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JP2825976B2 - 均質検定システム - Google Patents
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JP2825976B2 - 均質検定システム - Google Patents

均質検定システム

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JP2825976B2 JP3517497A JP51749791A JP2825976B2 JP 2825976 B2 JP2825976 B2 JP 2825976B2 JP 3517497 A JP3517497 A JP 3517497A JP 51749791 A JP51749791 A JP 51749791A JP 2825976 B2 JP2825976 B2 JP 2825976B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般に核酸化学の分野に関連したものであ
る。より特定的には、本発明は核酸ポリメラーゼの５′
→３′ヌクレアーゼ活性を利用して、標識されたオリゴ
ヌクレオチドとターゲットであるオリゴヌクレオチド配
列が構成する雑種形成二重鎖より標識されたオリゴヌク
レオチドを分解し検出可能な標識断片を得ようとするも
のである。
診断用の検定法として微生物学的技術による試験法が
通常行なわれている。例として米国特許第4,358,535号
では病因菌を検出する方法として以下の方法を開示して
いる；サンプル（血液、細胞、唾液など）をフィルター
（ニトロセルロースフィルターなど）上にスポットし、
細胞をとかし、化学的に変性し加熱してDNAを固定す
る。次に標識したDNAプローブを加え固定したサンプルD
NAとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたことによ
り病因菌のDNAが存在していたことを示す。この場合の
サンプルDNAはフィルター上の細胞あるいは生体を培養
することによって増幅することも可能である。
DNA増幅法の際だった改良法としてポリメラーゼチェ
ーン反応法（PCR）が米国特許第4,683,202号、4,683,19
5号、4,800,159号、4,965,188号に開示されている。こ
れらのうち最も単純化された形式としては、PCRはター
ゲットDNAの注目する領域をはさんで互いの鎖にハイブ
リダイズするような二つのオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いて特定のDNAシーケンスを酵素によりin vitro
で生成する方法である。鋳型DNAの変性、プライマーの
アニーリング、DNAポリメラーゼによるアニールしたプ
ライマーの伸張反応を含む一連の反応を繰り返すことに
よりプライマーの５′端を終端とする特定の断片が指数
的に増幅され蓄積される。PCR法は特定のDNAシーケンス
を選択的に109のファクターで生成することが可能であ
る。PCR法はSaikiらにより1985年のScience230巻1350ペ
ージにも示されている。
検出法は通常、ハイブリダイゼーション検定において
標識されたプローブと増幅されたDNAを用いて標準的なP
CR法によって行なわれる。すなわちEP出版第237,362号
及びPCT出版第89/11548号に開示されているようにPCRで
増幅したDNAをフィルターに固定し、特定のオリゴヌク
レオチドプローブをそれに加えてハイブリダイズさせ
る。プローブは32P、ビオチン、西洋ワサビ（HRP）など
で標識しハイブリダイゼーションが検出できるようにし
ておくのが望ましい。この逆の方法も呈示されていて、
すなわちプローブをかわりにメンブレンフィルター上に
固定し次にPCR増幅したDNAを加えるというものである。
他の検出方法として断片長の多様性を利用するもので
（PCR−FLP）、アレーレ特異的なオリゴヌクレオチドプ
ローブ（ASO）を用いてハイブリダイズを行なう方法や
（Saikiら1986年Nature324巻163ページ）、クローン化
されたDNAのかわりに増幅したDNAを使ってダイデオキシ
法により直接シーケンスする方法がある。標準的なPCR
法により二つのプライマーではさまれたDNAシーケンス
を複製し、それぞれのプライマーの５′端を終端とする
特定の長さのDNAシーケンスの反応産物をつくる。従っ
てプライマー間に挿入あるいは欠失があると異なった長
さの産物シーケンスが生成されることになりこれはPCR
−FLP産物のサイズ決定を行なうことにより検出され
る。ASOハイブリダイゼーションを例に取ると、増幅さ
れたDNAはドットブロットと呼ばれる方法でナイロンフ
ィルター上に固定され（紫外線照射などで）、HRPで標
識されたオリゴヌクレオチドプローブと厳しい条件の下
でハイブリダイズされる。未反応プローブ洗浄後、テト
ラメチルベンチジン（TMB）と過酸化水素が加えられる:
HRPは過酸化水素によるTMBの酸化による可溶性の青色の
色素の沈着を触媒し、その結果プローブがハイブリダイ
ズしていることが確認される。
PCR法は実際に実施されているように核酸シーケンス
を増幅させる非常に強力な方法であるが、増幅を受けた
材料の検出には、ターゲットとなるDNAが実際に存在す
るかの決定にはPCR産物に対するさらに別の操作あるい
は取り扱いが要求される。増幅された材料の検出に要求
される操作のステップ数はなるべく少ないほうが望まし
い。“均質”検定システムは、ターゲットのシーケンス
が増幅中にシグナルが得られ従って増幅後の操作数を最
小とするような理想的なシステムの一つである。
本発明は検出中のターゲットとなる核酸シーケンスの
検出を行なう操作法を呈示しており、この操作法は以下
から構成されている、 （ａ）一本鎖核酸からなるサンプルがターゲットとなる
核酸の領域に対する相補的なシーケンスを有する一つの
オリゴヌクレオチドと、第一のオリゴヌクレオチドで決
められる核酸シーケンスは含まないで同じターゲットの
核酸の別の領域に相補的なシーケンスを有する標識され
たオリゴヌクレオチドと接触し、ハイブリダイゼーショ
ンが起こる条件でターゲットの核酸と第一のオリゴヌク
レオチドと標識されたオリゴヌクレオチドが第一のオリ
ゴヌクレオチドの３′端が標識されたオリゴヌクレオチ
ドの５′端に近接してアニールした二重鎖を生成し； （ｂ）ステップ（ａ）のミクスチャと鋳型依存性の５′
→３′ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと
を、ポリメラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ活性が働い
てアニールされた標識オリゴヌクレオチドが切断され標
識された断片が遊離されるような条件を保ち； （ｃ）遊離された標識断片を検出しあるいは測定する。
本発明は特にPCR法によって増幅された核酸の解析に
適している。本方法の既知のPCR検出法を改良したもの
であってターゲットの増幅と検出のため標識物の遊離を
増幅産物に対し更に多くの取り扱いステップを要求せず
ひとつの反応系で実現している。従って、本発明の他の
具体化したものとして、PCR法を現行の与えられたサン
プル中の核酸シーケンスの増幅と検出法にも用いてい
る。これは以下のステップからなっている； （ａ）サンプルと少なくとも一つのターゲットの核酸に
相補的なシーケンスをふくむ標識されたオリゴヌクレオ
チドを含むPCR検定系が与えられ、ここで標識されたオ
リゴヌクレオチドはステップ（ｂ）のオリゴヌクレオチ
ドプライマーで決められる核酸シーケンスのターゲット
領域内にアニールし； （ｂ）１セットのプライマー、すなわち第一のプライマ
ーはターゲットの核酸シーケンスの一方の鎖に相補的な
シーケンスを有しDNA相補鎖の合成の開始を行ない、第
二のプライマーはターゲットの核酸シーケンスのもう一
方の鎖に相補的なシーケンスを有しDNA相補鎖の合成の
開始を行なうようなプライマーのセットを与え、ここで
それぞれのオリゴヌクレオチドプライマーは同じ核酸鎖
にアニールした標識オリゴヌクレオチドより上流の相補
的な鋳型鎖にアニールするように選ばれていて； （ｃ）ターゲットとなる核酸シーケンスを５′→３′ヌ
クレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを鋳型鎖依存
性のポリメラーゼとして（ｉ）プライマーと標識オリゴ
ヌクレオチドをターゲットを領域内の鋳型核酸シーケン
スにアニールさせ、（ii）プライマーの伸張を行なうPC
Rサイクリングステップを行なって増幅させ、ここで核
酸ポリメラーゼはプライマー伸張物を合成しながら同時
に核酸ポリメラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ活性が標
識オリゴヌクレオチドとその相補的な核酸鎖から構成さ
れるアニールされた二重鎖より標識された断片を遊離さ
せることによって標識断片が検出可能となり； （ｄ）遊離された標識断片を検出あるいは測定すること
によって、検体中にターゲットのシーケンスが存在する
か否かを決める方法である。
図１はDEAEセルロース薄層クロマトグラフィ（TLC）
のオートラジオグラフでプローブの切断により遊離され
た標識断片を示している。
図２はDEAEセルロース薄層クロマトグラフィ（TLC）
のオートラジオグラフで標識プローブの熱安定性を示し
ている。
図3Aと3BはDEAEセルロース薄層クロマトグラフィ（TL
C）のオートラジオグラフで遊離される標識プローブ断
片の量がPCRサイクルと反応開始時の鋳型DNAの濃度に相
関していることを示している。
図４はTaq DNAポリメラーゼの５′→３′ヌクレアー
ゼ活性がポリマー化反応に依存していないことをプロー
ブの上流０−20塩基にアニールする一連のプライマーを
用いてオートラジオグラフで示したものである。
図５は標識プローブ断片の遊離をインキュベーション
温度と時間を増加させたときの様子をオートラジオグラ
フで示したもので、プローブの５′端はGCリッチな構成
となっている。
図６は標識プローブ断片の遊離をインキュベーション
温度と時間を増加させたときの様子をオートラジオグラ
フで示したもので、プローブの５′端はATリッチな構成
となっている。
図７は５％アクリルアミドゲルによる電気泳動で142
塩基対のHIVの産物を解析したもので、標識プローブの
存在、非存在下で増幅を行なっている。
図８はPCR増幅産物のTLC解析の二つのオートラジオグ
ラフをまとめたもので、反応開始時の鋳型DNAの量とサ
ーモサイクリング数を増やすにしたがって放射性標識物
の遊離が見られその量も増加していくことが示されてい
る。
図９はNHS活性を有するビオチンのエステル誘導体が
オリゴヌクレオチドプローブの３′アミノ基に付加され
る反応を図示している。
図10はビオチンヒドラザイドを使って３′端にリボヌ
クレオタイドを持つオリゴヌクレオチドプローブに標識
する反応を図示している。
図11はビオチンフォスフォラミダイトを使ってオリゴ
ヌクレオチドプローブをビオチン標識する方法を図示し
ている。
図12はビオチンでオリゴヌクレオチドプローブを標識
するための試薬を示している。
図13はオリゴヌクレオチドプローブをローダミン−Ｘ
−590とクリスタルバイオレットで標識する方法を示し
ている。
図14はクリスタルバイオレットにアシルアザイド活性
を生じさせる反応を図示している。
図15はオリゴヌクレオチドプローブに標識物を結合さ
せるためのサイミジンにアミンを付加する反応を図示し
ている。
図16は本法でBakerbond TMのPEI固相抽出物を使用し
たときの、得られるシグナルと与えたターゲット数の結
果とその相関について典型的な例を示したものである。
ここで使われている“検体”とは核酸を含むあるいは
含むと考えられる全てのもので、個体から由来する組織
あるいは液性物でたとえば皮膚、血漿、血清、脊髄液、
リンパ液、関節液、尿、涙、血液細胞、臓器、腫瘍組織
あるいはインビトロの細胞培養物（培養培地中で育った
細胞に由来するコンディションドメディウム、組換体細
胞、細胞構成物などを含む）などであるが、、これに限
定されるものではない。
ここで使われている“核酸”、“ポリヌクレオタイ
ド”あるいは“オリゴヌクレオチド”はプライマー、プ
ローブ、検出の対象となるオリゴマー断片、対照として
のオリゴマーおよびブロッキングのための未標識オリゴ
マーおよびポリデオキシヌクレオタイド（２−デオキシ
−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオタイド（Ｄ
−リボースを含む）の一群で、プリンあるいはピリミジ
ン塩基のＮ−グルコシド形である任意のタイプのポリヌ
クレオタイド、あるいはプリン、ピリミジン塩基の修飾
形なども含まれる。“核酸”、“ポリヌクレオタイド”
あるいは“オリゴヌクレオチド”には長さの区別は考え
てなく、これらの用語は相互に交換可能である。これら
の単語は分子の一次構造について述べているだけであ
る。従って、これらの単語には二本鎖及び一本鎖DNAが
含まれていて、同様に二本鎖及び一本鎖RNAも含まれて
いる。オリゴヌクレオチドは最低約６塩基のシーケンス
から構成されるが、より望ましくは最低10−12の塩基か
らなっていて、さらに必要とされる核酸シーケンスの領
域の最低15−20塩基に一致する塩基から構成されること
が望ましい。“一致した”とは指定したシーケンスに対
して同一あるいは相補的であることを示す。
オリゴヌクレオチドは実在するものあるいは自然界に
あるシーケンスに由来する必要はなく、化学的合成、DN
A複製、逆転写あるいはこれらの組み合わせなど任意の
方法で作りえる。“オリゴヌクレオチド”あるいは“核
酸”とは遺伝子DNA、RNA、cDNA、半合成物あるいは、
（１）自然物に関係したポリヌクレオタイドの一部ある
いは全部とは関係していないものを起源とするもの、あ
るいは（２）自然物に関係している部分以外のポリヌク
レオタイドに関係したものを起源とするもの、あるいは
（３）自然界には全く存在しないものを起源とするもの
からの合成物を指している。
モノヌクレオタイドは、一つのモノヌクレオタイドの
５炭糖環の５′端のリン酸基がフォスフォダイエステル
結合を介して燐の３′端酸素に一方向性を保って結合し
オリゴヌクレオチドを形成するので、オリゴヌクレオチ
ドの端部のうちその５′リン酸基がモノヌクレオタイド
の３′端の酸素と結合していない部分を“５′端”と呼
び、３′酸素がモノヌクレオタイドの５炭糖環の５′リ
ン酸基と結合していない部分を“３′端”と呼ぶ。同様
にして、より大きいオリゴヌクレオチド内の核酸シーケ
ンスにおいても５′端、３′端を持つと言うことができ
る。
二つの異なった、重なり合いのないオリゴヌクレオチ
ドが同一の相補的な核酸シーケンスに異なった領域でア
ニールするとき、一方のオリゴヌクレオチドの３′端が
他方の５′端に向かっているような配置の時、前者を
“上流”のオリゴヌクレオチド、後者を“下流”のオリ
ゴヌクレオチドと呼ぶ。
“プライマー”とは一種以上のプライマーを指し、制
限酵素消化などで自然に得られるようなものあるいは合
成により得られるオリゴヌクレオチドで、核酸鎖に相補
的なプライマー伸張産物の合成が触媒されるような条件
の下におかれたときに、合成の開始点として働くことの
できるものである。ここでの条件とは、４種の異なった
基質のデオキシリボヌクレオシド３リン酸、DNAポリメ
ラーゼあるいは逆転写酵素などのポリマー化を行なうも
の、適切なバッファー（“バッファー”には補助因子、
pH、イオン強度などに作用するものを含んでいる）およ
び適切な温度が含まれている。プライマーは増幅を最大
の高率で達成するためには一本鎖であることが望まし
い。
ここで使われている核酸シーケンスに相補的であると
は、オリゴヌクレオチドが核酸シーケンスと一方の５′
端がもう一方の３′端と“アンチパラレル”な様式で配
向している状態を示す。通常自然物の核酸中には認めら
れないある種の塩基即ちイノシンや７ジアザグアニンな
ども本発明の核酸に含めるとする。完璧な相補性は要求
されず、安定な二本鎖複合体にはミスマッチの塩基対あ
るいはマッチしない塩基対が含まれていてもよい。核酸
技術における熟練者は二本鎖複合体の安定性をいくつか
の変数すなわちオリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌク
レオチドのシーケンスとその構成する塩基、イオン強
度、ミスマッチの塩基対の割合などから経験的に判断で
きる。
核酸の二本鎖複合体の安定性はメルティング温度ある
いは“Tm"を測定して行なうことができる。Tmはある特
定の条件化である核酸がその塩基対の半分が解離してい
るときの温度である。
ここで使われている“ターゲットシーケンス”あるい
は“ターゲット核酸シーケンス”とは、増幅あるいは検
出の対象となるオリゴヌクレオチドの領域を指してい
る。ターゲットシーケンスは増幅反応に使われる２つの
プライマーシーケンスに挟まれている。
ここで使われている“プローブ”とは標識されたオリ
ゴヌクレオチドで、ターゲット領域内のシーケンスとプ
ローブ内の少なくとも一つのシーケンスの相補性によっ
て、ターゲット核酸シーケンスと二本鎖複合体を形成す
るものを指す。プローブにはPCR反応開始に使われるシ
ーケンス配列に相補的なシーケンスは含まないことが望
ましい。普通、プローブの３′端はプローブはプライマ
