JP2848411B2 - 心房性ナトリウム利尿ペプチドクリアランス阻害剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、動物被検体における利尿剤、ナトリウム排
泄増加剤および／または血管拡張剤として有用な合成ペ
プチドに関する。特に、本発明は、心房性ナトリウム利
尿ペプチドに特異的なクリアランス受容体を阻止し、心
房性ナトリウム利尿ペプチドが基質である、ペプチダー
ゼを阻害するペプチドに関する。

背景技術 心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）は、心臓の心
房において合成され分泌される、循環ホルモンである。
このホルモンは、そのナトリウム排泄増加作用、利尿作
用および血管拡張作用により血圧を制御すると共に、副
腎腺からのアルドステロン分泌の阻害、肝臓からのレニ
ン分泌の阻害、およびレニンアンギオテンシン系の機能
的な拮抗作用を調整する。ANPホルモンは、広範囲にわ
たって研究されており、多数のアナログが提案されてい
る。1987年12月24日および1988年８月26日に出願され、
同一の譲渡人に譲渡され、本願に参考として取り入れ
た、同時係属中の米国特許出願第138,893号および第23
7,299号は、一連の天然ANP（環式ジスルフィドである）
の直鎖アナログを開示している。環式アナログは、1988
年５月31日に出願され、同一譲渡人に譲渡され、本願で
参考として取り入れた、同時係属中の特許出願第174,73
9号において開示されている。これらの同時係属出願
は、1988年３月16日に出願の米国特許出願第168,661号
（許可）、米国特許出願第921,360号（放棄）、米国特
許出願第904,091号（放棄）、米国特許第4,757,048号と
して現在発行されている米国特許出願第868,312号およ
び米国特許出願第795,220号（放棄）を含む、シリーズ
において提出されている最新のものである。様々なアナ
ログもまた、他によって提案されているが、ANPアナロ
グに関連する文献は、現在多岐にわたっている。

血流におけるANPの半減期は比較的短く、上記の米国
特許出願第138,893号において記載されるような、ANPの
アナログの多くは、ANPのクリアランス受容体を阻止す
る作用を行うと思われ、それによって、天然と同様に生
産されたANPがその効力を発揮する機会を増加させる。
大抵のANPクリアランスに貢献すると思われる、２つの
異なる経路が現在確認されている。第１経路は、受容体
によって仲介される代謝的クリアランスに関し、これ
は、その系におけるANPクリアランス全体の70〜80％を
説明するのに足りる十分な親和性と能力とを有する（Ma
ack,T.ら,Science（1987）238:675−679,EPO公開第233,
143号）。特異的受容体経路が阻害されるならば、もう
１つの経路、すなわち非飽和性のクリアランス経路が機
能することが示された、Almeida,F.A.,Amer J Physiol
（1988）（寄稿）。

様々な起源の付加的な証拠に基づいて、非飽和性のク
リアランス経路は、ペプチダーゼ、通常、エンドペプチ
ダーゼ24.11と呼ばれる中性エンドペプチダーゼ24.11
（EC3.4.24.11）の活性化を含んでいると思われる。198
8年４月26日発行の米国特許第4,740,499号は、エンドペ
プチダーゼ24.11の２つの特異的阻害剤であるチオルフ
ァン（thiorphan）またはケラトルファン（kelatorpha
n）を用いて心房性ペプチドの生物活性を長引かせるか
または高める方法を記載し、そしてクレームしている。
これらの阻害剤は、心房性ペプチドと同時に投与され
る。1988年１月27日公開のEPO出願公開第254,032号もま
た、一般に、血圧を治療するために、エンドペプチダー
ゼ24.11の阻害剤または中性金属ペプチダーゼの阻害剤
の使用を記載し、そしてクレームしている。これらはい
ずれも単独でまたはANP（またはアンギオテンシンを交
換する酵素の阻害剤）と共に使用される。この開示にお
いて、中性金属エンドペプチダーゼの阻害剤には、チオ
ルファンが含まれるが、さらに米国特許第4,610,816号
に開示されている化合物、すなわち実質的な一群（subs
tantial class）の化合物、およびEPO特許出願公開第11
7,429号（これも実質的な一群の化合物を含む）におい
て開示されている化合物を含む。1987年３月27日出願の
米国特許出願第32,153号、米国特許第4,513,009号およ
び欧州特許出願第38,046号に開示されている化合物も参
考とされる。さらに、多数の文献では、エンドペプチダ
ーゼ24.11がANPの細胞外不活性化の原因となるという結
論（Stevenson,S.L.ら、Biochem J（1987）243:183−18
7;Olins,G.M.ら、Biochim biophys Acta（1987）901:97
−100;Koehn,J.A.ら、J Biol Chem（1987）262:11623−
11627）［これは、ヒトプラズマから単離されたANPの代
謝による断片が、エンドペプチダーゼ24.11で処理され
たANPの開裂主生産物と同一である（Yandle,T.ら、Bioc
hem Biophys Res Commun（1987）146:832−839）という
所見を包含する］が支持されている。

また、エンドペプチダーゼ24.11の阻害剤が、投与さ
れたANPの生物学的応答を強化することも観察されてい
る（Fennell,S.A.,らFASEB J（1988）2:A936;Seymour,
A.A.ら、同書;Trapani、A.J.、ら、同書;McMartin,C.,
ら、同書;Zimmerman、M.B.、ら、同書:A937）。

チオルファンの使用に加えて、エンドペプチダーゼ2
4.11を阻害する様々な方法が開示されている。これらの
方法は、芳香族部分から適切な距離にある金属結合置換
基の使用を含む。Roques,B.P.ら、Nature（1980）288:2
86−288;Gordon,E.M.ら、Life Sci（1983）33（Supplem
ent 1）:113−116;Mumford,R.M.ら、Biochem Biophys R
es Comm（1982）109:1303−1309;Fournie−Zaluski,M.
C.ら、J Med Chem（1983）26:60−65;Waksman,G.ら、Bi
ochem Biophys Res comm（1985）131:262−268。

特異的受容体の阻害、およびエンドペプチダーゼ24.1
1に基づく非飽和性のクリアランス機構の、適切な阻害
剤による阻害の両者は、ANPの血液中の循環レベルを著
しく高め、その内因性ホルモンの活性を長引かせるはず
である。事実、ANPクリアランス受容体特異性リガン
ド、およびエンドペプチダーゼ24.11阻害剤であるチオ
ルファンを組み合わせたもので処理した、意識のあるラ
ットは、どちらか一方の経路のみを阻止した場合よりも
著しい利尿性およびナトリウム排泄増加性を示した（Ko
epke,J.,ら、FASEB Jour（1988）2:A527）。しかし、こ
れらの経路に阻害剤を投与することは、チオルファンが
血液と脳の境界を越えることが可能であるため、大脳エ
ンドペプチダーゼ24.11も阻害されるという欠点を有す
る（Bourgoin,S.,ら、J Pharm Exp Ther（1986）238:36
0−266）。この欠点は、ANPのクリアランス受容体を阻
止する単一の薬剤の使用、ならびにもう一方の非飽和性
の酵素経路を阻止することによって解決する。

本願に記載される本発明の化合物は、エンドペプチダ
ーゼ24.11阻害機能（すなわちANPのCys105−Phe106にお
ける開裂を阻害する機能）を、ANPクリアランス受容体
に結合するアナログに取り入れたものである。驚いたこ
とに、開裂阻害をもたらす要因は、これらの化合物のク
リアランス受容体結合能力には干渉しない。

発明の開示 本発明は、体内で分泌されるANPホルモン（これは、
高血圧からの防護、および体液およびナトリウムが滞在
することからの防護を提供する恒常性機構を制御する）
の能力を高める化合物を提供する。従って、本発明の化
合物は、ナトリウム排泄増加作用、利尿作用および血管
拡張作用であるので、高血圧、心臓病、腎臓疾患および
浮腫の治療に有用である。

本発明の合成アナログ化合物のほとんどは、Dzau,V.
J.,ら、N Engl J Med（1987）316:1279によって推薦さ
れる、126個の残基proANPペプチドに基づくANPペプチド
についての番号付けシステムを使用して天然ANPの配列A
A₁₀₉〜AA₁₁₃に、定められた様式で反応する、アミノ酸
残基のコアペンタペプチド配列を保持する。既知の天然
ANPにおいて、このコア配列は、ラットにおいてはRIDRI
であり、そして、ヒトにおいてはRMDRIである。この配
列のいくつかの定められた変換体（AA₁₁₃が存在しない
ものを含む）は、活性を有するが、ほとんどは、利尿作
用またはナトリウム排泄増加作用を調べるためのインビ
トロにおけるモデルシステムでのアッセイでは活性を示
さない。これらのアナログは、これらのペプチドのクリ
アランス受容体を阻止することによって内因性ANPの機
能を強化している。

