JP2813342B2 - 光学活性３−ヒドロキシピロリジン誘導体の製造法 - Google Patents
光学活性３−ヒドロキシピロリジン誘導体の製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般式［Ｉ］
【０００２】
【化５】
【０００３】（式中、Ｘは水素あるいは炭素数１〜１７
の置換又は未置換アルキル基、アルケニル基を示す。）
で示される（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ア
シロキシピロリジン混合物を立体選択的に加水分解し
て、一般式［II］ 【０００４】 【化６】 【０００５】で示される光学活性な（Ｓ）−Ｎ−ベンジ
ル−３−ヒドロキシピロリジンを生成させる立体選択的
エステラーゼ活性を有し、リゾップス属、フィコマイセ
ス属に属する微生物を、あるいは該微生物由来の立体選
択的エステラーゼ酵素を一般式［Ｉ］で示される（Ｒ）
および（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジ
ン混合物に作用させ、光学活性な（Ｓ）−Ｎ−ベンジル
−３−ヒドロキシピロリジン［II］と、これと立体的に
対掌な一般式［Ｉ′］ 【０００６】 【化７】 【０００７】（式中、Ｘは前記と同じ）で示される光学
活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジ
ンとに光学分割して、夫々の光学活性化合物を分離採取
することを特徴とする光学活性な（Ｓ）−Ｎ−ベンジル
−３−ヒドロキシピロリジン及びその対掌体の光学活性
な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンの
製造法に関する。 【０００８】本発明によって製造される光学活性な
（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジン及び
（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンは医
薬、農薬等の有用な合成中間体である。 【０００９】 【従来の技術】光学活性（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒ
ドロキシピロリジンの製法に関しては、Ｌ−リンゴ酸を
原料として合成する方法（特開昭６１−６３６５２号公
報）が知られているが、一部ラセミ化するため、これを
更にＤ−マンデル酸にて光学分割を行ない光学純度を向
上させる必要がある。またＮ−ベンジル−３−ピロリン
を不斉還元剤として（＋）−ジイソピイノカンフェイル
ボランを用いて還元する方法が知られている［ジャーナ
ル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（J.
Am. Chem. Soc.）、１０８、２０４９、１９８６］。
また、Ｎ位にベンジル基のない（Ｓ）−３−ヒドロキシ
ピロリジンについてはＬ−グルタミン酸から導く方法
（シンセティク・コミュニケーション、１６、１８１
５、１９８６）があり、逆の（Ｒ）体についてはトラン
ス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを脱炭酸して得る方
法（特開昭６０−２３３２８号公報）が知られており、
これらをベンジル化して合成することも可能である。し
かし、いずれの方法も工程が長かったり特殊な試剤を必
要とする等で経済的な工業的製法とは考え難い。 【００１０】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、医薬品等の
合成原料として有用な式［II］で示される光学活性な
（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジン及び
一般式［Ｉ′］で示される光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベン
ジル−３−アシロキシピロリジンを化学的に容易に合成
しうる（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロ
キシピロリジン混合物を微生物あるいは酵素により立体
選択的に加水分解することにより光学分割することで経
済的に生産することを目的としたものである。 【００１１】 【課題を解決するための手段】先に本発明者らは、
（Ｒ）体と（Ｓ）体の等量混合物であるラセミ体の（Ｒ
Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジン［Ｉ］
は、これまでに報告されたことのない新規化合物である
が、このものは安価なＤＬ−リンゴ酸等から容易に合成
しうる（ＲＳ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリ
ジンと脂肪酸ハライド等と反応させることで容易に合成
しうる事を見出し、特許出願した。次に本発明者らは、
この新規化合物である（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベンジ
ル−３−アシロキシピロリジン混合物［Ｉ］を微生物あ
るいは酵素により不斉加水分解をして光学分割すること
