JP2895896B2

JP2895896B2 - 脈管狭窄の治療におけるγ―インターフェロンの使用

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Publication number: JP2895896B2
Application number: JP1510051A
Authority: JP
Inventors: ゲーランハンソン; イャンホルム; レナヨナソン
Original assignee: JENENTETSUKU Inc
Current assignee: JENENTETSUKU Inc
Priority date: 1988-09-30
Filing date: 1989-09-27
Publication date: 1999-05-24
Anticipated expiration: 2014-05-24
Also published as: PT91863A; HU895542D0; KR900701308A; DE68905438T2; NZ230816A; AU623181B2; AU4305189A; EP0367735B1; IE893123L; KR0137017B1; HU206988B; JPH04500966A; SE8803472D0; DE68905438D1; CA1338722C; DD288094A5; ATE86869T1; IE63874B1; IL91796A; IL91796A0

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、例えば血管形成および／または脈管手術に
おける再狭窄治療を含む内膜過形成によって生じた脈管
狭窄の治療についての製剤の製造にγ−インターフェロ
ンを使用することに指向することにある。特に、本発明
は血管形成および／または脈管手術における動脈狭窄の
治療に指向することである。

発明の背景心臓血管について研究の進歩によって、特に高コレス
テロール血症、スモーキング（smokeing）および高血圧
症のようなアテーロム性動脈硬化症についての危険要素
を減少することによって、患者における心臓発作の発生
率を低下させている。心臓発作の発生は冠状動脈におけ
る血栓を溶解する組織−タイププラスミノーゲン活性
化因子（ｔ−PA）の投与によって止めることができるこ
とは知られている。最近、組換えDNA技術によるｔ−PA
のクローニングおよび生成によって、ｔ−PAを制限され
ない量で生成させている。

冠状アテローム性動脈硬化症を引き起こす患者におけ
る心臓発作を防止するためには、外科的方法だけが用い
られている。二三の重要な新しい技術は外科治療におい
て発展している。特に、バルーンカテーテルを用いる
血管形成手段および最近のレーザーは、冠バイパス外科
治療が確実でなく、かつひどくない症状の患者、また一
般条件が主な外科治療に望ましくない患者の治療に適し
ている。

しかしながら、通常の外科または血管形成手段である
主な血管のすべての手技は、動脈の再狭窄を導びく内膜
過形成をよく起すことから障害となる、例えば、サルグ
レンの病院（sahlgren′s Hospital），スウェーデン、
イェーテボリーにおける、経皮トランスルミナル冠血管
形成症にかかっている患者のすべての内の約30％が虚血
性症状を起す内膜病変（intimal lesions）を引き起し
ている。

また、この問題は通常の脈管外科治療後にも観察され
ている。下肢に血液を供給する動脈の再形成手術では、
すべての場合の50％が内膜病変により虚血性症状を再発
している（ラザフォードＲ（編集）「Vascular Surger
y」Ch.58,第２版、サウンダース（1984）参照）。同様
に、頚動脈血管内膜切除を受けた患者のすべての内ち約
20％が内膜過形成を引き起している。同様の結果は二三
の他の治療センターから報告されている。また、内膜過
形成は冠バイパス手術に関連して、しばしば観察されて
いる。それ故、今日において、手術後および「血管形成
後（postangioplastic）」内膜過形成は、臨床心臓病
学、心臓手術および脈管手術において主問題とされてい
る。

例えば、狭心症の多く患者は血管形成手術を繰返し受
けており、結局、冠バイパス手術が行われている。内膜
過形成の発生を回避できる場合には、患者を苦痛および
悩みから開放してやることができ、また実質的に治療費
を軽減することができる。

内膜細胞増殖による機構は脈管生物学者によって非常
に注意深く研究されている。動脈に対する機械的障害は
内側平滑筋細胞を内膜に移行することは知られている。
一旦、内膜において、細胞が増殖を始め、何ケ月か持続
する内膜病変を形成する（シュワルツSM,カンプベルGR
およびカンプベルJH氏「Circ Res」58:427（1986）参
照）。表面の再内皮化は病変の退行について重要である
と思われ、内皮下構造に対する損傷の割合は病変の進行
について大切である。

脈管平滑筋細胞の増殖は、おそらく、インスリンのよ
うな血液に循環するか、または小板−誘導成長ファクタ
ーのような細胞から開放するかによる成長ファクターで
制御することができる。後述するファクターは巨核球に
よるばかりでなく、単球および内皮細胞によって合成さ
れる（ロスＲ氏「New Engl J Med」314:488（1986）お
よびロスＲ氏、レインスEWボーウェン−ホップDF氏「Ce
ll」46:155〜169（1986）参照）、この事は炎症性細胞
が管壁の成長調整に関係することを示している。