ー伸張物中に取り込まれることを防ぐために“ブロック
化”されている。“ブロッキング”は非相補的な塩基配
列を用いて行なわれたり、ビオチンあるいはリン酸基な
どの化学分子を末端塩基の３′水酸基に付加して行なわ
れるが、使われる分子にもよるが引き続く検出のための
標識あるいは標識された核酸の捕獲という二重の目的に
働きうる。ブロッキングはまた３′水酸基を取り除いた
り、３′水酸基を持たないダイデオキシヌクレオタイド
を使用することによっても行なわれる。
ここで使われる“標識”とは検出可能な信号を与える
ような（定量可能であるようなものが望ましいが）任意
の原子あるいは分子で、核酸あるいは蛋白に結合できる
ようなものである。標識物とは蛍光、放射活性、比色
法、質量分析法、Ｘ線散乱あるいは、吸収、磁性、酵素
活性その他で検出可能な信号を与えるものである。
ここで定義されている“５′→３′ヌクレアーゼ活
性”あるいは“５′から３′方向性のヌクレアーゼ活
性”とは鋳型特異的な核酸ポリメラーゼが持つ特性で、
いくつかのDNAポリメラーゼに存在することが従来より
知られていたオリゴヌクレオチドの５′端より核酸を逐
次的に除去していく５′→３′エキソヌクレアーゼ活性
（すなわち大腸菌E.coliのDNAポリメラーゼはこの活性
を持つがクレノー断片はこの活性を持たない）と、５′
端より一箇所以上の場所で切断する活性をもつ５′→
３′エンドヌクレアーゼ活性のどちらかあるいは両方を
指すものである。
ここで使われている“隣接した”とは鋳型核酸の相補
鎖上でプライマーとプローブとの位置関係について述べ
たものである。プライマーとプローブとは検出操作がポ
リマー反応には依存しないように、１−20塩基、より望
ましくは１−10塩基、あるいは直接互いに隣接している
ような状態にあることが望ましい。あるいは本発明がPC
R増幅法と検出法に使われているように、ポリマー反応
と依存するような場合、“隣接性”とは増幅されるシー
ケンス内の任意の部分、あるいはプライマー伸張産物に
より位置が決められるポリメラーゼによるプローブの切
断がおこる場所、すなわちプライマーの下流の任意の場
所を指している。
ここで使われている“耐熱性核酸ポリメラーゼ”と
は、大腸菌由来のポリメラーゼに比べ比較的熱に対して
安定な酵素を指し、ヌクレオシド３リン酸のポリマー反
応を触媒する酵素を指す。一般にこの酵素はターゲット
の核酸シーケンスにアニールしたプライマーの３′端よ
り反応を開始させ、鋳型に沿って５′方向に反応を進行
させ、もし５′→３′ヌクレアーゼ活性を有する場合介
在するアニールしたプローブを水解し、合成反応が終了
するまで標識あるいは未標識のプローブの遊離を行な
う。
Thermus aquaticus（Taq）から精製された代表的な耐
熱性酵素については米国特許第4,889,818号に開示され
ており、通常のPCR法での本酵素の使用法についてはSai
kiらの1988年Science誌239巻487ページに述べられてい
る。
Taq DNAポリメラーゼはDNA合成に依存した鎖置換５′
→３′エキソヌクレアーゼ活性を有している（Gelfand
著、“Taq DNA Polymerase"Erlich編PCR Technology:Pr
inciples and Applications for DNA Amplification St
ockton出版社ニューヨーク1989年第２章を参照）。溶液
中では、わずかだが標識オリゴヌクレオチドの分解が認
められる。
本発明の施行に当たっては、勿論他の技術も必要だ
が、従来の分子生物の技術、微生物、組換DNAの技術が
用いられるが、これらは技術界は確立されている。これ
ら技術については成書に良く記載されていう。Sambroo
k,Fritsch ＆ Maniatis,Molecular Clonining;A Labora
tory Manual,2版1989年、Oligonucleotide Synthesis
（M.J.Gait編、1984年）、Nucleic Acid Hybridization
（B.D.Hames ＆ S.J.Higgins編1984年、A Practical Gu
ide to Molecular Cloning（B.Perbal、1984年）および
Methods in Enzymology（Academic Press）の一連のシ
リーズを読まれたい。本書類の前出あるいは後出する全
ての特許、特許出願、出版物は参考文献として編入され
ている。
本発明の種々の特長は核酸ポリメラーゼの特殊な性質
によるものである。核酸ポリメラーゼは種々の活性を持
ちうるもので、そのうちでも５′→３′ヌクレアーゼ活
性により核酸ポリメラーゼは大きい相補的なポリヌクレ
オタイドにアニールしているオリゴヌクレオチドからモ
ノヌクレオタイドあるいは小さいオリゴヌクレオチドを
切り出す。切り出しが効率的に起こるためには、上流の
オリゴヌクレオチドも同じ大きいポリヌクレオタイドに
アイールしていることが必要である。
この上流に位置するオリゴヌクレオチドの３′端は核
酸ポリメラーゼに最初に結合するサイトを与えている。
結合したポリメラーゼが下流に位置するオリゴヌクレオ
チドの５′端に遭遇すると、ポリメラーゼはモノヌクレ
オタイドあるいは小さいオリゴヌクレオチドをそこから
切り出す。
この二つのオリゴヌクレオチドは相補的なターゲット
核酸上で近接してアニールし、上流のオリゴヌクレオチ
ドの３′端に結合した核酸ポリメラーゼが下流のオリゴ
ヌクレオチドの５′端に自動的に接するように設定する
ことが出きる。この反応は核酸ポリメラーゼが切り出し
を行なえる位置に達するためにポリマー反応を必要とし
ないため、“ポリマー反応非依存性切り出し”と呼ぶ。
一方、二つのオリゴヌクレオチドがターゲットの核酸
上でもっと離れてアニールした場合、核酸ポリメラーゼ
が下流のオリゴヌクレオチドの５′端に到達する前にポ
リマー反応が起こらなければならない。ポリマー反応の
進行に伴って、ポリメラーゼは下流のオリゴヌクレオチ
ドの５′端よりモノヌクレオタイドあるいは小さいオリ
ゴヌクレオチドを切り出していく。この切り出し反応は
下流のオリゴヌクレオチドの残りの部分が不安定となっ
て鋳型分子より解離するまで続く。この反応を“ポリマ
ー反応依存性切り出し”と呼ぶ。
本発明では、標識は下流のオリゴヌクレオチドに対し
て行なわれている。従って、ポリメラーゼの５′→３′
ヌクレアーゼ活性により切り出されたモノヌクレオタイ
ドあるいは小さいオリゴヌクレオチドはその検出が可能
である。
従って、切り出された断片と切り出されなかった標識
オリゴヌクレオチドを区別するための戦略が行なわれ
る。このようにして、本発明は上流と下流のオリゴヌク
レオチドに相補的なシーケンスを含む核酸サンプルの同
定を行なうものである。
本発明ではPCR法にポリメラーゼの５′→３′ヌクレ
アーゼ活性を組み合わせている。この点が先に記載され
ているPCR増幅法でPCR増幅後のターゲットオリゴヌクレ
オチドをプローブとハイブリダイズさせ、ターゲットシ
ーケンスと厳しいあるいは中低度の厳しさの条件の下で
ハイブリダイズおよび洗浄を行なって安定な二本鎖複合
体を形成させて検出を行なう方法と異なっている。これ
らの既知のPCR増幅後に検出を行なう方法と比較して、
本発明ではターゲット核酸の増幅反応中に検出を行なう
ことを可能としている。本発明では標識したオリゴヌク
レオチドをPCR開始時にプライマーと共に加え、プロー
ブからの標識ヌクレオチドの水解物からシグナルより、
増幅反応中のターゲットシーケンスの検出を行なえる方
法を呈示している。
しかしながら、本発明は他の増幅反応系すなわちター
ゲットシーケンスのRNAコピーを作り出すためのプロー
モーター部をコードするPCRプライマーを使っておこな
われる転写増幅系などにも適用可能である。同様にして
本発明は、一定の温度下で種々の酵素を用いてRNA転写
産物を作り次にDNAコピーを作り出すself−sustaned se
quence複製系（3SR）にも適用できる。ポリメラーゼ
５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をライゲースチェー
ン反応系（LCR）に組み込み、適当なオリゴヌクレオチ
ドを使うことにより本発明をLCR産物の検出に適用する
ことも可能である。
勿論本発明は増幅反応を含まない系にも適用すること
が出来る。実際、本発明はポリマー反応を必要としな
い。ポリマー反応依存性反応の利点はターゲットシーケ
ンスの増幅を必要としない点にある。プライマー伸張が
行なわれていない状態ではターゲットの核酸は本質的に
は一本鎖の状態である。プライマーと標識されたオリゴ
ヌクレオチドが近接してターゲットの核酸に結合してい
るとき、オリゴヌクレオチドのアニリングと標識断片の
切り出しが連続して行なわれる。従って十分な量の標識
断片が生成され、ポリマー反応なしで検出が可能とな
る。技術界の熟練者には理解されると思うが、PCR増幅
中につくりだされるシグナルはこのポリマー反応非依存
性活性により増大するだろう。
ここに記載されているいずれの方法を取るにせよ、関
心とされる特定のオリゴヌクレオチドのシーケンスすな
わち“ターゲットの核酸”を含むと思われる試料が与え
られる。試料中のターゲット核酸は、もし必要ならまず
逆転写されてcDNAとし、次に適当な変性方法、すなわち
技術界で良く知られている物理的、化学的、酵素的な方
法で変性される。鎖を分離する物理的な望ましい方法は
核酸を加熱して完全に（99％以上）変性させる方法であ
る。典型的な熱変性法は温度が80℃から105℃で時間は
数秒から数分加熱して行なう。変性の代わりに一本鎖RN
AあるいはDNAウイルスなどのように試料中のターゲット
核酸が一本鎖の形で存在している場合もある。
変性された核酸は次に予め選んであったオリゴヌクレ
オチドプライマーと標識オリゴヌクレチド（“ブロー
ブ”とも呼ぶ）と、プライマーとプローブが一本鎖核酸
鎖に結合するようなハイブリダイゼーションの条件下で
インキュベートする。良く知られているように、プライ
マーの二本鎖複合体上の相対的位置関係が、一方のプラ
イマーから伸張産物が合成され、その伸張産物が鋳型鎖
（相補鎖）より離れ、それが他のプライマーよりの伸張
産物の鋳型となって、一定の長さの複製チェーンをおこ
すようにプライマーは選ばれている。
相補鎖の方はプローブあるいはプライマーより長いの
で、一定の時間内で相補鎖の方が多くの点で接触し互い
に遭遇する機会も多い。プローブとプライマーのモル数
を非常に過剰にすることによって、鋳型鎖同志の再アニ
ーリングよりあるいはプローブとのアニーリングを起こ
るようにしている。
プライマーはポリマー反応を起こす物質の存在の下で
伸張産物の合成が起こるための十分な長さを持っている
必要がある。実際要求される長さとプライマーの構成
は、アニーリング反応の温度、プライマーの由来構成、
プライマーのアニールする場所とプローブのアニーリン
グする場所との近接の程度、プライマーとプローブの濃
度比など多くの要因に左右される。例えばターゲットシ
ーケンスの複雑性にもよるが、オリゴヌクレオチドプラ
イマーは15−30塩基長の長さであることが普通で、一方
プライマーの塩基長はそれより長い場合も短い場合もあ
る。プライマーはその対象となる相補鎖に選択的にアニ
ールして安定な二本鎖複合体を形成するために十分相補
性を持っていることが必要である。
ここで使用されているプライマーはそれぞれ特定のシ
ーケンスが増幅されるような各々の鎖に対して本質的に
は相補的となるようにしてある。プライマーは鋳型鎖の
シーケンスを忠実に反映している必要はないが、それぞ
れのプライマーに対応した鎖に選択的にハイブリダイズ
するように十分相補性を保っていることが必要である。
鋳型鎖と安定な二本鎖複合体を形成できる程度の相補性
が保たれる範囲であれば、非相補的な塩基あるいは余分
なシーケンスをプライマー中に挿入したりプライマー端
部に加えることも可能である。プライマーの非相補的な
塩基配列中には制限酵素の認識部位を含ませることも可
能である。
本発明の実施にあたってはまず標識オリゴヌクレオチ
ドブロープと相補核酸のアニールを行ない、次いで核酸
ポリメラーゼがこの二本鎖複合体の領域に遭遇し、５′
→３′ヌクレアーゼ活性により標識オリゴヌクレオチド
断片の切り出しと遊離を行なう。
プライマー伸張産物がこの二本鎖複合体に到達する前
あるいはポリマー反応依存的過程においてポリメラーゼ
が上流のオリゴヌクレオチドに結合する前に標識オリゴ
ヌクレオチドがそれに対する相補鎖核酸にアニールしや
すくなるために種々の技巧が用いられうる。ポリマー反
応依存的過程においてはプローブの５′端がプライマー
の３′端と十分離れるように配置することによってプラ
イマー伸張産物によるプローブの結合サイトの阻害が起
こる前にプローブが十分アニールできる時間が生じる。
短いプライマーは普通ターゲットの核酸と十分安定な複
合体を形成するのに低い温度を必要とする。従って標識
オリゴヌクレオチドはプライマーとのアニーリングに比
較してより高い温度でターゲットとアニールするように
プライマーより長くなるように設定する。
また異なった熱安定性のプライマーと標識オリゴヌク
レオチドを使用することも可能である。例えば、標識オ
リゴヌクレオチドの塩基構成をG/C含量が大きくなるよ
うに選ぶと熱安定性はプライマーより高くなる。同様に
して、自然界に存在する核酸より安定な塩基対を形成す
る塩基の同族体を含む修飾ヌクレオチドをブローブ中に
取り込ませることも可能である。
本検定法においてプライマーの結合に先立ってプロー
ブの結合の効率を最大限にするためのプローブの修飾に
はプローブ内にプラスの荷電あるいは中性のフォスフォ
ダイエステル結合を取り入れてプローブとターゲットの
多荷のマイナス荷電による反発力を軽減させる効果もあ
る（Letsingerら、1988年J.Amer.Chem.Soc.110巻4470ペ
ージ参照）；プローブ中に５ブロモウリジンのようなア
ルキル化あるいはハロゲン化した塩基を取り込ませると
塩基のスタッキングが増加し；プローブ中にリボヌクレ
オチドを取り込ませるとプローブとターゲットの複号体
をＡ型に移行させ塩基のスタッキングが増加し；プロー
ブ中のアデノシンのいくつかあるいは全てを2,6−ディ
アミノプリン（アミノアデノシン）に置き換える。本発
明でこのようにプローブの修飾を行なうに当たって、二
本鎖複合体形成において律速段階となるのは“ヌクレー
ション”すなわち一本鎖部の形成であり、従ってプロー
ブ生物物理的性質を変えて十分満足の行く結果をなるの
は３′端あるいは５′端の部分のみである。更に、プロ
ーブの３′端部（３′端の８−12ヌクレオチド）はポリ
メラーゼによる５′端部のエキソヌクレアーゼによる分
解に続いて解離するので、３′端の修飾はポリメラーゼ
／ヌクレアーゼの干渉を考慮に入れる必要がなく行なえ
る。
熱サイクリングのパラメータも標識オリゴヌクレオチ
ドとプライマーの熱安定性の違いを利用して変えること
ができる。たとえば熱サイクル中の変性ステップに続い
て標識オリゴヌクレオチドは結合するプライマーは結合
しないような中間の温度を導入し、続いて温度を下げて
プライマーのアニーリングと伸張がおこるようにさせ
る。適切な結果を得るためにはプローブの切り出しはPC
R反応の後の方のサイクルでのみ行なわれるべきであ
る。このようにして最初はプライマーが優位にプローブ
に結合するが、プライマー伸張反応を通してプライマー
濃度が減少し、サイクルの後半ではプローブが優位にプ
ライマーに結合するように反応混合液を設定することが
できる。
プライマーより前に標識オリゴヌクレオチドを結合さ
せるためにプライマー濃度に比べモル数の過剰な標識オ
リゴヌクレオチドを使うことも可能である。実際この方
法を行なうには、プライマー濃度の２−20倍以上の標識
オリゴヌクレオチド濃度にし、これは普通0.5−5x10-7M
である。オリゴヌクレオチドの濃度、長さ、塩基構成は
反応液中のオリゴヌクレオチドのTmに関係する重要な要
因であることは良く知られている。これらの要因を操作
してプローブのアニーリングがプライマーのアニーリン
グに勝るように熱力学的なバイアスをかけることも可能
である。
オリゴヌクレオチドとプライマーは適当な方法により
調達できる。特定のシーケンス配列のオリゴヌクレオチ
ドを調達するには、よく知られているように適当な配列
からのクローニングおよび制限酵素による方法と直接化
学的に合成する方法などがある。化学合成法には、Nara
ngらによる1979年Methods in enzymology 68巻90ページ
に記載されているフォスフォトライエステル法、Brown
らによる1979年Methdos in enzymology 68巻109ページ
記載のフォスフォダイエステル法、Beaucageらによる19
81年Tetrahedron Leters 22巻1859ページ記載のジエチ
ルフォスフォラミダイト法、米国特許第4,458,066号記
載の固相支持体法などがある。
標識オリゴヌクレオチドの塩基構成はヌクレアーゼ活
性による鎖の除去（オリゴヌクレオチド全体をカバーす
るモノヌクレオタイドあるいはダイヌクレオタイドの断
片）を促進するためにGCに富む塩基配列にしたりＡある
いはＴが連続しないようにしたりプローブ中の標識の位
置を適切な場所に設定したりする。相補性プローブの
５′の領域にATに富むシーケンスがあると、切断はそれ
より４、５あるいは６塩基後ろで起こる。一方相補性プ
ローブの５′の領域にGCに富むシーケンスがあると、切
断はそれより１あるいは２塩基後ろで起こる。これとは
