JP2869860B2 - ビール生育乳酸菌の早期判定方法および判定キット - Google Patents
ビール生育乳酸菌の早期判定方法および判定キットInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明はビール生育乳酸菌
の早期判定方法および判定キットに関するものである。
の早期判定方法および判定キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】飲食品において有害微生物が混入すると
濁りや酸敗などによって著しく商品の品質を損ねる。ビ
ールでは、グラム陽性菌であるラクトバチルス属（Lact
obacillus)、ペディオコッカス属（Pediococcus)、ロイ
コノストック属（Leuconostoc)等の乳酸菌が、ビール汚
染菌として検出される代表的な菌である。しかし、これ
らの菌株が全てビール中で生育しビール品質を損なうこ
とになるとは限らず、同じ属でも生育できるもの、ビー
ルに馴化して始めて生育できるもの、あるいは全くビー
ルに生育できないものなどが含まれている。従って、こ
れらに属する菌株がビール製品およびビール製造工程よ
り検出された場合、その菌株がビール中で生育可能かど
うかを判定することが極めて重要である。
濁りや酸敗などによって著しく商品の品質を損ねる。ビ
ールでは、グラム陽性菌であるラクトバチルス属（Lact
obacillus)、ペディオコッカス属（Pediococcus)、ロイ
コノストック属（Leuconostoc)等の乳酸菌が、ビール汚
染菌として検出される代表的な菌である。しかし、これ
らの菌株が全てビール中で生育しビール品質を損なうこ
とになるとは限らず、同じ属でも生育できるもの、ビー
ルに馴化して始めて生育できるもの、あるいは全くビー
ルに生育できないものなどが含まれている。従って、こ
れらに属する菌株がビール製品およびビール製造工程よ
り検出された場合、その菌株がビール中で生育可能かど
うかを判定することが極めて重要である。
【０００３】現在、製造工程や製品ビール等から検出さ
れた乳酸菌は、検出用寒天培地から再度ビールに植え継
いで、その濁度および菌数測定を行い生育判定を行って
いるが、この場合、すべての乳酸菌が生育するとは限ら
ず、また、生育判定まで大変時間がかかる（約１〜２カ
月）という問題もある。一方、ビール有害乳酸菌の判定
にＡＴＰを利用し、またはルシフェリン・ルシフェラー
ゼ法を利用することが知られている。これらの利用を記
載する文献としては、主なものに特開昭54−123094の
「乳酸菌定量法およびそのキット」、特開平07−195の
「火落菌の測定方法」、J AM SOC BREW CHEM, VOL.
52, NO.1, 19-23 (1994)の「ＡＴＰ生物ルミネセンスに
よる潜在的ビール有害菌の生菌数測定」、J INST BRE
W, VOL.95, NO.5, 317-319 (1989) の「ＡＴＰの生物ル
ミネセンスを利用した酵母と乳酸菌検出のための迅速
法」等があるが、これらは有害乳酸菌の菌体内ＡＴＰが
ルシフェリン・ルシフェラーゼ法により発光され、その
発光強度よって該当する乳酸菌が存在するかどうか、ま
た存在する場合はその生菌数を測定するものである。
れた乳酸菌は、検出用寒天培地から再度ビールに植え継
いで、その濁度および菌数測定を行い生育判定を行って
いるが、この場合、すべての乳酸菌が生育するとは限ら
ず、また、生育判定まで大変時間がかかる（約１〜２カ
月）という問題もある。一方、ビール有害乳酸菌の判定
にＡＴＰを利用し、またはルシフェリン・ルシフェラー
ゼ法を利用することが知られている。これらの利用を記
載する文献としては、主なものに特開昭54−123094の
「乳酸菌定量法およびそのキット」、特開平07−195の
「火落菌の測定方法」、J AM SOC BREW CHEM, VOL.
