JP2843566B2 - 塩酸塩の存在下で生理活性物質を包みこんだ多胞性リポソーム - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は生物学的に活性のある物質を包みこんだ多胞
の合成脂質小胞（multivesicular lipid vesicles）す
なわちリポソームとその製造方法に関する。

発明の背景 多胞性リポソームはキム等によって最初に作られた
（1983年、Biochim−Biophys.Acta第782巻、339〜348
頁）３つの主要なリポソームタイプの中の１つであり、
その中に複数の非同中心的な水性の室をもつものであっ
て単層のリポソーム（ファン、1969年、Biochemistry、
第８巻、334〜352頁、キム等、1981年、Biochim−Bioph
ys.Acta第646巻、１〜10頁）や多重層のリポソーム（バ
ンガム等、1965年、J.Mol.Bio.第13巻、238〜252頁）と
は全く異なっている。リポソームを作るために先行技術
が多くの技術について記載しているが、これらの技術の
全てが多胞性でないリポソームの生産に関している。例
えば、レンク（Lenk）に対してのアメリカ特許No.4,52
2,803;バルデシュビーラー（Baldeschwieler）に対して
のNo.4,310,506;パパハドゥポウロス（Papahadjopoulo
s）に対しての4,235,871;シュナイダー（Schneider）に
対しての4,224,179;パパハドゥポウロスに対しての4,07
8,052;ティラー（Taylor）に対しての4,394,372;マルチ
ェッティ（Marchetti）に対しての4,308,166;メゼイ（M
ezei）に対する4,485,054;レジニアク（Redziniak）に
対する4,508,703などがあるが全て多胞性でない小胞性
について記したものである（リポソームの調製のいろい
ろな方法についての包括的な総説についてはSzoka等（1
980年）、Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，第９巻、467〜508
頁を参照せよ）。

キム等（Kim et al.）（1983年、Biochim.Biophys.Ac
ta、第782巻、339〜348頁）の方法は多胞性のリポソー
ムを記している唯一の報告であるが、アラーＣ（ara−
Ｃ）のような小さな分子を包み込む効率は比較的低く、
包み込まれた分子の生体液への漏洩の割合が高かった。

多くの薬剤での治療を最適にするには長時間薬剤の濃
度を保つ必要がある。例えば、細胞分裂に特異的な抗代
謝物で抗癌のための治療を最適にするには細胞障害性の
薬剤量を長時間維持することが必要である。サイタラビ
ンは高度に投与スケジュールに依存する抗癌剤である。
この薬剤は細胞がDNAを作っているときにのみ細胞を殺
すので、治療のための薬剤濃度に長時間さらされること
が細胞を殺すのに必要とされる。残念ながら、サイタラ
ビンの静脈注射（IV）あるいは皮下注射（SC）投与後の
半減期は非常に短かい。サイタラビンのような細胞分裂
サイクル相に特異的な薬剤で癌細胞を殺すことを最適に
するためには２つの主要な必要条件がある。第一に癌は
宿主にとって不可逆的な害作用をもたらさずに高濃度の
薬剤にさらされねばならない；第２に癌細胞の全部また
は殆んどがサイタラビンの存在にDNA合成をしなければ
ならないほど長時間腫瘍をさらさねばならない。

本発明前の技術では、血漿細胞を長期間接触させるた
めの唯一の方法は連続的なIV（静脈内投与）またはSC
（皮下投与）による注入（infusion）によるもので両方
とも不便で高価である。それ故、それらの薬剤を補給す
るための製剤では満足できる徐放性が必要とされる。過
去には、研究者は代謝をおくらせるために薬剤分子を化
学修飾したり、可溶化をおくらせるために疎水性の部分
を共有結合で結合することによってこれを得ようと試み
た。そのような操作は新たな毒性の作用〔フィンケルス
タイン等（Finkelstein.et al.）Cancer Treat Rep.第6
3巻、1331〜1333頁1979年〕や、或いは許容されざる薬
物動態学的または製剤的問題点〔ホー等（Ho et al.（C
ancer Res.第37巻、1640〜1643頁、1977年〕を生んでい
る。