１つの実体態様において、本発明は、次式の化合物に
向けられている： ここで、各AA₁₀₉およびAA₁₁₂は、好ましくは、独立し
て、塩基性／非環式アミノ酸残基であるが、また、中性
／極性／大型／非芳香族のアミノ酸残基であり得、そし
て、AA₁₀₉は、中性／無極性／大型／非芳香族のアミノ
酸残基であり得； AA₁₁₀は、ＤまたはＬ型の中性／無極性／大型／非芳
香族アミノ酸残基であり； AA₁₁₁は、酸性のアミノ酸残基であり；そして、 AA₁₁₃は、ＤまたはＬ型の中性／無極性／大型／非芳
香族のアミノ酸残基であるか、もしくは共有結合であ
り； ここで、Z₁は、 ここで、X₁は、４〜14Cの疎水性環式または非環式残
基であり、X₂は、式中の−CH−から1.5〜７Åの範囲
（２〜４単結合）において金属配位原子を含み、該金属
配位原子は、ＳおよびＯから選択され、−X₃−は、単結
合−CH₂−、−COまたは−NH−であり； Z₂は、AA₁₀₉とZ₁の疎水性部分との間に約4.5〜15Åの
距離（つまり、連結基においては、３〜９個の原子を含
み、あるいは、折りたたみにより適当な距離となる）を
提供するスペーサー基であり； Z₃は、（OH）、NH₂、NHR″またはNR″Ｒであり、こ
こでＲ″またはＲは、それぞれ独立して１〜10個の炭
素原子の直鎖または分岐鎖アルキルであり、１または２
個の炭素がＯ、ＮまたはＳによって置換され得；あるい
はZ₃は１〜20個のアミノ酸残基のペプチド、あるいはそ
のアミドまたはアルキルアミドであり、AA₁₁₃が共有結
合の際には、Z₃は、（OH）、NH₂またはペプチドであり
得ない。

本発明の前記の化合物において、隣接するアミノ酸残
基の間の１個またはそれ以上のアミドバックボーン結合
は、必要に応じて−CH₂NH−、−CH₂S−、−CH₂CH₂−、
−CH＝CH−（シスおよびトランス）、−COCH₂−、−CH
(OH)CH₂−および−CH₂SO−からなる群から選択される連
結基によって置換され得る。

本発明のペプチドにおける、１個または２個の残基
は、AA₁₁₀およびAA₁₁₃に加えて、またはそれらの代わり
に、対応するＤ異性体によって置換され得る。

また、本発明の局面に応じて、ナトリウム排泄増加
剤、利尿剤、血管拡張剤および／またはレニン−アンギ
オテンシン−アルドステロン系のモジュレーターとして
有用な薬剤組成物が提供される。この組成物は、本発明
の少なくとも１種の化合物（そのアミド、エステルおよ
びその無毒性塩を含む）を薬学的に受容され得る液体、
ゲルまたは固体担体と共に含む。さらに、本発明の局面
は、そのような化合物および組成物の製造方法、ならび
にそのような化合物および組成物を治療剤として使用す
る方法を提供する。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明の化合物を規定するアミノ酸の分類
を示す。

第２図は、いくつかの好適なZ₁置換基の例示的な実施
態様をそれらの略号と共に示す。

第３図は、Z₂の特性の実施態様の付加的な略号を示
す。

第４図は、本発明の化合物の例示的な実施態様を示
す。

第５図は、動物の全身における、利尿およびナトリウ
ム排泄増加に対する本発明の化合物の効力を示す。

発明を実施するための形態 このクラスの化合物は、特異的受容体クリアランス系
の阻害およびエンドペプチダーゼ24.11活性の阻害によ
って、内因性ANPのクリアランスを損なう能力を有する
ため、哺乳類の天然ペプチドがインビボで、ナトリウム
排泄増加作用、利尿作用および／または血管拡張作用を
示すかまたはモジュレートすることができる。

コアペンタペプチドのアミノ酸残基の配列，およびそ
の好ましい態様は，特定のサブクラスの、ある特徴を有
するアミノ酸によって定義される。

アミノ酸残基は一般に，以下に述べるとともに第１図
に示す４つの主要サブクラスに分けることができる。

酸性：この残基は生理的pHにおいて水素イオンを失う
ために負の電荷を有し，その残基は，ペプチドが生理的
pHの水性媒体中に存在するとき，この残基が含有される
ペプチドの立体配座の表面位置を求めて，水溶液により
引きつけられる。

塩酸基：この残基は生理的pHにおいて水素イオンと結
合するので正の電荷を有し，その残基は，ペプチドが生
理的pHの水性媒体中に存在するとき，この残基が含有さ
れるペプチドの立体配座の表面位置を求めて水溶液に引
きつけられる。

中性／無極性：この残基は生理的pHにおいて電荷をも
たず，この残基は，ペプチドが水性媒体中に存在すると
き，この残基が含有されるペプチドの立体配座の内部位
置を求めて，水溶液に反発される。またこれらの残基
は，本明細書においては“疎水性”とも呼ばれる。

中性／極性：この残基は生理的pHにおいて電荷をもた
ないが，この残基は，ペプチドが水性媒体中に存在する
とき，この残基が含有されるペプチドの立体配座の外部
位置を求めて水溶液に引きつけられる。

個々の残基分子を統計的に集積してみると、いくつか
の分子は電荷を有し，いくつかは電荷をもっていない。
従って，大なり小なり，水性媒体への吸引もしくは反発
があることは勿論明らかである。“電荷を有する”とい
う定義に適合するには，有意の割合（少なくとも約25
％）の個々の分子が生理的pHで電荷を持っていることが
必要である。極性もしくは無極性として分類するのに必
要な吸引もしくは反発の程度は任意的なものであるか
ら，本発明の特定のアミノ酸は，それぞれ特定して分類
されている。特定の名称がないアミノ酸のほとんどのも
のは，公知の挙動に基づいて分類することができる。

アミノ酸残基は，さらに，環式もしくは非環式，およ
び芳香族もしくは非芳香族，残基の側鎖の置換基につい
ての明らかな分類，ならびに小型もしくは大型というサ
ブクラス分類することができる。残基は，カルボキシル
基の炭素原子を含めて合計４個以下の炭素原子しかない
場合，小型とみなしている。小さな残基は，もちろん常
に非芳香族である。

天然に存在するタンパクのアミノ酸について，先のス
キームによるサブクラス分類は次のとおりである（第１
図もまた参照のこと）。

酸性：アスパラギン酸およびグルタミン酸； 塩基性／非環式：アルギニン，リジン； 塩基性／環式：ヒスチジン； 中性／極性／小型：グリシン，セリンおよびシステイ
ン； 中性／極性／大型／非芳香族：トレオニン，アスパラギ
ン，グルタミン； 中性／極性／大型／芳香族：チロシン； 中性／無極性／小型：アラニン； 中性／無極性／大型／非芳香族：バリン，イソロイシ
ン，ロイシン，メチオニン； 中性／無極性／大型／芳香族：フェニルアラニンおよ
びトリプトファン。

遺伝子がコードするアミノ酸のプロリンは，技術的に
は中性／無極性／大型／環式および非芳香族の群に含ま
れるが，ペプチド鎖の二次立体配座に基づいた公知の影
響による特別なケースなので，上記定義の群には含まれ
ない。

普通に遭遇するいくつかのアミノ酸で，遺伝コードで
コードされていないものがあり，それには，例えば次の
アミノ酸が含まれる：β−アラニン（β−Ala），また
はその他のω−アミノ酸類〔例えば３−アミノプロピオ
ン酸（３−amino proprionic）,4−アミノ酪酸（４−am
ino butyric）など〕，α−アミノイソ酪酸（Aib），サ
ルコシン（Sar），オルニチン（Orn），シトルリン（Ci
t）,t−ブチルアラニン（ｔ−BuA）,t−ブチルグリシン
（ｔ−BuG）,N−メチルイソロイシン（Ｎ−MeIle），フ
ェニルグリシン（Phg），およびシクロヘキシルアラニ
ン（Cha），ノルロイシン（Nle），システイン酸（Cy
a），およびメチオニンスルホキシド（MSO）。これらの
アミノ酸は特定の区分に入れるのが便利である。

上記定義に基づいて， Sarおよびβ−alaは中性／無極性／小型； ｔ−BuA,t−BuG,N−MeIle,NleおよびChaは中性／無極
性／大型／非芳香族； Ornは塩基性／非環式； Cyaは酸性； Cit,MSOおよび（アセチル）Lysは中性／極性／大型／
非芳香族；ならびに Phgは中性／無極性／大型／芳香族である（第１図参
照）。

種々のω−アミノ酸は，その大きさによって，中性／
無極性／小型アミノ酸として（β−アラニンすなわち３
−アミノプロピオン酸,4−アミノ酪酸）または大型アミ
ノ酸として（残り全部）分類される。