52, NO.1, 19-23 (1994)の「ＡＴＰ生物ルミネセンスに
よる潜在的ビール有害菌の生菌数測定」、J INST BRE
W, VOL.95, NO.5, 317-319 (1989) の「ＡＴＰの生物ル
ミネセンスを利用した酵母と乳酸菌検出のための迅速
法」等があるが、これらは有害乳酸菌の菌体内ＡＴＰが
ルシフェリン・ルシフェラーゼ法により発光され、その
発光強度よって該当する乳酸菌が存在するかどうか、ま
た存在する場合はその生菌数を測定するものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来利
用されている乳酸菌体内のＡＴＰをルシフェリン・ルシ
フェラーゼ法で測定する方法は、そもそも乳酸菌体内に
存在するＡＴＰを抽出してそのＡＴＰを測定することに
よって乳酸菌の存在の有無および乳酸菌の生菌数を測定
する方法であるが、その測定された乳酸菌がビール中で
生育できるかどうかまでを判定できるものではない。
用されている乳酸菌体内のＡＴＰをルシフェリン・ルシ
フェラーゼ法で測定する方法は、そもそも乳酸菌体内に
存在するＡＴＰを抽出してそのＡＴＰを測定することに
よって乳酸菌の存在の有無および乳酸菌の生菌数を測定
する方法であるが、その測定された乳酸菌がビール中で
生育できるかどうかまでを判定できるものではない。
【０００５】そこで本発明は、検出された乳酸菌がビー
ル中で生育するかしないかを早期に判定する方法および
判定キットを提供するものである。
ル中で生育するかしないかを早期に判定する方法および
判定キットを提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】前述した目的を達成する
ために、本発明は検体用の乳酸菌を培養し、次いでピル
ビン酸、リンゴ酸およびクエン酸のいずれか１種以上の
有機酸を加えて一定期間反応させた後、菌体内のＡＴＰ
量をルシフェリン・ルシフェラーゼ法で測定し判定する
方法およびキットである。
ために、本発明は検体用の乳酸菌を培養し、次いでピル
ビン酸、リンゴ酸およびクエン酸のいずれか１種以上の
有機酸を加えて一定期間反応させた後、菌体内のＡＴＰ
量をルシフェリン・ルシフェラーゼ法で測定し判定する
方法およびキットである。
【０００７】ビール中で生育する乳酸菌は、ビール中の
ピルビン酸、リンゴ酸あるいはクエン酸を消費し、新た
に乳酸、酢酸あるいは炭酸ガスを生成する。一方、ビー
ル中で生育しない乳酸菌は、ビール中のイソフムロンの
イオノフォア作用により菌体内のｐＨが低下し、生育が
阻害され、さらには死滅が起こる。この点について、ビ
ール生育乳酸菌と生育できない乳酸菌を用いて、ビルビ
ン酸、リンゴ酸あるいはクエン酸の有機酸を脱炭酸する
ことに基づくＡＴＰ生成量を測定したところ、ビール生
育乳酸菌の菌体内ＡＴＰ生成量は生育できない菌の量に
比べて著しく多いことが確認された。
ピルビン酸、リンゴ酸あるいはクエン酸を消費し、新た
に乳酸、酢酸あるいは炭酸ガスを生成する。一方、ビー
ル中で生育しない乳酸菌は、ビール中のイソフムロンの
イオノフォア作用により菌体内のｐＨが低下し、生育が
阻害され、さらには死滅が起こる。この点について、ビ
ール生育乳酸菌と生育できない乳酸菌を用いて、ビルビ
ン酸、リンゴ酸あるいはクエン酸の有機酸を脱炭酸する
ことに基づくＡＴＰ生成量を測定したところ、ビール生
育乳酸菌の菌体内ＡＴＰ生成量は生育できない菌の量に
比べて著しく多いことが確認された。
【０００８】そこで、本発明はこの現象を利用して、検
体の乳酸菌にリンゴ酸等の有機酸を作用させて、判定す
る乳酸菌体内のＡＴＰ量を変化させ、その変化したＡＴ
Ｐ量を既知の方法であるルシフェリン・ルシフェラーゼ
法によって測定し、ビール中の乳酸菌の生育能を判定す