従って生物学的に活性のある物質の治療濃度に長時間
引きつづいて接触させる徐放性の補給的製剤が望まれ
る。

本発明はそのような製剤を指向している。

発明の要約 本発明は最適な結果のために生物活性物質の治療濃度
に長時間続いて接触させるように塩酸塩の存在で包み込
まれた生物活性物質を含んだ多胞性のリポソームを提供
している。本発明はまたそのような多胞性リポソームを
作る方法を提供する。

多胞性リポソームは高いカプセル化効率をもち、包み
込んだ物質の漏出速度が低く、よく限定された再現性の
ある粒径分布をもち、球型をしており、容易に増減ので
きる調整の可能な平均径をもち、また内容積と数を調整
できる。

多胞性の脂質小胞すなわちリポソームを作る過程は一
種またはそれ以上の有機溶媒に少くとも１つの中性脂肪
と１種またはそれ以上の全体で負電荷をもつた少くとも
１つの両性脂質を含む脂質成分を溶かし、その脂質成分
の中に、塩酸塩を含んだ混じり合わない第一の水性成分
と包みこむべき１つまたはそれ以上の物質を加え、それ
ら２つのまじり合わない成分からの水と油のエマルジョ
ンを作り、その水−油エマルジョンを第２の混じり合わ
ない水性成分に浸漬し、水−油エマルジョンを分散させ
て最初の水性成分の多数の小滴をその中に含ませた溶媒
粒子を作り、その有機溶媒粒子から有機溶媒を蒸発させ
て多胞性リポソームを形成することを包含している。塩
酸のような塩酸塩の使用は、高効率でのカプセル化とカ
プセルに包みこまれた分子の生体液中及び生体内でのゆ
っくりとした漏出速度を得るために必須である。塩酸塩
が酸性のときは溶媒粒子が互いにくっつき合うことを防
ぐために低イオン強度の中和剤を使うことが必要であ
る。

従って、本発明の目的は生物学的に活性のある物質を
治療濃度に長時間長くさらせるような徐放性の補給製剤
を提供することである。

もう一つの本発明の目的は、そのような補給剤を調製
する方法を提供することである。

本発明のさらにもう一つの目的は、生物活性物質をそ
の中に包み込み、そして治療濃度に長時間保たせるよう
な多胞性のリポソームを提供することである。

生物学的な活性物質の治療濃度に最適な結果が得られ
るように長時間保たせるような塩酸塩の存在でカプセル
化した生物活性物質を含んだ多胞性リポソームの提供が
本発明のもう一つの目的である。

さらにもう一つの本発明の目的はそのような多胞性リ
ポソームを作る方法を提供することである。

好ましい態様の記載 明細書や特許請求の範囲の記載中で使われている「多
胞性リポソーム」の言葉は脂質二重層の膜から成り何層
もの非同中心性の水性の部屋を包みこんでいる人工的な
顕微鏡滴な脂質小胞を意味している。それに対して、単
層のリポソームは単一の水性の部屋をもっている。また
多重層リポソームは複数のタマネギの皮の型の同心円的
な膜をもちその間に貝殻のような同心円性の水性の区画
室をもったものである。

明細書や特許請求の範囲の記載中で使われている「溶
媒粒子」の言葉は有機溶媒性の顕微鏡的な球状粒子を言
い、その中には水溶液の多数の小滴がある。溶媒粒子は
第２の水溶液中に懸濁状態にあり、全体が浸漬された形
にある。

「中性脂質」の言葉はそれ自体では膜を作る能力がな
く親水性の「頭」の基を欠いている油または脂肪を意味
している。

「両性脂質」の言葉は、親水性の「頭」の部分と疎水
性の「尾」の部分をもち膜を形成する能力がある分子を
意味する。

「イオン強度」はイオン＝1/2（M₁Z₁ ²＋M₂Z₂ ²＋M₃Z₃ ²
＋…）で定義されM₁,M₂,M₃…は溶液中のいろいろなイオ
ンのモル濃度を、Z₁,Z₂,Z₃…はそれぞれの荷電を表わし
ている。

