JP2892699B2 - 新規な抗生物質メルサシジンおよびその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、メルサシジン（mersacidin）と称する新規
な抗生物質、ユバクテリウムバチルス（Eubacterium Ba
cillus）菌種Ｙ−85,54728（ブタペスト条約の規定によ
ってDSM 4584の番号で西独微生物寄託機関（Deutsche S
ammlung fr Mikroorganismen）に1988年５月６日に寄
託されている）からのその製法、上記菌種の変異体およ
び突然変異体および薬剤としてのメルサシジンの使用に
関するものである。

本発明によるメルサシジンは式Ｉ の環状ポリペプチドである。

キラル炭素原子の配置は、式IIにおいて明らかにされ
る。

本発明は、メルサシジンのみでなく、その生理学的に
許容し得る塩および明らかな化学的均等物にも関するも
のである。

環状ペプチド抗生物質は、CRC Handbook of antibiot
ics IV巻263〜424頁の“環状ペプチド”の節に記載され
ている。バチルス属から単離された抗生物質も、また、
Korzybski T.等によって編集された“Antibiotics,orig
in,nature and properties"（1978年）III巻1529〜2078
頁に記載されている。他の微生物源からのポリペプチド
抗生物質は、同文献Ｉ巻311〜491頁に記載されている。

しかしながら、すべての入手可能なデータは、メルサ
シジンが上記文献に記載されたすべての環状ポリペプチ
ド抗生物質と著しく異なっていることを示す。メルサシ
ジンの分子量およびアミノ酸組成を有する化合物は、ケ
ミカルアブストラクツに登録されていない。

メルサシジンの製造に使用されるユバクテリウム（ヘ
キストインドリミテツド培養菌番号Ｙ−85,54728）（以
下Ｙ−85,54728と称す）は、インド、マハラシユトラ、
ムランド（サルトパン）で得られた土壌試料から単離さ
れそしてバチルス菌種と同定されている。

メルサシジンの生理学的に許容し得る塩は、広範囲の
種々な化合物、例えば、トリエチルアミンまたはトリ−
（２−ヒドロキシエチル）−アミンのような有機アミ
ン、ナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシ
ウムのようなアルカリ金属およびアルカリ土類金属、例
えば塩酸、硫酸または燐酸のような無機酸および例えば
酢酸、、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマール
酸、酒石酸またはｐ−トルエンスルホン酸のような有機
酸を使用して一般に知られている方法で形成することが
できる。

更に、本発明は、ヘキストインドリミテツド培養菌Ｙ
−85,54728ならびにその突然変異体および変異体から新
規な抗生物質であるメルサシジンを製造する方法に関す
るものである。

該方法は、培養菌Ｙ−85,54728またはその突然変異体
および（または）変異体を炭素および窒素源、無機栄養
価および微量の元素を含有する栄養培地中で好気性条件
下で培養しそして培養ブロスから上記抗生物質を単離お
よび精製することからなる。

可能な炭素源の例は、ガラクトース、グリセロール、
シユクロースまたはグルコースである。ガラクトースが
炭素源として好適である。好適な窒素源は、酵母エキ
ス、肉エキス、とうもろこし浸出液、カサミノ酸（casa
mino acid）または例えばアンモニウム塩のような無機
物質である。とうもろこし浸出液は、窒素源として特に
好適である。可能な無機栄養塩の例は、燐酸水素ナトリ
ウム、燐酸水素カリウム、塩化カルシウムまたは硫酸マ
グネシウムである。可能な微量の元素の例は、鉄、マン
ガン、銅または亜鉛の塩または他の金属塩である。

培養菌Ｙ−85,54728は、好適には、26〜29℃の間の温
度および約6.5〜7.2の間のpHにおいて培養される。培養
菌Ｙ−85,54728は、特に好適には28℃（±１℃）および
pH7.2で培養される。

