料RNAおよび市販のヌクレオチドトリホス
フェートを用いて逆転写酵素により第１鎖cDNAを合成す
る初期工程を伴う。後続のPCRのために各試料に油を積
層し、94℃に５分間加熱して核酸を変性させた；次いで
30サイクルのPCRを下記のサイクルパラメーターにより
実施した:94℃で１分、55℃で１分、72℃で２分。反応
混合物中に鋳型cDNAが存在しない陰性対照を各バッチに
つきルーティンに試験した。ヒトCD44 cDNAにつき公表
された配列からの情報（ホフマン（Hoffmann）ら,199
1、スタメンコビック（Stamenkovic）ら,1991、ジャク
ソン（Jackson）ら,1992）（図６）を利用して本発明者
らが作成したプライマーおよびプローブの配列は下記の
とおりであった： P1はその起点が標準CD44分子中の挿入部位から324bp
上流に位置し（スタメンコビック（Stamenkovic）ら（1
989）が公表した配列中のヌクレオチド782と783の
間）、P4はこの部位の158bp下流にある。これらのプラ
イマーは、試料が標準CD44（いわゆる造血性CD44）を発
現する場合は482bpのPCRフラグメントを産生し、試料が
選択的スプライシングされた転写体を含む場合は上皮形
CD44に関する878bpを産生する。各PCR産物10μｌを1.2
％アガロースゲル中で電気泳動し、オリゴヌクレオチド
プローブE4（＝５′TGAGATTGGGTTGAAGAAATC−３′）
（図６参照）とのハイブリダイゼーションのためにハイ
ボンド（Hybond）N+（アメルシャムUK、英国リトルシャ
ルフォント）ナイロン膜に移した。検出感度および解像
度を向上させるために、ブロッティングおよびオートラ
ジオグラフィーを実施した。プローブをポリヌクレオチ
ドキナーゼの存在下にy32P−ATPで放射性標識した。プ
レハイブリダイゼーション後に、10％デキストラン、６
×NET、５×デンハルト液、0.5％NP40、および100μg/m
lサケ精子DNA中で42℃において一夜、ハイブリダイゼー
ションを実施した。次いでフィルターを２回、２×SS
C、１×SSC、および0.5％SSC−−0.1％SDS含有−−中で
42℃において順次15分ずつ洗浄した。フィルターをコダ
ックＸ線フィルムに２−16時間露光した。次いでプロー
ブをストリッピングするためにフィルターを0.5％SDS中
で煮沸し、他の放射性標識プローブ、すなわちCD44の標
準部分（図６）にアニーリングさせるために本発明者ら
が設計したP2（＝５′CCTGAAGAAGATTGTACATCAGTCACAGA
C）と再度ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーシ
ョン、洗浄およびオートラジオグラフィーに用いた条件
は上記と同じであった。
よびサッチ（Chomizynski,Sacchi）（1987）が記載する
方法に従って実施した。流体試料からの抽出はインビト
ロジェンが市販するマイクロファストトラック（Microf
asttrack）キットを用いて行った。cDNA合成およびそれ
に続くポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、スーパースク
リプト（Superscript、商標）予備増幅システム（BRLラ
イフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッド、英国ミ
ドルセックス）をこのキット中に供給される緩衝液およ
び試薬と共に用いて実施された。要約すると、これは鋳
型としての試料RNAおよび市販のヌクレオチドトリホス
フェートを用いて逆転写酵素により第１鎖cDNAを合成す
る初期工程を伴う。後続のPCRのために各試料に油を積
層し、94℃に５分間加熱して核酸を変性させた；次いで
30サイクルのPCRを下記のサイクルパラメーターにより
実施した:94℃で１分、55℃で１分、72℃で２分。反応
混合物中に鋳型cDNAが存在しない陰性対照を各バッチに
つきルーティンに試験した。ヒトCD44 cDNAにつき公表
された配列からの情報（ホフマン（Hoffmann）ら,199
1、スタメンコビック（Stamenkovic）ら,1991、ジャク
ソン（Jackson）ら,1992）（図６）を利用して本発明者
らが作成したプライマーおよびプローブの配列は下記の
とおりであった： P1はその起点が標準CD44分子中の挿入部位から324bp
上流に位置し（スタメンコビック（Stamenkovic）ら（1
989）が公表した配列中のヌクレオチド782と783の
間）、P4はこの部位の158bp下流にある。これらのプラ
イマーは、試料が標準CD44（いわゆる造血性CD44）を発
現する場合は482bpのPCRフラグメントを産生し、試料が
選択的スプライシングされた転写体を含む場合は上皮形
CD44に関する878bpを産生する。各PCR産物10μｌを1.2
％アガロースゲル中で電気泳動し、オリゴヌクレオチド
プローブE4（＝５′TGAGATTGGGTTGAAGAAATC−３′）
（図６参照）とのハイブリダイゼーションのためにハイ
ボンド（Hybond）N+（アメルシャムUK、英国リトルシャ
ルフォント）ナイロン膜に移した。検出感度および解像
度を向上させるために、ブロッティングおよびオートラ
ジオグラフィーを実施した。プローブをポリヌクレオチ
ドキナーゼの存在下にy32P−ATPで放射性標識した。プ
レハイブリダイゼーション後に、10％デキストラン、６
×NET、５×デンハルト液、0.5％NP40、および100μg/m
lサケ精子DNA中で42℃において一夜、ハイブリダイゼー
ションを実施した。次いでフィルターを２回、２×SS
C、１×SSC、および0.5％SSC−−0.1％SDS含有−−中で
42℃において順次15分ずつ洗浄した。フィルターをコダ
ックＸ線フィルムに２−16時間露光した。次いでプロー
ブをストリッピングするためにフィルターを0.5％SDS中
で煮沸し、他の放射性標識プローブ、すなわちCD44の標
準部分（図６）にアニーリングさせるために本発明者ら
が設計したP2（＝５′CCTGAAGAAGATTGTACATCAGTCACAGA
C）と再度ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーシ
ョン、洗浄およびオートラジオグラフィーに用いた条件
は上記と同じであった。
少数の細胞の検出に関して、この方法の感度の検量を
下記により実施した：全末梢血白血球（PBL）を20mlの
全血から、充填赤血球を塩化アンモニウム緩衝液（細胞
溶解用緩衝液50mlに対し充填細胞1ml）の添加により溶
解し、次いで15分後に遠心分離することにより精製し
た。HT29結腸癌細胞の懸濁液（5000細胞/ml）それぞれ
０μｌ、１μｌ、10μｌおよび100μｌを接種した４本
の試験管中に、この白血球ペレットを分配した。次いで
全RNAを抽出し、各試験管から約20μｇを得た。アリコ
ートの試料当たりそれぞれ０、１、10および100の腫瘍
細胞を表す、各試験管から得た４μｇアリコートのRAN
につき、前記に従ってcDNA合成を行った。これらの試料