るものである。このとき、ビール生育乳酸菌では菌体内
のＡＴＰ量は増加するが、生育できない乳酸菌では菌体
内のＡＴＰ量は増加しない。
体の乳酸菌にリンゴ酸等の有機酸を作用させて、判定す
る乳酸菌体内のＡＴＰ量を変化させ、その変化したＡＴ
Ｐ量を既知の方法であるルシフェリン・ルシフェラーゼ
法によって測定し、ビール中の乳酸菌の生育能を判定す
るものである。このとき、ビール生育乳酸菌では菌体内
のＡＴＰ量は増加するが、生育できない乳酸菌では菌体
内のＡＴＰ量は増加しない。
【０００９】本方法により、ビール製品、あるいはビー
ル製造工程からの検出菌のビール中での生育能の早期予
測が可能（６〜24時間）になる。
ル製造工程からの検出菌のビール中での生育能の早期予
測が可能（６〜24時間）になる。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明は次のように実施できる。
判定したい乳酸菌は、まず乳酸菌検出用培地で培養す
る。培養条件は嫌気培養で、ｐＨ 4.5〜6.0 で、培養温
度は25〜28℃にて、２〜３日間行う。乳酸菌検出用培地
は、ビール生育乳酸菌が適度に生育できる条件のもので
あれば限定されないが、その培地中に10〜50％のビール
を添加するか、あるいは構成する成分にホップ成分（２
〜１０ppm、Isohumurone)、有機酸（ピルビン酸、リン
ゴ酸、クエン酸）および金属（0.5〜1.5mM MgSO4、MnSO
4等）を添加した方が、生育が早いのでよい。
判定したい乳酸菌は、まず乳酸菌検出用培地で培養す
る。培養条件は嫌気培養で、ｐＨ 4.5〜6.0 で、培養温
度は25〜28℃にて、２〜３日間行う。乳酸菌検出用培地
は、ビール生育乳酸菌が適度に生育できる条件のもので
あれば限定されないが、その培地中に10〜50％のビール
を添加するか、あるいは構成する成分にホップ成分（２
〜１０ppm、Isohumurone)、有機酸（ピルビン酸、リン
ゴ酸、クエン酸）および金属（0.5〜1.5mM MgSO4、MnSO
4等）を添加した方が、生育が早いのでよい。
【００１１】前培養された乳酸菌を次に集菌し、緩衝液
で洗浄する。なお、検出効率を高めるために集菌後pH4.
0〜5.2のビールで６〜24時間培養する工程を加えてもよ
い。洗浄した乳酸菌を有機酸溶液に懸濁し、２〜30分間
反応させる。反応時間は実施時の温度条件により最適の
時間を設定すればよい。有機酸としては、リンゴ酸、ク
エン酸、ピルビン酸等が使用できる。有機酸の濃度とし
ては１〜20mMの範囲で使用するのが好ましい。乳酸菌の
有機酸溶液への添加量は 103〜1010 cells／mlの範囲が
適当である。反応させた乳酸菌を公知のルシフェリン・
ルシフェラーゼ法で測定し、菌体内のＡＴＰ量を調べ
る。ルシフェリン・ルシフェラーゼ法は既存の測定キッ
ト等を使用すると簡易である。
で洗浄する。なお、検出効率を高めるために集菌後pH4.
0〜5.2のビールで６〜24時間培養する工程を加えてもよ
い。洗浄した乳酸菌を有機酸溶液に懸濁し、２〜30分間
反応させる。反応時間は実施時の温度条件により最適の
時間を設定すればよい。有機酸としては、リンゴ酸、ク
エン酸、ピルビン酸等が使用できる。有機酸の濃度とし
ては１〜20mMの範囲で使用するのが好ましい。乳酸菌の
有機酸溶液への添加量は 103〜1010 cells／mlの範囲が
適当である。反応させた乳酸菌を公知のルシフェリン・
ルシフェラーゼ法で測定し、菌体内のＡＴＰ量を調べ
る。ルシフェリン・ルシフェラーゼ法は既存の測定キッ
ト等を使用すると簡易である。
【００１２】一方、有機酸を加えない系を対照とし、同
様に菌体内のＡＴＰ量を測定する。得られたＡＴＰ量測
定値を次式：有機酸添加菌体内ＡＴＰ量／有機酸無添加
菌体内ＡＴＰ量（対照試験の値）にあてはめ、得られた