「低イオン強度」とは大凡0.05以下の、望ましくは0.
01以下のイオン強度である。

簡単にいえば「水／油」エマルジョンは、まず、その
脂質成分のために両性脂質を揮発性の有機溶媒に溶か
し、それにまざり合わない第１の水性成分と、包みこむ
べき物質と塩酸塩を加え、そして機械的にその混合物を
エマルジョンにすることによって作られる。そのエマル
ジョンの中では有機溶媒に懸濁した水滴が内部の水性の
区画を作るだろうし、その水性の区画を裏打している両
性の脂質の単層が最終産物における二重膜の一つの層と
なろう。エマルジョン全体が１つまたはそれ以上の非イ
オン性の浸透剤と低イオン強度の酸中和剤を含む第２の
水性成分に浸漬され、機械的にあるいは超音波エネルギ
ーやノズル噴出やそれらの併用によって撹拌されて第２
の水性成分中に懸濁された有機溶媒の粒子を形成する。
溶媒粒子は包み込まれた物質を溶解して含んだ多数の水
性小滴を含んでいる。揮発性の有機溶媒は懸濁液の上を
気流を通すことによって粒子から蒸発させられる。溶媒
が完全に蒸発したら粒子は多胞性リポソームに変換す
る。利用される代表的な気体は窒素へ、ヘリウム、アル
ゴン、酸素、水素、二酸化炭素がある。

塩酸塩の使用は、カプセル化の効率を高め、カプセル
化された分子が生体液中において、および生体内におい
て、ゆっくり漏出する速度を得るために必須である。塩
酸塩が酸性のときは溶媒粒子が互いにくっつき合ってし
まうことを防ぐために低イオン強度の中和剤を使うこと
が必要である。塩酸が望ましいが満足できるその他の塩
酸塩はリジン塩酸塩、ヒスチジン塩酸塩やそれらの組み
合わせによるものを含む。使われる塩酸塩と中和剤の量
は約0.1mMから約0.5Μの濃度にあり望ましくは約10mMか
ら約200Μ濃度にある。

エーテル、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、フレオン
のような多くの異なるタイプの揮発性疎水性溶媒が脂質
相の溶媒として使える。

例えば、ジエチルエーテル、イソプロピルおよび、そ
の他のエーテル類、クロロホルム、テトラヒドロフラ
ン、ハロゲン化エーテル類、エステル類及びそれらのく
み合わせによるものなどが満足できる。

溶媒粒子が互いにくっつき合ったり、器壁にくっつい
たりすることを防ぐためには、全体で負荷電となるよう
な両性脂質を少なくとも１％のモル比で粒子の中に入れ
る必要があり、懸濁した水溶液は非常に低いイオン強度
にする必要があり塩酸塩が酸であるときには低イオン強
度の中和剤を塩酸塩を吸収するために必要とされる。さ
もなければ、溶媒粒子は合体してきたない浮カスにな
る。１つまたはそれ以上の非イオン性の浸透剤がバラン
スのとれたリポソームの中と外の浸透圧を保つために懸
濁された水溶液の中に入れる必要がある。多胞性リポソ
ームを作るためにいろいろなタイプの脂質を使うことが
できるが２つだけ必要なことは１つの中性脂質と１つの
負荷電の両性脂質を含ませることである。中性脂質の例
はトリオレイン、トリオクタニオン、大豆油のような植
物油、ラード、ビーフファット、トコフェロール及びそ
れらのくみ合わせなどである。全体で負電荷の両性脂質
の例はカルジオリピン、フォスファチヂルセリン、フォ
スファチヂルグリセロール、フォスファチジン酸などで
ある。

第２の水性成分はグルコース、庶糖（シュークロー
ス）、ラクトースを含む炭水化物やリジン、ヒスチジン
のようなアミノ酸やそれらの組み合わせによるような溶
質を含んでいる水溶液である。