遺伝子内にコードされているその他のアミノ酸置換体
も，この発明の範囲内のペプチド化合物に含まれ，この
一般のスキームに分類することができる。

この発明のアナログ化合物を述べるのに用いる命名法
は，アミノ基が，ペプチドの各アミノ酸の左に位置し，
カルボキシル基が右に位置すると仮定するという従来の
慣行に従っている。本発明の選択された特定の態様を示
す式においては，アミノ末端基およびカルボキシ末端基
は，具体的に示さない場合が多いが，特に指示のない限
り，生理的pH値においてとる形態であると理解される。
従って，生理的pHにおてるＮ末端H⁺ ₂とＣ末端O^-とは，
特定の実施態様もしくは一般式に必ずしも記載し示して
はいないが，存在することが理解される。しかし、従来
のペプチド結合が存在しない場合に、２つの残基を連結
する共用されているＮは、［Ｎ］として示される。従っ
て、置換されたＮ−アルキルカルボキシペプチドおよび
Ｎ−アルキルカルボキシヒドロキサム酸ペプチドを命名
する際に、その構造式は、共有れれる窒素を−［Ｎ］−
として示すことによって描かれる。（Ｎ−アルキルカル
ボキシヒドロキサムペプチドにおけるヒドロキシルアミ
ノは、HAとして省略して示される）。例えば、HOOC−CH
(CH₂Ph)−NH−CH₂CO−Gly−Arg−Ile−Asp−Arg−Ile−
NH₂（Phはフェニル）であるアナログ＃364は、Ｆ［Ｎ］
Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｉ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−NH₂として示され、そし
て、化合物HONHCOCH(CH₂Ph)−NH−CH₂CO−Gly−Arg−Il
e−Asp−Arg−Ile−NH₂であるアナログ＃702は、HAF
［Ｎ］Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｉ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−NH₂として示され
る。

さらに、ペプチド鎖が、通常のαアミノおよびカルボ
キシル基を介して連結してペプチド結合で連結した残基
を形成しない場合には、以下の記号が使用される：［γ
−Ｌ−Glu］は、Ｌ−Gluの側鎖カルボキシル基を介して
のペプチド結合を示し、そして、αカルボキシル基はフ
リーのカルボン酸側鎖となり、同様に、記号［γ−Ｄ−
Glu］、［β−Ｌ−Asp］および［β−Ｄ−Asp］は、通
常ではペプチド結合に含まれないカルボキシルを介して
の結合を示す。

示されたペプチドにおいて，コードされている各残基
は，それが適当な場合には，以下の従来のリストに従っ
て，アミノ酸の慣用名に対応する単一文字の名称で示さ
れる。

アミノ酸 一文字記号 アラニン Ａ アルギニン Ｒ アスパラギン Ｎ アスパラギン酸 Ｄ システイン Ｃ グルタミン Ｑ グルタミン酸 Ｅ グリシン Ｇ ヒスチジン Ｈ イソロイシン Ｉ ロイシン Ｌ リジン Ｋ メチオニン Ｍ フェニルアラニン Ｆ プロリン Ｐ セリン Ｓ トレオニン Ｔ トリプトファン Ｗ チロシン Ｙ バリン Ｖ 遺伝子でコードされていないアミノ酸は，上記のよう
に短縮して示す。

本出願で示す特定のペプチドにおいて，光学異性体を
有するどのアミノ酸残基のＬ形も，特にことわりのない
かぎり，別な方法で示す。本発明のペプチドの残基は通
常，天然のＬ光学異性体形であるが,1もしくは２個，好
ましくは１個のアミノ酸が、AA₁₁₀および／またはAA₁₁₃
に加えて，もしくはその代わりに，光学異性体であるＤ
形で置換されてもよい（AA₁₁₀およびAA₁₁₃がともにＤ型
である態様を含む）。

遊離の官能基（カルボキシル末端もしくはアミノ酸末
端が遊離であるものを含む）は，アミド化，アシル化も
しくは他の置換反応により修飾され得，その結果，例え
ばその化合物の活性に影響することなしに，化合物の溶
解度を変えることができる。

特に，カルボキシ末端のアミドを修飾したアナログが
特に強力なのでこの発明の好ましい態様であることが発
見された。一般，アミド基の窒素原子は，カルボニル基
の炭素原子と共有結合しており，NH₂，−NHR′もしくは
NR′Ｒ″の形態（式中Ｒ′およびＲ″は，直鎖もしくは
分岐鎖であり,1C〜10C好ましくは1C〜6Cのアルキルもし
くはアルキルアシル基であり，これら基の１〜２個の炭
素原子は窒素，酸素もしくは硫黄原子で置換されている
ものを含む）である。このようなアミド基の代表的なも
のは次の通りである：−NH₂，−NHCH₃，−N(CH₃)₂，−N
HCH₂CH₃，−NHC₆H₅，−NHCH₂CH(CH₃)₂，−NHCH₂CH(CH₃)
CH₂CH₃，−NHCH₂CH₂OH，−NHCH₂OCH₂CH₃および−N(CH₃)
CH₂CH₂SCH₂CH₃。

本発明のアミド化された化合物は，例えばBoc−AA_x−
pMBHA−樹脂もしくはBocAA_x−BHA−樹脂（式中AA_xは，
以下に詳述する所望のアナログ化合物からの選択された
カルボキシル末端アミノ酸である）を用いて直接合成す
ることができる。あるいは，本発明の化合物は，当該技
術分野に公知の手段を用いてペプチドを合成した後，化
学的もしくは酵素的にアミド化するか，または標準の液
相ペプチド合成法によって製造することができる。

好ましい態様 A.コアペンタペプチド 本発明の化合物はすべて，下記式で表されるペンタペ
プチドのコア配列を有している： ここで，AA₁₀₉−およびAA₁₁₂は，独立して， 塩基性／非環式の；または， 中性／極性／大型／非芳香族のアミノ酸残基であり； さらに、AA₁₀₉は、中性／非極性／大型／非芳香族ア
ミノ酸であり得； AA₁₁₀は,DもしくはＬ配置の中性／無極性／大型／非
芳香族のアミノ酸残基； AA₁₁₁は酸性アミノ酸残基；そして， AA₁₁₃は,DもしくはＬ配置の中性／無極性／大型／非
芳香族のアミノ酸残基，または共有結合である。

このコアの最も好ましい配列は,R（I/M）DRIであり，
この式中の残基はすべてＬ配置であり，括弧内のアミノ
酸残基はどちらかが選択される。次に好ましいのは,R
（I/M）DRI残基の１つだけが上記定義内の選択された残
基で置換された配置である。好ましい置換基は，次のと
おりである： AA₁₀₉については,Rの代わりにＫ、（アセチル）Ｋ、
Ｑ、Ｎ、ＬまたはNle; AA₁₁₀については,I/Mの代わりにＶ、V⁺、Ｌ、L⁺、
I⁺、M⁺、ｔ−BuA、ｔ−BuA、ｔ−BuG、またはCha; A₁₁₁については,Dの代わりにＥまたはCya; A₁₁₂については,Rの代わりにＫ、Ｑ、Ｎ、Orn、また
はCit; A₁₁₃についてはＩの代わりにＭ、M⁺、Ｖ、V⁺、Ｌ、
L⁺、I⁺、Ｎ−MeIle、ｔ−BuA、または共有結合。

（⁺は、Ｄ型を示す）。

特に好ましいのは，この配列が，下記の配列でなる群
から選択される態様である： RM⁺DRI Ｒ（I/M）DRL Ｋ（I/M）DRI RLDRI R（I/M）DRM Ｑ（I/M）DRI Ｒ（I/M）ERI R(I/M)DRM⁺ RVDRI Ｒ（I/M）DKI R(I/M)DRI⁺ RI⁺DRI Ｒ（I/M）DQI R（I/M）DRV。

ここで、⁺は、それがついているアミノ酸がＤ型であ
ることを示す。

天然に存在するRIDRIもしくはRMDRI配列からの１つを
越える変化した配列も本発明の範囲に含まれるが，余り
好ましくはない。この群の中で特に好ましいサブセット
には，他の置換を加えて，グルタミン酸残基が，AA₁₁₁
として，アスパラギン酸残基の代わりに入ったものか、
あるいはリジンがAA₁₀₉としてアルギニンの代わりに入
ったものが含まれる。

B.Z₁の実施態様 Z₁は次式を有する： ここで、X₁は、４〜14Cの疎水性の環式または非環式
残基であり； X₂は、式中のCHから1.5〜７Åの範囲において金属配
位原子を含み、該金属配位原子は、ＳおよびＯから選択
され；そして、−X₃−は、単結合−CH₂−、−COまたは
−NH−である。

エンドペプチダーゼ24.11を阻害するために、疎水性
残基および金属配位原子が、互いに近接して提供されな
ければならない。従って、X₁は、疎水性を提供し、X
₂は、金属配位原子を提供する。

中央のCH基は、キラルの中心である。従って、本発明
の化合物は、これらを、ＲおよびＳ配置で、またはその
混合物として含む。一般に、好ましい鏡像異性体は、Ｌ
−アミノ酸が模倣されるようなキラル性である場合であ
る。