平滑筋細胞についての成長抑制ファクターについては
あまり知られていない。ヘパリンの薬理学的に投与は平
滑筋増殖を抑制し（クローエスAWおよびカルノブスキー
MJ氏「Nature」265:625（1977）参照）、この事は内因
性ヘパリン−様物質が生理学的生成制御に影響を与える
ことを示している。しかしながら、血管形成および外科
的処置を受けたすべての患者がヘパリン治療を受けてい
るが、有意な内膜狭窄を引き起している。

細胞タイプ−特異的モノクロナール抗体を用いる最近
の免疫細胞化学研究では、単球−誘導マクロファージが
アテローム性動脈硬化斑に多量に存在することを報告し
ている（ベデラーCA,ナイランドＨおよびマトラーＲ
氏：早期ヒトアテローム性動脈硬化病変における泡沫細
胞のlnSitu特性「Acta Pathol Microbiol Immunol Scan
d（Ｃ）」92:133〜137（1984）、およびアクエルNM,バ
ルRY,ワルドマンＨおよびミッチンソンMJ氏：ヒトア
テローム性動脈硬化斑における泡沫細胞の単球源、「At
herosclerosis」53:265〜271（1984）、およびジョナソ
ンL,ホルムJ,スカリーO,ボンジェルスＧおよびハンソン
GK氏：ヒトアテローム性動脈硬化斑におけるＴ−細
胞、マクロファージおよび平滑筋細胞の局部蓄積、「At
herosclero−sis」6:131〜140（1986）、およびガウンA
M、ツカダＴおよびロスＲ氏：ヒトアテローム性動脈
硬化II、ヒトアテローム性動脈硬化病変の細胞組成の
免疫細胞化学分析「Am J Pathol」125;191〜207（198
6）参照）。しかしながら、これらの研究は、病的環境
における動脈壁に見出すことのできる唯一の血球−骨細
胞についてではない。Ｔ−リンパ球はヒトアテローム
性動脈硬化斑の線維性キャップにおける細胞集団の５分
１を構成しており（ジョナソン氏ほか「Atheroscle ros
is」6131〜140（1986）参照）、およびまた脈管損傷の
実験的モデムにおいて観察することができる（ジョナソ
ンＬ、ホルムＪおよびハンソンGK氏：平滑筋細胞の損傷
に対する動脈応答中のIa抗原発現、「Lab Invest」58:3
10〜315（1988）。

免疫細胞化学データは、Ｔ−リンパ球が平滑筋細胞の
成長特性および他の機能を調整できることを示してい
る。Ｔ−リンパ球に富んだアテローム性動脈硬化斑にお
いて、多くの平滑筋細胞はクラスII主組織適合性複合抗
原（Ia抗原）を発現する。他方において、平滑筋細胞は
非アテローム性動脈硬化、正常動脈におけるIa抗原に欠
乏している（ジョナンソンL,ホルムJ,スカリーO,ガビア
ニーＧおよびハンソンGK氏：ヒトアテローム性動脈硬
化における脈管平滑筋細胞のクラスII移植抗原の形質発
現、「J Clin Invest」76:125〜131（1985）、およびハ
ンソンGK,ジョナソンL,ホルムＪおよびクラエソン−ウ
ェルシＬ氏：アテローム性動脈硬化斑におけるクラスII
MHC抗原形質発現；平滑筋細胞のHLA−DR,HLA;DQおよび
不変γ鎖の発現、「Clin exp Immunol」64:261〜268（1
986）参照）。Ia抗原はラットの損傷に対する動脈応答
中、平滑筋細胞に発生するが、しかもIa抗原と脈管狭窄
との関係を示すまたは暗示する研究はこれまでは存在し
ていない。

こられの抗原はＴリンパ球に対する外来抗原の表示に
おいて基本的役割を演ずる。マクロファージ、内皮細胞
および二三の他の細胞タイプによるこれら抗原の形質発
現は活性化Ｔリンパ球により分泌されるγ−イナターフ
ェロンによって誘導される（ポベルJS,ギムブロンMA,コ
トランRS,レイスCS,ブラコオフSJ,フィエルスＷおよび
アウルトKA氏；活性化Ｔ細胞によりおよびヒトγ−イン
ターフェロンにより誘導できる脈管内皮によるIa形質発
現、「J Exp Med」157:1139〜1353（1983）、およびウ
ナヌエERおよびアレンPM氏：非リンパ球におけるIa形質
発現の研究結果についてのコメント、「Lab Invest」5
5:123〜125（1986）参照）。