ならびに陽性対照（腫瘍細胞のみ）および陰性対照（DA
Nなし）につき、図６のエキソン７および14に特異的に
アニーリングさせるために本発明者らが設計したプライ
マーD1およびD5を用いて、PCRを実施した。HT29細胞が
両エキソンその他をPBLから容易に区別しうるパターン
で発現することは従来の研究から知られており、本発明
者らは増幅すべきセグメントを短縮することによって感
度を高めたいので、オリゴヌクレオチドプライマーD1お
よびD5を選んだ。これらの大部分は上記遺伝子の標準部
分にアニーリングされることにより吸収されるので、こ
れらのプライマーを用いるとこの特定の目的にプリアマ
ーP1およびP4を用いる問題が回避されることもその理由
であった。PCRサイクルパラメーター、ブロッティン
グ、プロービングおよび洗浄の条件は前記と同様であっ
た。プロービングに用いたオリゴヌクレオチド配列は32
P標識E4であった。
下記により実施した：全末梢血白血球（PBL）を20mlの
全血から、充填赤血球を塩化アンモニウム緩衝液（細胞
溶解用緩衝液50mlに対し充填細胞1ml）の添加により溶
解し、次いで15分後に遠心分離することにより精製し
た。HT29結腸癌細胞の懸濁液（5000細胞/ml）それぞれ
０μｌ、１μｌ、10μｌおよび100μｌを接種した４本
の試験管中に、この白血球ペレットを分配した。次いで
全RNAを抽出し、各試験管から約20μｇを得た。アリコ
ートの試料当たりそれぞれ０、１、10および100の腫瘍
細胞を表す、各試験管から得た４μｇアリコートのRAN
につき、前記に従ってcDNA合成を行った。これらの試料
ならびに陽性対照（腫瘍細胞のみ）および陰性対照（DA
Nなし）につき、図６のエキソン７および14に特異的に
アニーリングさせるために本発明者らが設計したプライ
マーD1およびD5を用いて、PCRを実施した。HT29細胞が
両エキソンその他をPBLから容易に区別しうるパターン
で発現することは従来の研究から知られており、本発明
者らは増幅すべきセグメントを短縮することによって感
度を高めたいので、オリゴヌクレオチドプライマーD1お
よびD5を選んだ。これらの大部分は上記遺伝子の標準部
分にアニーリングされることにより吸収されるので、こ
れらのプライマーを用いるとこの特定の目的にプリアマ
ーP1およびP4を用いる問題が回避されることもその理由
であった。PCRサイクルパラメーター、ブロッティン
グ、プロービングおよび洗浄の条件は前記と同様であっ
た。プロービングに用いたオリゴヌクレオチド配列は32
P標識E4であった。
結果の全般的概観 プライマー（P1およびP4）はスプライス産物挿入部位
を越えて増幅するので、付加的なエキソンドメインから
の転写体を含む選択的スプライスされた変異型のほかに
標準分子の介在部分も増幅されることは明らかである。
従って標準形態に対するプローブ（たとえばP2）を用い
て検出されると考えられる産物の総数は、この遺伝子座
から同定される配列の可能な組み合わせすべてを考慮す
ると、大きい。プローブE4を用いると、16のこれらの組
み合わせ、すなわちエキソン11からのE4転写体を含むも
のを、電気泳動により分離された異なる分子サイズのバ
ンドとして視覚化しうる。実際には可能な組み合わせの
全範囲がこれらの結果において検出されたわけではな
く、数種類（最高９）の選択的スプライス変異型が各プ
ローブとハイブリダイズした状態で新生物形成組織中に
見られた。乳房、結腸およびリンパ節からの正常な組織
は、実際に幾つかのE4含有転写体（図１および３）を標
準分子（図２および４）のほかに発現したが、末梢血リ
ンパ球（図５）および肝臓（図４）はこの組み合わせの
プローブおよびプライマーで後者のみを検出可能な状態
で発現した。詳細を以下に提示する： 実施例１ 乳房組織試料 乳房組織試料の研究において得られた結果を図１およ
び２に示す。すべての症例からの転移性腫瘍沈着物およ
びそれらの対応する原発性腫瘍は、エキソン11からの転
写体を含有する数種類の選択的スプライス産物を過剰発
現した（図1a）。すべての腫瘍に存在する1500bpおよび
1650bpの一致した二重項と共に、少なくとも８つの分離
したバンドがしばしば見られた。正常な乳房組織および
正常なリンパ節はこのプローブにより２つのバンド（11
50bpおよび860bp）を形成した。正常な試料には上記の
二重項は見られなかった。
を越えて増幅するので、付加的なエキソンドメインから
の転写体を含む選択的スプライスされた変異型のほかに
標準分子の介在部分も増幅されることは明らかである。
従って標準形態に対するプローブ（たとえばP2）を用い
て検出されると考えられる産物の総数は、この遺伝子座
から同定される配列の可能な組み合わせすべてを考慮す
ると、大きい。プローブE4を用いると、16のこれらの組
み合わせ、すなわちエキソン11からのE4転写体を含むも
のを、電気泳動により分離された異なる分子サイズのバ
ンドとして視覚化しうる。実際には可能な組み合わせの
全範囲がこれらの結果において検出されたわけではな
く、数種類（最高９）の選択的スプライス変異型が各プ
ローブとハイブリダイズした状態で新生物形成組織中に
見られた。乳房、結腸およびリンパ節からの正常な組織
は、実際に幾つかのE4含有転写体（図１および３）を標
準分子（図２および４）のほかに発現したが、末梢血リ
ンパ球（図５）および肝臓（図４）はこの組み合わせの
プローブおよびプライマーで後者のみを検出可能な状態
で発現した。詳細を以下に提示する： 実施例１ 乳房組織試料 乳房組織試料の研究において得られた結果を図１およ
び２に示す。すべての症例からの転移性腫瘍沈着物およ
びそれらの対応する原発性腫瘍は、エキソン11からの転
写体を含有する数種類の選択的スプライス産物を過剰発
現した（図1a）。すべての腫瘍に存在する1500bpおよび
1650bpの一致した二重項と共に、少なくとも８つの分離
したバンドがしばしば見られた。正常な乳房組織および
正常なリンパ節はこのプローブにより２つのバンド（11
50bpおよび860bp）を形成した。正常な試料には上記の
二重項は見られなかった。
結合プローブからのバンドの数およびサイズならびに
シグナル強度の差は、検査したすべての試料において、
正常カテゴリーと悪性カテゴリーの間で明瞭であった。
明瞭な差を見るためにより長期間フィルターをＸ線フィ
ルムに露光する必要のある試料が時折りあったが、この
所見はいずれの症例においても確認された。
シグナル強度の差は、検査したすべての試料において、
正常カテゴリーと悪性カテゴリーの間で明瞭であった。
明瞭な差を見るためにより長期間フィルターをＸ線フィ
ルムに露光する必要のある試料が時折りあったが、この
所見はいずれの症例においても確認された。
転移の臨床証拠を伴わない局所湿潤性腫瘍からの、お
よび２例の線維腺腫からの試料も、正常組織と比較して
エキソン10/11からの転写体を含むスプライス産物を過
剰発現したが、これの程度は悪性腫瘍およびそれらの転
移体につき得られた結果と容易に区別された。正常組織
に見られるパターンとの区別も容易であった（図1b）。
しかし１試料は悪性腫瘍と類似の結果を与えた（列14）
（下記参照）。２例の線維腺腫は非転移性癌からのもの