示されている−X₃−は、２つの主要な特性である、Z₁
置換基と該化合物の残りの部分とを連結させる。

好適な実施態様においては、−X₁は、CH₂、NH、Ｏま
たはＳの少なくとも１つの連結基を介して、示されたCH
に結合する環式または芳香族基を含む。場合によって
は、この連結基は、２つの要素を含み得るため、−OCH₂
−、−CH₂O−、−CH₂S−、−SCH₂−、−CH₂CH₂−、−NH
CH₂−または−CH₂NH−を含む。芳香族置換基は、フェニ
ル、インドリル、ビフェニル、ナフチル、ピリジル、イ
ミダゾール等、すなわち、Ｎ、ＯおよびＳから選択され
る１または２個のヘテロ原子を含み得るいずれの５〜12
員環系でもあり得る。さらに、疎水性部分は、非芳香族
であり得、例えば、シクロヘキシルまたは１または２個
のＮ、ＳまたはＯのヘテロ原子を含む、いずれの５から
10員環の非芳香族環系である。場合によっては、疎水性
部分はまた、非環式でもあり得る。

金属配位原子を含む−X₂は、該原子をCHを示されてい
るところから適切に離すために効果がある。この分離
は、基本的に、２から４個の共有結合、または約1.5か
ら７Åの距離により達成される。つまり、−X₂は、−CH
₂SH、−CH₂CH₂SH、−COOH、−CONHOH、−CH₂COOH、−CH
₂CONHOH、−NHCH₂COOH、−NHCHRCOOHによって例示され
る。ここで、Ｒは、−CH₂Phまたは−CH₂CH₂Ph、およびN
HPO（OR′）₂であり、各Ｒ′は、それぞれ独立してＨま
たはアルキル（１〜7C）である。−X₂が−NHCH₂COOH、
−NHCHRCOOHまたは−NHPO（OR′）₂のとき、 がアミノ酸残基を示すならば、“N"は、括弧付き［Ｎ］
で示される。

Z₁の例示的な、好ましい実施態様を、（省略記号と共
に）第２図に示す。特に好ましいのは、Z₁において、X₃
がCOでX₂がCH₂SH、またはX₃がCOでX₂がCONOH、またはX₃
がCOでX₂が−CH₂CONHOH、またはＲがCH₂PhまたはCH₂CH₂
Phである場合に、X₃がCOおよびX₂が［Ｎ］CHRCOOHであ
る、化合物である。

示されているCHは、リンカー−X₃−を介して本発明の
化合物の残りの部分に結合する。リンカーは、Z₂として
示されるスペーサーと結合する単結合であり得るか、ま
たは、−NH−、−CO−および−CH₂−から選択され得
る。スペーサーZ₂がアミノ酸残基によって終わる場合に
は、以下に示す構造は、ペプチドのＮ末端を形成するNH
は［Ｎ］、すなわち、解読が容易になるように、括弧付
きのＮとして示され得る。

C.Z₂の実施態様 本発明の化合物において、Z₂は、Z₁からAA₁₀₉を分離
するスペーサー沃素を提供する。リンカーZ₂は、通常の
延長鎖において３〜９個の原子に対応する、約4.5と15
Åの間の距離を、AA₁₀₉とZ₁との間につくり出すもので
なければならない。もちろん、３次元配置が、このスペ
ース距離を提供する場合には、より長いリンカーが使用
され得る。

Z₂の好ましい実施態様は、以下よりなる群から選択さ
れる。

（ａ）(AA)_a：ここで、AAはアミノ酸であり、そして
“a"は１または２であり、特に、各AAはＧ、Ｓ、Ａ、Ｄ
−Ala、Sar、Aib、Asp、Glu、Ｄ−Asp、Ｄ−Glu、beta
−Ｌ−Asp、beta−Ｄ−Asp、γ−Ｌ−Glu、そしてγ−
Ｄ−Glu（γ−Gluおよびβ−Aspにおいて、結合は側鎖
カルボキシルを介する）； （ｂ）−(P)_n−(CO)_X−：ここで、Ｘは０または１で、
ｎは１〜６で、ＰはCH₂であり、Ｎ−Ｎが生じないとい
う条件下において、該−CH₂−基の１から２個がNHによ
って置換され得る；および （ｃ）−(Q)_m−Ｂ−(Q)_m−(CO)_X−：ここで、Ｘは０ま
たは１だあり、各ｍはそれぞれ独立して０から３である
が、両方のｍの合計が５以下であり；−Ｎ−Ｎ−が生じ
ないという条件下において、ＱはCH₂またはNHであり、
そしてＢは、Ｎヘテロ原子を必要に応じて含む、飽和さ
れたまたは不飽和の５〜６員環である。

Z₂の特に好ましい実施態様は、第３図に示される。こ
れらは、４−アミノベンゾイル（４−AB）、４−アミノ
フェニルアセチル（４−APA）、４−ピペリジンカルボ
キシル（４−PIP）および４−アミノメチルシクロヘキ
ソイル（４−AMC）を含む。

D.Z₃の実施態様 Z₃として好ましいのは、NH₂、NHR″およびアミドまた
は１から３個のアミノ酸を有するペプチド残基のアルキ
ルアミドである。ペプチド残基である実施態様の中で、
特に好ましいのは、アミノ酸がＧ、ＡおよびＳから選択
されるものである。しかし、特に、AA₁₁₃が共有結合で
ある場合には、Z₃は、アルキルアミド型、例えば、Ｒ′
が２〜10Cである−NHR″でなければならない。

E.非ペプチド結合 本発明の一実施態様において，コアペンタペプチド中
のアミド結合（−CO−NH−），またはZ₁および／もしく
はZ₂およびもしくはZ₃内のアミド結合は，当該技術分野
で公知の方法によって，他の種類の結合，例えば−CH₂N
H−，−CH₂S−，−CH₂CH₂−，−CH＝CH−（シスおよび
トランス），−COCH₂−、−C(OH)CH₂−および−CH₂SO−
で置換され得る。下記の文献には，これらの代替の連結
部分を有するペプチドアナログの調整について記載され
ている:Spatola,A.F.,Vega Data（1983年３月）１巻，
第３版，“ペプチド主鎖の修飾”（総説）;Spatola,A.
F.“アミノ酸ペプチドとタンパクの化学と生化学",B.We
insteinら編集,Marcel Dekker,ニューヨーク,267頁（19
83年）（総説）;Morley,J.S.,Trends Pharm Sci（1980
年）,463〜468頁（総説）;Hudson,D.ら，Int J Pept Pr
ot Res（1979年）14巻,177−185頁（−CH₂NH−，−CH₂C
H₂−）;Spatola,A.F.ら，Life Sci（1986年）,38巻,124
3〜1249頁（−CH₂−Ｓ）;Hann,M.M.,J Chem Soc Perkin
Trans I（1982年）307〜314頁，（−CH−CH,シスおよ
びトランス）;Almquist,R.G.ら，J Med Chem（1980年）
23巻,1392〜1398頁（−COCH₂−）;Jennings−White,C.
ら，Tetrahedron Lett（1982年）23巻,2533頁（−COCH₂
−）;Szelke,M,ら，ヨーロッパ特許出願EP第45665号CA:
97:39405（1982年）（−CH(OH)CH₂−）;Holladay,M.W.
ら，Tetrahedron Lett（1983年）24巻,4401〜4404頁
（−C(OH)CH₂−）；およびHruby,V.J.Life Sci（1982
年）31巻,189−199頁（−CH₂−Ｓ−）。

F.本発明のアナログの好適な実施態様 本発明の好適なアナログを第４図に示す。

図中、化合物１〜88において、コア配列はＲ−Ｉ−Ｄ
−Ｒ−Ｉ、Z₃はNH₂、Z₂はAA_aであり、そしてZ₁はメルカ
プチル基を含み、ここで、X₂−は−CH₂SHである。

化合物89〜110は、Z₂が−(P)_n−（CO）−式で表さ
れ、ｎが４〜５であることを除いて同様である。

化合物111〜154は、Z₂が４−AB、４−AMC、４−APAお
よび４−PIPから選択されることを除いて同様である。

化合物155〜220は、それらがコア配列Ｋ−Ｉ−Ｄ−Ｒ
−Ｉを有し、Z₃がNH₂であることを除いて同様である。

化合物221〜286は、それらがコア配列Ｒ−Ｉ−Ｄ−Ｒ
−NHR″を有し、ここで、Ｒ″がCH₂CH(CH₃)CH₂CH₃であ
ることを除いて同様である。

化合物287〜363はまた、Ｒ−Ｉ−Ｄ−Ｒ−Ｉコアペプ
チドを有する化合物であり、Z₃はNH₂であり、そしてZ₁
の実施態様は、X₂が−CH₂CH₂SHである。

化合物364〜624はすべて、Z₂の様々な好適な実施態様
において、NH₂であるZ₃を有するコア配列Ｒ−Ｉ−Ｄ−
Ｒ−Ｉを有する。Z₁は、Ｆ［Ｎ］、BF［Ｎ］、Nal2
［Ｎ］、Nal1［Ｎ］、Cha［Ｎ］、Ｗ［Ｎ］、homoF
［Ｎ］、homoCha［Ｎ］、homoNal2［Ｎ］、Ｆ［Ｎ］
Ｆ、Ｆ［Ｎ］BF、Ｆ［Ｎ］Nal2、Ｆ［Ｎ］Nal1、Ｆ
［Ｎ］Cha、Ｆ［Ｎ］Ｗ、Ｆ［Ｎ］homoF、Ｆ［Ｎ］homo
Cha、Ｆ［Ｎ］homoNal2、およびhomoF［Ｎ］またはＧ
［Ｎ］が、Ｆ［Ｎ］と置換されるような同様な構造から
選択される。従って、これらの実施態様において、Z
₁は、 ここで、Ｒは、−Ｈ、−CH₂Phまたは−CH₂CH₂Phであ
る。