別に、標識プローブを化学合成する際に修飾フォスフォ
ダイエステル（フォスフォロチオエートあるいはメチル
フォスフォネートなど）を取り込ませることにより（No
bleら、1984年Nuc Acid Res 12巻3387−3403ページ;Iye
rら、1990年J.Am.Chem.Soc.112巻1253−1254ページ）特
定の位置の切断を阻止することができる。プローブ長、
相補性プローブの５′の領域の塩基構成、プローブ中の
標識の位置にもよるが、本発明の標識プローブ断片の長
さは短くあるいは長くなるようにプローブを設定するこ
とが可能である。
以下に示すようにオリゴヌクレオチドの標識は分光学
的、光化学的、生化学的、免疫化学的、あるいは化学的
な方法で検出できる分子をとりこませて行なわれる。標
識物をオリゴヌクレオチドプローブに結合させる方法
は、用いられる標識物の種類とプローブ中の標識物の位
置に依存している。
本発明で使用するのに適当なプローブの種類として
は、プローブにそれらを取り込ませる方法と同様に技術
界では良く知られているが、酵素（アルカリフォスファ
ターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼなど）、酵素基
質、放射活性原子、蛍光色素、発色基、化学発光標識
物、OrigenTM（Igen社）などの電気化学発光標識物、特
定の結合相手を持つリガンド、あるいは互いに作用して
シグナルを増強したり、変えたりまたは減弱させる標識
物などがあるがこれだけに制限されるものではない。勿
論、PCRがサーマルサイクラーの装置で実行されるな
ら、標識物はこの自動化反応に要求される温度サイクリ
ングの間壊れずに持ちこたえる必要がある。
放射性原子のなかでは、32Pが望ましい。32Pを核酸中
に取り込ませる方法は技術界で良く知られているが、例
えば、リン酸化酵素による５′端標識やニックトランス
レーション法によりランダムに取り込ませる方法などが
ある。酵素はその活性を検出することが普通である。
“特定の相手に結合するもの”とはリガンド分子に高い
特異性で結合する蛋白を指し、例えば抗原とそれに特異
的なモノクロナール抗体がそれにあたる。他の“特定の
相手に結合するもの”には、ビオチンとアビジンあるい
はストレプトアビジン、IgGとプロテインＡ、多くのレ
セプターとそのリガンドなどが知られている。先に述べ
たことは種々の標識物を特定のクラスに分類しようとす
るものではなく、というのは同じ標識物を種々の異なっ
た様式でつかうことができるからである。例えば、125I
は放射性標識物として使うことも高電子密度の物質とし
てつかうこともできる。HRPも酵素あるいはそれに対す
るモノクローナル抗体の抗原としてつかうことができ
る。さらに種々の標識物を組み合わせて望んだ効果を得
ることもできる。例えば、ビオチン標識したプローブを
使いこのプローブの存在を125I標識したアビジンで検出
し、一方HRP標識した抗ビオチンモノクローナル抗体で
検出することもできる。他の組み合わせ及び可能性は技
術に習熟している人に容易に明らかであるし、簡単な発
明の範囲では同等なものと考えられる。
本発明で標識したプローブを作るのに際し標識物とし
て使用する蛍光物質には、ローダミンおよびその誘導体
であるテキサスレッドなど、フルオレセインおよびその
誘導体である５−ブロモメチルフルオレセイン、ルシフ
ェールイエロー、IAEDANS、７−Me2N−クマリン−４−
酢酸、７−OH−4CH3−クマリン−３−酢酸、７−NH2−
４−CH3−クマリン−３−酢酸（AMCA）、モノブロモビ
マネ、カスケードブルーのようなピレントリサルフォネ
ート、およびモノブロモトリメチル−アンモニオビマネ
などがある。一般に蛍光基質としては、モノクロモメー
ターの代わりにフィルターと共にフルオロメータを使っ
て検出効率があげられるように広いストークスシフトを
もつものが望ましい。
またある場合は、ひとつのオリゴヌクレオチドに対し
て二種類の相互作用する標識物を、オリゴヌクレオチド
上で二つの標識物がある間隔を保つように標識してオリ
ゴヌクレオチドの水解において標識物が分離するように
して使うこともできる。
本発明のその他の具現化として、水解された標識プロ
ーブの検出をたとえば蛍光偏光すなわち大きい分子と小
さい分子をその分子振動により区別することも可能であ
る。大きい分子は（すなわち元のままの標識プローブ）
溶液中で小さい分子に比べよりゆっくり振動しているこ
とに基ずく。蛍光分子が対象となる分子（すなわち標識
プローブの５′端）に結合すると、この蛍光分子は分子
振動により測定（および区別も）が可能となり、もとの
ままのプローブと消化されたプローブを区別することが
できる。測定はPCR反応中に直接行なうこともできる
し、PCR終了後に行なうこともできる。
また別の具現化として、二本鎖核酸ターゲットのそれ
ぞれの鎖の離れた領域に相補的で互いには相補的でな
く、オリゴヌクレオチドがそれぞれのプライマーの下流
にアニールするような二つの標識オリゴヌクレオチドを
使うほうほうがある。例えば、二種類のプローブが存在
すれば一種類のプローブを使って得られるシグナルの二
倍の強度が得られうること、さらにPCR増幅中にしばし
ば見られる産物同志の再アニーリングを低下させうる。
プローブはプライマーが結合するすぐ下流に結合するよ
うに設定する。
本発明では多種のプローブを使用することにより別の
利点も得られる。たとえば反応液中に多種類のプローブ
を加えておくのみで任意の数の病原菌の検査を行なうこ
とが出きる；この際プローブは検出が容易なように異な
った標識をしておくのがよい。
また対立遺伝子（アレーレ）特異的あるいは種特異的
（すなわちLyme病の原因菌と考えられるBorreliaの異な
った種）な識別も多種のプローブ使用で可能で、すなわ
ち異なったTmのプローブを使用し一組のプローブ／アレ
ーレ二本鎖複合体にのみ特異的な温度下でアニーリング
／切り出しを行なう。例えば、HTLV IとHTLV II両方を
増幅するプライマーとHTLV I、HTLV IIそれぞれに特異
的な二つのプローブを使用する。またアレーレ特異的な
識別はプローブは一種のみ用いて切断物の種類を調べる
ことによって行なえる。本発明のこの具現化において
は、プローブは最低５′端の領域で一方のアレーレに完
全に相補的に一致して、他のアレーレとは一致しないよ
うに設定する。他のアレーレについては、プローブは
５′端領域でミスママッチングとなるようにし、完全に
相補的なアレーレにハイブリダイズしたときに切り出さ
れてくう断片と異なった断片が切り出されるようにす
る。
プローブのシーケンスを選ぶことは非常に有益である
が、プローブの標識法をえらぶことも同様に有益な結果
をもたらす。標識物は種々の方法によって直接あるいは
間接にオリゴヌクレチドに結合される。使われる標識物
の種類によって、標識はプローブの５′端あるいは３′
端、プローブの内部、あるいはシグナルの相互作用を容
易にするような種々の大きさ構造を持ったスペーサーア
ームを介して結合している。市販されているフォスフォ
ラミダイト試薬を使うと保護されたフォスフォラミダイ
トを介して５′端あるいは３′端に官能基（チオールあ
るいは一級アミン）を持つオリゴマーを合成することが
でき、それへの標識のプロトコルはPCR Protocols:A Gu
ide tomethods and Application（Innisら編アカデミッ
クプレス、1990年）などに記載されている。
オリゴヌクレオチドに官能基を与える試薬を用いてオ
リゴヌクレオチドプローブ、とくにその５′端に一つ以
上のスルフヒドリル基、アミノ基、水酸基を取り込ませ
る方法は米国特許第4,914,210号に記載されている。
５′リン酸はポリヌクレオタイドキナーゼとガンマー32
P−ATPを使って放射性アイソトープとして取り込ませる
ことができる。ビオチンも、ビオチン−Ｎハイドロキシ
サクシニマイドエステルを用いて、アミノサイミジン残
基、あるいは６−アミノヘキシル残基と作用させて５′
端に取り込ませることができる。３′端への標識はポリ
ヌクレオタイドターミナルトランスフェラーゼを使って
必要な分子たとえばコルディセピン35S−dATPやビオチ
ン化dUTPを取り込ませることができる。
オリゴヌクレオチドの誘導体も標識物として利用でき
る。例えば、エテノ−dAあるいはエテノ−Ａは蛍光性の
アデニン塩基でオリゴヌクレオチドに取り込ませること
ができる。同様に、エテノ−dCあるいは２−アミノ−デ
オキシリボシドはプローブ合成に使わせる例の誘導体で
ある。このような塩基誘導体を含むプローブが、PCR反
応でプライマー伸張を行なっているDNAポリメラーゼの
５′→３′ヌクレアーゼ活性により水解されると非常に
蛍光の強いモノヌクレオタイドを遊離する。
オリゴヌクレオチドプライマーの鋳型依存性伸張反応
は適量の塩、金属イオン、pH緩衝系の反応液中に適当量
の４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dATP、dG
TP、dCTP、dGTP）が存在するときポリマー化をおこなう
物質によって触媒される。ポリマー化をおこなうのに適
しているのは酵素で、プライマー及び鋳型依存性DNA合
成を行ない５′→３′ヌクレアーゼ活性も持っている。
知られているDNAポリメラーゼには例えば、大腸菌DNAポ
リメラーゼI.Thermus thermophilus（Tth）のDNAポリメ
ラーゼ、Bacillus stearothermophilusのDNAポリメラー
ゼ、Thermococcus litoralisのDNAポリメラーゼ、Therm
us acquaticus（Taq）のDNAポリメラーゼなどがある。
これらポリメラーゼによるDNA合成反応を触媒する条件
はよく知られている。本発明が有効におこなわれるため
には、ポリマー反応を行なう物質がオリゴヌクレオチド
を切り出し標識断片を遊離して直接あるいは間接にシグ
ナルが作り出されなければならない。
合成による産物は鋳型鎖とプライマー伸張産物からな
る二本鎖分子で、これにはターゲットの塩基配列が含ま
れている。合成反応による副次的産物は標識されたオリ
ゴヌクレオチド断片でモノヌクレオタイド、ダイヌクレ
オタイドあるいはそれより長いヌクレオタイドの混合物
である。変性、標識オリゴヌクレオチドとプライマーの
アニーリング、プライマー伸張と標識オリゴヌクレオチ
ドの切断の一連のサイクルを繰り返すことにより、プラ
イマーによって定まるターゲットの領域の部分が指数的
に蓄積し、標識断片も指数的に産生される。十分なサイ
クル数行なうことによりバックグランドによる数オーダ
ー高い検出可能な標識物を得られるが、通常の方法では
このように高いシグナル／ノイズ比は得られない、 望ましい方法では、PCR反応は熱安定性酵素を使って
自動化された反応で行なわれる。この反応では反応液は
変性のステップ、プローブとプライマーをアニールさせ
るステップ、およびプライマー依存性の鋳型伸張反応と
同時に切断と解離が起きている合成のステップを繰り返
される。Perkin−Elmer Cetus社から市販されている機
会のような耐熱性酵素を使うために特別に設計されたDN
Aサーマルサイクラーを用いてこの反応が行なわれる。
この自動化反応では熱安定性のポリメラーゼが望まし
い、というのはPCRサイクリング中で二本鎖伸張産物を
変性させるのに好ましい方法は高温（95℃程度）にさら
すことだからである。米国特許第4,889,818号にThermus
aquaticusより分離された代表的な熱安定性酵素につい
て開示されている。その他の代表的な耐熱性ポリメラー
ゼは、すなわち以下の耐熱性バクテリアThermus flavu
s,Thermus ruber,Thermus thermophilus,Bacilus stear
othermophilus（これはほかのものよりは至適温度がや
や低めである）、Thermus lacteus,Thermus rubens,The
rmotoga maritina,Themococcus litoralis,Methanother
mus fervidusより抽出されたものである。
標識オリゴヌクレオチド断片の検出あるいは検証は種
種の方法によって行なわれるが、標識物の種類あるいは
標識の方法に左右される。本発明の具現化の簡便な方法
は反応産物を、切断された標識断片も含めてその大きさ
を解析することである。標識核酸断片の大きさを知る方
法は良く知られていて、たとえばゲル電気泳動法、密度
勾配による沈降、ゲルエクスクルージョンクロマトグラ
フ法、ホモクロマトグラフ法などがある。
増幅反応中あるいは反応後、PCR反応液により標識断
片の分離は、たとえばPCR反応液を固相抽出物（SPE）と
接触させることによって行なわれる。例えば、オリゴヌ
クレオチドの大きさあるいは荷電によって結合すること
のできるあるいはオリゴヌクレオチド塩基と相互作用で
きるような材料をPCR反応液に、未切断標識断片は結合
し短い標識断片は結合しない様な条件下で加える。この
種のPSEの材料にはイオン交換樹脂あるいはビーズ、す
なわち市販されているものとして、Nensorb（デゥポン
社）、Nuoleogen（The Nestグループ）、PEI,Baker Bon
d TM PEI,アミコンPAE 1,000,Selectaacel TM PEI,ホウ
素化したSPEに３′リボースプローブを結合したもの、
プローブの３′端に相補的な塩基配列を含んだSPE、ハ
イドロキシアパタイトなどがある。具現化の特殊な例と
して、二重標識されたオリゴヌクレオチドの３′ビオチ
ン標識を５′標識から区別するのにヌクレアーゼに対す
る感受性のサイトをシグナルとして利用する場合、PCR
反応液を、アビジン、ストレプトアビジンあるいはビオ
チンにたいするモオクローナル抗体のような特定の結合
する相手を含んだ材料と反応させる。このような材料に
は、特定の結合する相手を表面にコーティングしたビー
ズあるいは粒子があげられ、磁性体粒子の利用も可能で
ある。
PCR反応液をSPEと接触させた後、SPEの材料は濾過、
沈降、あるいは磁力によって取り除かれ未切断の標識オ
リゴヌクレオチドを含まない標識断片が遊離され検出が
行なえる。
本発明の方法で使用される試薬は診断キットとしてパ
ッケージすることが可能である。診断キットには標識オ
リゴヌクレオチドとプライマーが別々の容器に納められ
ている。オリゴヌクレオチドが未標識の場合、特定の標
識用の試薬をキットに組み込んでも良い。またキットに
は増幅反応に必要な緩衝液、dNTPおよびポリマー反応を
おこなうもの、検出を行なうものに必要な酵素、固相抽
出物などの試薬あるいは材料を検定を行なうための説明
書と共に加えても良い。
以下に示す例示は本発明の種々の方法および組み合わ
せを説明しようとするものである。
例１ PCRによる標識プローブの遊離 目的の産物が合成されたときに相補的なプローブの32
Pで標識された５′端が遊離されるPCR増幅反応。
A.ガンマ32P−ATPとポリヌクレオタイドキナーゼを用い
たプローブの標識 各10pmolのプローブ（BW31、BW33、BW55、塩基配列は
後述）をそれぞれ15ユニットのT4ポリヌクレオタイドキ
ナーゼ（New England Biolabs）、15.3pmolのガンマ32P
−ATP（New England Nuclear,3000キューリ/nmol）を50
mM Tris−HCl、pH7.5、10mM MgCl2、5mMジチオスレイト
ール、0.1mMスペルミジン、0.1mM EDTAを含む50μの
反応液と混合し37℃で60分反応させる。次にSambrookら
編のMolecular Cloning第二版（1989年）に記述されて
いるように、全量をフェノール／クロロホルム抽出し、
エタノール沈殿する。前述のSambrookら編に記載されて
いが、プローブは100μのTEバッファに再溶解しセフ
ァデクスＧ−50スピンカラムにかけ取り込まれなかった
ガンマ32P−ATPを取り除く。反応物のTCA沈殿は以下の
ような比活性を示していた。
三種のプローブの最終的な濃度は0.10pmol/μであ
った。
B.増幅 増幅を行なった領域はバクテリオファージM13mp10w由
来のプライマーBW36、BW42ではさまれる350塩基対の部
分である。ここに示す数字をつけた各プライマーの塩基
配列は標準として使われているM13塩基配列に従ってい
る。
三種類の異なったプローブが使用され、各プライマー
はM13mp10wに対し丁度30塩基相補的な配列を持っている
が５′端領域の非相補的な部分は長さが異なるようにな
っている。プローブはTaqポリメラーゼによる伸張を防
ぐために３′がOH基でなく３′がPO4基となるように化
学合成されている。
Ｘ ３′リン酸基をしめす a,t,g,c,の鋳型鎖に非相補的であることをしめす。
＊ガンマ32P−ATP標識 350塩基対の断片の増幅を行なうために、10-3pmolの
ターゲットのM13mp10wシーケンスを、50mM KCl、10mM T
ris−HCl、pH8.3、3mM MgCl2、10pmolの各プライマーBW
36とBW42、200μＭの各デオキシリボヌクレオシド三リ
ン酸、1.25ユニットのTaq DNAポリメラーゼと１、10、2
0pmolいずれかの等アイソトープ量となるように希釈し
たプローブBW31、BW33、BW35を含む50μの反応液に加
える。放射性標識物の量は一反応当たり0.4pmol一定に
なるようにし非放射性のプローブ１、10、あるいは20pm
olで希釈する。Taqポリメラーゼ10mM Tris−HCl、pH8.