と類似のバンドパターンを示し、乳房の嚢胞性疾患（cy
stic desease）の症例からの試料は正常な非−新生物形
成乳房組織についてのパターンに類似していた。これが
本方法による確実な診断の最初の例である。この組織片
は、肉眼による初期検査に際しての巨視的概観では良性
腫瘍、すなわち線維腺腫からのものであるとして、勤務
病理学者により提供された。次いでそれのcDNAのPCR増
幅後に確実に非−新生物形成であることが解明され、そ
の後の組織鏡検によりこれが確認された。
よび２例の線維腺腫からの試料も、正常組織と比較して
エキソン10/11からの転写体を含むスプライス産物を過
剰発現したが、これの程度は悪性腫瘍およびそれらの転
移体につき得られた結果と容易に区別された。正常組織
に見られるパターンとの区別も容易であった（図1b）。
しかし１試料は悪性腫瘍と類似の結果を与えた（列14）
（下記参照）。２例の線維腺腫は非転移性癌からのもの
と類似のバンドパターンを示し、乳房の嚢胞性疾患（cy
stic desease）の症例からの試料は正常な非−新生物形
成乳房組織についてのパターンに類似していた。これが
本方法による確実な診断の最初の例である。この組織片
は、肉眼による初期検査に際しての巨視的概観では良性
腫瘍、すなわち線維腺腫からのものであるとして、勤務
病理学者により提供された。次いでそれのcDNAのPCR増
幅後に確実に非−新生物形成であることが解明され、そ
の後の組織鏡検によりこれが確認された。
プローブE4を用いた場合に見られた差が有効であっ
て、技術的人工産物ではないことを確認するために、上
記と同一のフィルターをプローブP2とハイブリダイズさ
せた場合に得られた結果を図２に示す。これは、ｉ）検
査したすべての組織が標準型の遺伝子を発現したこと、
ii）エキソン10/11からの転写体を含まない他のエキソ
ンスプライス産物が腫瘍および転移体に存在したこと、
ならびにiii）上記の差はこの複合フィルターの種々の
パネルおよび列のトラックの装填が不均一だったことに
よるものではなく、選択的スプライシングによるもので
あることを示す。この実験の条件は、Ｘ線フィルムに対
するフィルターの露光時間（図１については10時間、こ
れに対し図３については1.5時間）以外はすべてE4との
ハイブリダイゼーションの場合と同じであった。
て、技術的人工産物ではないことを確認するために、上
記と同一のフィルターをプローブP2とハイブリダイズさ
せた場合に得られた結果を図２に示す。これは、ｉ）検
査したすべての組織が標準型の遺伝子を発現したこと、
ii）エキソン10/11からの転写体を含まない他のエキソ
ンスプライス産物が腫瘍および転移体に存在したこと、
ならびにiii）上記の差はこの複合フィルターの種々の
パネルおよび列のトラックの装填が不均一だったことに
よるものではなく、選択的スプライシングによるもので
あることを示す。この実験の条件は、Ｘ線フィルムに対
するフィルターの露光時間（図１については10時間、こ
れに対し図３については1.5時間）以外はすべてE4との
ハイブリダイゼーションの場合と同じであった。
実施例２ 結腸試料 結腸癌における所見は乳癌の場合と等しかった。たと
えばすべての症例において結晶癌組織はプローブE4につ
き（図３）正常な結晶粘膜その他の正常組織より強く標
識された、より大きな分子量のバンドをより多数示し
た。乳癌の場合と同様に、プローブP2とのハイブリダイ
ゼーションは標準形の分子（図４）と発現程度の差を示
さなかった。
えばすべての症例において結晶癌組織はプローブE4につ
き（図３）正常な結晶粘膜その他の正常組織より強く標
識された、より大きな分子量のバンドをより多数示し
た。乳癌の場合と同様に、プローブP2とのハイブリダイ
ゼーションは標準形の分子（図４）と発現程度の差を示
さなかった。
実施例３ 本発明の感度の検量 既知数のHT29結腸癌細胞を接種した末梢血白血球のPC
R産物のオートラジオグラムの検査は、白血球107個の試
料中に腫瘍細胞10個の水準に減少するまで、腫瘍細胞に
特徴的な付加的バンドの存在を示した。アッセイの条件
を微細に調整することにより、10mlの血液中に１個の腫
瘍細胞を検出することが可能であると考えられる。
R産物のオートラジオグラムの検査は、白血球107個の試
料中に腫瘍細胞10個の水準に減少するまで、腫瘍細胞に
特徴的な付加的バンドの存在を示した。アッセイの条件
を微細に調整することにより、10mlの血液中に１個の腫
瘍細胞を検出することが可能であると考えられる。
上記のシリーズにおいて、新生物形成組織の試料はす
べてCD44遺伝子の選択的スプライス産物の過剰発現を示
し、非−新生物形成組織からの試料はいずれもそれらを
示さなかった。従って正常な試料および新生物由来の試
料とCD44発現パターンとの間には完全な対応があった。
一例においては、現時点では転移の臨床証拠を伴わない
患者（患者B16、図1Aの列14）から摘出した腫瘍が、転
移の可能性を示す発現のパターンをもつことが見出され
た。現在はこれが偽陽性の結果であるか、または差し迫
った転移の徴候であるかを知ることはできない。この患
者は現在、追跡病院で観察されている。
べてCD44遺伝子の選択的スプライス産物の過剰発現を示
し、非−新生物形成組織からの試料はいずれもそれらを
示さなかった。従って正常な試料および新生物由来の試
料とCD44発現パターンとの間には完全な対応があった。
一例においては、現時点では転移の臨床証拠を伴わない
患者（患者B16、図1Aの列14）から摘出した腫瘍が、転
移の可能性を示す発現のパターンをもつことが見出され
た。現在はこれが偽陽性の結果であるか、または差し迫
った転移の徴候であるかを知ることはできない。この患
者は現在、追跡病院で観察されている。
実施例４ 本発明者らは、本発明者らの知見に従って下記のオリ
ゴヌクレオチドプライマーを設計し、合成した：− 標準部分につき（スタメンコビック（Stamenkovic）,19
89） エキソンにつき（ホフマン（Hofmann）,1991）。E1お
よびE2はエキソン６上にある。
ゴヌクレオチドプライマーを設計し、合成した：− 標準部分につき（スタメンコビック（Stamenkovic）,19
89） エキソンにつき（ホフマン（Hofmann）,1991）。E1お
よびE2はエキソン６上にある。
直径0.5−1cmの新鮮な組織試料を外科切除検体から、
または剖検に際して得た。この研究に用いた試料はすべ
て、診断用試料を採取したのちに残る、他の場合には廃
棄されていた組織残屑から得られた。試料を病理検体受
付区域に到着して10分以内に液体窒素中で瞬間凍結し、
使用時まで液体窒素中に保存した。cDNAはウイルス逆転
写酵素により５μｇの全細胞RNAを鋳型として用いて合
成され、次いでプライマーP1およびP4を用いてPCR処理
された。PCR増幅、電気泳動およびハイブリダイゼーシ
ョンは標準条件下で実施された。
または剖検に際して得た。この研究に用いた試料はすべ
て、診断用試料を採取したのちに残る、他の場合には廃
棄されていた組織残屑から得られた。試料を病理検体受
付区域に到着して10分以内に液体窒素中で瞬間凍結し、
使用時まで液体窒素中に保存した。cDNAはウイルス逆転