多くの多様な生物学的物質がその多胞性リポソームの
中に包む含まれることでくみこまれる。これらは薬剤や
DNAやRNA、ヒトにとって有効な組みかえDNA技術によっ
て作られたいろいろなタイプの蛋白やタンパク性ホルモ
ン、血球幹細胞性成長因子、モノカイン、リンホカイ
ン、腫瘍壊死因子、インヒビン、腫瘍成長因子α及び
β、ムレリアン阻害因子、神経成長因子、繊維芽細胞成
長因子、血小板由来成長因子、LHやその他の放出ホルモ
ンを含む脳下垂体ホルモン、カルシトニン、ワクチンの
ための免疫原として使われるタンパク、DNAやRNA配列な
どが含まれる。

以下の第１表には塩酸塩の存在で多胞性リポソーム中
に包みこまれるヒトにとって有効な代表的な生物活性物
質のリストが掲げられている。

ヒトに投与するのに適する用量範囲は体表面積に対し
て１〜1600mg/m²の範囲にある。この範囲が非常に大き
い理由は皮下投与のようなある種の適用には必要量は全
く小さいが、腹腔内投与のような他の適用では使われる
べき量は著しく多い。前記の投与量範囲外の投与量が与
えらえようがこの範囲は殆んど全ての生物活性物質につ
いて使われる幅を含んでいる。

多胞性リポソームはどんな投与形態が望まれても投与
できる。例えば、母指球内、腹腔内、皮下、静脈内、リ
ンパ内、経口、粘膜下、及び気管支上皮、消化器官上
皮、泌尿生殖器上皮やいろいろな粘膜を含む多種多様な
上皮下及び筋肉内などの投与である。

以下の実施例が生物活性物質を包みこんだこれらの多
胞性リポソームを調製する望ましい方法を示している。

実施例１ ステップ１） 清浄な１−ドラムのガラス製バイヤル
（外寸法で1.4cm×高さ4.5cm）に9.3マイクロモルのジ
オレイルレシチン、2.1マイクロモルのパルミトイルフ
ォスファチジルグリセロール、15マイクロモルのコレス
テロール、1.8マイクモルのトリオレイン及び1mlのクロ
ロホルムを入れた（脂質相）。

ステップ２） 1mlの水性相の0.136Nの塩酸水溶液にシ
トシン・アラビノシド（20mg/ml）を溶かし上の脂質相
を含んだ１ドラムバイヤルに加えた。

ステップ３） 水／油エマルジョンを作るために、バイ
ヤルをシールしてボルテックス・シェカーの頭にとりつ
け最高速度で６分間振とうした。

ステップ４） 水に懸濁したクロロホルム粒子を作るた
めに、エマルジョンの半分づつを先細のパスツールピペ
ットを開いて迅速に４％のデキストロース水溶液と40mM
のリジン（塩基を含まない）を含む１−ドラムバイヤル
に移しボルテックスミキサーで半分のスピードで３秒間
振とうしてクロロホルム粒子を形成した。

ステップ５） ２つのバイヤル中のクロロホルム粒子懸
濁液を5mlの水、グルコース（3.5g/100ml）及びフリー
塩基のリジン（40mM）を含んだ250ml容エルレンマイヤ
ーフラスコの底に注ぎこみ、窒素ガス気流を７／分で
フラスコ中にふきつけて37℃、10〜15分間でクロロホル
ムをゆっくり蒸発させた。リポソームはそれから600×
ｇ、５分間遠心分離して分離した。