化合物625〜701において、Z₁もまたカルボキシル基を
含み、X₂−がCOOHおよび−X₃−が−CO−である実施態様
から選択される。

化合物702〜764において、X₂−は、ヒドロキサメート
を含み、Z₁は、 ここで、X₂−は、−CONHOHである。

化合物765〜841において、Z₁は、 ここで、X₂は、−CONHOHである。

化合物842〜918において、Z₁は、 ここで、X₂−は、−CH₂CONHOHである。

化合物919〜981において、Z₁は、 ここで、X₁は変わり得る基であり、X₂は、示されてい
るようにホスホルアミデートである。これらの実施態様
において、芳香族アミノ酸であるZ₁の、第２図に示され
る様々な置換基は、そのαカルボキシル基を介してZ₂置
換基に結合し、αアミノ基の位置においてリン酸化され
る。従って、Z₁は、第２図の実施態様Z19〜Z27として示
される構造を有する。

化合物982〜1056において、Z₁は次式を有する ここで、X₁は、変わり得る基であり、X₂は、−CH₂COO
Hである。

特に好ましいのは、化合物１〜286、436〜561および8
42〜981までである。

化合物122は、特に好適である。

合成 本発明の範囲に含まれる化合物は，例えば固相ペプチ
ド合成法のような当該技術分野で公知の手段によって化
学的に合成することができる。この合成は，α−アミノ
基が保護されたアミノ酸を用いてペプチドのカルボキシ
ル末端から開始される。ｔ−ブチルオキシカルボニル
（Boc）保護基は，他の保護基が適切である場合でも，
全てのアミノ基に対して用いることができる。例えば,B
oc−Ile−OH,Boc−Arg−OH,Boc−Asp−OH,Boc−Ile−OH
またはBoc−Arg−OH（すなわち選択されたANPアナログ
のカルボキシル末端アミノ酸）は，クロロメチル化ポリ
スチレン樹脂、好ましくはｐ−メチルベンズヒドリルア
ミン（pMBHA）樹脂の支持体にエステル化することがで
きる。ポリスチレン樹脂支持体は，スチレンと約0.5〜
２％のジビニルベンゼンとのコポリマーが好ましいが，
このジビニルベンゼンは，架橋剤であって，ポリスチレ
ンポリマーをいくつかの有機溶媒に対して完全に不溶性
にする（Stewartら，“固相ペプチド合成”（1969年）
W.H.Freeman Co.,サンフランシスコ；およびMerrifiel
d,J.Am Chem Soc（1963年）85巻,2149−2154頁，参
照）。これらおよび他のペプチド合成法は，米国特許第
3,862,925号，第3,842,067号，第3,972,859号および第
4,105,602号にも例示されている。

上記の合成法は，手動法を用いてもよく，あるいは，
例えば，アプライドバイオシステムズ430Aペプチドシン
セサイザー（Applied BioSystems 430A Peptide Synthe
sizer）（米国，カリフォルニア州，フォスター・シテ
ィ）またはバイオサーチSAM IIオートマチックペプチド
シンセサイザー（Biosearch SAM II automatic peptide
synthesizer）（Biosearch,Inc.,米国，カリフォルニ
ア州，サン・ラファエル）を用い，メーカーが供給する
指示マニュアルに提示されている指示に従う自動的方法
も利用できる。

本発明のアナログ化合物を合成する過程で本発明の開
示にしたがって構築される中間体は，それ自体新規で有
用な化合物なので本発明の範囲に含まれることは，ペプ
チド合成の一般的な技術を有する当業者ならで容易に分
かるであろう。

投与法と用途 本発明の化合物は，健全な哺乳動物内でナトリウム排
泄増加作用，利尿作用および血圧低下作用があることが
判明しており，および血管拡張作用を有し，すなわちア
ルデステロンとレニンの放出を阻害する。

したがってこれらの化合物と，これを含有する組成物
は，肝臓の灌流が無効なこと，または糸球体の濾過速度
が低下していることが原因の高血圧と腎不全に加えて，
例えば，うっ血心不全，ネフローゼ症候群，肝硬変およ
び肺病のような各種の浮腫状態の治療の治療剤としての
用途を見出すことができる。

したがって，本発明は，単独で上記の治療上の利益を
与える働きがある，本発明の化合物（それには，化合物
の排毒性付加塩，アミドおよびエステルを包含する）の
有効量を含有する組成物を提供するものである。このよ
うな組成物は，生理学的に許容できる液体，ゲルもしく
は固体の希釈剤，アジュバントおよび賦形剤を含有して
いてもよい。

これらの化合物と組成物は，家畜に対するような獣医
学的用途およびヒトの臨床用途に，他の治療剤と同様の
方式で哺乳類に投与するとができる。一般に，治療効果
を得るのに必要な投与量は，被験体の体重1kg当り約0.0
1〜1000mcgの範囲であり,0.1から1000mcgがより一般的
である。あるいは，これらの範囲内の投与量は，所望の
治療利益が得られるまで，長期間にわたって，一定の注
入量で投与することができる。

典型的には，上記の組成物は，液体溶液もしくは懸濁
液の注射可能薬剤として調製されるが，注射する前に液
体中の溶液もしくは懸濁液とするのに適切な固体の形態
としても調製され得る。組成物は乳濁液にしてもよい。
活性成分は，生理学的に許容できる，活性成分と適合す
る希釈剤もしくは賦形剤と混合することが多い。適切な
希釈剤賦形剤としては，例えば、水，生理食塩水，デキ
ストロース，グリセリンなど，およびその組合せがあ
る。さらに，所望により，組成物は，湿潤剤もしくは乳
化剤，安定化剤もしくはpH緩衝剤などの補助剤を少量含
有していてもよい。

組成物は，通常，例えば皮下もしくは静脈に注射する
ことにより非経口投与される。他の方式の投与に適切な
その他の様式には，坐剤，鼻内用エアロゾルおよびある
場合には，経口用製剤がある。坐剤用の伝統的な結合剤
と賦形剤には、例えばポリアルキレングリコール類もし
くはトリグリセリドがあるが，このような坐剤は,0.5〜
10％，好ましくは１〜２％の範囲の活性成分を含有する
混合物で形成される。経口用製剤は，例えば医薬グレー
ドのマンニトール，ラクトース，デンプン。ステアリン
酸マグネシウム，サッカリンナトリウム，セルロース，
炭酸マグネシウムなどの通常用いられる賦形剤を含有し
ている。これらの組成物は，溶液，懸濁液，錠剤，丸
剤，カプセル剤，除放性製剤または散剤の形態をとり，
活性成分を10〜95％含有し，好ましくは25〜70％含有し
ている。

ペプチド化合物は，中性もしくは塩の形態で組成物に
処方され得る。薬学的に許容できる非毒性塩には，（遊
離のアミノ基で形成された）酸付加塩が含まれ，これら
酸付加塩は，例えば塩酸もしくはリン酸のような無機
酸，または酢酸，シュウ酸，酒石酸，マンデル酸などの
有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成された
塩は，水酸化ナトリウム，水酸化カリウム，水酸化アン
モニウム，水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄のよう
な無機塩基，およびイソプロピルアミン，トリメチルア
ミン,2−エチルアミノエタノール，ヒスチジン，プロカ
インなどの有機塩基から誘導することができる。

ナトリウム排泄増加作用，利尿作用および血管拡張作
用を示す本発明の化合物に加えて，本発明の化合物は，
有用な化合物を合成する際の中間体として利用すること
もできる。あるいは，適切に選択することによって，活
性レベルが減少するか全く消失する本発明の化合物は，
例えば他の受容体に結合し，受容体の代謝回転を刺激
し，または分解酵素活性もしくは分解受容体活性を有す
る別の基質を与えて，その結果これらの酵素もしくは受
容体を阻害することによって，本発明の範囲以外の化合
物を含む他の利尿性，ナトリウム排泄増加性もしくは血
管拡張性化合物の活性を調節するのに利用できる。この
ような方法で用いる場合，このような化合物は，他の活
性化合物との混合物として用いるか，または例えばそれ
自体の担体と混合して別々に用いることもできる。