写酵素により５μｇの全細胞RNAを鋳型として用いて合
成され、次いでプライマーP1およびP4を用いてPCR処理
された。PCR増幅、電気泳動およびハイブリダイゼーシ
ョンは標準条件下で実施された。
PCR産物を放射性標識E2またはE4とハイブリダイズさ
せた場合、癌由来のすべての試料が数種類のスプライス
変異型を過剰発現したが、各プローブにつき見られたバ
ンドパターンは異なっていた。従ってエキソン６産物に
対するオリゴヌクレオチドプローブは、新生物形成試料
を非−新生物形成試料と区別する際に極めて有効であ
る。ただし少なくとも固形組織からの試料についてはE4
より著しく感受性が高いわけではないが、散在性の転移
細胞または樹立した転移の由来する器官を検出するのに
は恐らく有用であろう。次いで正常組織を含めすべての
試料がCD44の標準部分を産出することを示すために、同
一フィルターをストリッピングし、P2プローブとハイブ
リダイズさせた。これによりE2およびE4でプローピング
した正常試料と腫瘍試料につき得られた結果の間に見ら
れた差がPCR産物の不均一な装填によるものではないこ
とが確認された。総合的な結果を表３に示す。これはこ
れらの変化が高範囲の一般的に癌に見られることを指示
する。
せた場合、癌由来のすべての試料が数種類のスプライス
変異型を過剰発現したが、各プローブにつき見られたバ
ンドパターンは異なっていた。従ってエキソン６産物に
対するオリゴヌクレオチドプローブは、新生物形成試料
を非−新生物形成試料と区別する際に極めて有効であ
る。ただし少なくとも固形組織からの試料についてはE4
より著しく感受性が高いわけではないが、散在性の転移
細胞または樹立した転移の由来する器官を検出するのに
は恐らく有用であろう。次いで正常組織を含めすべての
試料がCD44の標準部分を産出することを示すために、同
一フィルターをストリッピングし、P2プローブとハイブ
リダイズさせた。これによりE2およびE4でプローピング
した正常試料と腫瘍試料につき得られた結果の間に見ら
れた差がPCR産物の不均一な装填によるものではないこ
とが確認された。総合的な結果を表３に示す。これはこ
れらの変化が高範囲の一般的に癌に見られることを指示
する。
本発明者らは、骨格筋の悪性腫瘍を幾つか検査し、骨
肉種において同様な多重スプライス変異型の著しい過剰
発現のパターンを認めた。
肉種において同様な多重スプライス変異型の著しい過剰
発現のパターンを認めた。
実施例５ 臨床採取した尿試料のPCRアッセイによる癌の診断 各人から自然排泄した尿約50mlを得て、可能な限り速
やかに研究室へ輸送した。90人の患者からの検体を検査
した:44は生検で証明された膀胱癌を伴う患者からのも
の、46は膀胱の非−新生物形成性延焼（膀胱炎）を伴う
患者および正常なボランティアからのもの。十分に撹拌
したのち、各1mlの尿試料を取り出し、細胞学的検査を
行った。試料中の細胞の生存性を判定するために、他の
1mlの尿をフルオレセインジアセテート−臭化エチジウ
ム染色により検査した。残りの尿を2000rpmで10分間遠
心分離し、細胞ペレットを使用時まで−70℃に保持し
た。オリゴdTセルロース錠剤（インビトロジェン）を用
いてmRNA抽出を行った。cDNAはAMV逆転写酵素（インビ
トロジェン）を用いて合成された。完成したcDNA溶液を
２本の試験管に等分した。一方は本発明者らが診断に有
用であることを見出した特定のcDNA転写体を増幅するた
めのE1およびE5によるPCR用であり、他方は内部対照と
しての標準形のCD44（全スプライス変異型を含むもの、
または含まないもの）を増幅するためのP1およびP4によ
るPCR用である。
やかに研究室へ輸送した。90人の患者からの検体を検査
した:44は生検で証明された膀胱癌を伴う患者からのも
の、46は膀胱の非−新生物形成性延焼（膀胱炎）を伴う
患者および正常なボランティアからのもの。十分に撹拌
したのち、各1mlの尿試料を取り出し、細胞学的検査を
行った。試料中の細胞の生存性を判定するために、他の
1mlの尿をフルオレセインジアセテート−臭化エチジウ
ム染色により検査した。残りの尿を2000rpmで10分間遠
心分離し、細胞ペレットを使用時まで−70℃に保持し
た。オリゴdTセルロース錠剤（インビトロジェン）を用
いてmRNA抽出を行った。cDNAはAMV逆転写酵素（インビ
トロジェン）を用いて合成された。完成したcDNA溶液を
２本の試験管に等分した。一方は本発明者らが診断に有
用であることを見出した特定のcDNA転写体を増幅するた
めのE1およびE5によるPCR用であり、他方は内部対照と
しての標準形のCD44（全スプライス変異型を含むもの、
または含まないもの）を増幅するためのP1およびP4によ
るPCR用である。
次いで35サイクルのPCRを実施した。サイクル条件は:
95℃で１分間、55℃で１分間、72℃で２分間であった。
すべての試料につき‘ホットスタート（hot start）’
法を採用した。結果を図８に示す。
95℃で１分間、55℃で１分間、72℃で２分間であった。
すべての試料につき‘ホットスタート（hot start）’
法を採用した。結果を図８に示す。
等容量のPCR産物を、1.2％アガロースゲルの各列に装
填し、臭化エチジウムで染色した。尿中の細胞がエキソ
ン６−エキソン14のすべてのエキソンを発現するはずの
ものであれば、現在のPCRプロトコルによればプライマ
ーE1およびE4を用いて735bpバンドが生成すると予想さ
れた。PCRがプライマーE1およびE5を用いて実施された
場合、正常な尿または非−新生物形成性膀胱炎を伴う患
者の尿からのcDNAを含むトラック（１−８列）にはバン
ドがないが、膀胱癌を伴う患者からの尿試料（９−16
列）にはすべて明瞭な735bpのバンドが見られる（上方
パネル）。
填し、臭化エチジウムで染色した。尿中の細胞がエキソ
ン６−エキソン14のすべてのエキソンを発現するはずの
ものであれば、現在のPCRプロトコルによればプライマ
ーE1およびE4を用いて735bpバンドが生成すると予想さ
れた。PCRがプライマーE1およびE5を用いて実施された
場合、正常な尿または非−新生物形成性膀胱炎を伴う患
者の尿からのcDNAを含むトラック（１−８列）にはバン
ドがないが、膀胱癌を伴う患者からの尿試料（９−16
列）にはすべて明瞭な735bpのバンドが見られる（上方
パネル）。
標準形のCD44を表す482bpバンドは、PCRがP1およびP4
を用いて実施された場合、すべての例にほとんど等しく
得られた（下方パネル）。これは、膀胱癌を伴う患者か
らの尿と対照からのものと間の診断上重要な相異は、ト
ラックの不均一な装填によってではなく、CD44遺伝子の
選択的スプライシングによって生じたものであることを
示す。１−４列：正常な尿。５−８列：膀胱炎の尿。９
−16列：膀胱癌を伴う患者１−８からのもの。
を用いて実施された場合、すべての例にほとんど等しく
得られた（下方パネル）。これは、膀胱癌を伴う患者か
らの尿と対照からのものと間の診断上重要な相異は、ト
ラックの不均一な装填によってではなく、CD44遺伝子の
選択的スプライシングによって生じたものであることを