培養は、好適には、約60〜72時間実施する。このよう
な時間において、本発明の抗生物質は、最適の収量で生
産される。培養は、特に、好適には振盪フラスコならび
に実験室の醗酵器中で液内培養条件下で66時間実施され
る。もし必要であるならば、醗酵器中に泡抑制剤（例え
ばバイエルAGからのポリオール、デスモフエン ）を使
用することができる。培養の進行および本発明のメルサ
シジンの形成は、既知の寒天プレート拡散試験法を使用
してスタフイロコツカスオーレウス209P、スタフイロコ
ツカスオーレウスR85およびアルカリゲネスフエーカリ
スに対する培養ブロスの生物活性度を測定することによ
って確立することができる〔イギリス、ロンドンのオキ
ソイドリミテツドにより発行されたOxoid Manual（1972
年）２版を参照されたい〕。

得られた培養ブロスは、培養液中にメルサシジンの
みを含有する。このものは、遠心分離によって細胞のか
たまりから分離される。メルサシジンは、例えば、ダイ
アイオン HP−20（日本の三菱化成工業株式会社）また
はアンバライト XAD−２（Ｒ）、XAD−７（Ｒ）（40−
225×10^-10ｍの平均孔直径を有するポリスチレン、アク
リル酸エステルまたはアミンオキシドのマトリツクスか
らなる重合体吸着剤。USAのローム・アンド・ハス社）
のような重合体吸着剤上の疎水性の相互作用クロマトグ
ラフィー処理または酢酸エチルまたはブタノールのよう
な水と混和しない溶剤による抽出のような１またはそれ
以上の既知の方法によって、培養液から単離すること
ができる。好適な方法は、ダイアイオンHP−20上に吸着
させ次に例えばメタノール、アセトニトリルまたはこれ
らの溶剤の水性組み合わせ物のような適当な有機溶剤で
化合物を脱着させることからなる。メタノールは、メル
サシジンの溶離に対する溶剤として好適である。

活性溶離液からの溶剤の除去によって粗製のメルサシ
ジンが得られる。更に、精製は、シリカゲル、変性シリ
カル、セルロースまたはセフアデツクス LH−20（スエ
ーデンのフアルマシアフアインケミカルABによって製造
された親油性ゲル過材料）のような物質上のクロマト
グラフイー処理によって達成することができる。水濃度
を段階的にそれぞれの時間において５〜10％まで増加さ
せたアセトニトリル／水混合物を溶離剤として使用して
シリカゲル上で粗製メルサシジンをクロマトグラフイー
処理することが、好適な方法である。活性な溶離液（生
物学的試験法によって検出）を、濃縮して半純粋な化合
物を得る。この方法で得られた半純粋な抗生物質は、更
に、例えば、水、MeOH、CHCl₃、ヘキサンまたはこれら
の適当な組み合わせ物のような溶剤を使用して例えばセ
フアデツクス LH−20のような親油性ゲル過材料上で
クロマトグラフイー処理し、適当な場合は次に活性炭粉
末で処理することによって、または、例えばMeOH、CH₃C
N、水またはこれらの適当な組み合わせ物のような溶剤
を使用してシリカゲルカラム上で分取用高圧液体クロマ
トグラフイー処理することによって精製することができ
る。CH₃CNおよび水の混合物（70:30）を使用してオクタ
デシルトリクロロシラン基を有するHPLC物質（例えばUS
A、シヤンドンからの製品であるハイパーシル のよう
な）を含有するカラム上で分取用高圧液体クロマトグラ
フイー処理することが、好適な方法である。メルサシジ
ンは、例えば真空蒸留によって有機溶剤を活性溶離液か
ら除去しそして次に凍結乾燥して水を除去した後に、白
色粉末として得られる。

メルサシジンは、抗菌活性（活性度試験参照）によっ
て薬学的組成物に使用するのに適当である。従って、本
発明は、また、慣習的な一般に知られている補助剤およ
び（または）賦形剤のほかにメルサシジンを含有する薬
剤ならびにそれ自体既知の方法で抗生物質様および（ま
たは）免疫抑制作用を有する薬剤にメルサシジンを使用
することに関するものである。