を考え検討を行った。その結果、化合物［Ｉ］の（Ｓ）
体を立体選択的に加水分解し、光学活性な化合物［II］
を生成させうる微生物および酵素の存在を見出し、該反
応後、簡単な分離操作により光学活性な（Ｓ）−Ｎ−ベ
ンジル−３−ヒドロキシピロリジン［II］と立体的に対
掌な光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシ
ピロリジン［Ｉ′］とを採取しうる事を見出した。また
光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロ
リジン［Ｉ′］は、更にアルカリ加水分解あるいは
（Ｒ）体に立体特異的に作用する微生物や酵素あるいは
立体選択性のないリパーゼ等を用いて加水分解すること
により立体配置を保持した光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベン
ジル−３−ヒドロキシピロリジンとすることができ、い
ずれの立体特異性をもつ微生物あるいは酵素を用いても
（Ｒ）体と（Ｓ）体のＮ−ベンジル−３−ヒドロキシピ
ロリジン両対掌体を同時に得ることができる。 【００１２】本製造法の発明により、従来法と比べ経済
的に光学活性なＮ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジ
ンおよび光学活性なＮ−ベンジル−３−アシロキシピロ
リジンの各々の両対掌体の生産が可能となった。 【００１３】 【発明の実施の形態】本発明の基質として用いられる一
般式［Ｉ］ 【００１４】 【化８】 【００１５】で表わされる（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベ
ンジル−３−アシロキシピロリジンは、（Ｒ）体と
（Ｓ）体の等量混合物であるラセミ体でも、（Ｒ）体か
（Ｓ）体のいずれかがより多く含まれた混合物でも使用
しうる。また置換基Ｘとしては、水素あるいは炭素数１
〜１７個の直鎖あるいは分岐アルキル基、アルケニル基
で無置換のもの、あるいはハロゲン等で置換されたもの
も用いることができる。例えば、メチル基、エチル基、
エチレン基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、１−プ
ロピレン基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、１−ブチレ
ン基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル
基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノナシル基、ｎ−デシル基、
ｎ−ウンデシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−トリデシル
基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ペンタデシル基、ｎ−ヘ
キサデシル基、ｎ−ヘプタデシル基、ｎ−オクタデシル
基等の直鎖あるいは分岐状の未置換アルキル基、アルケ
ニル基等、例えばクロロメチル基、ジクロロメチル基、
トリフロロメチル基、２−クロロエチル基、３−クロロ
プロピル基、４−クロロブチル基等のハロゲン置換され
た置換アルキル基などが挙げられる。 【００１６】化合物［Ｉ］を立体選択的に加水分解し、
光学活性［II］を生成させる立体選択的エステラーゼ活
性を有する微生物あるいは酵素は、次の様なスクリーニ
ングを行なえば容易に見出すことができる。例えばその
具体的な一例として示すと、微生物の生育可能な栄養培
地１０ｍｌを大型試験管に入れ、被試験菌を植菌後、２
５〜３５℃で１〜３日間振とう培養する。次に、この培
養液に（ＲＳ）−Ｎ−ベンジル−３−ブチリルオキシピ
ロリジンを２％（ｗ／ｖ）添加し、更に２０〜３５℃、
ｐＨをＮａＯＨでｐＨ５〜７に調整しながら１〜３日間
反応させる。加水分解の進行は、反応液を硫酸でｐＨ
２．０とし２倍量の酢酸エチルで生成する酪酸を抽出
し、これをガスクロマトグラフィー（充填剤、島津ＦＡ
Ｌ−Ｍ６％／シマライト、φ０．３×１００ｃｍカラ
ム、温度１４０℃）にて定量することで分析できる。各
反応液の経時変化をとり、添加基質に対して、生成する
酪酸が約２分の１当量生成したところで反応が極端に遅
くなる菌株を１次選択する。次に反応スケールを５００
ｍｌにかえ、前記と同様の培養及び加水分解を行ない、
終了後、ジクロロメタン５００ｍｌで４回抽出し、減圧
下で脱溶剤する。これをシリカゲルカラム（ワコーゲル
Ｃ−２００、２５０ｇ）に負荷し、ヘキサン／酢酸エチ
ル（１０／２）で未反応のＮ−ベンジル−３−ブチリル
オキシピロリジンを溶出する。更に、酢酸エチルで生成
したＮ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジンを溶出す
る。各画分を濃縮すれば油状の光学活性Ｎ−ベンジル−
３−ブチリルオキシピロリジンと光学活性Ｎ−ベンジル
−３−ヒドロキシピロリジンが得られる。 【００１７】そして、光学活性Ｎ−ベンジル−３−ブチ
リルオキシピロリジンはＮａＯＨで加水分解すれば、光
学活性を損う事なく光学活性のＮ−ベンジル−３−ヒド
ロキシピロリジンとなり、これらを蒸留により精製し、
比旋光度を測定すれば、立体選択的エステラーゼ活性を