示す。１−４列：正常な尿。５−８列：膀胱炎の尿。９
−16列：膀胱癌を伴う患者１−８からのもの。
全体的結果において、この735bpのバンドは正常な尿
検体７例中７例および膀胱炎に感染した尿検体９例中に
全く存在しなかった：すなわち偽陽性０％である。同様
に膀胱癌を共う患者からの尿試料19例中14例（74％）が
陽性の結果を示した（すなわち偽陰性26％）。偽陰性試
料の場合、フルオレセイン−ｄアセテート−臭化エチジ
ウム染色により示されるように、生存癌細胞が不足して
いた。
検体７例中７例および膀胱炎に感染した尿検体９例中に
全く存在しなかった：すなわち偽陽性０％である。同様
に膀胱癌を共う患者からの尿試料19例中14例（74％）が
陽性の結果を示した（すなわち偽陰性26％）。偽陰性試
料の場合、フルオレセイン−ｄアセテート−臭化エチジ
ウム染色により示されるように、生存癌細胞が不足して
いた。
実施例６ 12人の患者からの便を本明細書に記載した方法でアッ
セイした。結腸直腸癌を伴う患者９人からの試料のうち
５例は陽性の結果を与えた。正常な患者３人からの試料
のうち３例すべてが陰性の結果を与えた。予備処理して
いない、最近に満ちた試料から得たこれらの様子は、実
行可能な診断アッセイ法を容易に開発しうるであろうと
いう信念を助成する。
セイした。結腸直腸癌を伴う患者９人からの試料のうち
５例は陽性の結果を与えた。正常な患者３人からの試料
のうち３例すべてが陰性の結果を与えた。予備処理して
いない、最近に満ちた試料から得たこれらの様子は、実
行可能な診断アッセイ法を容易に開発しうるであろうと
いう信念を助成する。
この方法で腫瘍細胞を検出するための本発明者らによ
る他の経験において、下記の所見はその診断能を調べる
他の人々にとって有用であろう。認識すべき主な考慮点
は、結果の信頼性および再現性は試料から得られるmRNA
の品質およびこれらの技術を実施する際の配慮に著しく
依存するということである。主な要件は、確実に高品質
のmRNAをルーティンに得ることにより、かつPCR増幅工
程の監視のために反応毎に内部標準品を用いることによ
り、偽陰性の結果を排除することである。偽陽性は、さ
ほど頻度が高くないことを前提として著しい問題ではな
い。それらは同一または他の試料についてのレプリカア
ッセイにより、かつ他の臨床データを参照して、認識し
うるからである。
る他の経験において、下記の所見はその診断能を調べる
他の人々にとって有用であろう。認識すべき主な考慮点
は、結果の信頼性および再現性は試料から得られるmRNA
の品質およびこれらの技術を実施する際の配慮に著しく
依存するということである。主な要件は、確実に高品質
のmRNAをルーティンに得ることにより、かつPCR増幅工
程の監視のために反応毎に内部標準品を用いることによ
り、偽陰性の結果を排除することである。偽陽性は、さ
ほど頻度が高くないことを前提として著しい問題ではな
い。それらは同一または他の試料についてのレプリカア
ッセイにより、かつ他の臨床データを参照して、認識し
うるからである。
本発明者らは、腫瘍細胞を含有する少量の臨床試料に
おいて異常なCD44遺伝子活性のルーティンRT−PCR検出
を保証するために必要な方法を探査した。組織試料をア
リコートに分割し、その半分を直ちに液体窒素中で凍結
させ、その残りを周囲温度に放置した場合、CD44スプラ
イス変異型の検出能が経時的に、また検出取り扱い様式
によって、どのように低下するかを示すことができる。
切除後、半時間以内にmRNA抽出処理がなされた新鮮な試
料は極めて信頼性のある結果を与え、新鮮な組織を周囲
温度に放置した場合はその後の数時間にわたって徐々に
品質が低下する。試料をまず瞬間凍結した場合、解凍後
直ちにRNAを抽出した際に得られた結果は満足すべきも
のであるが、15分以内から始まって極めて急速に低下
し、大きい方の変異型転写体が最初に喪失し、最終的に
は標準形ですら喪失する。瞬間凍結した細胞および組織
の試料を−70℃に保存した場合、４週間後には解凍後直
ちにmRNAを抽出したものとしても結果は低下するという
ことも認められた。従って凍結に際して捕獲された細胞
から放出されるリボヌクレアーゼによるRNA分解は、よ
り遅い速度ではあるがこの温度においてすら継続してい
ると思われる。さらに予想されるように、RNA抽出のた
めに採取した試料が壊死または線維症の領域からのもの
である場合、生存性腫瘍組織につき見られた典型的な結
果は得られない。従って信頼性のあるデータを得るため
には、試料の選択および検体の処理に際して共に配慮を
要する。
おいて異常なCD44遺伝子活性のルーティンRT−PCR検出
を保証するために必要な方法を探査した。組織試料をア
リコートに分割し、その半分を直ちに液体窒素中で凍結
させ、その残りを周囲温度に放置した場合、CD44スプラ
イス変異型の検出能が経時的に、また検出取り扱い様式
によって、どのように低下するかを示すことができる。
切除後、半時間以内にmRNA抽出処理がなされた新鮮な試
料は極めて信頼性のある結果を与え、新鮮な組織を周囲
温度に放置した場合はその後の数時間にわたって徐々に
品質が低下する。試料をまず瞬間凍結した場合、解凍後
直ちにRNAを抽出した際に得られた結果は満足すべきも
のであるが、15分以内から始まって極めて急速に低下
し、大きい方の変異型転写体が最初に喪失し、最終的に
は標準形ですら喪失する。瞬間凍結した細胞および組織
の試料を−70℃に保存した場合、４週間後には解凍後直
ちにmRNAを抽出したものとしても結果は低下するという
ことも認められた。従って凍結に際して捕獲された細胞
から放出されるリボヌクレアーゼによるRNA分解は、よ
り遅い速度ではあるがこの温度においてすら継続してい
ると思われる。さらに予想されるように、RNA抽出のた
めに採取した試料が壊死または線維症の領域からのもの
である場合、生存性腫瘍組織につき見られた典型的な結
果は得られない。従って信頼性のあるデータを得るため
には、試料の選択および検体の処理に際して共に配慮を
要する。
このことからみて、新鮮な試料を凍結するか、または
mRNA抽出のために処理するまで、24時間を越えて保持し
ないこと；かつ解凍試料をmRNA抽出のために処理するま
で、２時間を越えて保持しないことが好ましい。
mRNA抽出のために処理するまで、24時間を越えて保持し
ないこと；かつ解凍試料をmRNA抽出のために処理するま
で、２時間を越えて保持しないことが好ましい。
本明細書に記載する診断法は、１日以内に、恐らく数
時間以内に実施することができ、かつ自動化することが
できる。本方法の採用により種々の試料につきあらゆる
種類の癌を検出することが証明され、血液および尿試料
についても証明された。従って本発明者らはこれを癌の
スクリーニングおよび診断のための実用的方法として提
供する。原則としてこれは癌の検出および予防プログラ
ムに幅広い一般的用途をもち、従って疫学および公衆衛
生において有用である。その感度、特異性および簡易性
の適切な利用は、癌の初期診断のみでなく、身体の疾病
の程度の評価、治療効果の判定、および腫瘍再発の早期
検出をも高める。
時間以内に実施することができ、かつ自動化することが
できる。本方法の採用により種々の試料につきあらゆる