値が２以上であればビール中で生育能ありと判定する。
本発明の方法のフローチャートを図１に示す。
様に菌体内のＡＴＰ量を測定する。得られたＡＴＰ量測
定値を次式：有機酸添加菌体内ＡＴＰ量／有機酸無添加
菌体内ＡＴＰ量（対照試験の値）にあてはめ、得られた
値が２以上であればビール中で生育能ありと判定する。
本発明の方法のフローチャートを図１に示す。
【００１３】また、前述の検出法をもとにビール生育乳
酸菌検出用キットを構成することも可能である。その構
成を表１に記載した。
酸菌検出用キットを構成することも可能である。その構
成を表１に記載した。
【００１４】
【表１】
【００１５】
【発明の効果】本発明によれば、簡便な方法で早期にビ
ール生育乳酸菌を判定することができる。
ール生育乳酸菌を判定することができる。
【００１６】
【実施例】以下、実施例で本発明を説明するが、これに
限定されるものではない。 実施例１ ビール生育株７株（Lactobacillus brevis アサヒビー
ル（株）保存菌株（以下、ＡＢＢＣという）45、Lactob
acillus brevis ＡＢＢＣ46、 Lactobacillusbrevis Ａ
ＢＢＣ65、 Lactobacillus brevis ＡＢＢＣ69、 Lacto
bacillus sp.ＡＢＢＣ70、 Lactobacillus brevis ＡＢ
ＢＣ99、 Lactobacillus brevis ＡＢＢＣ104）および
ビール非生育株７株（Lactobacillus brevis ＡＢＢＣ2
16、Lactobacillus buchneri ＡＢＢＣ219、Lactobacil
lus buchneri ＡＢＢＣ220、Lactobacillus buchneri
ＡＢＢＣ221、Lactobacillus paracasei ＡＢＢＣ223、
Lactobacillus sp. ＡＢＢＣ229、Lactobacillus sp.
ＡＢＢＣ232）を、乳酸菌検出用培地（メルク社製、商
品名：ＭＲＳ broth）および乳酸菌検出用培地ＭＲＳに
ビールを25％添加したビール添加ＭＲＳ培地（以下、Ｂ
ＭＲＳ培地という）のそれぞれ10ml中に懸濁し、25℃、
３日間嫌気培養を行った。その培養後の培養液の0.1％
溶液をpH5.0に調整したビール10mlに添加して25℃、24
時間で培養した。それぞれの菌混濁液を10,000rpmで10
分間遠心分離して集菌し、pH4.2の酒石酸緩衝液で洗浄
した。その後、遠心して上澄みを除去し、再びpH4.2の
酒石酸緩衝液に懸濁し、その懸濁液に、20mMのリンゴ
酸、１mMのクエン酸を基質として添加し、25℃で20分間
反応させて、菌体内ＡＴＰを生成させた。
限定されるものではない。 実施例１ ビール生育株７株（Lactobacillus brevis アサヒビー
ル（株）保存菌株（以下、ＡＢＢＣという）45、Lactob
acillus brevis ＡＢＢＣ46、 Lactobacillusbrevis Ａ
ＢＢＣ65、 Lactobacillus brevis ＡＢＢＣ69、 Lacto
bacillus sp.ＡＢＢＣ70、 Lactobacillus brevis ＡＢ
ＢＣ99、 Lactobacillus brevis ＡＢＢＣ104）および
ビール非生育株７株（Lactobacillus brevis ＡＢＢＣ2
16、Lactobacillus buchneri ＡＢＢＣ219、Lactobacil
lus buchneri ＡＢＢＣ220、Lactobacillus buchneri
ＡＢＢＣ221、Lactobacillus paracasei ＡＢＢＣ223、
Lactobacillus sp. ＡＢＢＣ229、Lactobacillus sp.