有する微生物か否か容易に判断できる。各種起源の酵素
のスクリーニングにおいても微生物培養液の代りに、酵
素０．５ｇを１０ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解
し、同様な方法で行なう事ができる。この様にＮ−ベン
ジル−３−ブチリルオキシピロリジンを立体選択的に加
水分解しうる微生物あるいは酵素は前記の様な各種のＮ
−ベンジル−３−アシロキシピロリジンに対しても同様
な立体選択的加水分解活性を示す。 【００１８】（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−
アシロキシピロリジン混合物を立体選択的に加水分解
し、［II］と［Ｉ′］を与える立体選択的エステラーゼ
活性を有する微生物としてはリゾップス属、フィコマイ
セス属等に属する微生物があり、更に詳しくは、リゾッ
プス・ジャポニカス（Rhizopus japonicus）ＩＦＯ ４
７５８、リゾップス・デレマー（Rhizopus delemer）Ｉ
ＦＯ ４６９７、フィコマイセス・ニテンス（Phycomyc
es nitens）ＩＦＯ ５６９４、などが利用できる。 【００１９】これらの微生物は培養液そのものを用いる
事ができるが、培養液あるいは菌体から酵素を抽出精製
して用いることもできる。また市販酵素を直接用いるこ
ともできる。例えば、リパーゼＰＮ（フィコマイセス属
由来、和光純薬（株）製）、リパーゼ（リゾップス属由
来、生化学工業（株）製）、リパーゼ「サイケン」１０
０（リゾップス属由来、大阪細菌研究所（株）製）、ニ
ューラーゼ（リゾップス属由来、天野製薬（株）製）な
どがこの目的に適している。 【００２０】加水分解反応は、微生物培養液あるいは酵
素抽出物又は酵素の水溶液に基質［Ｉ］を０．５〜７５
％（ｗ／ｖ）濃度の範囲で添加し、温度１０〜５５℃の
範囲で撹拌しながら行なう。酵素量は酵素活性に依存す
るが、通常［Ｉ］に対して等量から１０００分の１の範
囲で行なう。反応のｐＨは５．０〜８．５の範囲で行な
うが、加水分解反応中にｐＨが変化する場合は適当な酸
やアルカリ水溶液で最適のｐＨに保持するのが望まし
い。 【００２１】反応において微生物あるいは酵素を水不溶
性の担体等で固定化して、くり返し用いる事もできる。
微生物の固定化は、例えばアクリルアミドポリマー、ウ
レタンポリマー、エチレングリコール誘導体ポリマー、
カラギーナン、アルギン酸カルシウム等による方法が挙
げられる。また酵素の固定化にはアンバーライトＸＡＤ
−７、アンバーライトＸＡＤ−２、ダイヤイオンＨＰ２
０、ダイヤイオンＨＰ２ＭＧ、オクチル・セファロース
ＣＬ−４Ｂ等の合成吸着剤等による方法等が挙げられ
る。基質の［Ｉ］は水に対する溶解度は一般に低いが、
撹拌を充分すれば本反応にとって支障とならない。しか
し、反応をすみやかに進行させる目的でアセトン、エタ
ノール等の親水性溶媒や界面活性剤等を反応に支障を与
えない程度加えても良い。 【００２２】反応の追跡は、加水分解によって生成する
有機酸をガスクロマトグラフィーで分析し、添加した
［II］の０．５当量の有機酸が生成した時点で反応を終
了させれば良い。 【００２３】加水分解物［II］と残存する［Ｉ′］を分
離する方法としては、疎水性の有機溶剤、例えばヘキサ
ン、シクロヘキサン、石油エーテル、塩化メチレン、ク
ロロホルム、四塩化炭素等を用い、ｐＨ４．０〜８．５
の範囲に調整した反応液より、［Ｉ′］のみあるいは若
干［II］を含む［Ｉ′］を抽出分離し、必要あればシリ
カゲルクロマトグラフィー（ヘキサン−アセトン溶剤で
分離）にて［Ｉ′］と［II］を分離し、各々純粋なもの
を得ることができる。更に反応液中に残存する［II］は
反応液のｐＨをＮａＯＨ等で９〜１４に調整した後、前
記の溶剤で抽出すれば完全に回収することができる。こ
こで注意すべき事は、［Ｉ′］はアルカリ条件で加水分
解を受けるため、最初からアルカリ性条件で［II］と
［Ｉ′］を抽出することは、［II］の光学純度低下をも
たらすため良くない点である。 【００２４】［Ｉ′］と［II］との分離は、前記シリカ
ゲルクロマトグラフィーでも、他の無機吸着剤、例えば
フロリジル、アルミナ、ゼオライト等、あるいは合成吸
着剤、例えばアンバーライトＸＡＤ−７、アンバーライ
トＸＡＤ−２、ダイヤイオンＨＰ２０、ダイヤイオンＨ
Ｐ２ＭＧ、オクチル・セファロースＣＬ−４Ｂ等を用い
て分離することもできる。炭素鎖の長い［Ｉ′］と［I
I］であれば蒸留によっても分離することができる。 【００２５】光学活性な［Ｉ′］は、そのまま合成原料
として用いることもできるが、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ
（ＯＨ）2等のアルカリにより化学的に、あるいは立体
選択性の異なるエステラーゼや微生物を用いて加水分解
することで容易に光学活性を保持したまま［II］に導く
こともできる。 【００２６】［II］および［Ｉ′］の光学純度の測定は
次の方法で行なう事ができる。［Ｉ′］は前記の方法で
加水分解後、［II］となし、［II］を塩化メチレン中、
等モルのｐ−トルエンスルホニルクロライドと反応させ
てトシル化後、これを高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）（カラム：キラルセルＯＢ（日本分光製）φ