種類の癌を検出することが証明され、血液および尿試料
についても証明された。従って本発明者らはこれを癌の
スクリーニングおよび診断のための実用的方法として提
供する。原則としてこれは癌の検出および予防プログラ
ムに幅広い一般的用途をもち、従って疫学および公衆衛
生において有用である。その感度、特異性および簡易性
の適切な利用は、癌の初期診断のみでなく、身体の疾病
の程度の評価、治療効果の判定、および腫瘍再発の早期
検出をも高める。
図面の説明： 略号:N＝正常、Ｔ＝原発性腫瘍、Ｍ＝転移 図１ E4でプロービングした乳房組織試料からのPCR産物の
オートラジオグラム（Ｘ線フィルムを試料フィルターに
10時間露光）。パネルA:転移を伴う悪性原発生乳癌。ト
ラック１、２および3:患者1;トラック４、５および6:患
者B2B;トラック７、８および9:患者B3;トラック10およ
び11:患者B4;トラック12および13:患者B5。正常な乳房
組織と比較して、原発性乳癌およびそれらの転移沈着物
は数種類のスプライス変異型を過剰発現することが認め
られる。1500bpおよび1650bpの二重項（矢印）がトラッ
ク５に最も良く見える点に注目されたい。これはすべて
の腫瘍および転移体に存在するが、他のトラックにおい
てはこの露光時間ではかぶりを生じている。これは正常
な試料においてはいずれも、より長い露光時間（23時
間）ですら検出されない。パネルB:転移の臨床証拠を伴
わない乳癌。トラック14−20は患者B15−21からのもの
である。これらの腫瘍はすべて数種類の変異型を過剰発
現するが、トラック16（患者B17）以外はバンドがより
少なく、かつシグナル強度がより低い−本文参照。1500
/1650bp二重項（矢印）は、この露光時間ではトラック1
5、16および18において容易に認められ、より長期間露
光すると腫瘍を含む他のトラックすべてにおいて検出可
能となった。しかしこの図は、より強いシグナルを示す
トラックのかぶりを避けるために短い露光時間のみを示
す。パネルC:乳房の線維腺腫および線維嚢胞疾患。良性
腫瘍試料（試料B22および23）を含むトラック21および2
2は、トラック23（試料B24）の非−新生物形成試料（線
維性嚢胞疾患）より多く発現する。
オートラジオグラム（Ｘ線フィルムを試料フィルターに
10時間露光）。パネルA:転移を伴う悪性原発生乳癌。ト
ラック１、２および3:患者1;トラック４、５および6:患
者B2B;トラック７、８および9:患者B3;トラック10およ
び11:患者B4;トラック12および13:患者B5。正常な乳房
組織と比較して、原発性乳癌およびそれらの転移沈着物
は数種類のスプライス変異型を過剰発現することが認め
られる。1500bpおよび1650bpの二重項（矢印）がトラッ
ク５に最も良く見える点に注目されたい。これはすべて
の腫瘍および転移体に存在するが、他のトラックにおい
てはこの露光時間ではかぶりを生じている。これは正常
な試料においてはいずれも、より長い露光時間（23時
間）ですら検出されない。パネルB:転移の臨床証拠を伴
わない乳癌。トラック14−20は患者B15−21からのもの
である。これらの腫瘍はすべて数種類の変異型を過剰発
現するが、トラック16（患者B17）以外はバンドがより
少なく、かつシグナル強度がより低い−本文参照。1500
/1650bp二重項（矢印）は、この露光時間ではトラック1
5、16および18において容易に認められ、より長期間露
光すると腫瘍を含む他のトラックすべてにおいて検出可
能となった。しかしこの図は、より強いシグナルを示す
トラックのかぶりを避けるために短い露光時間のみを示
す。パネルC:乳房の線維腺腫および線維嚢胞疾患。良性
腫瘍試料（試料B22および23）を含むトラック21および2
2は、トラック23（試料B24）の非−新生物形成試料（線
維性嚢胞疾患）より多く発現する。
図２ P2でプローピングした乳房組織試料からのPCR産物の
オートラジオグラム（Ｘ線フィルムを試料フィルターに
1.5時間露光）。この結果は、図１で用いたものと同一
フィルターを、ストリッピングにより先のプローブの除
去後に再プロービングすることにより得られた。この場
合、下記のことが認められる:i）図１で見られた相異は
トラックの不均一な装填によるものではない、ii）標準
形の分子の発現は他のいずれの変異型のものより量的に
多い、iii）標準形は検査したすべての組織において発
現する、およびiv）腫瘍においてはエキソン３転写体を
含まない他の変異型も存在し、過剰発現する。1500/165
0bp二重項はパネルＡの腫瘍においては認められるが、
パネルＢおよびＣにおいて検出可能であるためにはより
長期間の露光を必要とした。
オートラジオグラム（Ｘ線フィルムを試料フィルターに
1.5時間露光）。この結果は、図１で用いたものと同一
フィルターを、ストリッピングにより先のプローブの除
去後に再プロービングすることにより得られた。この場
合、下記のことが認められる:i）図１で見られた相異は
トラックの不均一な装填によるものではない、ii）標準
形の分子の発現は他のいずれの変異型のものより量的に
多い、iii）標準形は検査したすべての組織において発
現する、およびiv）腫瘍においてはエキソン３転写体を
含まない他の変異型も存在し、過剰発現する。1500/165
0bp二重項はパネルＡの腫瘍においては認められるが、
パネルＢおよびＣにおいて検出可能であるためにはより
長期間の露光を必要とした。
図３ E4でプロービングした結腸組織試料からのPCR産物の
オートラジオグラム（写真フィルムを試料フィルターに
10時間露光）。トラック１、２および3:患者C1;トラッ
ク４、５および6:患者C2;トラック７、８および9:患者C
3;トラック10および11:患者C4;トラック12および13:患
者C5;トラック14:正常な肝臓試料。この写真は図１の説
明に記載したものと同じ特色を示し、これらの所見が結
腸癌にも適用されることを示す。1500/1650bp二重項
（矢印）は、数個のトラック（２および８−12）に容易
に認められ、トラック３、５、６および13の対応する位
置におけるかすかなシグナルは、より長期間露光する
と、より強くなった。しかしトラック１、４、７または
14（正常組織）においてはこの付近に何も現れなかっ
た。
オートラジオグラム（写真フィルムを試料フィルターに
10時間露光）。トラック１、２および3:患者C1;トラッ
ク４、５および6:患者C2;トラック７、８および9:患者C
3;トラック10および11:患者C4;トラック12および13:患
者C5;トラック14:正常な肝臓試料。この写真は図１の説
明に記載したものと同じ特色を示し、これらの所見が結
腸癌にも適用されることを示す。1500/1650bp二重項
（矢印）は、数個のトラック（２および８−12）に容易
に認められ、トラック３、５、６および13の対応する位
置におけるかすかなシグナルは、より長期間露光する
と、より強くなった。しかしトラック１、４、７または
14（正常組織）においてはこの付近に何も現れなかっ
た。
図４ P2でプローピングした結腸組織試料からのPCR産物の
オートラジオグラム（写真フィルムを試料フィルターに