ＡＢＢＣ232）を、乳酸菌検出用培地（メルク社製、商
品名：ＭＲＳ broth）および乳酸菌検出用培地ＭＲＳに
ビールを25％添加したビール添加ＭＲＳ培地（以下、Ｂ
ＭＲＳ培地という）のそれぞれ10ml中に懸濁し、25℃、
３日間嫌気培養を行った。その培養後の培養液の0.1％
溶液をpH5.0に調整したビール10mlに添加して25℃、24
時間で培養した。それぞれの菌混濁液を10,000rpmで10
分間遠心分離して集菌し、pH4.2の酒石酸緩衝液で洗浄
した。その後、遠心して上澄みを除去し、再びpH4.2の
酒石酸緩衝液に懸濁し、その懸濁液に、20mMのリンゴ
酸、１mMのクエン酸を基質として添加し、25℃で20分間
反応させて、菌体内ＡＴＰを生成させた。
【００１７】この菌体内ＡＴＰをキッコーマン（株）製
キット（商品名：ルシフェラーゼＬＵプラス）を使用し
てルシフェリン・ルシフェラーゼ法により測定した。対
照として、有機酸無添加のものを同一の系にて反応さ
せ、次式で生育能を判定した。有機酸添加菌体内ＡＴＰ
量／有機酸無添加菌体内ＡＴＰ量＞２で生育能ありと判
定。
キット（商品名：ルシフェラーゼＬＵプラス）を使用し
てルシフェリン・ルシフェラーゼ法により測定した。対
照として、有機酸無添加のものを同一の系にて反応さ
せ、次式で生育能を判定した。有機酸添加菌体内ＡＴＰ
量／有機酸無添加菌体内ＡＴＰ量＞２で生育能ありと判
定。
【００１８】菌体内ＡＴＰ生成量を調べたところ、ビー
ル生育株と非生育株の区別が短時間で明確にできた。こ
の結果を表２に記載した。
ル生育株と非生育株の区別が短時間で明確にできた。こ
の結果を表２に記載した。
【００１９】
【表２】
【図１】 ビール生育乳酸菌の早期判定方法のフローチ
ャート。
ャート。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C21Q 1/66 C12Q 1/04 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＯＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＯＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】判定したい乳酸菌をピルビン酸、クエン酸
およびリンゴ酸のいずれか１種以上の有機酸と反応させ
た後、菌体内ＡＴＰ量をルシフェリン・ルシフェラーゼ
法で測定することを特徴とするビール生育乳酸菌の早期
判定方法。 - 【請求項２】乳酸菌検出用培地に判定したい乳酸菌を加
えて培養し、ピルビン酸、クエン酸、リンゴ酸のいずれ
か１種以上の有機酸を加えて反応させ、菌体内のＡＴＰ
量をルシフェリン・ルシフェラーゼ法で測定することを
特徴とするビール生育乳酸菌の早期判定方法。 - 【請求項３】乳酸菌検出用培地がビールまたはホップ成
分を添加したものである請求項２記載の判定方法。 - 【請求項４】ルシフェリン・ルシフェラーゼ発光液、Ａ
ＴＰ抽出液、ピルビン酸、クエン酸およびリンゴ酸のい
ずれか１種以上の有機酸反応溶液、培養用ビール溶液お
よび乳酸菌検出用培地から構成されるビール生育乳酸菌
検出用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31169095A JP2869860B2 (ja) | 1995-11-07 | 1995-11-07 | ビール生育乳酸菌の早期判定方法および判定キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31169095A JP2869860B2 (ja) | 1995-11-07 | 1995-11-07 | ビール生育乳酸菌の早期判定方法および判定キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09121896A JPH09121896A (ja) | 1997-05-13 |
| JP2869860B2 true JP2869860B2 (ja) | 1999-03-10 |
Family
ID=18020299
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31169095A Expired - Fee Related JP2869860B2 (ja) | 1995-11-07 | 1995-11-07 | ビール生育乳酸菌の早期判定方法および判定キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2869860B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19625137A1 (de) * | 1996-06-24 | 1998-01-08 | Basf Ag | Verwendung eines Bioluminszenz-Tests zum Nachweis von Mikroorganismen in Dispersionen, die Polymere und/oder Pigmente enthalten |
| JP2002191395A (ja) * | 2000-12-27 | 2002-07-09 | Zeon Joho System Kk | 製品の真偽判別方法 |
| DE102011077238B4 (de) * | 2011-06-09 | 2016-03-31 | Bayerische Motoren Werke Aktiengesellschaft | Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in einem Hohlraumkonservierungsmittel |
| JP2015188412A (ja) * | 2014-03-28 | 2015-11-02 | 味の素ゼネラルフーヅ株式会社 | 乳酸菌の検出方法 |
-
1995
- 1995-11-07 JP JP31169095A patent/JP2869860B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09121896A (ja) | 1997-05-13 |
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