以下の実施例は、本発明を説明するのに役立つ。

実施例１ 土壌からの培養菌Ｙ−85,54728の単離 （ａ）単離のための栄養培地の組成 プロテオースペプトン 20.0g K₂SO₄ 1.5g MgSO₄・7H₂O 1.5g グリセロール 10.0g 寒天粉末 15.0g ミネラルを除いた水 １ pH 6.8 （ｂ）土壌の画線および単離 滅菌し、ミネラルを除いた水90mlを、250mlの三角フ
ラスコ中のムランドのサルトパンで得られた土壌試料10
gに加えそしてフラスコを軌道振盪器上で220rpmで２時
間振盪する。次に、この土壌懸濁液を10から10^-5まで段
階的に連続希釈する。最終希釈からの懸濁液1mlを滅菌
したガラス製のペトリ−プレート（直径６インチ）の中
心におきそして次に45℃に冷却された上記の単離培地約
50mlを注加しそしてプレートをはげしく振盪する。土壌
懸濁液および培地の混合物を沈降させそしてそれを28℃
（±１℃）で３日間培養する。ペトリ−プレートを規則
的な間隔で検査しそして培養菌番号Ｙ−85,54728を生長
微生物から単離する。

実施例２ 培養菌Ｙ−85,54728の維持 維持培地の組成 培養菌Ｙ−85,54728は、次の組成の栄養寒天培地上に
維持する。

ペプトン 10g 肉エキス 3g 酵母エキス 3g 寒天粉末 15g ミネラルを除いた水 １ pH 7.2 成分を加熱によって完全に溶解した後、これらを試験
管に分配しそして121℃で20分滅菌する。試験管を冷却
しそして傾斜位置の状態で固化させる。培養菌Ｙ−85,5
4728をワイヤーループを使用して寒天斜面培養基に加え
そしてこれらを良好な生長がみられるまで28℃（±１
℃）で培養する。よく生長した培養菌を冷却器中で＋８
℃で貯蔵する。

実施例３ 振盪フラスコ中での培養菌Ｙ−85,54728の醗酵 種子培養培地の組成 カサミノ酸 5g とうもろこし浸出液 5g グリセロール 20g ガラクトース 10g ミネラルを除いた水 １ pH 7.2 上記種子培養培地25mlづつを、250mlの三角フラスコ
に分配しそしてオートクレーブ中において121℃で20分
加熱する。フラスコを冷却しそしてそれぞれのフラスコ
に実施例２からの上述した良く生長した培養菌の１ルー
プを接種しそして１分当たり220の回転でそして28℃
（±１℃）で24時間振盪する。得られた培養溶液を以下
に記載するような生産フラスコに接種する種子培養溶液
として使用する。

振盪フラスコ中における抗生物質メルサシジンの生産 生産培地は、実施例３に記載した種子培地に相当す
る。培地100mlづつを500mlの三角フラスコに分配しそし
てオートクレーブ中において121℃で20分加熱する。フ
ラスコを冷却しそして上述した種子培養溶液（1v/v％）
で接種する。醗酵を、１分当たり220回転および28℃
（±１℃）の温度で66時間軌道振盪器中で実施する。

抗生物質の生産は、プレート拡散法を使用して既知の
方法で試験するスタフイロコツカスオーレウス209P、ス
タフイロコツカスオーレウスR85およびアルカリゲネス
フエーカリスに対する生物活性のプロフイルによって監
視する。収穫後、培養ブロスを遠心分離しそしてメルサ
シジンを以下に記載するようにして培養液から単離し
そして精製する。

実施例４ 醗酵器中における培養菌Ｙ−85,54728の培養 段階1.振盪フラスコ中における種子培養液の製造 滅菌前にpHを6.8に調整した実施例３からの種子培養
培地（100ml）を500mlの三角フラスコに入れる。これ
を、オートクレーブ中で121℃で20分滅菌し、冷却しそ
して実施例２からのよく生長した培養液の１ループを接
種する。フラスコを、１分当り220回転で軌道フラスコ
中で28℃（±１℃）で24時間培養する。この生長した培
養菌を使用して以下に記載するような小さな醗酵器に接
種する。