０．４６×２５ｃｍ、溶出液 ヘキサン：イソプロパノ
ール（２０：１）、流速１．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出２２
１ｎｍ、保持時間（Ｒ）体：３６．７分、（Ｓ）体 ５
１．３分）により測定することができる。 【００２７】 【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものでは
ない。 【００２８】実施例１〜３ グルコース２％、イーストエキス０．５％、肉エキス
０．３％、ペプトン０．３％、オリーブ油１％（ｐＨ
７．０）の組成からなる栄養液体培地１５００ｍｌを３
リットル容ミニジャーに入れ、１２０℃、２０分間殺菌
後、表１に示す微生物を植菌し、３０℃、４０時間通気
１ｖｖｍ、撹拌５００ｒｐｍで培養した。その後ｐＨを
７．０に調整し、（ＲＳ）−Ｎ−ベンジル−３−ヘキサ
ノイルオキシピロリジン５ｇを添加し、３０℃で４８時
間反応させた。反応後、遠心分離して菌体を除去し、上
清を等量のヘキサンで３回抽出し、未反応のＮ−ベンジ
ル−３−ヘキサノイルオキシピロリジンを回収した。 【００２９】次に抽出残液をＮａＯＨ溶液でｐＨ１３と
し、等量の塩化メチレンで３回抽出し、加水分解された
Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジンを得た。減圧
下脱溶剤の後、蒸留により無色透明のＮ−ベンジル−３
−ヒドロキシピロリジンを得、これをトシル化後、ＨＰ
ＬＣによる光学純度を測定した結果表１に如くであっ
た。 【００３０】 【表１】 【００３１】実施例４〜７ １００ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に
（ＲＳ）−Ｎ−ベンジル−３−ヘキサノイルオキシピロ
リジン１０ｇを添加し、更に表２に示す市販酵素を添加
し、４０℃、撹拌下２２〜１２０時間反応を行った。反
応液を等量のヘキサンで３回抽出し、未反応のＮ−ベン
ジル−３−ヘキサノイルオキシピロリジンを回収した。
その後ＮａＯＨ溶液でｐＨを１３とし、等量の塩化メチ
レンで３回抽出し、加水分解されたＮ−ベンジル−３−
ヒドロキシピロリジンを抽出分離した。減圧下脱溶剤を
行ない、次に蒸留により精製して無色透明油状のＮ−ベ
ンジル−３−ヒドロキシピロリジンを得た。これをトシ
ル化後、ＨＰＬＣにより光学純度を測定した結果を表２
に示す。 【００３２】 【表２】【００３３】 【発明の効果】本発明によれば、光学活性な（Ｓ）−Ｎ
−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジンと光学活性な
（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンを経
済的に得ることができる。
の置換又は未置換アルキル基、アルケニル基を示す。）
で示される（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ア
シロキシピロリジン混合物を立体選択的に加水分解し
て、一般式［II］ 【０００４】 【化６】 【０００５】で示される光学活性な（Ｓ）−Ｎ−ベンジ
ル−３−ヒドロキシピロリジンを生成させる立体選択的
エステラーゼ活性を有し、リゾップス属、フィコマイセ
ス属に属する微生物を、あるいは該微生物由来の立体選
択的エステラーゼ酵素を一般式［Ｉ］で示される（Ｒ）
および（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジ
ン混合物に作用させ、光学活性な（Ｓ）−Ｎ−ベンジル
−３−ヒドロキシピロリジン［II］と、これと立体的に
対掌な一般式［Ｉ′］ 【０００６】 【化７】 【０００７】（式中、Ｘは前記と同じ）で示される光学
活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジ
ンとに光学分割して、夫々の光学活性化合物を分離採取
することを特徴とする光学活性な（Ｓ）−Ｎ−ベンジル
−３−ヒドロキシピロリジン及びその対掌体の光学活性
な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンの
製造法に関する。 【０００８】本発明によって製造される光学活性な
（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジン及び
（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンは医
薬、農薬等の有用な合成中間体である。 【０００９】 【従来の技術】光学活性（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒ
ドロキシピロリジンの製法に関しては、Ｌ−リンゴ酸を
原料として合成する方法（特開昭６１−６３６５２号公
報）が知られているが、一部ラセミ化するため、これを
更にＤ−マンデル酸にて光学分割を行ない光学純度を向
上させる必要がある。またＮ−ベンジル−３−ピロリン
を不斉還元剤として（＋）−ジイソピイノカンフェイル
ボランを用いて還元する方法が知られている［ジャーナ
ル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（J.