白血球、繊維芽細胞および他の細胞タイプにより生ず
るα−およびβ−タイプインターフェロンはある種の
細胞タイプの増殖を抑制することが知られている。γ−
インターフェロンは活性化Ｔリンパ球により釈放され、
またコンディションドメディウムまたは製剤を乳腺細
胞および繊維芽細胞のような種々のタイプの培養細胞に
加える場合には、増殖を抑制することが知られている
（ルビンBYおよびグフタSL氏：抗ウィルス剤および抗増
殖剤としてのヒトタイプＩおよびタイプIIインターフ
ェロンの識別効力、「Proc Natl Acad Sci USA」77:592
8〜5932（1980）、およびブラロックJE,ゲオルジアデス
JA,ラングフォールドNFおよびヨハンソンHM氏：繊維芽
細胞または白血球インターフェロンより強い抗細胞活性
を有する精製ヒト免疫インターフェロン、「Cell Immun
ol」49:390〜401（1980）、およびワッヒルSMおよびガ
ルテリィCL氏：ヒトＴ細胞および連続Ｔ細胞系源のリン
ホカインによる繊維芽細胞成長の調整、「J Immunol」1
30:1226〜1230（1983）参照）。しかしながら、この効
果はγ−インターフェロンそれ自体の抑制効果より、む
しろリンフォトキシン（腫瘍壊死因子）による製剤の汚
染によるかどうかが問題とされている。

要約すると、脈管狭窄および関連する障害を平滑筋細
胞の成長を抑制する製剤の使用によって治療できるので
有益である。

発明の簡単な説明本発明において、γ−インターフェロンが内膜病変お
よびアテローム性動脈硬化における平滑筋細胞について
の重要な成長抑制剤であることを見出したことは驚くべ
きことであり、この事が本発明の基礎をなすものであ
る。

本発明の視点の一つは、治療効果を生み出すのに十分
な量のγ−インターヘロンを含有することを特徴とする
脈管狭窄治療用医薬組成物を提供することにある。

本発明の脈管狭窄治療用医薬組成物は、血管細胞の成
長あるいは拡散活動によって引き起こされた脈管狭窄に
対し有効な治療効果を示す。また、本発明の脈管狭窄治
療用医薬組成物は、閉塞性の動脈硬化を治療することに
伴う再狭窄に対して有効な治療効果を示す。さらに、本
発明の脈管狭窄治療用医薬組成物は、上記動脈硬化が脈
管手術及び／または血管形成に伴って引き起こされた場
合に有効な治療効果を示す。

本発明のこの観点の１例においては、脈管狭窄の治療
を動脈狭窄または閉塞の治療による再狭窄の治療に適用
する。

本発明のこの観点の好適例においては、脈管狭窄の治
療を血管形成および／または脈管手術による動脈狭窄治
療に適用する。

使用するγ−インターフェロン源は臨界的でなく、合
成、天然または組換えDNA技術により作られた組換えγ
−インターフェロンを用いることができる。

本発明の製剤は患者に非経口投与、すなわち、皮下、
静脈または筋肉注射によって投与するのが好ましい。

希釈薬および賦形剤を、一般に製薬、例えば生理食塩
水に用いることができる。

図面の簡単な説明第１図は培養平滑筋細胞増殖におけるγ−インターフ
ェロンの種々の濃度の効果を示すグラフである。

第２図は平滑筋細胞培養における成長の誘導について
のγ−インターフェロンの種々の濃度の効果を示すグラ
フである。

第３図は平滑筋細胞周期のG₁相の持続を示すグラフで
ある。

第４図は平滑筋細胞周期の初期相での平滑筋細胞複製
におけるγ−インターフェロンの効果を示すグラフであ
る。

第５図は異なるγ−インターフェロン濃度において平
滑筋細胞におけるＩ−Ａ形質発現でのγ−インターフェ
ロンの効果を示すグラフである。

第６図は平滑筋細胞におけるＩ−Ａ形質発現でのγ−
インターフェロンの時間に対する効果を示すグラフであ
る。

第７図は平滑筋細胞増殖の抑制に用いられたγ−イン
ターフェロン製剤におけるエンドトキシン汚染の欠乏を
示すグラフである。

第８図はＩ−Ａ発現平滑筋細胞およびＩ−Ａネガティ
ブ平滑筋細胞のそれぞれの複製の程度を示すダイヤグラ
ムである。

発明の詳細な説明培養動脈平滑筋細胞における組換えγ−インターフェ
ロン効果を研究し、このリンホカインが細胞増殖を抑制
することを確めた。この効果はIa抗原の誘導に対応す
る。それ故、Ia形質発現および細胞複製をバルーンド
（ballooned）ラット頚動脈における損傷に対する動脈
応答について研究した。Ia形質発現と増殖の欠乏との相
関関係を得た。