1.5時間露光）。これはトラック装填が等しいこと、お
よび図２に示した他の点が結腸癌に適用されることを確
認する。正常な肝臓が標準形のCD44を発現することに注
目されたい。
オートラジオグラム（写真フィルムを試料フィルターに
1.5時間露光）。これはトラック装填が等しいこと、お
よび図２に示した他の点が結腸癌に適用されることを確
認する。正常な肝臓が標準形のCD44を発現することに注
目されたい。
図５ E4でプローピングした正常な末梢血白血球、PBL（３
人の異なる者）および他の正常な組織のPCR産物のオー
トラジウム（パネルA:写真フィルムを試料フィルターに
８時間露光）およびP2でプロービングしたもの（パネル
B:写真フィルムを試料フィルターに５時間露光）。トラ
ック６は乳癌（患者B1）からのPCR産物を陽性対照とし
て含む。プライマーおよびプローブのこの組み合わせ
で、白血球は標準形のCD44分子を発現するが、検出可能
なスプライス変異型を発現しないことが分かる。トラッ
ク４および５の試料は下記のように新生物形成の臨床証
拠を伴わない固体からのものであった：トラック４、細
菌性心内膜炎で死亡した婦人の身体から剖検に際して得
た乳房組織；トラック５、腸捻転のため切除した結腸。
人の異なる者）および他の正常な組織のPCR産物のオー
トラジウム（パネルA:写真フィルムを試料フィルターに
８時間露光）およびP2でプロービングしたもの（パネル
B:写真フィルムを試料フィルターに５時間露光）。トラ
ック６は乳癌（患者B1）からのPCR産物を陽性対照とし
て含む。プライマーおよびプローブのこの組み合わせ
で、白血球は標準形のCD44分子を発現するが、検出可能
なスプライス変異型を発現しないことが分かる。トラッ
ク４および５の試料は下記のように新生物形成の臨床証
拠を伴わない固体からのものであった：トラック４、細
菌性心内膜炎で死亡した婦人の身体から剖検に際して得
た乳房組織；トラック５、腸捻転のため切除した結腸。
参考文献 1.スタメンコビック、アミオット、ペサンド、シート （Stamenkovic,Amiot M,Pesando J.M,Seed B.） リンパ節ホーミングに関与するリンパ球分子は軟骨連結
蛋白質族の１員である。
蛋白質族の１員である。
Cell 1989;56;1057−062. 2.バーチ、ミッチェル、ハート（Birch M,Mitchell S,H
art I.R.） 高水準および低水準のCD44を発現するヒト黒色腫細胞変
異型の単離および解明。Cancer Res.1991;51:6660−666
7. 3.グンタート、ホフマン、ルディー、レーベル、ゾラ
ー、ハウプマン、マズク、ウェンゼル、ポンタ、ヘルリ
ッヒ （Gunthert U,Hofmann M,Rudy W,Reber S,Zoller M,Hau
Bmann,Matzku S,Wenzel A,Ponta H,Herrlich P.） 糖蛋白質CD44の新変異型がラット癌細胞に転移能力を付
与する。
art I.R.） 高水準および低水準のCD44を発現するヒト黒色腫細胞変
異型の単離および解明。Cancer Res.1991;51:6660−666
7. 3.グンタート、ホフマン、ルディー、レーベル、ゾラ
ー、ハウプマン、マズク、ウェンゼル、ポンタ、ヘルリ
ッヒ （Gunthert U,Hofmann M,Rudy W,Reber S,Zoller M,Hau
Bmann,Matzku S,Wenzel A,Ponta H,Herrlich P.） 糖蛋白質CD44の新変異型がラット癌細胞に転移能力を付
与する。
Cell 1991;65:13−24. 4.サイ、ガオ、スタメンコビック（Sy M S,Guo Y−J,St
amenkovio I.） ２種類のCD44イソ型がインビボで腫瘍の増殖に及ぼす異
なる作用。
amenkovio I.） ２種類のCD44イソ型がインビボで腫瘍の増殖に及ぼす異
なる作用。
J.Exp.Med 1991;174:859−866. 5.ホフマン、ルディー、ゾラー、トルク、ポンタ、ヘル
リッヒ、グンタート （Hofmann M,Rudy W,Zoller M,Tolg C,Ponta H,Herrlic
h P,Gunthert U.） CD44スプライス変異型がラットにおいて転移挙動を付与
する：相同配列がヒト腫瘍細胞系において発現される。
リッヒ、グンタート （Hofmann M,Rudy W,Zoller M,Tolg C,Ponta H,Herrlic
h P,Gunthert U.） CD44スプライス変異型がラットにおいて転移挙動を付与
する：相同配列がヒト腫瘍細胞系において発現される。
Cencer Res.1991;51:5292−5297. 6.スタメンコビック、アルフォ、アミオット、シード （Stamenkovic I,Aruffo A,Amiot M,Seed B.） 造血形と上皮形のCD44は、ヒアルロン酸保有細胞に対す
る異なる付着能力をもつ異なるポリペプチドである。
る異なる付着能力をもつ異なるポリペプチドである。
EMBO J.1991;10:343−348. 7.ジャクソン、バックレイ、ベル（Jackson D.G,Buckle
y J,Bell J.I.） 細胞外ドメイン内の単一部位への挿入により形成された
ヒトリンパ球ホーミング受容体CD44の多数の変異型。
y J,Bell J.I.） 細胞外ドメイン内の単一部位への挿入により形成された
ヒトリンパ球ホーミング受容体CD44の多数の変異型。
J.Biol.Chem.1992;267:4732−4739. 8.コムジンスキー、サッチ（Chomzynski P,Sacchi N.） 酸性グアニジウム チオシアンテート−フェノール−ク
ロロホルム抽出によるRNA単離のための１工程法。
ロロホルム抽出によるRNA単離のための１工程法。
Anal Biochem.1987;162:156. 9.クヌドソン（Knudson A.G.） 遺伝性癌、癌遺伝子および癌抑制遺伝子。
Cancer Res.1985;45:1437−43. 10.タリン（Tarin D.） 腫瘍の転移。
Oxford Textbook of Pathology 1992; （監修者：オドマッギ
ー、ライト、アイザックソン（J O′DMcGee,N.A.Wrigh
t,P.G.Isaacson））オックスフォード・ユニバーシティ
ー・プレス、オックスフォード、p.607−633。
ー、ライト、アイザックソン（J O′DMcGee,N.A.Wrigh
t,P.G.Isaacson））オックスフォード・ユニバーシティ
ー・プレス、オックスフォード、p.607−633。
11.ハイレ、ダーリン、テイラー、タリン （Hayle A.J,Darling D.L,Taylor A.R,Tarin D） 転移性腫瘍細胞系からの全ゲノムDNAを用いる転移能力
のトランスフェクション。Differentiation,1993,印刷
中。
のトランスフェクション。Differentiation,1993,印刷
中。
12.スクリートン、ベル、ジャクソン、コーネリス、ゲ
ルス、およびベル （Screaton G.R.,Bell M.V.,Jackson D.G.,Cornelis F.