Am. Chem. Soc.）、１０８、２０４９、１９８６］。
また、Ｎ位にベンジル基のない（Ｓ）−３−ヒドロキシ
ピロリジンについてはＬ−グルタミン酸から導く方法
（シンセティク・コミュニケーション、１６、１８１
５、１９８６）があり、逆の（Ｒ）体についてはトラン
ス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを脱炭酸して得る方
法（特開昭６０−２３３２８号公報）が知られており、
これらをベンジル化して合成することも可能である。し
かし、いずれの方法も工程が長かったり特殊な試剤を必
要とする等で経済的な工業的製法とは考え難い。 【００１０】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、医薬品等の
合成原料として有用な式［II］で示される光学活性な
（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジン及び
一般式［Ｉ′］で示される光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベン
ジル−３−アシロキシピロリジンを化学的に容易に合成
しうる（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロ
キシピロリジン混合物を微生物あるいは酵素により立体
選択的に加水分解することにより光学分割することで経
済的に生産することを目的としたものである。 【００１１】 【課題を解決するための手段】先に本発明者らは、
（Ｒ）体と（Ｓ）体の等量混合物であるラセミ体の（Ｒ
Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジン［Ｉ］
は、これまでに報告されたことのない新規化合物である
が、このものは安価なＤＬ−リンゴ酸等から容易に合成
しうる（ＲＳ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリ
ジンと脂肪酸ハライド等と反応させることで容易に合成
しうる事を見出し、特許出願した。次に本発明者らは、
この新規化合物である（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベンジ
ル−３−アシロキシピロリジン混合物［Ｉ］を微生物あ
るいは酵素により不斉加水分解をして光学分割すること
を考え検討を行った。その結果、化合物［Ｉ］の（Ｓ）
体を立体選択的に加水分解し、光学活性な化合物［II］
を生成させうる微生物および酵素の存在を見出し、該反
応後、簡単な分離操作により光学活性な（Ｓ）−Ｎ−ベ
ンジル−３−ヒドロキシピロリジン［II］と立体的に対
掌な光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシ
ピロリジン［Ｉ′］とを採取しうる事を見出した。また
光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロ
リジン［Ｉ′］は、更にアルカリ加水分解あるいは
（Ｒ）体に立体特異的に作用する微生物や酵素あるいは
立体選択性のないリパーゼ等を用いて加水分解すること
により立体配置を保持した光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベン
ジル−３−ヒドロキシピロリジンとすることができ、い
ずれの立体特異性をもつ微生物あるいは酵素を用いても
（Ｒ）体と（Ｓ）体のＮ−ベンジル−３−ヒドロキシピ
ロリジン両対掌体を同時に得ることができる。 【００１２】本製造法の発明により、従来法と比べ経済
的に光学活性なＮ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジ
ンおよび光学活性なＮ−ベンジル−３−アシロキシピロ
リジンの各々の両対掌体の生産が可能となった。 【００１３】 【発明の実施の形態】本発明の基質として用いられる一
般式［Ｉ］ 【００１４】 【化８】 【００１５】で表わされる（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベ
ンジル−３−アシロキシピロリジンは、（Ｒ）体と
（Ｓ）体の等量混合物であるラセミ体でも、（Ｒ）体か
（Ｓ）体のいずれかがより多く含まれた混合物でも使用
しうる。また置換基Ｘとしては、水素あるいは炭素数１
〜１７個の直鎖あるいは分岐アルキル基、アルケニル基
で無置換のもの、あるいはハロゲン等で置換されたもの
も用いることができる。例えば、メチル基、エチル基、
エチレン基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、１−プ
ロピレン基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、１−ブチレ
ン基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル
基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノナシル基、ｎ−デシル基、
ｎ−ウンデシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−トリデシル
基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ペンタデシル基、ｎ−ヘ
キサデシル基、ｎ−ヘプタデシル基、ｎ−オクタデシル