研究を行い、アテローム性動脈硬化斑を形成する細胞
集団を同定した。それ故、細胞タイプ−特異抗原に対す
るモノクロナール抗体を血管内膜切除被検物のセクショ
ンに適用した。脂質に富んだコア部位における多くの細
胞は抗体によりマクロファージ抗原を染色するのを確
め、繊維状キャップの細胞の多くが、しばしば抗平滑筋
抗体によって染色された（ジョナソンL,ホルムJ,スカリ
ーO,ボンドジエルスＧおよびハンソンGK氏「Arterioscl
erosis」6:131（1986）参照）。更に、驚くべきこと
は、特に繊維状キャップに実質的量のＴリンパ球を観察
したことである。これらの多くを活性化の符号、すなわ
ち、HLA−DR、VLA−１およびインターロイキン−２受容
体の形質発現を示した（ジョナソンL,ホルムJ,スカリー
O,ガビアニＧおよびハンソンGK氏「J Clin Invest」76:
125（1985）、およびハンソンGK,ジョナソンL,ホルムＪ
およびクラエソン−ウエルシＬ氏「Clin exp Immunol」
64:261（1986）参照）。

これらのＴ細胞に富んだ区域における多くの平滑筋細
胞はHLA−DR（Ia抗原）を発現し、これに対してこの抗
原は正常動脈壁の平滑筋細胞においていまだかって見出
されていない。HLA−DR形質発現はγ−インターフェロ
ンの釈放を介して活性化Ｔ細胞によって誘導される（ポ
ベルJS氏ほか「Nature」305:726（1983）、およびウナ
ヌエERおよびアレンPM氏「Lab Invest」55:123（1983）
参照）。それ故、アテローム性動脈硬化における研究結
果は、γ−インターフェロンがアテローム性動脈硬化斑
における遺伝子発現のパラクリニア調整に含まれること
を示している。アテローム性動脈硬化斑におけるγ−イ
ンターフェロンの存在についての直接免疫組織化学的証
明は最近、得られている。

実験的手段実験動物モデルを動脈平滑筋増殖および遺伝子発現を
調整するＴ白血球の役割についての分析に用いた。この
目的のために、バウムガートナー氏により開発され、か
つクローウスおよびレイディ氏により改良されたバルー
ンカテーテルモデルを適用した。内膜病変をラット
頚動脈にフォガーティバルーンカテーテルにより誘
導し、白血球およびIa抗原の発現の異なるタイプの浸潤
を損傷後、異なる時点で免疫組織化学により分析した。

少量であるが、しかし有意量のＴ細胞増殖を２週間に
わたって確め、内膜における平滑筋細胞がIa抗原の発現
し始めるのを確めた。試験管内で、Ia形質発現は組換え
γ−インターフェロンによって誘導することができた。
これらの研究結果は、γ−インターフェロンが釈放し、
内膜病変において平滑筋遺伝子発現に影響を及ぼすこと
を示している。

試験管内で、γ−インターフェロン平滑筋細胞増殖の
効果的な抑制剤であり、これが損傷後、内膜病変におい
て平滑筋増殖の内因性抑制剤として作用するものと思わ
れる。

この仮説についての間接的支持と病変における平滑筋
細胞複製の分析によって得られた。Iaポジティブ平滑筋
細胞が損傷後14日目において24時間パルス中に³Hチミジ
ンを吸収しないことを確かめた。

他の組の実験において、すべての複製平滑筋細胞をバ
ルーニング（ballooning）時に導入された浸透圧ポンプ
を介して³Hチミジンで標識付けした。³Hオートラジオグ
ラフィーおよびIaについての免疫組織化学染色の組合せ
によって、犠牲時において、すなわちバルーニング後14
日目においてIaを発現した細胞がIa−ネガティブ平滑筋
細胞により有意に少ないサイクルの複製を受けることを
確かめた。この事は、γ−インターフェロンが内膜過形
成における平滑筋細胞複製の内因性抑制剤であることを
確認している。これらの結果は、損傷に対する動脈応答
における非経口的投与によるγ−インターフェロンの効
果を試験する研究継続によって確かめた。