できたリポソームの平均の大きさは（±分布の標準偏
差）は19.4±6.5μｍであった。捕獲のパーセントは59
±７％で、その容量は使った全脂質mg当り36±４μで
あった。ヒトの血漿中でインキュベートした多胞性リポ
ソームからのシトシンアラビノシドの漏出の速度に対し
て塩酸の添加は著しく影響する。リポソーム製剤＋少な
くとも100倍の体積の血漿＋0.01％アジ化ナトリウムを
振とうしながら37℃の温度で培養した。望ましい時点
で、この混合物の画分を取り出して、リポソームを遠心
分離で分離し、ペレット内に残っている薬品の量を分光
光度定量計で、またはHPLCで測定した。上の例に塩酸が
添加されたとき薬剤の半分が12日で漏出したが、一方、
上のステップ２）ので塩酸が除かれたときにはたった12
時間で漏出した。1mlのリポソーム製剤を腹膜内に注射
されたマウスを望ましい時点で頸部切除（cervical dis
location）により殺し、腹腔を10mlの通常食塩水で洗浄
して、サンプルを上に述べたように分析した。動物でテ
ストしたときも塩酸の添加はシトシンアラビノシドの漏
出速度に著しく影響する。その薬剤は製造の間塩酸を加
えたときもっと長い期間マウスの腹腔内に留まった。

以下の例は多胞性リポソームを大バッチで作る方法の
スケールアップを説明している。

実施例２ ステップ１） ステンレススチールのホモゲナイザー
〔オムニミキサー、17150型、ソーバル社、（コネチカ
ット州ニュートン市）製〕に186μモルのジオレイルレ
シチン、42μモルのジパルミトイルフォスファチジルグ
リセロール、30μモルのコレステロール、36μモルのト
リオレイン及び20mlのクロロホルムを入れる（脂質
相）。

ステップ２） 0.136Nの塩酸溶液にとかしたシトシンア
ラビノシド（20mg/ml）の20mlの水性相を脂質相を入れ
た上記ステンレススチールミキサー中に撹拌しながら加
えた。

ステップ３） 水／油エマルジョンを作るために、ホモ
ゲナイザーを密閉してスピード“7"にセットして３分間
動かした。

ステップ４） 水に懸濁したクロロホルム微粒子を作る
ために、エマルジョンの半量を２つの別のステンレスス
チール製ホモゲナイザー容器に各々注ぎこんだ（撹拌し
ながら）。各々には４％デキストロース水溶液200mlと4
0mMのフリー塩基のリジンが入れられており、それから
スピードを“1"にセットして３秒間オムニミキサーでホ
モゲナイズした。

ステップ５） 各ホモゲナイザー容器中のクロロホルム
粒子懸濁液を底の平らな８インチ×12インチの大きさの
四角いスチール容器に注ぎ込み、14l/minの量の窒素ま
たは空気の気流を一様に吹きこむことで10〜15分間かけ
てクロロホルムをゆっくりと蒸発させた。リポソームを
それから600×ｇ、５分間遠沈して分離した。

次の例はより小さなあるいはより大きなリポソームを
作る方法を説明している。

実施例３ 実施例１または２のものよりも小さなリポソームを作
るためには、実施例１または２のステップ４の振とうま
たは均質化の強さ、時間を増加した。大きいリポソーム
を作るためには実施例１または２のステップ４の振とう
または均質化の強さまたは時間を減らした。

次の実施例の４はいろいろな脂質組成のリポソームを
作りいろいろな材料をリポソームにとり込ませる代表的
な例を説明している。

実施例４ 実施例１または２のステップ１）においてフオファチ
ジルコン（PC）、カルジオリピン（CL）、ジミリストイ
ルフォスファチジルブリセロール（DMPG）、フォスファ
チジルエタノールアミン（PE）、フォスファチジルセリ
ン（PS）、ジミリストイルフォスファチジン酸（DMPA）
のような他の両性脂質がいろいろな組合せで使われ同様
な結果が得られた。例えばPC/C/CL/TOを4.5/4.5/1/1の
モル比で;DOPC/C/PS/TO/を4.5/4.5/1/1のモル比で;PC/C
/DPPG/TCを5/4/1/1のモル比で;PC/C/PG/TCを5/4/1/1の
モル比で;PE/C/CL/TOを4.5/4.5/1/1のモル比で;PC/C/DM
PA/TOを4.5/4.5/1/1のモル比で全て使うことができる。
他の生物活性物質をとり込ませるためには単に希望の物
質または第１表の物質の組合せに実施例１または２のス
テップ２）においてシトシンアラビノシドと置換するこ
とができる。これらは全て、ヒトに効果のある多胞性リ
ポソームを提供し、生物活性物質を治療濃度に長時間お
くことができる。