段階2.小さな醗酵器中における種子培養液の製造 滅菌前にpHを6.8に調整した種子培地（実施例３に記
載したような）10lを、泡抑制剤としての0.04％（v/v）
のデスモフエンと一緒に容量15lのステンレス鋼製の醗
酵器に入れ、オートクレーブ中で121℃で36分滅菌し、
冷却しそして無菌の条件下で実施例４の上記段階１から
の４％（v/v）の種子物質を接種する。次に、培養を、
次の条件下で24時間実施する。

温度 28℃（±１℃） 撹拌速度 150rpm 通気 １分当り6l 24時間後の培養生長物を使用して段階３からの生産培
地に接種する。

段階3.生産規模における醗酵 容量150lの醗酵器中の滅菌前にpHを6.8に調整した生
産培地（実施例３に述べた種子培地に相当する）100lお
よび0.06％のデスモフエンまたは容量390lの醗酵器中の
培地250lおよび0.06％のデスモフエンを、121℃で28分
滅菌しそして段階２からの種子培養液４％を接種する。

培養は、次の条件下で実施する。

温度 28℃（±１℃） 撹拌温度 80〜100rpm 通気 １分当り50l（100lの醗酵器に対して） １分当り125l（390lの醗酵器に対して） 収穫時間 66時間後 抗生物質の生産は、、スタフイロコツカスオーレウス
209P、スタフイロコツカスオーレウスR85およびアルカ
リゲネスフエーカリスに対して試験する活性度のプロフ
イルによって監視する。収穫後、培養ブロスを遠心分離
しそして抗生物質を以下に記載するように培養液から
単離しそして精製する。

実施例５ メルサシジンの単離および精製 収穫したブロス約100lを、遠心分離によって菌糸から
分離する。得られた液（pH6.8〜7.0）を、5lのダイア
イオンHP−20カラムを通して通過させる。カラムを、は
じめにミネラルを除いた水50lで洗浄する。次に、それ
を順次にMeOH中の70％H₂O（40l）、MeOH中の50％H₂O（5
0l）およびMeOH中の30％H₂O（50l）で洗浄しそして水性
洗液はすべて捨てる。カラムを、最後に、MeOH10lで溶
離する。活性な溶離液を、減圧下で濃縮して褐色の油状
物質を得る。後者を石油エーテル（沸点40〜60℃）１
とともにすりつぶし、過しそして液を捨てる。この
操作を粉末が過器上の残留物として残るまで反復す
る。この方法で粗製のメルサシジンが帯褐色の黄色粉末
（12g）として得られる。

次に、粗製のメルサシジンを、5.5×53cmのサイズの
ガラスカラム中でシリカゲル（200〜300メツシユ）300g
上の中圧液体クロマトグラフイー処理に付す。カラム
を、CH₃CN 1.5lで洗浄しそして次に１分当り16mlの流速
で10％水性CH₃CN（3l）および15％水性CH₃CN（3l）で溶
離する。250mlづつのクラクシヨンを集めそして210nmの
波長におけるUV検出によっておよび微生物試験法によっ
て検査する。15％濃度の水性CH₃CNの溶離液の６つのフ
ラクシヨン（1.5l）が、活性である。これを、35℃で真
空濃縮してCH₃CNを除去しそして次に凍結乾燥して帯黄
色粉末として半純粋の物質2gを得る。

この方法で得られた半純粋の物質を、再び、４×54cm
のサイズのガラスカラム中でシリカゲル（200〜300メツ
シユ）上の中圧液体クロマトグラフイー処理に付す。カ
ラムを、順に、１分当り30mlの流速でCH₃CN（１）、
５％水性CH₃CN（１）および10％水性CH₃CN（4.5l）で
溶離する。250mlづつのクラクシヨンを集めそして210nm
におけるUV検出および微生物試験によって検査する。メ
ルサシジンは、10％濃度の水性CH₃CNによる溶離によっ
て得られる（750ml）。この溶離液（750ml）を35℃で減
圧濃縮し次に凍結乾燥して白色または帯白色の粉末とし
てメルサシジン593mgを得る。