0、50mM KCl、0.1mM EDTA、0.5％NP40、0.5％Tween20、
500μg/mlゼラチンで0.3125ユニット／μに希釈した
ものを一反応当たり４μ加える。
マスターとなる反応液中は適当な量の反応バッファ、
ヌクレオシド三リン酸、一組のプライマー、、および酵
素を加える。このマスターの反応液を等分し、鋳型と種
々の濃度のプローブを加える。対照とする反応は全ての
反応成分のうち鋳型とプローブを除外したもの以外から
構成されている。各反応液は蒸発しないように50μの
ミネラルオイルが上にのせられ、45秒遠心後、サーマル
サイクラーに設置される。反応液は次の増幅反応を行な
われる。
15サイクル 96℃ 変性 １分 60℃ アニール／伸張 1.5分 １サイクル 96℃ 変性 １分 60℃ アニール／伸張 5.5分 サイクル終了後、ミネラルオイルは50μのクロロフ
ォルムで抽出され、４℃に保存され、つぎのテストが施
行される。
C.解析 アクリラミドゲルによる解析のために、増幅反応産物
の４μを３μの５×ゲルローディング液（0.125％
ブロモフェノールブルー、12.5％フィコール400水溶
液）と混ぜ、４％アクリラミドゲル（10×TBEバッファ1
0ml、10％過硫酸アンモニウム1ml、49％ビスアクリラミ
ド19:1 10mol、50μのTEMED、水79ml）にのせ、１×T
BEバッファ（0.089M Tris,0.089Mホウ酸、2mM EDTA）中
で200ボルト90分間電気泳動を行なう。エチジウムブロ
マイド染色後、DNAをUV蛍光で可視化する。
その結果、三種のそれぞれのプローブの種々の濃度は
増幅される産物の量には影響を与えないことがわかっ
た。
プローブを含まないサンプルをのせたレーンには目的
の塩基配列に相当する350塩基長の明瞭な強度の強いバ
ンドが認められる。プローブを含む全てのレーンには幾
らか分子量の大きいいくらかの微弱なバンドと共におな
じバンドが認められる。鋳型を加えられていない対照の
バンドでは、30−40ベースにプライマーをしめす弱いバ
ンドを認めるのみで、350ベース付近にはまったくバン
ドが認められない。
写真撮影の後、ゲルをワットマンロ紙上に移し、サラ
ンラップで覆ってオートラジオグラフを行なった。一晩
の露出により、90−95％の放射性標識物がプローブある
いは部分的に分解したプローブがそこまで流れているこ
とを示すゲルの底にあった。
変性ゲルによる解析のため、増幅反応産物の各２μ
をフォルマミドローディングバッファ（0.5M EDTA pH8.
0 0.2mol、ブロモフェノールブルー10mg、キシレンシア
ノール10mg、フォルマミド10ml）２μに加え、96℃３
−５分加熱し、氷上で冷却する。サンプルを6.2％の変
性勾配ポリアクリルアミドゲル（ショ糖バッファの勾配
を設けた7Mの尿素による）に前述のSambrookら編に記載
されている方法に従ってローディングする。ゲルの電気
泳動を2000V、45Wで90分行ない、ワットマンロ紙に移
し、オートラジオグラフィを行なう。
変性ゲルの結果、各プローブの約50％がサイズの小さ
い標準断片に分解されていた。カウント約50−60％は30
−40塩基長の位置にあり、未分解のプローブに相当して
いる。全ての増幅反応で極めて微弱なバンドが300塩基
長の位置に認められ、プローブのうち非常に少ない割合
のものは３′PO4が失われたかあるいは元々なく、伸張
反応が進んでしまったことを示している。残りのカウン
トは０−15塩基長の位置にあった。この種のゲルの解像
力は産物の真の大きさを反映しているわけではないの
で、ホモクロマトグラフィによる解析を行なうほうが良
い。
ホモクロマトグラフィの解析のため、各サンプルの１
μを1.2cm間隔で、予め５μのシェアをくわえたニ
シン精子DNA（150μg/ml）をスポットし乾燥させておい
た20×20cMのポリグラムCEL300DEAEセルロース薄層プレ
ート上にスポットする。サンプルが乾いた後、プレート
を蒸留水で満たした水槽に置き、丁度サンプルをのせた
すぐ上まで水を昇らせる。プレートを次に濾過した7Mの
尿素を含むRNAの部分分解物の水溶液Homo−mix III（Ja
yら、1979年Nuc.Acid.Res.1巻（３）、331−353ペー
ジ）の入ったガラスの展開層に置き、70℃のオーブン内
に置く。毛細管現象によりHomo−mixがプレートの上ま
で昇った後、プレートを取り出し、乾燥させサランラッ
プでおおってオートラジオグラフィを行なう。
ホモクロマトグラフィプレートの一晩の露光の結果、
約40％のプローブが分解されて小さい断片となってい
た。これら断片は各プローブの５′非相補的なテールに
よってそれぞれ特長的な大きさを示していた。図１がTL
Cプレートのオートラジオグラフィを示している。プロ
ーブBW31（レーン１−３）はM13mp10wの鋳型に完全に相
補的で生成された標識断片は主に１−２塩基長である。
プローブBW33（レーン４−６）は３塩基の５′非相補的
領域を持っていて、主に４−６塩基長の産物を遊離して
いる。プローブBW35（レーン７−９）は10塩基の５′非
相補的領域を持っていて、主に12−13塩基長の産物を遊
離している。レーン10−12は各BW31、BW33、BW35と鋳型
を除いたPCR成分による対照反応を15サイクル行なった
後のものである。DNA合成の間に、酵素は最初に遭遇し
た１−２塩基対をはずしてそこで切断しているが、エン
ドヌクレアーゼに類似の活性であることを示している。
ここの結果はPCR反応における産物の蓄積に相関した特
異的なプローブの放出を示している。
例２ 標識プローブの遊離の特異性 標識プローブの遊離の特異性に関して、バクテリオフ
ァージラムダとプライマーと非相補的なリン酸化を行な
ったプローブのシリーズを用いてPCR反応を行なって調
べた。増幅する領域はGene Amp DNA増幅試薬キット（Pe
rkin−Elmer Cetus）のバクテリオファージDNAの500塩
基長の領域で、やはりGene Amp DNA増幅試薬キットにふ
くまれているプライマーPCRO1とPCRO2ではさんで増幅し
た。
例１に示されている３種の標識プローブBW31、BW33、
BW35の等分量を使用したが、これらプローブはすべて鋳
型鎖とは完全に非相補である。
500塩基対長の領域の増幅のために、0.5ngのターゲッ
トのラムダDNAシーケンス（コントロール用テンプレー
ト、ロット番号3269、１μg/ml、10mM Tris−HCl、pH8.
0、1mM EDTAで1:10に希釈、10mM NaClで保存）を50mM K
Cl、10mM Tris−HCl、pH8.3、3mM MgCl2、１μＭの各プ
ライマーPCRO1（ロット番号3355）とPCRO2（ロット番号
3268）、200μＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン
酸、1.25ユニットのTaq DNAポリメラーゼと２、10、20p
molいずれかの等アイソトープ量となるように希釈した
プローブBW31、BW33、BW35を含む50μの反応液に加え
る。放射性標識物の量は一反応当たり0.4pmol一定にな
るようにし非放射性のプローブ１、10、あるいは20pmol
で希釈する。Taqポリメラーゼは10mM Tris−HCl、pH8.