材料および方法細胞培養ラット大動脈平滑筋細胞（SMC_s）を200g雄のスプラギ
ューダウレイ（spraque−Dawley）ラットからコラゲナ
ーゼ消化により分離し、ウシ胎児血清（FCS）、100単位
/mlペニシリンＧ、100μg/mlストレプトマイシンおよび
50μg/mlアスコルビン酸で補充したRPMI−1640培地で成
長させた。1/3〜1/5部の細胞を実験に用い、これらの細
胞を成長分析のために96−ウエル微量滴定プレート（Nu
nc,Roskilde,デンマーク）に、またはDNA合成の分析の
ために10cm²ペストリー皿に入れた。

成長分析 SMC_sを指数関数的に成長させるか、または0.5％FCSに
おける血清飢餓（serum staruation）の48時間後10％FC
Sの添加による細胞サイクルのギャップ１（G₁）相を導
入するように誘導した。培養物を、培地を10％FCSと共
に加えた組換えマウスγ−インターフェロン（Genentec
h.,カリフォルニア州、南サンフランシスコ）にさらし
た。

種々の時間において、培養物を0.1M酢酸緩衝液、pH3.
1中に４％ホルムアルデヒドで固定し、アミドブラック
Ｂと温置して細胞蛋白質を染色させた。非結合染料を蒸
留水でゆすぎ落とし、染料吸収量をEIA微量滴定光度計
において620nmで調べた。細胞当りに結合した染料を培
養物当りの染料吸収度（A₆₂₀単位）を培養物当りの細胞
数で割って計算し、更に平衡培養物におけるトリプシン
処理した細胞の血球係数器で測定した。こられの培養物
における細胞当たりの染料吸収度が極めて小さい変動性
（＜２％）であったことから、細胞数は与えられた培養
物のA₆₂₀吸収度をA₆₂₀／細胞係数で割って評価すること
ができた。この場合、γ−インターフェロン処理培養物
と未処理培養物との間のA₆₂₀／細胞における有意な差は
なかった。細胞数を測定するための微視的カウンテング
と染料結合分析との間に相関関係は優れていた（ｒ＝0.
98）。

DNA合成 DNA合成をレインスおよびロス氏により記載されるよ
うに調べた。簡単に、SMCを上述するようにしてキャッ
プ０相（G₀）に同期し、次いでγ−インターフェロンの
存在で、または不存在で血清の添加後、同時にまたは異
なる時間において10％FCSを添加して細胞周期を導入す
るように誘導した。³H−チミジン（10μCiー10cm²ウエ
ル（well）をPCSと共に加え、細胞を24時間でトリプシ
ン処理により採取した。これらを0.22−μｍ微細孔フィ
ルター（Bedford,マサチューセッツ州）上に集め、トリ
クロロ酢酸−不溶性放射能をインスターゲルI^R（Indta
−gel 1）に可溶化後、シンチレーションカウンター
で分析した。

Ia形質発現の酵素結合イムノアッセイ 96−ウエル微量滴定プレート（ヌンシ（Nunc））にお
けるSMCを以下に記載するようにγ−インターフェロン
にさらした。細胞をPBS（リン酸緩衝食塩水、150mM NaC
l,15mMリン酸緩衝液、pH7.2）で３回ゆすぎ、100mMリン
酸ナトリウム緩衝液、pH7.2中１％ホルムアルデヒドで
４℃15分間にわたって固定した。これをPBSで３回ゆす
ぎ、0.1ウシ血清アルブミンを含むPBS（BSA;RIA等級、
シグマケミカル（Sigma Chemical,ミズーリ，セント
ルイス）中100mMグリシンと37℃30分間にわたって反応
させた。細胞をPBS中でゆすいだ後、細胞を0.1％BSA含
有PBS中0.5％標準ウマ血清と37℃で60分間にわたって予
備温置し、0.05％トゥイーン20を含有するPBSで３回ゆ
すぎ、次いでモルクロナール抗体０×６および０×17
（Seralab,Crawle Down,英国、サセックス）で温置し、
チェケルボード滴定（checkerboardtitration）によっ
て定めた最適な希釈で、37℃60分にわたってＩ−Ａおよ
びＩ−Ｅ抗原のそれぞれを検出した。過剰の抗体をPBS/
トィイーンで３回ゆすいで洗い落し、細胞をPBS/BSAに
1:1000の割合に希釈したアルカリ性ホスファターゼ−標
識、アフィニティー精製ヤギアンチ−マウス免疫グロ
ブリンＧ抗体（Jackson Lab,ペンシルヴェニア州アボン
ダレ）と30分間にわたって温置した。PBS/トゥイーン洗
浄後、被検物を10％ジエタノールアミン、0.5mM MgCl₂
に1mg/ml p−ニトロフェニルホスフェート基質を含有
する基質溶液、pH9.8中37℃で60分間にわたって温置し
た。反応を2MNaOHの添加により停止し、405における吸
光度を微量滴定光度計で調べた。