本発明の化合物は，標識をつけた試薬を利用する免疫
検定法に用いる抗血清，通常は抗体、を製造するのに使
うこともできる。簡便には、これらのポリペプチドは，
必要に応じてジアルデヒド，カルボジイミドにより，も
しくは市販のリンカーを用いて、抗原性を付与する担体
に，結合され得る。これらの化合物と免疫試薬には，発
色団，例えばフルオレセインもしくはローダミンのよう
な螢光体，¹²⁵I，³⁵S，¹⁴C，もしくは³Hのような放射性
同位元素，または磁化粒子のような各種の標識を用い
て，当該技術分野で公知の方法で標識してもよい。

これらの標識化合物と試薬，またはそれらを認識し特
異的に結合することができる標識試薬は，例えば，診断
薬としての用途がある。生物学的試料由来の試料は，本
発明の化合物によって，共通抗原決定基を有する物質の
存在もしくは量を検定することができる。さらにモノク
ローナル抗体を当該技術分野の公知の方法で製造するこ
とができ，この抗体は，例えばインビボでの免疫学的類
緑化合物の過剰産生を中和する治療用途がある。

実施例 以下の実施例は、本発明課題を限定するものではな
く、例示のために提供される。

本発明の化合物は、手作業で行われるかもしくは、製
造者の指示に従ってｔ−Bocアミノ酸を用いて、アプラ
イドバイオシステムズ430Aペプチドシンセサイザー（Ap
plied BioSystems 430S Peptide Syntesizer）（カリフ
ォルニア州フェスターシティー）もしくはバイオサーチ
サムII自動ペプチドシンセサイザー（Biosearch Sam II
automated peptide synthesizer）（バイオサーチ、カ
リフォルニア州サンラフィアル）で行われる固相技術に
よって合成された。

残基Z₂−AA₁₀₉−AA₁₁₃は、通常、従来のｔ−Boc化学
法によって、固相支持体上で調製される。利用され得る
場合には、Z₂スペーサーは、対応するNH₂−Z₂−COOHは
およびBoc無水物からうまく調製されたBOC−Z₂で保護さ
れた中間媒体を使用して、ペプチド鎖に導入される。ス
ペーサーは、生成するペプチド鎖上で、ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（DCC）のような標準カルボキシル活
性化剤を使用して、フリーのアミノ基に結合される。３
−メルカプト−２−（置換）−プロピオニルを含むペプ
チドとしては、例（１〜286）、または４−メルカプト
−２−（置換）−ブチリルアミノ末端、例（287〜36
3）、対応する保護された３−アセチルチオまたは３−
ベゾイルチオ−２−（置換）−プロピオン酸あるいは４
−アセシルチオまたは４−ベンゾイルチオ−２−（置
換）−酪酸が使用される。Fournie−Zaluskiら、Eur J
Biochem（1984）139:267−274に記載されるように、Ｓ
−アセチルまたはＳ−ベンゾイル基は、後で、塩基性加
水分解によって除去される。置換されたマロノイルまた
はスクシノイル基を含む例については、例（625〜918）
それらをペプチド樹脂に導入するには、一般に、Fourni
e−Zaluskiら、J Med Chem（1985）28:1158−1169に記
載の方法が使用され得る。ヒドロキシアミノマロノイル
と呼ばれる（Ｎ−ヒドロキシ）カルボキサミド−２−
（置換）−１−オキソ−アセチル基、およびヒドロキシ
アミノスクシノイル基と呼ばれる３−（Ｎ−ヒドロキ
シ）カルボキサミド−２−（置換）−１−オキソプロピ
ル基を含むペプチドについては、これらの基は、Fourni
e−Zaluski（前出）およびフランス特許第81.23.488号
に記載される方法に従って導入され得る。Ｎ−カルボキ
シアルキルを含むペプチド、例（364〜624）は、Fourni
e−Zaluskiら、J Med Chem（1983）26:60−65、Patchet
tら、Nature（1980）288:280−283、またはMumfordら、
Biochem Biophys Res Commun（1982）109:1303−1309の
方法を使用して調製される。Ｎ−アルキル化は、対応す
る置換されたα−ケトカルボン酸またはエステルを用い
て、ペプチド樹脂上でフリーのアミノ基を還元してアミ
ン化することによるルーチンで実施される。Ｎ−ホスホ
リルペプチド、例（919〜981）は、Kamら、Biochemistr
y（1979）18:3032−3038に記載されている方法を使用し
て得られる。

手順Ａ Boc−AA1...AA_n-１−AA_n−Ｏポリスチレン樹脂の調製 １グラムの選択されたBoc−AA_n−Ｏ−ポリスチレン樹
脂（0.2−0.6mmole/g樹脂）（例えば、Peninsula Labs,
Inc.より入手可能）を、Boc−AA_n-1−OHの結合のために
計画Ａに従って処理する。

計画Ａ １）ジクロロメタン（CH₂Cl₂）で３回洗浄； ２）TFA:CH₂Cl₂：エタンジチオール（EDT）（体積比45:
50:5）で１分間処理； ３）TFA:CH₂Cl₂:EDT（体積比45:50:5）で20分間処理
（体積比45:50:5）； ４）CH₂Cl₂で３回洗浄； ５）CH₂Cl₂中のジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）1
0％（V/V）で１分間処理することを２回繰り返す； ６）CH₂Cl₂で２回洗浄； ７）メタノール（MeOH）で２回洗浄； ８）（５−７）を一度繰り返す； ９）CH₂Cl₂で３回洗浄； 10）あらかじめ調製した適切に保護されたBoc−アミノ
酸の対称の無水物をCH₂Cl₂もしくはジメチルホルムアミ
ド（DMF）／CH₂Cl₂（50:50体積）、中に溶解した溶液の
１〜６当量を添加（Boc−Asn−OH,Boc−Gln−OHおよびB
oc−Arg（TOS）−OHがＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ルを用いて活性エステルとして結合された）； 11）CH₂Cl₂で２回洗浄； 12）10％DIPEAで２回洗浄； 13）CH₂Cl₂で２回洗浄； 14）MeOHで２回洗浄； 15）CH₂Cl₂で２回洗浄； 16）工程（11−15）を一度繰り返す； 17）Kaiserら、Anal.Biochem. 34:595（1970）に従っ
てニヒドリン反応によって試験する。結合反応が不十分
な場合には、工程（10−16）を繰り返すか、Ｎ−アセチ
ルイミダゾール（DMF中、0.30M）、もしくはCH₂Cl₂中で
過剰の無水酢酸を用いてキャップ合成する。

手順Ｂ Boc−AA_n−ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂の調製 選択されたBoc−AA_n−OHを、以下に示す様に、N,N′
−ジシクロヘキシルカルボジイミドを介してｐ−メチル
ベンズヒドリルアミン（pMBHA）樹脂に結合させる。

計画Ｂ １）pMBHA HCl樹脂を洗浄； ２）上記樹脂をDIPEAのCH₂Cl₂溶液10％（V/V）で２回洗
浄； ３）CH₂Cl₂で２回洗浄； ４）MeOHで２回洗浄； ５）CH₂Cl₂で２回洗浄； ６）反応時間0.5〜24時間において、CH₂Cl₂中に溶解さ
せた、あらかじめ調製した適切に保護されたBoc−アミ
ノ酸の対称の無水物の１〜６の当量を添加； 反応しなかったアミノ茎は、0.30/M N−アセチルイミ
ダゾール:DMFもしくは無水酢酸：CH₂Cl₂でアセチル化す
る。

次の実施例は、典型的なアナログ化合物（Analog ＃
として示される）の化学合成を示しており、本発明のあ
る局面を例示する。

実施例１ アナログ＃１の調製： MBP−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｉ−Ｄ−Ｒ−NH₂ 1gmのpMBHA樹脂（0.25meg/g,Applied Biosystems,Fos
ter City,CA）を、必要とされる配列のアミノ酸（Boc−
Ile−OH,Boc−Arg（Tos）−OH,Boc−Asp（Ｏ−cHexyl）
−OH,Boc−Ile−OH,Boc−Arg（Tos）−OH,Boc−Asp（Ｏ
−cHexyl）−OH,Boc−Ile−OH,Boc−Arg（Tos）−OH,Bo
c−Gly−OHの順に導入される）と共に、手順Ａに、次い
で手順Ｂによって処理した。Boc基の脱保護を行った後
に中和し、MBP−Ｇ−基を、（D,L）−チオルファンのカ
ルボキシル活性化型を使用して付加した。これは、（D,
L）−チオルファン（100mg、0.39mmol、Bachem Bioscie
nces,Philadelphia、PA）を、Ｎ−ヒドロキシベンゾト
リアゾール（0.39mmol、１当量）およびCH₂Cl₂中の1M D
CC（１当量）で処理して、（D,L）−チオルファンの活
性化エステルを形成し、これを、CH₂Cl₂/DMF（50/50）
中で４時間、脱保護ペプチド樹脂と反応させることによ
って達成された。この樹脂をCH₂Cl₂で３回、MeOHで２回
洗浄し、真空内で乾燥した。