0、50mM KCl、0.1mM EDTA、0.5％NP40、0.5％Tween20、
500μg/mlゼラチンデ0.3125ユニット／μに希釈した
ものを一反応当たり４μ加える。マスターとする反応
液は前述したように、プローブを入れないものあるいは
酵素を入れない対照反応液と共に作成する。反応液は例
1Bに示されたサイクリング条件に従って増幅を行ない以
下の解析を行なう。アクリラミドゲル解析のため、増幅
反応産物の各４μを３μの５×ゲルローティング液
と混ぜ、４％アクリラミドゲルにのせ、１×TBEバッフ
ァ中で200ボルト90分間電気泳動を行なう。エチジウム
ブロマイド染色後、DNAをUV蛍光で可視化する。
その結果、いずれのプローブの種々の濃度も増幅され
る産物の量には影響を与えないことがわかった。プロー
ブを含まないサンプルをのせたレーン、およびプローブ
を含む全てのレーンには目的の塩基配列に相当する500
塩基長の明瞭な強度の強いバンドが認められる。酵素を
加えていない対照のレーンでは産物に相当するバンドは
認めないが、30−40塩基長にプライマーをプローブをし
めす弱いバンドを認める。
図２に示すのはプレートを一晩露光したホモクロマト
グラフィ解析の結果で、プローブの分解が起こっていな
いことを示している。カウントの全ては原点に位置して
おり、標識断片の遊離が起こっていないことを示してい
る。レーン１−３はプローブBW31を含む反応、レーン４
−６はプローブBW33、レーン７−９はプローブBW35を含
む反応で、レーン10−12は鋳型鎖を含まない対照反応で
ある。この結果はプローブが特異的に鋳型鎖に結合しな
い限り分解されないことを示しており、またPCRサイク
リングの条件に耐えていることも示している。
変性ゲルによる解析のため、増幅反応産物の各２μ
をフォルマミドローディングバッファ（例１に記述）２
μに加え、ヒートブロックで96℃３−５分加熱する。
すぐに氷上で冷却し、サンプルを6.2％の変性勾配ポリ
アクリルアミドゲルにローディングし、ゲルの電気泳動
を2000V、90分行ない、ワットマンロ紙に移し、サラン
ラップでおおいオートラジオグラフィを行なう。
一晩の露光の結果、カウントの全ては30−40塩基長の
位置にあり、未分解のプローブに相当していた。また、
明らかなプローブの分解を認められず、プローブは鋳型
鎖に特異的に結合して始めて分解を受けているという事
実をさらに確証するものである。
例３ 遺伝子DNA存在下での標識プローブの遊離の特異性 本例では標識プローブの遊離の特異性を分解あるいは
未分解のヒト遺伝子DNAの存在の下でPCR増幅反応を行な
って調べてみた。
本例で使用したリン酸化を行なったプローブBW33の比
活性はリン酸化反応後のTCA沈殿により5.28×106cpm/pm
olであった。増幅を行なう領域はM13mp10wの350塩基対
長の部分で、プライマーBW36、BW42ではさんで行なわれ
る。プライマーの塩基配列および位置は例１に示してあ
る。ヒト遺伝子DNAは細胞株HL60のものを使い、未分解
あるいはフレンチプレスで約800塩基対長に分解して使
用している。
各50μの増幅反応液は、10-2あるいは10-3pmolのタ
ーゲットシーケンスM13mp10w、１μｇの分解あるいは未
分解のHL60遺伝子DNA、50mM KCl、10mM Tris−HCl、pH
8.3、3mM MgCl2、10pmolの各プライマーBW36とBW42、20
0μＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、1.25ユ
ニットのTaq DNAポリメラーゼと10pmolの等アイソトー
プ量となるように希釈したプローブBW33から構成されて
いる。
マスターとなる反応液には適当量の反応バッファ、ヌ
クレオシド三リン酸、プライマー、プローブ、酵素が含
まれている。等分にわけたものにM13mp10w鋳型及び／あ
るいは遺伝子DNAを加える。対照用の反応液にはM13mp10
w鋳型のみ取り除いた他の反応液成分あるいは遺伝子DNA
のみ取り除いた他の反応液成分を用いる。
各反応液に50μのミネラルオイルを加え、遠心し、
サーマルサイクラに設置する。反応液は次の増幅反応を
行なわれる。
10、15、あるいは20サイクル 96℃変性 １分 60℃ アニール／伸張 1.5分 最終サイクル 96℃ 変性 １分 60℃ アニール／伸張 5.5分 サイクル終了後、ミネラルオイルは50μのクロロフ
ォルムで抽出され、４℃に保存される。サンプルはつぎ
に４％アクリラミドゲル電気泳動およびホモクロマトグ
ラフィによる解析が行なわれる。
アクリラミドゲルニよる解析のために、増幅反応産物
の４μを３μの５×ゲルローディング液と混ぜ、４
％アクリライドゲルにのせ、１×TBEバッファ中で220ボ
ルト90分間電気泳動を行なう。エチジウムブロマイド染
色後、DNAをUV蛍光で可視化する。
M13mp10w鋳型を含まない対照サンプルに相当するレー
ンでは、産物のバンドが見えず、M13mp10w鋳型のクロス
オーバのコンタミネーションがないことを示している。
続くレーン全てには期待されるシーケンスに相当する35
0塩基のバンドが認められる。
10-2pmolのM13mp10w鋳型が存在するときのバンドの強
度は、遺伝子DNA（分解あるいは未分解）が存在する、
しないに関わらず10-3pmolのM13mp10w鋳型のばあいにく
らべ強い。産物のバンドの強度は増幅サイクル数が増え
るに従って強くなる。20サイクルの増幅は10サイクルの
時にみられる強度の２倍の強度を与え、15サイクルの増
幅はその中間となっている。PCR産物の量は開始時のタ
ーゲットの鋳型量とサイクル数によって変わり、１μｇ
のヒト遺伝子DNAの存在は、それが分解されているか分
解されていないかに関わらず、全く影響を与えない。
ホモクロマトグラフィの解析のため、各サンプルの１
μをDEAE薄層プレート上にスポットしHomo−mix III
の入ったガラスの展開層に70℃で置く。90分後、プレー
トを取り出し、乾燥させ、サランラップでおおってオー
トラジオグラフィを行なう。一晩露光後を図３に示す。
図3Aで、レーン１−６はM13mp10w鋳型が存在しない条件
で変わりに分解あるいは未分解のHL60DNAを10、15、20
サイクルPCR反応サイクル行なったものである；レーン
７−12はM13mp10w鋳型が存在する条件でヒト遺伝子DNA
が存在しないとき10、15、20サイクルPCR反応サイクル
行なったものを二つずつロードしたものである。図3Bで
反応は10サイクルから始めて５サイクルづつ増加して行
なっている。M13mp10W鋳型DNAの濃度レーン１、２、
５、６、９、10では10-2pmolで、レーン３、４、７、
８、11、12では10-3pmolである。レーン１−11のうち奇
数番号は分解されたヒト遺伝子DNAを含み、偶数番号は
未分解のヒト遺伝子DNAを含んでいる。標識プローブ断
片は薄層プレート上で約4.5塩基長にあたる位置に移動
している二つのあきらかなスポットとして認められる。
サイクル数の増加と同様に開始時の鋳型の増加に相関し
て、遊離される標識プローブ断片の量も増加している。
ヒト遺伝子DNAが存在するか否かは、それぞれ分解され
ているか分解されていないかに関わらず、プローブのハ
イブリダイゼーションあるいは分解を阻害したり増強す
るものではない。
この結果は、遊離されるプローブの小断片の量の増加
はPCR検定法が行なわれる間に特異的に蓄積される産物
に相関し連立した現象であることを示している。大量の
高次構造を持つヒト遺伝子DNAあるいは大量のランダム
なDNAの“末端”が存在するかしないかは、特異的な産
物の蓄積あるいはプローブの遊離の程度には影響しな
い。最後に、大量の高次構造を持つヒト遺伝子DNAの存
在は、特異的な産物の蓄積がない応対で、検出できるよ
うなプローブの遊離を引き起こすものではない。
例４ ３′標識プローブを使用したPCR ３′端放射性標識したプローブが鋳型鎖にアニールす
るとより小断片になって遊離させるためにPCR増幅反応
を行なう。ここで使用したプローブの塩基配列は次のと
おりである、 A.32Pコルディセピンとターミナルとトランスフェラー
ゼを用いたプローブの標識 5pmolの各プローブ（DG46、BW32、BW34）をそれぞれ1
7.4ユニットのターミアルトランスフェラーゼ（Stratag
ene）と10pmolの〔α−32P〕コルディセピン（コルディ
セピン:3′−デオキシアデノシン−５′三リン酸、New
England Nuclear,5000キューリ/mmol、ddATP［Pharmaci
a］で３倍に希釈）を100mMポタシウムカコヂレート、25
mM Tris−HCl、pH7.6、1mM塩化コバルト、0.2mMジチオ
スレイトールを含む17.5μの反応液に加え37℃で60分
反応させる。全量をフェノール／クロロホルム抽出しエ
タノール沈殿を行なう。前述のSambrookら編に記載され
ているMolecular Cloningの方法に従行、プローブを50
μのTEバッファに再溶解しセファデックスＧ−50スピ
ンカラムにかける。プローブの最終濃度は0.1pmol/μ
であった。反応物のTCA沈殿により以下の比活性であっ
た。
変性濃度勾配ゲルによる３′放射性標識プローブとBW
31、BW33、BW35の５′リン酸化を比較した結果、３′放
射性標識プローブと５′リン酸化プローブは同じような
流れかたをした。
再び、増幅を行なった領域はプライマーBW36、BW42で
はさんだM13mp10wの350塩基の部分である。プライマー
の塩基配列およびその位置は例１に示してある。各増幅
反応液は、10-3pmolのターゲットシーケンスM13mp10w
を、50mM KCl、10mM Tris−HCl、pH8.3、3mM MgCl2、10
pmolの各プライマーBW36とBW42、200μＭの各デオキシ
リボヌクレオシド三リン酸、1.25ユニットのTaq DNAポ
リメラーゼと２、10、あるいは20pmol等のアイソトープ
量となるように希釈したプローブDG46、BW32、BW34から
構成されている50μの反応液にくわえて調整した。
マスターとなる反応液には適当量の反応バッファ、ヌ
クレオシド三リン酸、鋳型DNA、酵素が含まれている。
等分にわけたものに適量のプライマーとプローブを加え
る。対照用の反応液にはプライマーのみ取り除いた他の
反応液成分あるいはプローブのみ取り除いた他の反応液
成分を用いる。
各反応液に50μのミネラルオイルを加え、遠心し、
サーマルサイクラに設置する。反応液は次の増幅反応を
行なわれる。
15サイクル 96℃ 変性 １分 60℃ アニール／伸張 1.5分 最終サイクル 96℃ 変性 １分 60℃ アニール／伸張 5.5分 サイクル終了後、ミネラルオイルは50μのクロロフ
ォルムで抽出され、４℃に保存される。
サンプルはつぎに４％アクリラミドゲル電気泳動、８
％変性濃度勾配アクリラミドゲル電気泳動およびホモク
ロマトグラフィによる解析が行なわれる。三通りの解析
において反応液の取り扱いは前述したとおりである。
４％アクリラミドゲルによる解析の結果、ブライマー
を含まない対照反応を除き全ての反応液で、期待される
産物に一致する350塩基の位置に明瞭なバンドが認めら
れた。プライマー、プローブを共に含む反応液では、約
300塩基の位置に第二のバンドが認められた。この第二
のバンドはプローブ濃度を上げるに従って、強度が増強
したので、十分３′端が放射性標識を受けなかったか
３′端放射性標識がはずれてしまい、プローブからの伸
張、合成が起こってしまったものを反映していると思わ
れる。
８％変性濃度勾配アクリラミドゲル電気泳動の一晩の
露光の結果、泳動を行なった３種のプローブ全てで、産
物の大きさはプローブ全長から15塩基以下まで広がって
いることがわかった。予想されたように、Taq DNAポリ
メラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ活性がプローブを分
解し、分解されたプローブが鋳型鎖より解離してきた。
産物の大きさの分布が広いということは、PCRサイク
リング反応中に反応物の濃度が連続して変化しているこ
とと温度が変化していることを指し示している。このよ
うな変化はプローブおよび酵素のアニーリングの動力学
を変え、サイクリング反応中のいろいろな時期でプロー
ブがいろいろな大きさで解離することになるのであろ
う。
ホモクロマトグラフィのプレートの解析の結果、プロ
ーブすべてについて最小の産物の大きさは10−12塩基長
であった。３種のプローブは５′端のテール領域を除い
て同一の塩基配列を有しているので、この結果はこのよ
うなプローブの塩基配列で60℃でアニール／伸張を行な
った場合、プローブは約10塩基長まで分解されその後鋳
型鎖より解離されてくることを示している。
例５ Taq DNAポリメラーゼのポリマー反応非依存性５′→
３′ヌクレアーゼ活性 Taq DNAポリメラーゼは、プローブが上流のプライマ
ーに近接しているとき、ハイブリダイズしているプロー
ブの32Pで標識された５′端の遊離を起こなうことがで
きる。リン酸化されたプローブBW33の０−20塩基上流に
位置するような一連のプライマーを設計した。これらの
プライマーを以下に示す。
約0.5pmolのプローブBW33と0.5pmolのプライマーの一
つを0.5pmolのM13mp10wに、10.5μの50mM KCl、10mM
Tris−HCl、pH8.3、3mM MgCl2反応液中でアニールさせ
る。対照の反応液には22μＭあるいは200μＭの４種類
の各デオキシヌクレオシド三リン酸が含まれている。更
にプローブから530塩基上流に位置するプライマーDG47
を使う。
反応液は98℃で１分加熱したのち、60℃で30分アニー
ルを行なう。チューブを遠心後、70℃の温浴中に置いて
おく。反応液が平衡温度に達した後、10、５、2.5、1.2
5、0.3125ユニットのTaq DNAポリメラーゼを加え、２、
５、10分反応の後それぞれより４μずつ反応液を回収
する。各アリコットに４μのEDTAを加えて酵素を失活
させ、４℃に置いておく。反応液は続いてホモクロマト
グラフィによる解析を行なう。
ホモクロマトグラフィの解析のため、各サンプルの１
μをDEAE薄層プレート上にスポットしHomo−mix III
の入ったガラスの展開層に70℃で置くHomo−mixが各プ
レートの上まで到達したのち、プレートを取り出し、乾
燥させ、サランラップでおおってオートラジオグラフィ
を行なう。図４この実験の結果を示す。
図４で、レーン１−３は放射性標識したオリゴヌクレ
オチドの分子サイズマーカーで６、８、９、10、11、1
2、13塩基を示している。レーン４−10はdNTPが存在し
ない条件においての、プライマーBW37、BW38、BW39、BW
40、BW41、BW42、DG47に対する反応を示したものであ
る。レーン11−24は20μＭあるいは200μＭのdNTP存在
下での各プライマーに対する対照の反応を示している。
dNTPが存在しない条件において、Taq DNAポリメラー
ゼは全てのプライマーで標識プローブの断片を生成して
いたが、プライマーとプローブの間隔が広がるにつれて
標識物の放出は低下していた。この効果は調べた酵素濃
度全て（0.3125−10ユニット/1反応）と反応時間すべて
で認められた、。遊離されてくる断片の大きさは、同等
２−３塩基長であった；しかしながら主要な産物の大き
さは加えたプライマーに依存していた。デルタ０とデル
タ２のプライマーから遊離される主要な産物の大きさ
は、デルタ１、５、10、20のプライマーからのそれより
１塩基小さかった。このヌクレアーゼ活性はポリマー化
反応には依存していなく、距離に依存していた。
ヌクレオシド三リン酸が存在する場合、遊離される標
識プローブ断片の大きさと相対的な割合は全てのプライ
マーで同じであった。またdNTPが存在する場合、産物の
大きさも１−２塩基大きかった。このことは、酵素がポ
リマー反応を行なっているとき、酵素はすでに“ランニ
ングスタート”の状態にありハイブリダイズしたプロー
ブに遭遇するとただちに１−２塩基の解離を行ないそれ
から切断をおこなうので、その分長い断片を産み出すも
のと思われる。
20μＭあるいは200μＭのdNTPが存在するとき、遊離
される産物の量に検出出きるほどの差は認められず、ま
たdNTPが存在するとき伸張反応時間あるいは酵素濃度に
よる明らかな差も認められなかった。
例６ ５′端のプローブの塩基配列に基ずく遊離される産物の
性質について例示したもの プローブの５端相補的領域の塩基対対形成力の強弱が
遊離される産物の大きさにどのような影響があるかを調
べた。GCあるいはATに富む５′端の相補的領域を含むよ
うな２種のプローブBW50、BW51を設計した。BW50、BW51
は例５で使用した。プローブBW33を参照した。
ａ、ｔ、ｇ、ｃ、＝鋳型鎖に非相補的な塩基 BW50,BW51、BW33はポリヌクレオタイドキナーゼを使
って32PATPで標識し以下の比活性を得た。
３種のプローブの最終濃度は0.10pmol/μであっ
た。
約0.5pmolのプローブBW50、BW51あるいはBW33と0.5pm
olのプライマーBW42を0.5pmolのM13mp10wに、10.5μ
の50mM KCl、10mM Tris−HCl、pH8.3、3mM MgCl3各200
μＭの４種のデオキシヌクレオシド三リン酸からなる反
応液中でアニールさせる。対照の反応液には鋳型DNAを
除いた全ての成分が含まれている。アニーリングの反応
のために、反応液は98℃で１分加熱したのち、60℃で30
分アニールを行なう。チューブを遠心後、50℃、60℃、
70℃の温浴中に置いておく。反応液が平衡温度に達した
時、0.3125ユニットのTaq DNAポリメラーゼを加え、
１、２、５分反応の後それぞれより４μずつ反応液を
回収する。各アリコットに４μのEDTAを加えて酵素を
失活させ、４℃に置いておく。反応液は続いてホモクロ
マトグラフィによる解析を行なわれその結果は図５、６
に示す。
図５はGCに富んだプローブBW50を含んだ反応である。
レーン１−３はオリゴヌクレオチドの分子サイズマーカ
ーで、６、８、９、10、11、12、13塩基を示している。
レーン４−６は伸張反応を50℃で１、２、５分行なった
ものである。レーン７−９は伸張反応を60℃で１、２、
５分行なったものである。レーン10−12は伸張反応を70
℃で１、２、５分行なったものである。レーン13−15は
鋳型DNAのみを除いた対照反応で70℃で１、２、５分行
なったものである。
図６はATに富んだプローブBW51を含んだ反応である。
図５と同様に、レーン１−３はオリゴヌクレオチドの分
子サイズマーカーで６、８、９、10、11、12、13塩基を
示している。レーン４−６は伸張反応を50℃で１、２、