動物実験Ｉ 15年５ケ月生育したスプラギュー−ダウレイラット
を上述するように頚動脈損傷させた。簡単に、麻酔した
ラットを左外側頚動脈を介してフォガーティ2Pバルーン
カテーテルでカテーテル処理した。バルーンを共通頚
動脈の最も近い部分において膨脹し、カテーテル頚動脈
分岐点の方向に後退させた。この処理を３回繰返し、次
いでカテーテルを除去し、外側頚動脈および表在損傷を
閉じた。この処理によって、損傷区域のすべての内皮細
胞を除去し、かつ内側平滑筋細胞が幾分、失うのを確か
めた。³H−チミジン（6.7Ci/mモル;New England Nuclea
r,マサチューセッツ州ボストン）を、５匹のラットに手
術日から腹腔内浸透ミニポンプを介して連続的に注射し
た（クローエスAWおよびシュワルツSM:損傷ラット頚動
脈における静止平滑筋移動の重要性「Cire Res」56:139
〜145（1985）参照）。他の10匹のラットに、４日間に
おいて24時間中３回にわたって³H−チミジンを注射した
（ジョナンソンL,ホルムJ,ハンソンGK:損傷に対する動
脈応答中Ia抗体を発現する平滑筋細胞「Lab Invest」5
8:310〜315（1988）参照）。

手術後14日にして、ラットを麻酔し、頚動脈にリン酸
緩衝液、pH7.2中１％ホルムアルデヒドを潅流して固定
した。損傷させた左側および損傷させない右側の頚動脈
を含むセグメントを液体窒素中でスナップ凍結し（snsp
−frozen）、８μｍセクションを低温槽ミクロトームに
おいてカットした。Ia抗原Ｉ−Ａを、マウスアンチ−
ラットモノクロナール抗体０×６で、次いでビオチニ
ル処理した（biotinylated）ウマアンチ−マウス免疫
グロブリンＧおよびビオチン−アルカリ性ホスファター
ゼ複合物（Victor,カリフォルニア州バーリンガム）で
温置して明視化した。次いで、セクションをホルムアル
デヒドに固定し、NTB 2ニュークリアトラックエマ
ルジョン（Kodak,ニューヨーク州ロチェスター）に浸し
た。これらのセクションを２週間後展開し、ヘマトキシ
リンで染色し、光学顕微鏡で検査した。各動物につい
て、200個の細胞を内膜肥厚（intimal thick ening）の
相当する区域において数え、およびIa−ポジティブおよ
び³H−チミジン−ポジティブ細胞を定めた。

手段をスチュデンツｔテスト（Students′t test）と
比較した；多比較の場合、シェフツコレクション（Sc
heffe s′ corrction）をアルミテージ（Armitage）氏
により記載されているように用いた（アルミテージＰ
氏；医学研究における統系的方法、英国オックスフォー
ド、ブラックウェル出版（1971）参照）。差異はＰ＜0.
05において有意のように考えられた。回帰線を最小−ス
クエア法（least−squares method）により適合させ
た。

結果指数関数的に成長するラット平滑筋細胞の増殖は培養
基に組換えγ−インターフェロンを存在することによっ
て抑制できた。第１図は、平滑筋細胞増殖はγ−インタ
ーフェロンによって抑制することを示している。96−ウ
エル微量滴定プレートにおける指数関数的に成長する動
脈平滑筋細胞を培養基において異なる投与量の組換えマ
ウスγ−インターフェロン（γ−IFN）にさらした。A,
B,C,DおよびＥは0,1,10,15および100のそれぞれの単位
（ｕ）/mlのγ−インターフェロンの濃度に相当させ
た。有意な抑制を処理後４日目において10単位/mlで、
およびインターフェロン添加後２日目で50または100単
位/mlで得た。平坦域に達した場合には、50単位/mlま
で、γ−インターフェロン投与と増殖抑制との間に投与
−応答関係が存在した。

成長抑制は、先ず細胞が血清飢餓により成長抑制さ
れ、次いでFCS添加により細胞周期が導入される場合
に、極めて著しかった。この事を第２図に示しており、
同期した平滑筋培地における成長誘導がγ−インターフ
ェロンによって抑制されていることを示している。A,B,
C,DおよびＥを第１図のＡ〜Ｅと同じγ−インターフェ
ロン濃度に相当させた。この場合、培地における10単位
/mlγ−インターフェロンが50％成長抑制を得、有意な
抑制が９日間さらした後１単位/mlのように少量で得
た。有意な抑制は10単位/mlで４日後に得られ、最大抑
制は50単位/mlで達成した。