基等の直鎖あるいは分岐状の未置換アルキル基、アルケ
ニル基等、例えばクロロメチル基、ジクロロメチル基、
トリフロロメチル基、２−クロロエチル基、３−クロロ
プロピル基、４−クロロブチル基等のハロゲン置換され
た置換アルキル基などが挙げられる。 【００１６】化合物［Ｉ］を立体選択的に加水分解し、
光学活性［II］を生成させる立体選択的エステラーゼ活
性を有する微生物あるいは酵素は、次の様なスクリーニ
ングを行なえば容易に見出すことができる。例えばその
具体的な一例として示すと、微生物の生育可能な栄養培
地１０ｍｌを大型試験管に入れ、被試験菌を植菌後、２
５〜３５℃で１〜３日間振とう培養する。次に、この培
養液に（ＲＳ）−Ｎ−ベンジル−３−ブチリルオキシピ
ロリジンを２％（ｗ／ｖ）添加し、更に２０〜３５℃、
ｐＨをＮａＯＨでｐＨ５〜７に調整しながら１〜３日間
反応させる。加水分解の進行は、反応液を硫酸でｐＨ
２．０とし２倍量の酢酸エチルで生成する酪酸を抽出
し、これをガスクロマトグラフィー（充填剤、島津ＦＡ
Ｌ−Ｍ６％／シマライト、φ０．３×１００ｃｍカラ
ム、温度１４０℃）にて定量することで分析できる。各
反応液の経時変化をとり、添加基質に対して、生成する
酪酸が約２分の１当量生成したところで反応が極端に遅
くなる菌株を１次選択する。次に反応スケールを５００
ｍｌにかえ、前記と同様の培養及び加水分解を行ない、
終了後、ジクロロメタン５００ｍｌで４回抽出し、減圧
下で脱溶剤する。これをシリカゲルカラム（ワコーゲル
Ｃ−２００、２５０ｇ）に負荷し、ヘキサン／酢酸エチ
ル（１０／２）で未反応のＮ−ベンジル−３−ブチリル
オキシピロリジンを溶出する。更に、酢酸エチルで生成
したＮ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジンを溶出す
る。各画分を濃縮すれば油状の光学活性Ｎ−ベンジル−
３−ブチリルオキシピロリジンと光学活性Ｎ−ベンジル
−３−ヒドロキシピロリジンが得られる。 【００１７】そして、光学活性Ｎ−ベンジル−３−ブチ
リルオキシピロリジンはＮａＯＨで加水分解すれば、光
学活性を損う事なく光学活性のＮ−ベンジル−３−ヒド
ロキシピロリジンとなり、これらを蒸留により精製し、
比旋光度を測定すれば、立体選択的エステラーゼ活性を
有する微生物か否か容易に判断できる。各種起源の酵素
のスクリーニングにおいても微生物培養液の代りに、酵
素０．５ｇを１０ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解
し、同様な方法で行なう事ができる。この様にＮ−ベン
ジル−３−ブチリルオキシピロリジンを立体選択的に加
水分解しうる微生物あるいは酵素は前記の様な各種のＮ
−ベンジル−３−アシロキシピロリジンに対しても同様
な立体選択的加水分解活性を示す。 【００１８】（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−
アシロキシピロリジン混合物を立体選択的に加水分解
し、［II］と［Ｉ′］を与える立体選択的エステラーゼ
活性を有する微生物としてはリゾップス属、フィコマイ
セス属等に属する微生物があり、更に詳しくは、リゾッ
プス・ジャポニカス（Rhizopus japonicus）ＩＦＯ ４
７５８、リゾップス・デレマー（Rhizopus delemer）Ｉ
ＦＯ ４６９７、フィコマイセス・ニテンス（Phycomyc
es nitens）ＩＦＯ ５６９４、などが利用できる。 【００１９】これらの微生物は培養液そのものを用いる
事ができるが、培養液あるいは菌体から酵素を抽出精製
して用いることもできる。また市販酵素を直接用いるこ
ともできる。例えば、リパーゼＰＮ（フィコマイセス属
由来、和光純薬（株）製）、リパーゼ（リゾップス属由
来、生化学工業（株）製）、リパーゼ「サイケン」１０
０（リゾップス属由来、大阪細菌研究所（株）製）、ニ
ューラーゼ（リゾップス属由来、天野製薬（株）製）な
どがこの目的に適している。 【００２０】加水分解反応は、微生物培養液あるいは酵
素抽出物又は酵素の水溶液に基質［Ｉ］を０．５〜７５
％（ｗ／ｖ）濃度の範囲で添加し、温度１０〜５５℃の
範囲で撹拌しながら行なう。酵素量は酵素活性に依存す
るが、通常［Ｉ］に対して等量から１０００分の１の範
囲で行なう。反応のｐＨは５．０〜８．５の範囲で行な
うが、加水分解反応中にｐＨが変化する場合は適当な酸
やアルカリ水溶液で最適のｐＨに保持するのが望まし
い。 【００２１】反応において微生物あるいは酵素を水不溶
性の担体等で固定化して、くり返し用いる事もできる。
微生物の固定化は、例えばアクリルアミドポリマー、ウ
レタンポリマー、エチレングリコール誘導体ポリマー、
カラギーナン、アルギン酸カルシウム等による方法が挙
げられる。また酵素の固定化にはアンバーライトＸＡＤ
−７、アンバーライトＸＡＤ−２、ダイヤイオンＨＰ２
０、ダイヤイオンＨＰ２ＭＧ、オクチル・セファロース
ＣＬ−４Ｂ等の合成吸着剤等による方法等が挙げられ
る。基質の［Ｉ］は水に対する溶解度は一般に低いが、
撹拌を充分すれば本反応にとって支障とならない。しか
し、反応をすみやかに進行させる目的でアセトン、エタ
ノール等の親水性溶媒や界面活性剤等を反応に支障を与
えない程度加えても良い。 【００２２】反応の追跡は、加水分解によって生成する
有機酸をガスクロマトグラフィーで分析し、添加した
［II］の０．５当量の有機酸が生成した時点で反応を終
了させれば良い。 【００２３】加水分解物［II］と残存する［Ｉ′］を分