B.,Gerth U.,and Bell J.I.） リンパ球ホーミング受容体CD44をコードするDNAのゲノ
ム構造が、少なくとも12の選択的スプライシングされた
エキソンを示す。
ルス、およびベル （Screaton G.R.,Bell M.V.,Jackson D.G.,Cornelis F.
B.,Gerth U.,and Bell J.I.） リンパ球ホーミング受容体CD44をコードするDNAのゲノ
ム構造が、少なくとも12の選択的スプライシングされた
エキソンを示す。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol 899,p 12160−4,1991年12
月、免疫学。
月、免疫学。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９２ ２６ １６５．０ (32)優先日 1992年12月16日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） 前置審査 (56)参考文献 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖ ｏｌ．51（1991）Ｐ．5292−5297 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 267，Ｎｏ．７（1992．Ｍａｒ）Ｐ. 4732−4739
Claims (4)
- 【請求項１】非培養細胞から得られた試料中の新生物形
成を検出する方法であって、試料中のmRNAからcDNAを作
成して、 CD44遺伝子またはその一部に対応する部分のcDNAを増幅
し、そして増幅されたcDNAを検出する ことにより、CD44遺伝子またはその一部の過剰発現産物
に関して試料を分析する、上記検出方法。 - 【請求項２】CD44遺伝子がCD44遺伝子のエキソン６であ
る、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】CD44のエキソン６の核酸配列： またはその対立遺伝子変異体からなる核酸断片、または
少なくとも20ヌクレオチドを含むその部分断片、 あるいはそれらに完全に相補な核酸断片。 - 【請求項４】E1: またはE2: である、オリゴヌクレオチド。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB929215498A GB9215498D0 (en) | 1992-07-21 | 1992-07-21 | Diagnostic method |
| GB9224386.4 | 1992-11-20 | ||
| GB929224386A GB9224386D0 (en) | 1992-11-20 | 1992-11-20 | Nucleic acid sequence |
| GB9215498.8 | 1992-12-16 | ||
| GB9226165.0 | 1992-12-16 | ||
| GB929226165A GB9226165D0 (en) | 1992-12-16 | 1992-12-16 | Nucleic acid sequence |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08500731A JPH08500731A (ja) | 1996-01-30 |
| JP2800850B2 true JP2800850B2 (ja) | 1998-09-21 |
Family
ID=27266293
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6504278A Expired - Lifetime JP2800850B2 (ja) | 1992-07-21 | 1993-07-20 | 新生物形成の検出方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0651822B1 (ja) |
| JP (1) | JP2800850B2 (ja) |
| AT (1) | ATE136940T1 (ja) |
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| WO (1) | WO1994002633A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| EP0767379A1 (de) * | 1993-06-22 | 1997-04-09 | BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH | Verfahren zur Diagnose und Analyse von Kolonkarzinomen |
| GB9317139D0 (en) * | 1993-08-18 | 1993-10-06 | Miniser For Agriculture Fisher | Method and test kits for detection of bacteriophage |
| DE4431297A1 (de) * | 1994-09-02 | 1996-03-07 | Boehringer Ingelheim Int | Monoklonaler Antikörper gegen CD44v6 |
| CA2195404A1 (en) * | 1994-07-21 | 1996-02-08 | David Tarin | Diagnostic method and probe |
| DE19545472A1 (de) * | 1995-12-06 | 1997-06-12 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur Diagnose und Therapie von Plattenepithelkarzinomen |
| DE19653607A1 (de) | 1996-12-20 | 1998-06-25 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur Diagnose und Therapie von Hodgkin-Lymphomen |
| WO1999004036A1 (en) * | 1997-07-14 | 1999-01-28 | Isis Innovation Limited | Cd44 based cancer detection |
| US20030170637A1 (en) * | 2002-03-06 | 2003-09-11 | Pirrung Michael C. | Method of analyzing mRNA splice variants |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4014510A1 (de) * | 1990-05-07 | 1991-11-14 | Kernforschungsz Karlsruhe | Variante cd44-oberflaechenproteine, diese kodierende c-dna-sequenzen, antikoerper gegen diese proteine sowie ihre verwendung in der diagnostik und therapie |
| JPH06504186A (ja) * | 1990-07-13 | 1994-05-19 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | Ｃｄ５３細胞表面抗原とその使用 |
-
1993
- 1993-07-20 US US08/373,284 patent/US5830646A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-20 JP JP6504278A patent/JP2800850B2/ja not_active Expired - Lifetime
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- 1993-07-20 WO PCT/GB1993/001520 patent/WO1994002633A1/en not_active Ceased
- 1993-07-20 AT AT93916109T patent/ATE136940T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-20 DE DE69302276T patent/DE69302276T2/de not_active Revoked
Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５１（１９９１）Ｐ．５２９２−５２９７ |
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６７，Ｎｏ．７（１９９２．Ｍａｒ）Ｐ．４７３２−４７３９ |
Also Published As
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|---|---|
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| JPH08500731A (ja) | 1996-01-30 |
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