また、平滑筋細胞複製におけるγ−インターフェロン
の効果は、細胞周期中および細胞周期に導入後、同期細
胞によって吸収される³H−チミジンの分析によって評価
した。先ず、細胞周期のG₁相の持続を調べた。10cm²ペ
トリ皿中の細胞を血清飢餓によって阻止し、次いで10％
ウシ胎児血清の添加により０時間で細胞周期を導入され
るように誘導した。³H−チミジンをウシ胎児血清と一緒
に加え、細胞を異なる時点で採取し、トリクロロ酢酸不
溶性放射能を三重培養物（triplicatecultures）のシン
チレーションカウンターにより調べた。血清添加から
³H−チミジン吸収の開始にわたる時間を調べた（すなわ
ち、第３図の曲線の彎曲点）。G₁相は約20時間であっ
た。

第４図は、γ−インターフェロンを血清と一緒に添加
した場合、³H−チミジンの吸収が70％まで減少すること
を示している。γ−インターフェロンは細胞周期の初期
G₁において作用することによって平滑筋細胞複製を抑制
する。10cm²ペトリ皿中の細胞を成長阻止し、次いでFCS
の添加により細胞周期に入るように誘導した。次いで細
胞を³H−チミジンに連続的にさらした。γ−インターフ
ェロンをFCSと共に、または3,6、9,12または15時間後に
加えた。すべての細胞を24時間で採取し、トリクロロ酢
酸不溶性放射能を四重培養物のシンチレーションカウ
タンーにより調べた。ｘ軸はFCSの添加からγ−インタ
ーフェロンの添加にわたる時間を示しており、「０時
間」はFCSおよびγ−インターフェロンを同時に受け入
れた培養物を示し、「15時間」はウシ胎児血清の添加後
15時間においてγ−インターフェロンを受け入れた培養
物を示している。ｙ−軸において、100％はγ−インタ
ーフェロンにさらさない培養物における³H−放射能を示
しており、γ−インターフェロン処理培養物における放
射能をこの値の百分率で与える（平均値±SD）。しかし
ながら、γ−インターフェロンの添加を血清添加後９時
間以上遅らせた場合には、抑制は得られなかった（第４
図参照）。それ故、データは、γ−インターフェロンが
G₀からG₁の変異、または脈管平滑筋細胞における細胞周
期のG₁相中の初期を阻止することによって作用すること
を示している。

γ−インターフェロンは内皮細胞および繊維芽細胞を
含む標的細胞の変種によるIa抗原の形質発現を誘発す
る。アテローム性動脈硬化動脈における平滑筋細胞はこ
れらの抗原を発現するのに観察されており（ジョナソン
L,ホルムJ,スカリO,カビアニＧおよびハンソンGK氏：ヒ
トアテローム性動脈硬化における脈管平滑筋細胞での
クラスII移植抗原の形質発現「J Clin Invest」76:125
〜131（1985））、アテローム性動脈硬化斑における活
性化Ｔリンパ球の存在は、Ｔリンパ球から釈放されたγ
−インターフェロンがこの抗原の形質発現を誘導するこ
とを示している（ジョナソンL,ホルムJ,スカリO,カビア
ニＧおよびハンソンGK氏：ヒトアテローム性動脈硬化
における脈管平滑筋細胞でのクラスII移植抗原の形質発
現「J Clin Inbest」76:125〜131（1985）、およびハン
ソンGK、ジョナソンL,ホルムＪおよびクラソン−ウエル
シＬ氏；アテローム性動脈硬化斑におけるクラスII MHC
抗原形質発現；平滑筋細胞がHLA−DR,HLA−DQおよび不
変のγ−鎖を発現する、「Clin Exp Immunol」64;261〜
268（1986）参照）。この可能性については培養平滑筋
細胞をγ−インターフェロンにさらすことによって試験
した。

第５図は、γ−インターフェロン（γ−IFN）が投与
量−依存手段での平滑筋細胞における細胞表面Ｉ−Ａ形
質発現を誘導することを示している。96−ウエル微量滴
定プレートにおける細胞を組換えマウスγ−インターフ
ェロンにより種々の濃度で３日間にわたって処理し、次
いで酵素結合イムノアッセイ技術によりＩ−Ａ形質発現
について検定した。細胞当りのＩ−Ａ形質発現を、各培
養物における全Ｉ−Ａ値（405nmにおける吸光度）を染
料結合により測定された培養物当りの細胞数で割って計
算した。培養物の平均（ｎ＝16）を示し、変動係数（va
riation coefficients）は常に２％以下とした。