５分行なったものである。レーン７−９は伸張反応を60
℃で１、２、５分行なったものである。レーン10−12は
伸張反応を70℃で１、２、５分行なったものである。レ
ーン13−15は鋳型ンDNAのみを除いた対照反応で70℃で
１、２、５分行なったものである。
これらの結果から、標識プローブの温度と５′端の塩
基構成に依存していることが示された。より安定である
GCに富んだプローブBW50では、50℃ではほとんど標識物
の放出が見られず（図５、レーン４−６）、60℃（図
５、レーン７−９）、70℃（図５、レーン10−12）で増
加してくる。遊離される主要な産物の大きさは３−５塩
基である。BW51は５′端でATに富むが、50℃でも（図
６、レーン４−６）より高い温度と同様の標識物の遊離
が見られた。更にATに富んだプローブではGCに富んだプ
ローブより作られる産物の大きさが大きかった。ATに富
んだプローブ構成はよりおおきい“プレッシング”能力
をあげるようになり、従ってGCに富んだプローブに比べ
てプローブの解離が切断より早く、低い温度で起きるよ
うになるからであろう。
例７ HIVを捕捉する検定 以下はビオチンを含んだ二重標識プローブをPCRに用
いてターゲットシーケンスの検出を行なった一例であ
る。HIVの遺伝子の一部のそれぞれの相補鎖である、２
種のオリゴヌクレオチドBW73、BW74をオリゴヌクレオチ
ドの３′端にビオチン分子を結合させて合成した。各オ
リゴヌクレオチドの５端には更にポリヌクレオタイドキ
ナーゼとガンマー32P−ATPを使って32Pで標識した。２
種のオリゴヌクレオチドpH7、pH8もHIV遺伝子と相補的
で、２種類のオリゴヌクレオチドプローブに相同な領域
をはさみ、PCR反応用のプライマーとして働き、142塩基
対の産物を作る。これらオリゴヌクレオチドの塩基配列
を以下に示す。
シーケンス中の“Y"はビオチンを示し、小文字は鋳型
のDNAに対し非相補的な塩基であることを示す。
50μのポリメラーゼチェーン反応液が、二重標識さ
れたBW73あるいはBW74をプローブとして2nM加えられて
作成される。HIVが鋳型としてプラスミドクローンの形
で１反応当たり102あるいは103コピー数加えられ、プラ
イマーオリゴヌクレオチドpH7とpH8がそれぞれ0.4μＭ
加えられる。Taqポリメラーゼが１反応当たり1.25UとdN
TP200μＭ加えられる。各反応液に50μのオイルがの
せられ、軽く遠心して水溶液をチューブの底に集め、95
℃と60℃の間で、各温度で60秒休止を入れながら、30、
35、40サイクルの熱循環反応を行なう。熱循環反応終了
後、50μのクロロホルムで抽出し、水相を回収する。
各反応液は、３μを５％アクリラミド電気泳動ゲル
にのせ、期待される142塩基対の産物を調べて増幅反応
を解析する。また、各反応液の１μをDEAEセルロース
プレートにのせTLCホムクロマトグラフィで解析する。
最後に、のこりの反応液を、10mg/ml濃度に溶解した25
μのストレプトアビジンで標識したDYNABEADS M−280
超常磁性ポリスチレンビーズと接触させて解析を行なっ
た、ビーズとの反応後混合液はコースタースピンＸ遠心
フィルターで濾過し、濾過物を回収し遊離された放射性
標識物の存在を調べた。
図７は２種のゲルのイメージを示してあり、プローブ
の存在、非存在に関わらず全ての反応に142塩基対長の
産物が見られることが示され、またその量は反応開始時
のテンプレートが102から103コピーに増加するに従い、
あるいは熱サイクリングが30、35、40へと続くに従って
増加していることを示している。
図８は、PCR反応のTLC解析の２つのオートラジオグラ
フィを組み合わせたもので、放射性標識物の遊離が起こ
っていて、かつその量は反応開始時のテンプレートが増
加するに従い、あるいは熱サイクリング増えるに従って
増加していることを示している。最初のBW73を使ったPC
R反応のTLCでは、レーン１と３に見られる放射性標識オ
リゴヌクレオチドがサイズスタンダードと比較して２、
３塩基長であることが示されている。レーン４、５、６
は開始時のテンプレートが102コピーのPCR反応で、レー
ン７、８、９は開始時のテンプレートが103コピーのPCR
反応である。レーン４、７のサンプルは30サイクル数の
熱循環反応を行なったもの；レーン５、８のサンプルは
35サイクル数の熱循環反応を行なったもの；レーン、
６、９のサンプルは40サイクル数の熱循環反応を行なっ
たものである。２番目のBW74を使ったPCR反応のTLCで
は、レーン１、２は放射性標識した２塩基、３塩基（の
サイズマーカー）、レーン４、５、６は開始時のテンプ
レートが102コピーでそれぞれ30、35、40サイクルの熱
循環反応を行なったPCR反応、レーン７、８、９は開始
時のテンプレートが103コピーでそれぞれ30、35、40サ
イクルの熱循環反応を行なったPCR反応である。遊離さ
れてきた標識物の大きさは、５′端非相補性塩基を持た
ないBW73では小さく、５′端に３塩基余分な非相補性塩
基をもつBW74では長かった。
各クロマトグラムはさらにアンビスカウンターを使っ
た二次元ラジオアイソトープ画像装置により解析した。
アンビスの計数とビーズに捕捉された計数を表１に示
す。標識物の遊離に対する２種の計測法が良く一致を示
していることは、PCR産物が合成されることを調べるの
にビオチン標識をプローブとアビジン化ビーズを使用す
ることが有用であることを示している。
例８ プローブ標識と固相抽出方法について 本発明の具現化の一つに、切り出されたプローブを切
り出されないプローブから分離するステップが、プロー
ブの切り出し後、切り出されたプローブの量を決める前
に行なわれている。２通りの分離する方法が行なわれて
いる：（Ｉ）アビジン化あるいはストレプトアビジン化
した磁性粒子を使って、３′端にビオチン５′端に蛍光
団を標識したプローブを結合させ；磁性体粒子は切り出
されないプローブと切り出されたプローブの３′側断片
の両方を結合する方法と；（２）５′端が蛍光団あるい
は32Pで標識されているものでオリゴヌクレオチドには
結合するがモノヌクレオタイドあるいはダイヌクレオタ
イドには結合しない、磁性体粒子をつけたイオン交換樹
脂を使う方法がある。これら別々のストラテージの種々
の特長について以下で論議する。
A.アビジン化磁性体粒子 ３′端ビオチン標識プローブとアビジン化（またはス
トレプトアビジン化）磁性体ビーズから構成される分離
システムハDynal社からのDybabeadTMのようなビーズを
用いて行なうのがよく；この種のビーズは50μのビー
ズ溶液で約100pmolのビオチンを結合できる。非特異的
な吸着は、最初にビーズをデンハルト溶液およびキャリ
アDNAで処理することにより最小に抑えられる。
ストレプトアビジン−ビオチンによる分離方法に使う
プローブは、３′端にビオチン分子５′端に蛍光団が標
識されている必要がある。３′端のビオチンはストレプ
トアビジン化（あるいはアビジン化）による分離のリガ
ンドとしての役目と、増幅反応中の伸張を阻止する役目
がある。合成後の修飾はプローブの各末端に異なった求
核団を付加させることで容易に行なえる；すなわちビオ
チンを付けるために３′端にアミンを加え、のちに蛍光
団を加えるために５′端のチオールをブロックする。
３′端ビオチン標識プローブは種々の方法で行なえる
が、いくつかを以下に示す。
ビオチンの誘導体でNHS活性を有するエステルはプロ
ーブ３′端のアミンに図９で示すような機構で付加され
ることができる。連結の結果、二位のガンマハイドロキ
シル基がアミドカルボニル基となるが、これは典型的な
PCR熱循環反応の繰り返しで不安定となる。例えば、40
サイクルの熱循環で、最初のプローブのうち約６％がア
ビジン化磁性粒子に結合しなくなる。プローブと付加さ
れたビオチン間の結合が熱循環反応により壊れると、プ
ローブはもはや切断された産物から分離することができ
ず、バックグラウンドの原因となる。この問題はプロー
ブに一つ以上のビオチンを付加させることで克服するこ
とができるが、別のいくつかの、プローブにビオチンを
付加させる方法でより安定な産物を作り出すことができ
る。
ビオチンヒドラザイドをアルデヒドと共にプローブの
３′リボース糖より反応させてビオチン化オリゴヌクレ
オチドを合成することができる。この戦略のため、プロ
ーブの３′ヌクレオチドはデオキシリボース糖の代わり
にリボース糖を含んでいる。合成において、３′リボー
スはその２′あるいは３′OH基を固相支持体に結合させ
ておく。合成後、オリゴヌクレオチドは固相支持体より
はずされ、リボースの近位のディオール基がソディウム
ペリオデート（NaIO4）により酸化されてアルデヒドと
なり、次いで図10に示されるようにビオチンヒドラザイ
ドと反応し、産物がソディウムボロハイドライド（NaBH
4）により還元される。しかしながらできたビオチン化
プローブはアビジン化磁性体粒子とは有効に結合しな
い。図10にも示してあるビオチン長鎖ヒドラザイドがこ
の問題を解決する。
図11に示されているように、プローブ合成において可
溶性のビオチンフォスフォルアミダイトを使用してプロ
ーブにビオチンを付加させることができる。合成は最初
塩基をcontrolled porous glass（CEG）に付加させるこ
とから開始されるが、このCEGは最終的には廃棄され
る。フォスフォルアミダイトが加えられて、合成オリゴ
ヌクレオチドの脱保護剤である水酸化アンモニウムに作
用して３′リン酸基をつくりだす。次にビオチンフォス
フォルアミダイトが加えられ、図11に示されるようなオ
リゴヌクレオチドが合成され最終産物ができる。この付
加反応は５′がアミンで終わっているオリゴヌクレオチ
ドを使用することにより蛍光団の付加反応に用いること
もできる。ビオチンの付加のために３′アミンを使用す
ることにより５′チオール基に蛍光団を付加する化学反
応には制限がつくことになる。ビオチンの一つの窒素原
子がブロックされているビオチンフォスフォルアミダイ
トを使用することにより、ビオチン標識プローブの合成
の効率が改善する。
ビオチンが直接有孔のガラスの結合されている市販の
試薬を使うことも可能で、図12に示してあるようにこの
試薬はプローブ合成反応の開始物として使われる。この
付加法は５′端がアミンで終わっているオリゴヌクレオ
チドを使用することによって蛍光団の付加にも応用でき
る。ビオチンの付加のために３′アミンを使用すること
により５′チオール基に蛍光団を付加する化学反応には
制限がつくことになる。オリゴヌクレオチドの５′端に
修飾塩基を酵素的手法で付加することも可能であるが、
一般性と実用性において限界が見られる。
B.磁性によるイオン交換物質 市販されているポリエチレンイミン（PEI）マトリッ
クス（セルロース−、シリカ−、あるいはポリオールポ
リマーをベースとした）粒子を使って未切断プローブよ
り切断されたプローブを分離することができる。たとえ
ば、Hydrophase,PEI,SelectacelTM PEI,BakerbondTM PE
I,Amicon PAE300,1000,1000Lなどは全て市販のPEIマト
リックスで切断プローブ産物より未切断のプローブを分
けることできる。
市販されている活性化セルロースの磁性体粒子で、Co
rtex MagaCellTMのような粒子はPEI600,PEI1800,PEI10,
000のような種々の大きさのPEIと１グラムのマトリック
スあたり種々のモル比のPEIと誘導体を作ることができ
る。しかしながら、任意の大きさのオリゴヌクレオチド
あるいはクマリン標識したオリゴヌクレオチドはPEI
（市販のPEIマノリックスのオリゴヌクレオチドに対す
る特異性は、オリゴヌクレオチドをクマリンで標識する
と失われてしまう）との誘導体であるか否かに関わらず
磁性体セルロース及びアガロースビーズに結合してしま
う。高濃度の塩（2.0M NaCl）あるいはＮ−メチルピロ
リンドン（10−20％）を加えることにより、部分的に特
異性をあげることが可能であるし、他の共溶媒剤、SD
S、Brij35、グアニジン、尿素も特異性をあげるのに使
われる。しかしながら、8M尿素はクマリン標識したダイ
ヌクレオチド、トリヌクレオチドがBakerbondTM PEI,ma
gnetic CortexTM両PEI誘導体粒子に非特異的に結合する
のを効率良くブロックする。しかしＮ置換尿素使用がよ
り好ましいが。
前述したように、Cortex Biochem社はPEIに結合する
ことのできる種々の活性化セルロースでコートした磁性
体粒子を販売している。これらのうちで最も便利なもの
はペリオデートで活性化したマトリックスである。しか
しながら、製造元で推奨するプリオデートで活性化した
マトリックスにアミンを付加するプロトコルにはいくつ
かの問題がある：アミンとアルデヒドとの反応でイミン
が生じ、これは不安定で加水分解されあるいはさらにア
ミンと反応を起こし；残存するアルデヒドをブロックす
るために過剰のエタノラミンヲ加えるステップではPEI
がエタノーラミンに置換されマトリックスよりPEIが取
り除かれることとなり；アルカリ性の条件で結合反応を
行なうときはアルドールの濃縮によりアルデヒド間で反
応が起こり粒子の凝集が起こり；またアリカル性の条件
でアルデヒドの反応を行なう結果フリーラジカルが生
じ、セルロースに作用して種々の反応が起こる。
イミンを安定化させるため、還元（NaBH4とNaBH3CNに
よる）反応を加えることも可能だが、このステップはガ
スの発生を伴い粒子の体積を減少させ、粒子の凝集をお
こす。このような不要な効果はフリーラジカルの発生に
よるものである。活性化したアルデヒドへの結合による
合併症を防ぐにはエポキシド化学を利用して防ぐことが
できる。生じるベーターハイドロキシアミンは安定で還
元剤を必要としない。更に、酸素はフリーラジカルの生
成に関係しているので、反応系から酸素を取り除くこと
はフリーラジカルの生成を最小に抑え、特に還元のステ
ップで顕著である。PEI誘導セルロースによってコーテ
ィングした磁性体粒子の合成で、エタノラミンによるブ
ロッキングのステップをなくすことが可能で、調整物は
ソディウムシアノボロハイドライド（NaBH3CN）で還元
する一晩前あるいは還元の間ヘリウムによってパージさ
れる。この最終の調整においてほとんど凝集は起こらな
い。
ポリアクロレイン磁性体粒子もPEI600、エチレンジア
ミンによって誘導体が行なえ、クマリン標識したダイヌ
クレオチド、トリヌクレオチドにより非特異的結合は高
濃度のNMPにより阻止することができる。長鎖のPEIポリ
マーの使用により、小分子のクマリン標識オリゴヌクレ
オチドとの非特異的相互作用をマスクすることもでき
る。
本方法で使用する磁性体マトリックスを選定する最も
重要な要因はマトリックスに寄与するバックグラウンド
の蛍光の量である。このバックグラウンドの蛍光を最小
に抑える方法は、使用する蛍光団の励起、および最大放
出波長が、バッファー、マトリックス、臨床サンプルか
らのバックグラウンドの蛍光スペクトルと重なり合いが
最小になるようなものを選定するということである。更
に、バックグラウンドの蛍光はマトリックス内の汚染物
からも由来するので、結合させる前に十分前処置をして
取り除いておく必要がある。
C.プローブに蛍光団を付加させる化学反応 前述したように、プローブを標識の標識物で望ましい
のは、分離の方法を無視すれば、蛍光団である。オリゴ
ヌクレオチドと結合した蛍光団との間には何らかの相互
作用が認められる。この相互作用は蛍光団がオリゴヌク
レオチドに結合した時に観察される減光現象として報告
されているものに関与しているかもしれない。核酸の
５′に結合したときDNAとの相互作用が最小であるよう
な蛍光団を選定する必要がある。
３種の推奨できる蛍光団として、７−dietylamino−
３−（４′−maleimidylphenyl）−４−methyl coumari
n（CPM）,6−（bromomethyl）fluorescein（BMF）,Luci
fer Yellow iodoacetamide（LYIA），と５−（および６
−）carboxy−Ｘ−rhodamine succinimidyl esterで、
なかでもCPMが：減衰係数が大きいこと、発光量が多い
こと、褪色が少ないこと、ストークスシフトが大きいこ
となどの性質をもち好ましい。蛍光団はプローブの５′
端に結合しているチオール基を介して結合することもで
きるが、CPMの場合アリルマレイミドが生じ、これは熱
循環反応の条件化で不安定である。
蛍光標識された物質の解析のための機会が多く市販さ
れている。例えば、ABI社のGene AnalyserはROX（６−c
arboxy−Ｘ−rhodamine）,rhodamini−NHS,T AMRA（5/6
−carboxytetramethyl rhodamin NHS）,FAM（５′carbo
xyfluorescein NHS）などの蛍光団で標識されたDNAをア
ットモルのレベルで解析することが可能である。これら
の物質はプローブの５′アルキラミンを介してアミド結
合でプローブに結合している。
CNHS（７−amino−４−methyi−coumarin−３−acetic,
acid,サクシニミヂルエステル）を含むその他の有用な
蛍光団もアミド結合を介し結合させられる。
標識反応において、特定のオリゴヌクレオチドに与え
られた蛍光団を効率良く結合させるには修飾も要求され
る。例えば、５′端がアミンで終わっていプローブと７
−diethylaminocoumarin−３−carboxylate NHS eater
間の初期反応は非常に効率が悪い。３′端がリン酸化さ
れていて増幅反応中の伸張反応を阻害するプローブは、
高度な二次構造を持ち、５′アミンと３′燐酸基が接近
して塩の架橋を作りうる。この構造は５′アミンとNHS
エステルが反応するのを妨げ、従って産物の収量が低下
することになる。25％のＮ−メチルピロリジノン（NM
P）を加えることによりこの反応の効率を著明に改善す
ることができる。
蛍光団と褪色物質を同時にプローブに標識することも
可能である。ブローブが壊れていない状態の場合、蛍光
団よりの蛍光は褪色物質により褪色させられる。本発明
の方法によって、プローブが蛍光団と褪色物質の間で切
断されると、蛍光団より完全な蛍光量が放出される。褪
色現象には蛍光団と褪色物質の間でのエネルギー移動も
含まれるので、蛍光団の発光スペクトルと褪色物質の吸
収スペクトルは重なり合っている必要がある。本発明の
性質より好ましい組み合わせは蛍光団がローダミン590
で褪色物質はクリスタルバイオレットである。
このようなプローブのひとつが図13に示してある。こ
のような構造を合成するには、ローダミンの誘導体を
５′チオール基を介して結合させ、クリスタルバイオレ
ットを２塩基離れたサイミジンから延びているアミンを