実施例５ ステップ１） 清浄な１−ドラム・ガラス製小びん（外
寸法で直径1.4cm×高さ4.5cm）に、13マイクロモルのジ
オレイルレシチン、2.9マイクロモルのジパルミトイル
フォスファチジルグリセロール、10マイクロモルのコレ
ステロール、2.5マイクロモルのトリオレイン、および1
mlのクロロホルムを入れた（脂質相）。

ステップ２） 1mlの水性相シトシン・アラビノシト（2
mg/ml）を0.100Μリシン塩酸塩水溶液に溶かしたもの
を、脂質相を含んだ上記の１−ドラム小びんに加えた。

ステップ３） 水／油エマルジョンを作るために、この
小びんを密閉して、ボルテックス・シェーカーの頭部に
取り付け、最高速度で６分間振とうした。

ステップ４） クロロホルム粒子を水に懸濁させるため
に、上記エマルジョンの半分を、先細のパスツール・ピ
ペットを通じて、４％デキストロース水溶液と40mMの塩
基を含まないリシンをそれぞれ含んでいる２つの１−ド
ラム小びんのそれぞれに迅速に噴出させ、そして、ボル
テックス・ミキサーで三分間、半分のスピードで振とう
して、クロロホルム粒子を形成した。

ステップ５） ２つの小びんの中のクロロホルム粒子懸
濁液を5mlの水、グルコース（3.5g/100ml）、およびフ
リー塩基リジン（40mM）を250ml容のエルレンマイヤー
・フラスコの底に注ぎ込み、窒素ガス流を７／分の割
合でフラスコ内に吹きつけて、30℃の温度下で10〜15分
間、クロロホルムを蒸発させた。600×ｇで５分間遠心
分離を行って、リポソームを分離させた。

ヒトの血漿内で培養された多胞性リポソームからのシ
トシン・アラビノシドの漏出の速度に対して、シリン塩
酸塩の添加は著しい影響を及ぼした。ステップ２で0.1
Μリシンの塩素塩酸に溶かしたカプセル剤の５および31
％がそれぞれ24時間および72時間後に漏出したのに対し
て、塩酸を含んでいない場合には、カプセル剤の50およ
び90％がそれぞれ、24時間と72時間後に漏出した。

かくして，本発明は生物学的な活性物質が比較的多量
に包み込まれた広い範囲の用途適用のできる「補給」性
薬剤を提供し、害となる投与量の高すぎるピーク量を避
けて最適の結果を得るためのこれらの物質の治療濃度に
長時間保たせることができる。

それ故、本発明はその目的を達するためによく適合さ
れており、その中に含まれている他の利点や特徴も含め
た利点、特徴をもっている。

本発明において、ここに述べられた内容はそれを記載
するために与えられたもので、特許請求の範囲によって
定義される発明の精神の中にある変更は可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 9/10,9/127 B01J 13/02