このペプチド樹脂を、無水フッ化水素（HF）を含有す
る10％アニソール、２％エチルメチルスルフィドで、−
10℃で30分間、さらに０℃で30分間処理した。HFを真空
内で取除し、ペプチド／樹脂混合物を、ジエチルエーテ
ルに懸濁し、次いでクロロホルムおよびエーテルで交互
に３回洗浄した。エーテルで最終洗浄した後、ペプチド
を2.0M酢酸で樹脂から抽出し、蒸留水で希釈し、凍結乾
燥した。

セファデックスＧ−25F（Pharmacia）上で、溶出剤と
して0.5Mの酢酸を使用することによって脱塩し、次い
で、CM−セファロース（Pharmacia）またはCM−セルロ
ース（Whatman）を用いたイオン交換クロマトグラフィ
ーのNH₄OAcのグラディエント溶出により、粗ペプチドを
精製した。溶出画分を、0.1％のトリフルオロ酢酸（TF
A）を含む15〜35％のアセトニトリルグラディエントに
よりVydac C18カラムでの逆相液体クロマトグラフィー
によって分析した。セミ分取用HPLSにより、精製ペプチ
ド＃１を得た。これは、アミノ酸分析によって同定され
た。

実施例２ アナログ＃445の調製 Ｆ［Ｎ］Ｆ−４−APA−Ｒ−Ｉ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−NH₂ 1gmのpMBHA樹脂（0.45meg/g、U.S.Biochemical）を、
必要な配列のアミノ酸（Boc−Ile−OH,Boc−Arg（Tos）
−OH,Boc−Asp（Ｏ−cHexyl）−OH,Boc−Ile−OH,Boc−
Arg（Tos）−OH,Boc−ｐ−アミノフェニル酢酸（Boc−
４−APA−OH）、Boc−Phe−OHの順に導入される）と共
に手順Ａに従って、次いで手順Ｂに従って処理した。Bo
c基の脱保護および中和に次いで、フリーのアミンの還
元的アミン化を次のようにして行った。つまり、DMF
中、触媒としての酢酸（100μｌ）の存在下、フェニル
ピルビン酸（246mg,1.5meq,Aldrich）および95mgのNaCH
BH₃を用いて、室温で１日処理することによって行っ
た。次いで、この樹脂を、DMFおよびCH₂Cl₂、さらにMeO
Hで洗浄し、次いで、真空乾燥した。

無水フッ化水素（HF）を含有する10％アニソール、２
％エチルメチルスルフィド中で−10℃で30分間、さらに
０℃で30分間、処理した。HFを真空内で除去し、ペプチ
ド／樹脂混合物をジエチルエーテル中に懸渦させ、20分
間攪拌した。この混合物を、クロロホルムおよびエーテ
ルで交互に３回洗浄した。最終のエーテル洗浄後、この
ペプチドを、2.0M酢酸で樹脂から抽出し、蒸留水で希釈
し、凍結乾燥した。

NH₄OAcのグラディエント溶出によるCM−セファロース
（Pharmacia）またはCM−セルロース（Whatman）のカチ
オン交換クロマトグラフィーによって、粗ペプチドを精
製した。0.1％のTFAを含む15〜35％のアセトニトリルグ
ラディエントを使用したVydac C18カラムのセミ分取用H
PLCによって、ペプチドの最終精製を行った。アミノ酸
分析によって、ペプチド＃445の構造を確認した。

実施例３ ANPクリアランス受容体への結合 使用されるアッセイ系は、Schenk,K.B.,ら、Biochem
Biophys Res Commun（1985）127:433−442およびScarbo
rough,R.M.,J Biol Chem（1986）261:12960−12964の方
法から採用する。これらのアッセイは、ウシの大動脈平
滑筋（BASM）またはウシの大動脈内皮（BAE）細胞中の
受容体を使用する、ANPとの拮抗によるクリアランス受
容体結合親和性を測定する。また、Maack,T.ら、Scienc
e（1987）238:675−679に記載されている、ラットの灌
流され、単離された腎臓において、クリアランス受容体
に対する受容体結合親和アッセイが使用される。

本発明で例示する化合物を、126位のチロシンでヨウ
素置換したI¹²⁵標識rANP（102〜126）を用いるBASMアッ
セイでテストした。標識された標準品がBASM細胞に結合
した最大値の50％が、置換される濃度として示された結
果は、Ki（app）と表す。従って、Ki（app）が低ければ
低いほど、アナログの結合がより有効となる。

表１は、この拮抗結合アッセイの結果を示すものであ
り、その結果は、ANP結合の最大値の半分を阻害するの
に必要とされるアナログの濃度を、Ki（app）（平値は
ナノモル／リットル）として示す。

ラットの腎臓レセプター結合アッセイにおいて、天然
の、28残基に標識したANPを使用した:126位のチロシン
と連結した標識を有する、I¹²⁵で標識したrANP（99−12
6）。このアッセイの結果を、拮抗化合物の有無のそれ
ぞれにおいて、標識されたrANP（99〜126）の結合した
ものとフリーのものとの割合として、表２に示す。表２
に示すように、アナログ436は、レセプターに対して、
標識された化合物とうまく拮抗する。

実施例４ エンドペプチダーゼ24.11の阻害 エンドペプチダーゼ24.11は、Cys¹⁰⁵−Phe¹⁰⁶アミド
結合における開裂によって、ANPを不活性にする。この
分解を阻止する、本発明の化合物の能力を、Ura,N.,
ら，Kidney Int（1987）32:507−513の手順の変形によ
って、基質としてブラジキニンの代わりにrANP（99−12
6）を使用することによって、アッセイした。

簡単にのべると、ラットの尿を収集し、Ura（前出）
によって記載されるようにセファデックスＧ−25上で脱
塩し、アミノペプチダーゼ阻害剤ベスタチン（bestati
n）（10μg/ml）、ジャガイモの塊茎カルボキシペプチ
ダーゼ阻害剤（10μg/ml）およびアプロチニン（5,000
カリクレイン阻害性単位/ml）を含むpH7.2の、0.1M Tri
s緩衝溶液100μｌ中に４μｌのサンプルと入れたもの
を、37℃で15分間インキュベートした。次いで、最終体
積の0.5mlに２−10μｇのrANP（99〜126）を加えること
によって、アッセイを開始し、37℃で10〜20分間インキ
ュベートした。反応は、沸騰、遠心分離および凍結によ
って完了した。

エンドペプチダーゼの阻止能力がテストされる化合物
を、基質を加える15分前のプレインキュベーション混合
物に加えた。

阻害剤を用いてまたは用いないでインキュベートし
た、凍結サンプルを解凍し、HPLCで分析し、出発物質で
あるrANP（99〜126）および分解生成物の濃度を決定し
た。Vydac C18逆相HPLCカラム（4.6mm ID x 12.5cm;5μ
M,300A）において、HPLC分析を行った。0.1％TFAを含
む、15〜35％のアセトニトリルの直線グラディエント
を、パーキン・エルマー社製シリーズ4HPLCシステムに
おいて、1.0ml/minで行った。220nmおよび測定されたペ
プチドのピーク高度において、溶出物をモニターした。

テストサンプルにおけるCys¹⁰⁵−Phe¹⁰⁶の開裂代謝産
物のピークの割合（パーセント）を、コントロールにお
けるこの代謝産物のピーク高度と比較して、結果を計算
した。その結果を表３に示す。

表３に示すように、本発明のアナログ＃１は、阻害剤
としてチオルファンほど強力ではないが、約１μＭのED
₅₀で、阻止することが可能である。さらに、アナログ＃
133は、チオルファンよりは強力ではないが、ホスホラ
ミドンに匹敵する。

実施例５ インビボでのアッセイ 動物の全身における、アナログ＃１の利尿およびナト
リウム排泄増加能力は、以下のように決定された。イナ
クチン（体重100mg/kg）で麻酔した、雌のフプラーグ−
ドーリーラット（230〜260g）を、大腿動脈（B.P.モニ
ター）、大腿静脈（薬物および塩類の注入）および膀胱
（尿の収集）にカニューレを配置することによってカテ
ーテルを挿入した。手術の後、およびテスト物質の投与
前に生理食塩水を、尿の流れを安定させるために、20μ
l/minで45分間注入した。尿の流れが安定したかどうか
は、数10分間、尿を収集することによって決定された。
一旦、安定した尿の流れが得られると、10分間の収集を
３回行い（コントロール）、次いで注入投与を10回行っ
た後、20μl/minで１時間、テスト化合物の投与を行っ
た。試験的な注入期間に次いで、回収期中に20μl/min
でさらに２時間、生理食塩水を注入した。10分間の収集
期間に収集された尿の量を、重量測定によって決定し
た。尿ナトリウム排泄量U_NaVを、光度計によって決定し
た。比較として、表４には、hANP（102〜126）および化
合物＃１の300ng/kg/分での注入の影響を示す。