介して結合させる。２つの分子を２つのフォスフォダイ
エステル結合の分、離すことによって、それらの間をDN
Aポリメラーゼが切断する機会を増やしている。
最初クリスタルバイオレットをラクトンとアミン間の
反応で行なおうとしたが成功しなかった。クリスタルバ
イオレットは図14に示すように修飾し活性型のアシルア
サイドにした。この型のクリスタルバイオレットはアミ
ンで修飾されたDNAと反応することができ、望む産物が
逆相HPLCによって精製できた。
ローダミン−Ｘ−マレイミド群と５′チオール基との
反応は成功しなかった。これはクリスタルバイオレット
を加える前にローダミン−Ｘ−マレイミドを反応させて
も同様であった。これは脱ブロック化された５′チオー
ル基がサイミジンのスペーサー内のアクリラミドの二重
結合（図13参照）と反応したためと思われる。アミンを
サイミジンに付加する別の方法を図15に示してある。
この例ではオリゴヌクレオチドプローブの３′端にビ
オチンを５′端に蛍光団を結合する一般的な方法の案内
を示した。このような付加方法は数多くあるものであ
り、本発明はプローブの標識について特定の方式を選定
しているわけではない。
例９ Ampli Wax TMを用いUNG,dUTPを使用したPCR反応法のプ
ロトコール PCR反応は増幅の特異性ということに関して、以下に
詳しく記述されている方法あるいは試薬などの改善が行
われてきた、PCT出願第91/01039号、1991年２月15日登
録；米国特許出願第481,501号1991年２月16日登録;PCT
出願第PCT/US91/05210号1991年６月23日登録；米国特許
出願第609,157号1990年11月２日登録；米国特許出願第5
57,517号1990年７月24日登録。これら出願特許の内容は
参考文献として添付されているが、以下のプロトコルは
これらの改良されたPCR法が優れた結果をえるために本
発明とどのようにして組み合わされているかを示してい
る。使われている全ての試薬はPerkin−Elmer Cetus社
より購入した。（PECI,Norwalk,CT） このプロトコルは基本的にはつぎの３部からなってい
る：ワックスでカバーされたdNTP、プライマー、マグネ
シウムおよびトリスを含むMicroAmpTMチューブ;AmpliTa
qDNAポリメラーゼとUNGが加えられたプレミックスＢ
（酵素混合液ともよばれる）；試料とプローブの入った
プレミックスC0酵素混合液とプローブの入った試料が作
成されワックス層の上に載せられる。チューブをサーモ
サイクラーTC9600に置き熱循環反応を開始する。下のプ
ロトコルは50μ反応用で、試料は27μ以下でターゲ
ットはHIVである。
試薬は以下のようにして用意されるのが望ましい。Mi
croAmpTMチューブは一本当たり12.5μのプレミックス
Ａと12mgのAmpliWaxTMペレットが入っている。プレミッ
クスＡには１μＭのプライマーSK145とSK431（どちらも
ビオチン化されていない）、800μM dATP、800μM dGT
P、800μM dCTP、800μM dTTP、15mM MgCl2、10mM Tris
−HCl、pH8.3が入っている。AmpliWaxTMペレットは融点
55℃のパラフィンで（アルドリッチケミカル社）0.15％
のTween 65を含み、ワックスペレットとプレミックスＡ
の底の層が共にDNAを含まない部分に加えられる。ワッ
クスペレットは溶けて上層に蒸発を防止するバリヤーを
形成する。このバリヤーはチューブを４−25℃におくと
硬度が回復して、４℃に保存した場合この下のPCR反応
物を数箇月間安定に保つ役割がある。バリアーの上に加
えた材料は熱循環反応の開始においてワックスが溶け出
すまで混ぜる必要はない。対照としてのチューブにはプ
ライマーが含まれていない以外同じである。
プレミックスＢのバッファには10mM Tris−HCl、pH8.
3と50mM KClが入っていて酵素AmpliTaqTMDNAポリメラー
ゼとUNGの希釈に用いられる。１反応当たり約2.6μの
プレミックスＢバッファが使われる。
プレミックスＣバッファは10倍濃度として調整され、
105mM Tris−HCl、pH8.3と715mM KClが入っていて、最
終反応濃度がそれぞれ10mMと50mMになるように試料DNA
に加えられる。キャリアDNAと同様にプローブもこの層
に加えられる。もしプラスミドの対照反応が行なわれる
なら、１反応当たり約１μｇのヒト胎盤DNA（１μg/μ
、10mM Tris−HCl、pH8.1mM EDTA、10mM NaCl、シェ
アかけフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈
殿して調整）をキャリアDNAとして加える。１反応当た
り約3.3μの10倍濃度のプレミックスＣ保存液をしよ
うする。
プローブは５μＭ濃度の保存溶液として調整し、LG10
1Cと名付けた。プローブLG101Cは３′端に燐酸基を持っ
ているので、プローブの伸張と７−ジエチルアミノクマ
リン−３−カルボキシレートがオリゴヌクレオチドの
５′端のアミノアリファティックス基にアミド結合を介
して結合するのを妨げている。プローブの塩基配列は以
下に示すとおりである。
このプローブは遮光して−20℃で保存する。
AmpliTaq DNAポリメラーゼはPECI社より貯蔵濃度5U/
μで供給され、UNGは同社より貯蔵濃度1U/μで供給
されている。プラスミドの補正用試料を同時に反応させ
ることも可能であるし、この目的のため、300;1,000;3,
000;10,000;30,000;100,000;1,000,000倍に希釈ものをG
ene AmplifierTMのポジティブコントロールDNAと共に用
意しておくと有用である。このDNAはHIVZ6の遺伝子がpo
l遺伝子の領域が中断するようなかたちに組み替えられ
ていて、感染性が阻止されたかたちでプラスミドpBR322
内に挿入されている。
それぞれの反応液の最終濃度は、12.5μのプレミッ
クスA;2.6μのプレミックスB;3.3μのプレミックス
C;2μのプローブLG101C;27μの検体試料;0.4μの
AmpliTaq DNAポリメラーゼ;2μのUNGで最終的な容量
は49.8μとなる。この反応液は、250nMの各プライマ
ー;200μＭの各dNTP;3.75mMのMgCl2;50mM KCl、10mM Tr
is−HCl、pH8.3;200nMプローブ;2ユニットのUNGと２ユ
ニットのポリメラーゼからなっている。
反応をするために、一反応当たり2.6μのプレミッ
クスB;0.4μのAmpliTaq DNAポリメラーゼ;2μのUNG
を、DNAの存在しないフード内あるいは室内で混合して
酵素混合液を調整する。16反応分を行なうには、材料が
十分なように18反応分の酵素混合液を用意しておくべき
である。DNAの存在しないフード内あるいは室内で、ワ
ックスでカバーされたプレミックスＡが入っているMicr
oAmpTMのチューブ内に酵素混合液をワックスの上に置く
ようにして加える。
サンプルを調整する場所で、サンプル混合液を3.3μ
の10倍のプレミックスＣバッファと27μの試料と
（定量のための対照反応用として、10μの希釈液と17
μの水を加える）２μのプローブを加えて調整する
（キャリア−DNAは加えるとすれば検体と混ぜてお
く）。次に、それぞれ別々のサンプラ−チップを用い
て、32.3μのサンプル混合液を各チューブに加え、酵
素混合液とサンプル混合液の容量のアンバランスは完全
にかき混ぜて解消する。同時にプライマーを含まない二
つの対照反応用のチューブを熱循環反応中のプローブの
切断を測定するために用意する。この対照反応には通常
1,000コピーの対照テンプレートを使われる。更にこの
検定を補正するためにプラスミドの希釈系を用いる。こ
の補正として通常一反応当たり３から10,000コピー数の
HIV遺伝子のターゲットが使われる。これら操作が終了
した後、チューブにキャップをしてTC9600のトレイに配
置する。
サーマルサイクラーの設定様式は以下の通りである;5
0℃２分を１サイクル;95℃10秒、55℃10秒、72℃10秒を
５サイクル;90℃10秒、60℃10秒72℃10秒を35サイクル
行なう。サーマルサイクリング反応が終了後、チューブ
をTC9600より取り出し、必要なら−20℃で保存する。70
℃以上にチューブを長時間さらすのはすすめられない、
またアルカリ変性は行なってはならない。
いくつもの対照反応をおくのは有効で、テンプレート
を含まない対照反応は反応液に汚染がないかを決めるの
にまたプローブの切断による非特異的な産物の増幅と非
特異的なシグナルが生じているかを決める目的に；プラ
イマーを含まない対照反応はバックグラウンドに影響す
る増幅とは関係していないプローブの切断を測定する目
的に（いくつかの臨床サンプルを加えてプローブの切断
で生じた成分が存在するかを検定することも可能であ
る）；あるいは定量を目的とした対照反応がある。
前述のプロトコルによる増幅反応後ワックス層の下に
形成されているPCR産物を回収するために、サンプラ−
チップをワックス層の中心に突きたてて、チップをゆっ
くりと穏やかな力で反応液が飛び出して実験室を汚染す
ることのないようにすすめてサンプルを吸い出す。反応
チューブを片手の一本の指で固定するとうまく行なうこ
とが出きる。細いサンプラ−チップ（ゲルにのせるため
の）を使うと特にワックスをうまく貫くことができる。
突き立てるより刻むような動きでもワックスを貫くこと
が可能でありワークスで詰まることもない。もしチップ
にワックスの小片がついてきたら、それはのこりのワッ
クスに軽くこすり付けて取り除ける。
あるいは反応チューブを凍らせて（ドライアイスエタ
ノールバス、あるいはフリーザーで一晩凍らせて）、解
答し、小型遠心機で軽く遠心する（アングルローター
で）こともおこなえる。するとワックス層は粉々に砕
け、サンプラ−チップが詰まることなくいれることがで
きる。ワックスの断片はサンプルチップをチューブの内
壁にこすって取り除くことができる。この方法は特にに
positive displacement samplersの場合（？）、チップ
が厚くワックス層に直接貫通させるのが困難な場合有効
である。前述した方法はいずれも取り出したサンプルか
らほぼ完全にワックスが取り除かれているのでクロロフ
ォルム抽出は不要である。
前述の発明は説明のためやや詳しく述べているが、付
属している特許請求の範囲内での変更あるいは修飾がな
されうることは容易に理解されるところである。
例10 BakerbondTMPEIを用いた固相抽出法 この例示では増幅反応を本発明の方法に従って、蛍光
物質標識（クマリン誘導体）プローブ存在下で行なった
PCR反応液の試料採取についてのプロトコルを示すもの
である。いくつかのストック用試薬を調整しておくとこ
のプロトコルの実行がより容易になる。これら試薬の一
つは予め洗浄した50mMのBakerbondTMPEIマトリックスが
入ったエッペンドルフチューブである。BakerbondTMPEI
はJ.T.Baker社（製品番号7264−00）より入手でき、シ
リカベースで粒子サイズ40μｍで275オングストローム
のポアサイズである。このマトリックスは最初水で洗い
エタノールで洗い、また水で洗い、次に10mM Tris−HC
l、pH8.3、50mM KCl、1mM EDTA、2M NaCl、8M尿素で洗
い、次に10mM Tris−HCl、pH8.3、50mM KCl、1mM EDT
A、500mM NaCl、8M尿素で平衡化する。チューブに分け
た後、15μの水を加えマトリックスの水分を保ってお
く。このチューブは４℃に保存する。
バインディングバッファも同様にストック溶液として
調整でき、その構成は10mM Tris−HCl、pH8.500mM NaC
l、50mM KCl、1mM EDTA、8M尿素である。このバップァ
は４℃に保存するが、この温度で尿素は沈殿を形成す
る。バインディングバッファは使用前に軽く温めて尿素
を再溶解させる。
このプロトコルを行なうにはいくつかの器具が有用で
ある。バインディングのステップにおいて、マトリック
スが浮遊状態に保たれるようにチューブをミックスし続
ける必要があるが、このためにはVortex Genie2ミキサ
ーが有用である（Ficcher Scientific社、カタログ番号
12−812、60マイクロチューブホルダー付き、カタログ
番号12−812−Ｂより入手可能）。更にエッペンドルフ
小型遠心機、日立モデル2000分光光度計、微量蛍光光度
計用の内巾2mm、光路長2.5mmの石英性キュベット（Star
na Cells社より入手可能、番号18FQ10mm5）もこのプロ
トコルを行なうのに有用である。
適当な対照反応は行なうべきであり、バインディング
ステップでは３種の対照反応が必要とされる。バックグ
ラウンドの蛍光の対照反応としては、プローブだけを除
いたPCR増幅反応用のサンプルを調整して行なう。対照
のサンプルは実際の検体サンプルと全く同様に処理を行
なって、20マイクロをマトリックスに加え上清存在する
蛍光量を測定する。この対照反応により、マトリック
ス、バインディングバッファ、およびPCR増幅反応液の
成分にあるバックグラウンドの蛍光量が測定でき、また
臨床サンプル中に存在する蛍光量を測定することができ
る。
二番目の対照反応は偶然のプローブの分解とバインデ
ィング反応を測定するためのもので、プローブを含むす
べての成分を含むPCR増幅反応液だが熱循環反応は行な
わない模擬反応（モック）である。実際の検体サンプル
と同様に処理した後、上清に存在する蛍光量を測定す
る。この対照反応は貯蔵中に起こるプローブの分解を測
定するもので同様にバインディングの効率も測定する。
もしプローブの分解が起きず、バインディング反応が完
全に行なわれていればBakerbondTMPEIに結合させた後の
上清中の蛍光量は第一の対照反応で測定されたバックグ
ラウンドの蛍光量に等しくなるはずである。
第三の対照反応は加えたプローブの量を測定するため
のものである。第二の対照反応用に調整されたサンプル
がこの測定にも使用できる。しかしながらこの場合、20
μをマトリックスを含まない290μのバインディン
グバッファに加えて行なう。この対照反応は加えたプロ
ーブの量を決めるためのものである。
このプロトコルを行なうためには、先ず必要なバイン
ディング用のチューブの数を決めなければならない；こ
の数は検体サンプルと対照の合計である。対照は、テン
プレートをふくまない対照、プライマーを含まない対
照、補正用の対照および前述した第一、第二の対照であ
る。対照は三重で行なってもよい。各チューブに235μ
のバインディングバッファを加える。
また、インプットの量を測定するために、空のエッペ
ンドルフチューブにマトリックスの入ったチューブに相
当する（235μバインディングバッファ、15μ水、
マトリックスに相当する40μ分）290μのバインデ
ィングバッファを加えたものを用意してもよい。インプ
ット量の測定は三重で行なってもよい。
マトリックスが入っているチューブに（検体サンプル
と第一、第二の対照）20μのサンプルを加える。バッ
ファの入っているチューブに（第三の対照）20μのモ
ックPCR反応液を加える。チューブをVortex Genie2ミキ
サーで４のレベルで室温で30分間振蕩する。チューブを
次にエッペンドルフ小型遠心機で（16、000G）室温で５
分間遠心する。各々のチューブから上清の200μを、
チューブの壁にあるペレットあるいはマトリックスが崩
れないようにして取り出し、新しいエッペンドルフチュ
ーブに移し変える。
上清の蛍光量を前述したキュベットで日立モデル2000
で測定する。
７−ジエチルアミノ−３（４′−マレイミドフエニ
ル）−４−メチル−クマリンで標識したプローブの場
合、分光光度計は以下のように設定する;PM管の電圧700
v、励起波長432nm、吸収波長480nm、励起スリット巾10n
m、吸収スリット巾20nm。サンプルへの励起光の露光は
最小限になるようにし、サンプルが分光光度計内に長く
置かれるような場合は、シャッタを閉めるようにする。
切り出されたプローブのpmol数での評価がシグナルの
量の評価に最も便利である。シグナルの量を評価するた
めには最初に、次式に従って第三の対照反応よりインプ
ットシグナルを決定する。
この式で、引き算は検体サンプル中の全てのバックグ
ランウンド蛍光量を補正するためのもので、310/20は希
釈係数である、また10pmolはPCR増幅反応に加えられた
プローブの量である。
検体サンプルのシグナル量は次式に従って計算され
る。
上のプロトコルはプローブを標識する蛍光団によって
修飾されるものであり、ただ本発明を説明するためのも
のである。
図16は本発明のBakerbondTMPEIを用いた固相抽出法に
よるシグナルとインプットしたターゲットの数との結果
とその関係を示したものである。
配列の一覧 （１） 一般の情報 （ｉ）出願人:Cetus社 他 （ii）発明の名称：均質検定システム （iii）シーケンスの数:24 （iv）連絡先住所： （Ａ）宛先:Cetus社 （Ｂ）番地:1400 53番通り （Ｃ）都市:Emeryville （Ｄ）州：カリフォルニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:94608 （ｖ）コンピュータで読み取り可能な形式 （Ａ）媒体の種類：ディスケット、3.50インチ、800Kb
容量 （Ｂ）コンピュータ：アップルマッキントッシュ （Ｃ）オペレーティングシステム：マッキントッシュ