離する方法としては、疎水性の有機溶剤、例えばヘキサ
ン、シクロヘキサン、石油エーテル、塩化メチレン、ク
ロロホルム、四塩化炭素等を用い、ｐＨ４．０〜８．５
の範囲に調整した反応液より、［Ｉ′］のみあるいは若
干［II］を含む［Ｉ′］を抽出分離し、必要あればシリ
カゲルクロマトグラフィー（ヘキサン−アセトン溶剤で
分離）にて［Ｉ′］と［II］を分離し、各々純粋なもの
を得ることができる。更に反応液中に残存する［II］は
反応液のｐＨをＮａＯＨ等で９〜１４に調整した後、前
記の溶剤で抽出すれば完全に回収することができる。こ
こで注意すべき事は、［Ｉ′］はアルカリ条件で加水分
解を受けるため、最初からアルカリ性条件で［II］と
［Ｉ′］を抽出することは、［II］の光学純度低下をも
たらすため良くない点である。 【００２４】［Ｉ′］と［II］との分離は、前記シリカ
ゲルクロマトグラフィーでも、他の無機吸着剤、例えば
フロリジル、アルミナ、ゼオライト等、あるいは合成吸
着剤、例えばアンバーライトＸＡＤ−７、アンバーライ
トＸＡＤ−２、ダイヤイオンＨＰ２０、ダイヤイオンＨ
Ｐ２ＭＧ、オクチル・セファロースＣＬ−４Ｂ等を用い
て分離することもできる。炭素鎖の長い［Ｉ′］と［I
I］であれば蒸留によっても分離することができる。 【００２５】光学活性な［Ｉ′］は、そのまま合成原料
として用いることもできるが、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ
（ＯＨ）2等のアルカリにより化学的に、あるいは立体
選択性の異なるエステラーゼや微生物を用いて加水分解
することで容易に光学活性を保持したまま［II］に導く
こともできる。 【００２６】［II］および［Ｉ′］の光学純度の測定は
次の方法で行なう事ができる。［Ｉ′］は前記の方法で
加水分解後、［II］となし、［II］を塩化メチレン中、
等モルのｐ−トルエンスルホニルクロライドと反応させ
てトシル化後、これを高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）（カラム：キラルセルＯＢ（日本分光製）φ
０．４６×２５ｃｍ、溶出液 ヘキサン：イソプロパノ
ール（２０：１）、流速１．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出２２
１ｎｍ、保持時間（Ｒ）体：３６．７分、（Ｓ）体 ５
１．３分）により測定することができる。 【００２７】 【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものでは
ない。 【００２８】実施例１〜３ グルコース２％、イーストエキス０．５％、肉エキス
０．３％、ペプトン０．３％、オリーブ油１％（ｐＨ
７．０）の組成からなる栄養液体培地１５００ｍｌを３
リットル容ミニジャーに入れ、１２０℃、２０分間殺菌
後、表１に示す微生物を植菌し、３０℃、４０時間通気
１ｖｖｍ、撹拌５００ｒｐｍで培養した。その後ｐＨを
７．０に調整し、（ＲＳ）−Ｎ−ベンジル−３−ヘキサ
ノイルオキシピロリジン５ｇを添加し、３０℃で４８時
間反応させた。反応後、遠心分離して菌体を除去し、上
清を等量のヘキサンで３回抽出し、未反応のＮ−ベンジ
ル−３−ヘキサノイルオキシピロリジンを回収した。 【００２９】次に抽出残液をＮａＯＨ溶液でｐＨ１３と
し、等量の塩化メチレンで３回抽出し、加水分解された
Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジンを得た。減圧
下脱溶剤の後、蒸留により無色透明のＮ−ベンジル−３
−ヒドロキシピロリジンを得、これをトシル化後、ＨＰ
ＬＣによる光学純度を測定した結果表１に如くであっ
た。 【００３０】 【表１】 【００３１】実施例４〜７ １００ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に
（ＲＳ）−Ｎ−ベンジル−３−ヘキサノイルオキシピロ
リジン１０ｇを添加し、更に表２に示す市販酵素を添加
し、４０℃、撹拌下２２〜１２０時間反応を行った。反
応液を等量のヘキサンで３回抽出し、未反応のＮ−ベン
ジル−３−ヘキサノイルオキシピロリジンを回収した。
その後ＮａＯＨ溶液でｐＨを１３とし、等量の塩化メチ
レンで３回抽出し、加水分解されたＮ−ベンジル−３−
ヒドロキシピロリジンを抽出分離した。減圧下脱溶剤を
行ない、次に蒸留により精製して無色透明油状のＮ−ベ
ンジル−３−ヒドロキシピロリジンを得た。これをトシ
ル化後、ＨＰＬＣにより光学純度を測定した結果を表２
に示す。 【００３２】 【表２】【００３３】 【発明の効果】本発明によれば、光学活性な（Ｓ）−Ｎ
−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジンと光学活性な
（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンを経
済的に得ることができる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C12P 41/00
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．一般式［Ｉ］ 【化１】 ［式中、Ｘは水素あるいは炭素数１〜１７の置換又は未
置換アルキル基、アルケニル基を示す。］で示される
（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピ
ロリジン混合物を立体選択的に加水分解して、一般式
［II］ 【化２】 で示される光学活性な（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒド
ロキシピロリジンを生成させる立体選択的エステラーゼ
活性を有し、リゾップス属、フィコマイセス属に属する
微生物あるいは該微生物由来の立体選択的エステラーゼ
活性を有する酵素を一般式［Ｉ］で示される（Ｒ）およ
び（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジン混
合物に作用させ、式［II］ 【化３】で表わされる光学活性な（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒ
ドロキシピロリジンと、これと立体的に対掌な一般式
［Ｉ′］ 【化４】 （式中、Ｘは前記と同じ）で示される光学活性な（Ｒ）
−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンとに光学分
割し、夫々の光学活性化合物を分離採取することを特徴
とする光学活性な（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキ
シピロリジン及び／またはその対掌体の光学活性（Ｒ）
−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンの製造法。 ２．酵素がリパーゼである請求項１記載の製造法。 ３．立体選択的エステラーゼ活性を有する微生物あるい
は酵素を水不溶性担体に固定化して用いる請求項１ない
し２のいずれかに記載の製造法。 ４．一般式［Ｉ］で示される（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−
ベンジル−３−アシロキシピロリジン混合物を微生物あ
るいは酵素により立体選択的に加水分解をして得られる
光学活性な（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロ
リジン［II］と光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−
アシロキシピロリジン［Ｉ′］との混合物から［II］と
［Ｉ′］とを分離採取する際に、無機吸着剤あるいは合
成吸着剤を担体とするカラムクロマトグラフィーにより
分離し、夫々を採取することを特徴とする請求項１ない
し３のいずれかに記載の製造法。 ５．一般式［Ｉ］で示される（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−
ベンジル−３−アシロキシピロリジン混合物を微生物あ
るいは酵素により立体選択的に加水分解をして得られる
光学活性な（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロ
リジン［II］と光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−
アシロキシピロリジン［Ｉ′］との混合物から［II］と
［Ｉ′］とを分離採取する際に、疎水性溶剤を用いて
［Ｉ′］を抽出して［II］と分離し、夫々を採取するこ
とを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の製
造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13110097A JP2813342B2 (ja) | 1997-05-21 | 1997-05-21 | 光学活性３−ヒドロキシピロリジン誘導体の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP13110097A JP2813342B2 (ja) | 1997-05-21 | 1997-05-21 | 光学活性３−ヒドロキシピロリジン誘導体の製造法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30105287A Division JP2703768B2 (ja) | 1987-11-28 | 1987-11-28 | 光学活性３−ヒドロキシピロリジン誘導体の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1042894A JPH1042894A (ja) | 1998-02-17 |
| JP2813342B2 true JP2813342B2 (ja) | 1998-10-22 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13110097A Expired - Fee Related JP2813342B2 (ja) | 1997-05-21 | 1997-05-21 | 光学活性３−ヒドロキシピロリジン誘導体の製造法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2813342B2 (ja) |
-
1997
- 1997-05-21 JP JP13110097A patent/JP2813342B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH1042894A (ja) | 1998-02-17 |
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