Claims (21)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の各ステップを含む多胞性の脂質小胞
   すなわちリポソームを作る方法。 （ａ） 少なくとも１つの中性脂質と、ホスファチジル
   コリン、カルジオリピン、ホスファチジルエタノールア
   ミン、スフィンゴミエリン、リゾフォスファチジルコリ
   ン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトー
   ル、ホスファチジルグリセロール及びフォスファチジン
   酸から成る群から選ばれ少なくとも１つの両性脂質を含
   む脂質成分を１つまたはそれ以上の有機溶媒に溶解し、 （ｂ） その脂質成分に塩酸塩と１つまたはそれ以上の
   込み包みべき生物活性物質とを含む混り合わない第一の
   水性成分を加え、 （ｃ） その２つの混り合わない成分から水／油エマル
   ジョンを作り、 （ｄ） その水／油エマルジョンを第二の混り合わない
   水性成分の中に移し、浸漬し、 （ｅ） 水／油エマルジヨンを分散して第一の水性成分
   の多数の小滴をその中に含んだ溶媒粒子を作り （ｆ） その溶媒粒子から有機溶媒を蒸発して多胞性リ
   ポソームにする。
2. 【請求項２】脂溶性の生物学的に活性のある物質が脂質
   成分と混和物として提供される特許請求の範囲第１項記
   載の方法。
3. 【請求項３】中性脂質がトリオレイン、トリオクタノイ
   ン、植物油、ラード、牛脂、トコフェロール及びそれら
   の組み合わせから成る群から選ばれる特許請求の範囲第
   １項記載の方法。
4. 【請求項４】有機溶媒がジエチルエーテル、イソプロピ
   ルエーテル、クロロホルム、テトラヒドロフラン、エー
   テル類、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、ハロゲン化エ
   ーテル、エステル及びそれらの組み合わせら成る群から
   選ばれる特許請求の範囲第１項記載の方法。
5. 【請求項５】塩酸塩が塩酸、リジン塩酸塩、ヒスチジン
   塩酸塩及びそれらの組み合わせからなる群から選ばる特
   許請求の範囲第１項記載の方法。
6. 【請求項６】物質が親水性の生物活性物質である特許請
   求の範囲第１項記載の方法。
7. 【請求項７】有機溶媒の蒸発が第二の水性成分上を気体
   を通すことによって行われる特許請求の範囲第１項記載
   の方法。
8. 【請求項８】包みこまれる物質が生理活性物質である特
   許請求の範囲第１項記載の方法。
9. 【請求項９】脂質成分が燐脂質及び燐脂質の混合から成
   る群から選ばれる特許請求の範囲第１項記載の方法。
10. 【請求項１０】少なくとも１つの燐脂質が少なくとも１
    つの全体で負の荷電をもった群から選ばれる特許請求の
    範囲第９項記載の方法。
11. 【請求項１１】燐脂質がコレステロールとの混和物で提
    供される特許請求の範囲第９項記載の方法。
12. 【請求項１２】燐脂質がステアリルアミンとの混和物で
    提供される特許請求の範囲第９項記載の方法。
13. 【請求項１３】２つの成分の乳化が機械的な混合、超音
    波エネルギー、ノズルからの噴霧から成る群から選ばれ
    た方法を使って行われる特許請求の範囲第１項記載の方
    法。
14. 【請求項１４】リポソームの平均径とその中にある水性
    の分画室の数が選ばれた方法のタイプ、強さ、時間の長
    さによって決められる特許請求の範囲第13項記載の方
    法。
15. 【請求項１５】塩酸塩が酸性で第二の水性成分が少なく
    とも１つの中和剤を含んでいる特許請求の範囲第１項記
    載の方法。
16. 【請求項１６】中和剤がフリーベース（Free−base）の
    リジンとフリーベースのヒスチジン及びそれらの組み合
    わせから成る群から選ばれる特許請求の範囲第15項記載
    の方法。
17. 【請求項１７】第二の水性成分が低イオン強度のもので
    ある特許請求の範囲第１項記載の方法。
18. 【請求項１８】第二の水性成分が炭水化物とアミノ酸か
    ら成る群から選ばれた溶質を含む水溶液である特許請求
    の範囲第17項記載の方法。
19. 【請求項１９】第二の水性成分がグルコース、シューク
    ロース、ラクトース、フリーベースのリジン、フリーベ
    ースのヒスチジン及びそれらの組み合わせから成る群か
    ら選ばれた溶質を含む水溶液である特許請求の範囲第17
    項記載の方法。
20. 【請求項２０】溶媒の小粒体の形成が機械的な撹拌、超
    音波エネルギー、ノズルから噴霧すること及びそれらの
    組み合わせから成る群から選ばれる方法を使って行われ
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。
21. 【請求項２１】リポソームの平均径が使われたエネルギ
    ーのタイプ、強度、時間によって決められる特許請求の
    範囲第20項記載の方法。