化合物を注入したラット（ｎ＝７）における、実験お
よびコントロール期間（平均±SE）の間の差（−）。

麻酔をかけたラットのナトリウム排泄増加および利尿
に対する化合物の特異的効果を、第5A図から第5D図に示
す。ナトリウム排泄増加および利尿の割合（パーセン
ト）および絶対増加±SEを、これらの図面に示す。10μ
g/kg/分で注入されたアナログ＃１は、尿ナトリウム排
泄において、平均10倍の増加を示し、尿の流量において
２から３倍の増加を示す。第２または第３の実験的収集
期間まで、最大の影響力は観察されず、注入の間保持さ
れる。ANP（102〜126）による影響と比較して、アナロ
グ＃１については、基礎となる（baseline）尿の流れお
よびナトリウム排泄率にゆるやかに戻るのが観察され、
このことは、一旦阻止されたクリアランス機構が、ANP
のクリアランスを完全に行う状態になるまでには、非常
に時間がかかるという概念と一致する。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＣＡＯＬＤ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (15)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】哺乳類において、ナトリウム排泄増加作
   用、利尿作用および／または血管拡張作用を有する直鎖
   ペプチド化合物であって、該直鎖ペプチド化合物は次式
   を有する： Z₁Z₂−AA₁₀₉−AA₁₁₀−AA₁₁₁−AA₁₁₂−AA₁₁₃−Z₃ （１） ここで、各AA₁₀₉およびAA₁₁₂は、独立して、塩基性／非
   環式の、または中性／極性／大型／非芳香族のアミノ酸
   残基であり、そして、AA₁₀₉は、中性／無極性／大型／
   非芳香族のアミノ酸残基であり得； AA₁₁₀は、ＤまたはＬ配置の中性／無極性／大型／非芳
   香族アミノ酸残基であり； AA₁₁₁は、酸性のアミノ酸残基であり； AA₁₁₃は、ＤまたはＬ配置の中性／無極性／大型／非芳
   香族のアミノ酸残基であるか、もしくは共有結合であ
   り；そして、 ここで、Z₁は、 ここで、X₁は、４〜14Cの疎水性環式または非環式残基
   であり、X₂は、式中の−CH−から1.5〜７Åの範囲にお
   いて金属配位原子を含み、該金属配位原子は、Ｓおよび
   Ｏから選択され、そして−X₃−は、単結合、−CH₂−、
   −COまたは−NH−であり； Z₂は、AA₁₀₉とZ₁の疎水性部分との間に4.5〜15Åの距離
   を提供することができるスペーサー基であり； Z₃は、（OH）、NH₂,NHR″またはNR″Ｒであり、ここ
   でＲ″またはＲは、それぞれ独立して１〜10個の炭素
   原子の直鎖または分岐鎖アルキルであり、１または２個
   の炭素はO,NまたはＳによって置換され得；あるいは１
   〜20個のアミノ酸残基のペプチド、あるいはそのアミド
   またはアルキルアミドであるが、AA₁₁₃が共有結合の際
   には、Z₃は、（OH）、NH₂またはペプチドではあり得な
   い。
2. 【請求項２】Z₁が、 である請求項１に記載の化合物： ここで、X₁は、少なくとも１個のCH₂,NH,OまたはＳ連結
   基を介して結合する環式（５〜12員環）の芳香族または
   非芳香族基を含み；そして −X₂は、−CH₂SH、−CH₂CH₂SH、−COOH,−CH₂COOH，−C
   HRCOOHから選択され;Rは、−CH₂Phまたは−CH₂CH₂Phで
   あり、Phは、フェニル、−CONHOH、−CH₂CONHOH、−NHC
   H₂COOHおよび−NHPO（OR′）₂であり、各Ｒ′は、独立
   してＨまたはアルキル（１〜7C）である。
3. 【請求項３】Z₁が以下よりなる群から選択される、請求
   項２に記載の化合物：
4. 【請求項４】Z₂が以下よりなる群から選択される、請求
   項１から３に記載の化合物： （ａ）−(AA)_a−：ここで、AAはアミノ酸であり、そし
   てａは１または２である； （ｂ）−(P)_n−（CO）−_X：ここで、Ｘは０または1,nは
   １〜６、そしてＰはCH₂であり、Ｎ−Ｎが生じないとい
   う条件下において、該−CH₂−基の１から２個がNHによ
   って置換され得る；および （ｃ）−(Q)_m−Ｂ−(Q)_m−(CO)_X−：ここで、Ｘは０ま
   たは１で、各ｍが０から３であり、ｍの合計は５以下で
   あり、−Ｂ−は必要に応じてＮヘテロ原子を含む、飽和
   または不飽和の５または６員環であり、−Ｎ−Ｎ−が生
   じないという条件下において、ＱはCH₂またはNHであ
   る。
5. 【請求項５】Z₃がNH₂またはNHR″、あるいは１〜２個の
   アミノ酸残基のペプチド、あるいはそのアミドまたはア
   ルキルアミド型である、請求項１から４に記載の化合
   物。
6. 【請求項６】AA₁₀₉−AA₁₁₀−AA₁₁₁−AA₁₁₂−AA₁₁₃が、
   Ｒ（I/R）DRIであり、その中の多くとも１個の残基が、 AA₁₀₉においてＲを、Ｋ、アセチルＫ、Ｑ、Ｎ、Ｌまた
   はNMeIleと置換すること、 AA₁₁₀においてＩまたはＭを、Ｖ、V⁺、Ｌ、L⁺、I⁺、
   M⁺、ｔ−BuA、ｔ−BuGまたはChaと置換すること、 AA₁₁₁においてＤをＥと置換すること、 AA₁₁₂においてＲを、Q,N,K,OrnまたはCitと置換するこ
   と、 および AA₁₁₃においてＩを、M,M⁺,V,V⁺,L,L⁺、I⁺、Ｐ、Ｎ−MeI
   le、ｔ−BuAまたは共有結合と置換すること、 ここで⁺は、Ｄ型を示す、 によって置換される、請求項１から５に記載の化合物。
7. 【請求項７】AA₁₀₉−AA₁₁₀−AA₁₁₁−AA₁₁₂−AA₁₁₃が、
   以下よりなる群から選択される、請求項６に記載の化合
   物： Ｋ（I/M）DRI Ｑ（I/M）DRI RVDRI RI⁺DRI RM⁺DRI RLDRI Ｒ（I/M）ERI Ｒ（I/M）DKI Ｒ（I/M）DQI Ｒ（I/M）DRL Ｒ（I/M）DRM R(I/M)DRM⁺ R(I/M)DRI⁺ Ｒ（I/M）DRV および Ｒ（I/M）DRI ここで、⁺は、それがついているアミノ酸がＤ型である
   ことを示す。
8. 【請求項８】Z₁が、第２図の置換基から選択される、請
   求項１から７に記載の化合物。
9. 【請求項９】Z₂が、−Ｇ−Ｇ−、−Ｄ−Ｇ−、［Ｄ−As
   p］−Ｇ−、Ｄ−たはＬ−γ−Glu,D−またはＬ−β−As
   p,4−AB,4−APA,4−PIPおよび４−AMCから選択される、
   請求項１から８に記載の化合物。
10. 【請求項１０】AA₁₀₉−AA₁₁₀−AA₁₁₁−AA₁₁₂−AA₁₁₃−Z
    ₃が、Ｒ（I/M）DR−NHR″であり、Ｒ″が３〜10個の炭
    素のアルキルである、請求項１から９に記載の化合物。
11. 【請求項１１】AA₁₀₉−AA₁₁₀−AA₁₁₁−AA₁₁₂−AA₁₁₃がR
    IDRIであり、そして、Z₃がNH₂である、請求項１から８
    に記載の化合物。
12. 【請求項１２】アナログ＃122:MBP−４−APA−Ｒ−Ｉ−
    Ｄ−Ｒ−Ｉ−NH₂である、請求項１に記載の化合物。
13. 【請求項１３】第４図の化合物からなる群から選択され
    る、請求項１に記載の化合物。
14. 【請求項１４】ナトリウム排泄増加剤、利尿剤および／
    または血管拡張剤として有用な組成物であって、請求項
    １の、治療学上有効な量の化合物を、薬学的に受容され
    得る担体と共に含む、組成物。
15. 【請求項１５】哺乳類において、ナトリウム排泄増加作
    用、利尿作用および／または血管拡張作用を有するペプ
    チド化合物の製造方法であって、該ペプチド化合物は、
    請求項１の式の化合物、またはその薬学的に受容され得
    る塩を含み、該方法は、以下の工程を包含する： a.反応混合物中において固体樹脂担体と結合させた保護
    されたペプチドを調製する工程であって、該ペプチド
    は、上記のアミノ酸配列を有する； b.該固体樹脂担体をペプチドから除去し、該ペプチドを
    脱保護する工程； c.上記のように、所望の有機置換基を付加するために、
    必要に応じて該ペプチドを修飾する工程；および d.反応混合物から該ペプチドを単離し、必要に応じて、
    該ポリペプチドをその酸付加塩に変化させる工程。