メルサシジンの最終の精製は、溶離剤として30濃度の
水性CH₃CNおよび１分当り1.0mlの流速を使用する４×25
0mmのサイズのハイパーシル（10μ）カラム上の高圧液
体クロマトグラフイー処理によって実施される。フラク
シヨンは、210nmにおけるUV検出系によって検査する。
メルサシジンは、これらの条件下において約3.5分の保
持時間を有す。適当なフラクシヨンを集め、35℃で真空
濃縮しそして最後に凍結乾燥して白色の粉末として抗生
物質275mgを得た。メルサシジンの純度は、４×120mmの
サイズのAPS−ハイパーシル（５μ）、溶離剤としてのC
H₃CNおよびH₂Oの70:30の混合物、１分当り1mlの流速、
１分当り10mmのチヤート速度、210nmにおける検出によ
り検査した。高圧液体クロマトグラムは、第１図に示さ
れる通りである。

メルサシジンの生理化学的性質 メルサシジンは、その構造がＣ−末端ビニルアミド基
および４個の分子内スルフイドブリツジを有するノナデ
カペプチドからなる新規な化合物である。

第１表は、メルサシジンの生理化学的性質を要約した
ものである。

第１表：メルサシジンの生理化学的性質 外観：白色の無定形粉末 性質：環状ポリペプチド 融点：約240℃（分解） ▲〔α〕²⁰ _D▼ −9.4°（MeOH中ｃ＝0.3） 分子式：C₈₀H₁₂₀N₂₀O₂₁S₄ −高分解質量分析（FAB電離、マトリツクス３−ニトロ
ベンジルアルコール）によって確認 −Ｍ＋H⁺イオンの測定m/z1825.785 −¹²C₈₀ ¹H₁₂₁ ¹⁴N₂₀ ¹⁶O₂₁ ³²S₄に対する計算m/z 1825.790質量スペクトル（FAB、マトリツクス３−ニト
ロベンジルアルコール）：第２図¹ H NMRスペクトル（270MHz、CD₃OD）：第３図¹³ C NMRスペクトル（100MHz、CD₃OD）：第２表 活性度試験： （ａ）試験管内におけるメルサシジンの活性度 種々な微生物の生長の阻止に必要なMIC値としてのメ
ルサシジンの生物学的性質は、第３表に示される通りで
ある。

（ｂ）生体内におけるメルサシジンの活性度 メルサシジンは、実験室マウスの生体内系において良
好な活性度を示す。スタフイロコツカスオーレウスSG 5
11およびS.オーレウス710（メチシリンに耐性）を使用
して実験的に感染させた実験室マウスに9.37および25.0
0mg/kgの投与量で皮下的に投与した場合、100％の割合
の治療が達成された。更に、抗生物質の急性毒性を実験
室マウスにおいて試験した。現在まで試験したもっとも
高い濃度である500mg/kg（皮下的）の投与量においてさ
え、動物の死亡は観察されない。結果は第４表に示す通
りである。

バンコマイシンと比較したマウスにおけるS.オーレウス
E 710（MRSA）に対するメルサシジンの生体内活性度 使用した接種媒質:5×10⁹CFU/マウス（IMLD） バンコマイシンと比較したラツトにおけるS.オーレウス
SG 511膿瘍に対するメルサシジンの生体内活性度 感染投与量:5％ムチン中の２×10^-9CFU、皮ふ下に注入 処理:50mg/kg×７日 結果：メルサシジンは、細菌数を1.4log₁₀CFU/mlまで減
少する（コロニー形成単位）。