6.0.5 （Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト （vi）本出願に関するデータ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日:1991年８月６日 （Ｃ）分類： （vii）先行する特許出願のダーテ （Ａ）出願番号:563、758 （Ｂ）出願日:1990年８月６日 （viii）特許事務所に関するデータ （Ａ）名称:Kevin R.Kaster （Ｂ）登録番号:32、704 （Ｃ）Reference/Docket番号:2528.1 （ix）電話番号 （Ａ）電話：（415）420−3444 （Ｂ）電話ファックス：（415）658−5470 （２）塩基配列 IDナンバー１に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質 （Ａ）長さ:28塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー１ （２）塩基配列 IDナンバー２に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:30塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー２ （２）塩基配列 IDナンバー３に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:31塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー３ （２）塩基配列 IDナンバー４に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:37塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー４ （２）塩基配列 IDナンバー５に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:41塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー５ （２）塩基配列 IDナンバー６に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:25塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー６ ２）塩基配列 IDナンバー７に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:25塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー７ ２）塩基配列 IDナンバー８に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:30塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー８ ２）塩基配列 IDナンバー９に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:33塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー９ ２）塩基配列 IDナンバー10に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:40塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー10 ２）塩基配列 IDナンバー11に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:30塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー11 ２）塩基配列 IDナンバー12に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:30塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー12 ２）塩基配列 IDナンバー13に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:30塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー13 ２）塩基配列 IDナンバー14に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:30塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー14 ２）塩基配列 IDナンバー15に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:30塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー15 ２）塩基配列 IDナンバー16に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:30塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー16 ２）塩基配列 IDナンバー17に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:30塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー17 ２）塩基配列 IDナンバー18に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:29塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー18 ２）塩基配列 IDナンバー19に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:34塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー19 ２）塩基配列 IDナンバー20に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:33塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー20 ２）塩基配列 IDナンバー21に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:36塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー21 ２）塩基配列 IDナンバー22に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:30塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー22 ２）塩基配列 IDナンバー23に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:37塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー23 ２）塩基配列 IDナンバー24に関する情報 （ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ:33塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質：一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ii）分子の種類：他の核酸 （xi）配列の記述：塩基配列 IDナンバー24
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 サイキ，ランドール ケイ. アメリカ合衆国94805 カリフォルニア 州リッチモンド，サーティーナインス ストリート 320 (72)発明者 ワトソン，ロバート エム. アメリカ合衆国94703 カリフォルニア 州バークレイ，バークレイ ウエイ 1819 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/68

Claims (38)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】サンプル中のターゲットの核酸配列を検出
    する方法において、 （ａ）一本鎖の核酸からなるサンプルを、ターゲットの
    核酸の領域に相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドと
    同じターゲットの核酸の配列鎖の第二の領域に相補的な
    配列を含み、第一のオリゴヌクレオチドにより限定され
    る核酸配列は含まないような標識オリゴヌクレオチドを
    接触させ、ハイブリダイゼションを生じさせる条件で二
    本鎖複合体の混合物を形成し、ここで二本鎖複合体は、
    第一のオリゴヌクレオチドと標識オリゴヌクレオチドに
    第一のオリゴヌクレオチドの３′端が標識オリゴヌクレ
    オチドの５′端と隣接するような配置でアニールしたタ
    ーゲットの核酸からなり； （ｂ）工程（ａ）の混合物を５′→３′ヌクレアーゼ活
    性を持つ鋳型鎖依存性核酸ポリメラーゼと、そのポリメ
    ラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ活性が働いてアニール
    した標識オリゴヌクレオチドを切断して標識断片を遊離
    するような条件に保ち； （ｃ）その遊離されてきた標識断片を検出しおよび／あ
    るいは測定する 方法。
  2. 【請求項２】工程（ａ）でアニールした二本鎖の第一の
    オリゴヌクレオチドの３′端がアニールした標識オリゴ
    ヌクレオチドの５′端に、核酸のポリマー化反応がなく
    ても標識断片の遊離が効率よく行なえるような間隔で近
    接している請求の範囲１の方法。
  3. 【請求項３】オリゴヌクレオチドがデオキスリボヌクレ
    オチドからなる請求の範囲１の方法。
  4. 【請求項４】核酸ポリメラーゼが５′→３′ヌクレアー
    ゼ活性を有するDNAポリメラーゼである請求の範囲１の
    方法。
  5. 【請求項５】標識オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド
    が、ヌクレアーゼの切断の特異性をコントロールするよ
    うに修飾を加えてある請求の範囲１の方法。
  6. 【請求項６】標識オリゴヌクレオチドが少なくとも１種
    の標識物を含む請求の範囲１の方法。
  7. 【請求項７】標識オリゴヌクレオチドが第１、第２の標
    識物をふくみ、第一の標識物と第二の標識物がヌクレア
    ーゼにより切断を受けやすいサイトを隔てて離れている
    請求の範囲１の方法。
  8. 【請求項８】標識オリゴヌクレオチドが５′末端で標識
    されている請求の範囲６の方法。
  9. 【請求項９】標識オリゴヌクレオチドがさらにそのテー
    ル部分が核酸でないものから構成されているものあるい
    はターゲットの核酸配列とは非相補的なヌクレオチド配
    列から構成されている請求の範囲７の方法。
  10. 【請求項１０】標識物がテールの部分あるいは非相補的
    な配列のヌクレオチドに結合している請求の範囲９の方
    法。
  11. 【請求項１１】標識物が５′末端に結合していて、テー
    ル部分あるいは非相補的な配列によりターゲットの核酸
    配列に相補的な配列よりはなされている請求の範囲10の
    方法。
  12. 【請求項１２】核酸のポリマー化反応が十分促進される
    ような条件下で、標識断片の遊離が第一のオリゴヌクレ
    オチドが伸張している間に起こる請求の範囲１の方法。
  13. 【請求項１３】サンプル中のターゲットの核酸塩基配列
    を検出するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅方法にお
    いて、 （ａ）前記サンプルを含むPCRアッセイに、ターゲット
    の核酸の領域に相補的な配列を含有する少なくとも一種
    の標識オリゴヌクレオチドを供給し、この標識オリゴヌ
    クレオチドはステップ（ｂ）のオリゴヌクレオチドプラ
    イマーで決定されるターゲットの核酸の領域内にアニー
    ルし； （ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーのセットを供給
    し、そこで第一のプライマーはターゲット核酸配列の一
    本の鎖の領域に相補的な配列を持ち、相補的なDNA鎖の
    合成のプライミングを行ない、第二のプライマーはター
    ゲット核酸配列のもう一本の鎖の領域に相補的な配列を
    含有し、その相補的なDNA鎖の合成のプライミングを行
    ない：それぞれのオリゴヌクレオチドプライマーは同じ
    核酸鎖にアニールする標識オリゴヌクレオチドの上流で
    その相補的鋳型にアニールするようにして選定されてい
    て； （ｃ）ターゲットの核酸塩基配列の増幅を鋳型依存性ポ
    リメライジング剤として５′→３′ヌクレアーゼ活性を
    もつ核酸ポリメラーゼを用いPCRサイクリングステップ
    で受け入れられるような条件で行なうもので、PCRサイ
    クリングステップとは（ｉ）ターゲット配列中の鋳型の
    核酸配列にプライマーと標識オリゴヌクレオチドをアニ
    ールさせ、（ii）プライマーを伸張させ、そこで核酸ポ
    リメラーゼはプライマー伸張生成物を合成し、同時に核
    酸ポリメラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ活性により標
    識オリゴヌクレオチドとそれに相補的な鋳型核酸配列か
    ら構成されるアニール形成下二本鎖複合体から標識断片
    の遊離を行ない、それによって検出可能な標識断片を産
    生し、そして、 （ｄ）遊離された標識断片を検出および／あるいは測定
    しサンプル中のターゲットの核酸配列の存否を決定する
    ことからなる方法。
  14. 【請求項１４】核酸ポリメラーゼが耐熱性酵素である請
    求の範囲13の方法。
  15. 【請求項１５】耐熱性酵素がThermus属種に由来するDNA
    ポリメラーゼである請求の範囲14の方法。
  16. 【請求項１６】アニールしているオリゴヌクレオチドプ
    ライマーの３′末端が同じ核酸鎖にアニールしている標
    識オリゴヌクレオチドの５′末端に近接している請求の
    範囲13の方法。
  17. 【請求項１７】核酸ポリメラーゼによる伸張反応を阻止
    するために３′末端をブロックされた標識オリゴヌクレ
    オチドによる請求の範囲16の方法。
  18. 【請求項１８】標識オリゴヌクレオチドがさらに１−約
    10塩基の、ターゲットの核酸配列とは実質的に非相補的
    な配列を含有する請求の範囲16の方法。
  19. 【請求項１９】標識オリゴヌクレオチドが第１、第２の
    標識物をふくみ、第一の標識物と第二の標識物がヌクレ
    アーゼにより切断を受けやすいサイトを隔てて離れてい
    る請求の範囲13の方法。
  20. 【請求項２０】請求の範囲13の工程（ａ）において標識
    オリゴヌクレオチドのプローブの一対があたえられる請
    求の範囲13の方法。
  21. 【請求項２１】標識されたプローブの一対が同じ相補的
    核酸鎖の異なった重なり合わない領域にアニールし、第
    二の標識プローブの５′末端が第一の標識プローブの
    ３′末端と隣接する請求の範囲20の方法。
  22. 【請求項２２】標識物が非相補的配列内のヌクレオチド
    に結合している請求の範囲18の方法。
  23. 【請求項２３】標識物が５′末端に結合していて、非相
    補的な配列により相補的なプローブ配列よりはなされて
    いる請求の範囲22の方法。
  24. 【請求項２４】オリゴヌクレオチドが５′末端で標識さ
    れている請求の範囲13の方法。
  25. 【請求項２５】オリゴヌクレオチドがブロックされた
    ３′末端で標識されている請求の範囲17の方法。
  26. 【請求項２６】標識物がオリゴヌクレオチドの内部の配
    列に結合している請求の範囲13の方法。
  27. 【請求項２７】標識物が増幅されたターゲットの核酸配
    列の数に比例したシグナルを与える請求の範囲13の方
    法。
  28. 【請求項２８】標識物がシグナルを与える性質をそなえ
    たデオキシリボヌクレオシドアナログである請求の範囲
    13の方法。
  29. 【請求項２９】標識オリゴヌクレオチドは、オリゴヌク
    レオチド上で相互作用し合う一対のシグナル発生標識物
    で、検出しうるシグナルの発生を有効に減弱させるよう
    に配置されている標識物からなり、その標識物はオリゴ
    ヌクレオチド内でヌクレアーゼの切断を受けやすいサイ
    トによって離されて配置され、、それにより、プライマ
    ー伸張反応において核酸ポリメラーゼの５′→３′ヌク
    レアーゼ活性により第一の相互作用するシグナル発生標
    識物が第二の相互作用するシグナル発生標識物よりその
    感受性サイトで切り離されて検出しうるシグナルを生成
    する請求の範囲13の方法。
  30. 【請求項３０】第一の標識物が化学発光基質で、第二の
    標識物がそれと相互作用する蛍光団である請求の範囲29
    の方法。
  31. 【請求項３１】オリゴヌクレオチドの標識物が核酸ポリ
    メラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ活性が標識断片を遊
    離させることが可能なだけ十分な長さのスペーサーアー
    ムを介して、結合している請求の範囲13の方法。
  32. 【請求項３２】標識オリゴヌクレオチドとそれに関連し
    た上流のオリゴヌクレオチドプライマーのメルティング
    温度（Tm）の差が、PCRサイクル中のアニーリングのス
    テップで標識オリゴヌクレオチドがより結合しやすいよ
    うな設定になっている請求の範囲13の方法。
  33. 【請求項３３】標識オリゴヌクレオチドのTmが上流のオ
    リゴヌクレオチドプライマーのTmより40℃高い請求の範
    囲32の方法。
  34. 【請求項３４】標識オリゴヌクレオチドの断片がモノヌ
    クレオチド、ジヌクレオチドおよびより大きいヌクレオ
    チド断片の混合物からなる請求の範囲13の方法。
  35. 【請求項３５】標識断片の検出の前に標識オリゴヌクレ
    オチド断片をPCR混合物中の他の成分より分離すること
    からなる請求の範囲13の方法。
  36. 【請求項３６】分離のステップでサイズエクスクルージ
    ョンクロマトグラフを使用する請求の範囲35の方法。
  37. 【請求項３７】PCR混合物から標識断片を固相抽出法で
    分離する請求の範囲35の方法。
  38. 【請求項３８】固相にアビジンあるいはストレプトアビ
    ジンを結合させ、標識オリゴヌクレオチドにさらに標識
    物とはヌクレアーゼの切断を受けやすいサイトで分離す
    るビオチン分子を結合させた請求の範囲37の方法。
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