バンコマイシンは、細菌数を0.79log₁₀CFU/mlまで減
少する（コロニー形成単位）。

実施例６ メルサシジンの可溶性塩の製造 メルサシジンは、そのアルカリ金属塩の形態で水溶性
である。これらの塩は、ピリジンの存在下においてメル
サシジンを相当するアルカリ金属の水酸化物1.0当量で
処理することによつて製造することができる。例えば、
メルサシジン（50mg）をピリジン1mlに溶解し、溶液を
０℃に冷却しそして蒸留水3ml中のKOH 1.683mgの溶液を
撹拌下で加える。混合物を、０℃で１時間撹拌しそして
次に凍結乾燥して白色の粉末としてカリウムメルサシジ
ン49mgを得る。このカリウムメルサシジンは、水1mlに
対して160mgまで自由に溶解する。カリウムメルサシジ
ンの試験管内および生体内抗菌性は、メルサシジンの抗
菌性に匹敵しそして第５表および第６表に示される通り
である。

【図面の簡単な説明】

第１図はメルサシジンの高圧液体クロマトグラム、第２
図はメルサシジンの質量スペクトルそして第３図はメル
サシジンの¹H NMRスペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 ビマル・ナレツシユ・ガングリ インド国ボンベイ 400 071．チエンブ ール．セントラルアベニユー 173 (72)発明者 デイ―パク・クマル・チヤタジー インド国ボンベイ 400 081．ムランド ／ウエスト．マハトマプールロード．シ エータルブンガロウナン バー２ (72)発明者 ラジエンドラ・クマル・ハリプラサド・ ジヤニ インド国ボンベイ 400 082．ムランド ／ウエスト．ダルガロード．ヘキストク オーターズ ケイ‐４ (72)発明者 リヒアルト・ヘルムート・ルツプ ドイツ連邦共和国デー‐6240 ケーニヒ シユタイン／タウヌス．レーダーヴエー ク16アー (72)発明者 ハンス‐ヴオルフラム・フエールハーバ ー ドイツ連邦共和国デー‐6270 イートシ ユタイン／タウヌス．トーマス‐マン- シユトラーセ５アー (72)発明者 ヘルベルト・コグラー ドイツ連邦共和国デー‐6233 ケルクハ イム／タウヌス．ブレスラウアーシユト ラーセ 39 (72)発明者 ゲールハルト・ザイベルト ドイツ連邦共和国デー‐6100 ダルムシ ユタツト．グレーザーヴエーク 21 (72)発明者 フオルカー・テーツ ドイツ連邦共和国デー‐6238 ホフハイ ム・アム・タウヌス．アンデアタン 20 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/02 C07K 7/08 C12N 1/20 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の式Ｉ の化合物およびその生理学的に許容し得る塩。
2. 【請求項２】次の式II の化合物およびその生理学的に許容し得る塩。
3. 【請求項３】ユバクテリウムバチルス菌種Ｙ−85,54728
   （DSM 4584）、またはその突然変異体および（または）
   変異体を、炭素および窒素源、無機栄養塩および微量の
   元素を含有する栄養培地中において好気性条件下で培養
   し、そして従来の方法で培養ブロスから化合物を単離お
   よび精製することからなる請求項１または２記載の式Ｉ
   またはIIの化合物の製法。
4. 【請求項４】培養を約26〜29℃の温度および約6.5〜7.2
   のpHで実施する請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】培養を28℃（±１℃）および約7.2のpHで
   実施する請求項３または４記載の方法。
6. 【請求項６】醗酵を60時間より長い時間実施する請求項
   ３〜５の何れかの項記載の方法。
7. 【請求項７】式ＩおよびIIの化合物をクロマトグラフィ
   ー法によって精製する請求項３〜６の何れかの項記載の
   方法。
8. 【請求項８】適当な場合は、薬剤の製造に対して慣習的
   な補助剤および（または）賦形剤のほかに請求項１また
   は２記載の化合物を含有する抗菌剤。
9. 【請求項９】バチルス菌種Ｙ−85,54728（DSM 4584）。