第６図は、平滑筋Ｉ−Ａ形質発現を誘導するγ−イン
ターフェロンの時間経過状態を示している。96−ウエル
微量滴定プレートにおける細胞（ｎ＝16）をγ−インタ
ーフェロン（γ−IFN微量:100単位/ml）で処理し、γ−
インターフェロン（Ａ）添加後、種々の時点での酵素結
合イムノアッセイによって分析した。細胞当りのＩ−Ａ
形質発現を、ウエル当りのＩ−Ａ形質発現（A₄₀₅単位）
をウエル当りの細胞数で割って定めた。対照値（Ｂ）は
非模擬細胞（unsimnlated cells）から誘導した。標準
偏差は平均の２％以下であった。誘導はγ−インターフ
ェロンにさらした40時間後に検出でき、平坦域は60時間
の刺激後に達成した。Ｉ−Ａ形質発現の誘導のタイム
フレームはγ−インターフェロンにより誘導された成長
抑制に明らかに近似した。

第７図、成長およびＩ−Ａ形質発現におけるγ−イン
ターフェロンの効果がエンドトキシン汚染によらないこ
とを示している。この事はポリミキシンＢをγ−インタ
ーフェロンと共に添加することによりエンドトキシン抑
制が結果に影響を及ぼさないためである。成長−同期細
胞は種々の濃度における組換えγ−インターフェロンに
よって、およびポリミキシンＢの添加（50μg/ml）
（Ｂ）または添加しない（Ａ）で影響される。96−ウエ
ル微量滴定斑における16個の平行培養物の平均を示して
おり、変動係数を常に２％以下にした。P_mはポリミキシ
ンＢと称する。マウスγ−インターフェロンにより得ら
れた成長およびIa形質発現における効果（Genetechによ
り得られた）は組換えラットγ−インターフェロンによ
り得られた効果（Holland Biotechnologyにより得られ
た）と同一であった。これに対して、ヒトγ−インター
フェロンはラット細胞におけるIa形質発現を誘導しなか
った。

同時にγ−インターフェロンの試験管内での観察は細
胞増殖の抑制を誘導し、Ｉ−Ａ抗原の形質発現は成長抑
制およびＩ−Ａ形質発現が生体内での現像と関係すると
いう仮定の試験を助長する。それ故、ラット頚動脈にお
ける平滑筋増殖はバルーンカテーテル損傷によって誘
導し、損傷時からのすべての複製細胞を浸透ポンプを介
して連続的に受ける³H−チミジンで標識付けした。細胞
複製およびＩ−Ａ形質発現を、内膜肥厚を達成し、しか
も増殖がまた続いた場合に、損傷後14日で分析した。結
果を表１に示す。

内膜平滑筋細胞のうち、81.9％は細胞複製の少なくと
も１サイクルを通じて生じたことを示す³H−チミジンで
あった。免疫組織化学により検出できるＩ−Ａは細胞の
10.9％で発現した。また、大部分の全内膜平滑筋細胞は
³H−チミジンにより標識付けされ、Ｉ−Ａポジティブ細
胞の８分の１だけが³H−チミジンポジティブであっ
た。³H−チミジン−ネガティブ平滑筋細胞のうち、半分
以上がＩ−Ａポジティブであった。

また、DNA複製とＩ−Ａ形質発現との相関関係は動物
を殺す直前、24時間³H−チミジンを注射することによっ
て、手術から14日中に分析した。この場合、25.5％の細
胞が³H−チミジンポジティブであったが、しかしこれ
らの細胞はなにもＩ−Ａを発現しなかった。これらの結
果を表IIに示す。

DNA複製とＩ−Ａ形質発現との間の逆相関関係は、Ｉ
−Ａ形質発現を誘導する機構が増殖を抑制することを示
している。この考察は、14日浸透ポンプで標識付けした
ラットから得たオートラジオグラフィー分析によって支
持した。第８図は、Ｉ−Ａ形質発現平滑筋細胞が、損傷
についての応答中、ネオインチマ（neointima）におけ
るＩ−Ａネガティブ形質発現平滑筋細胞より僅かに複製
されることを示している。動脈損傷はラットの頸動脈バ
ルーニングによって加えられ、複製細胞は14日にわたる
浸透ポンプを介して連続的に注入する³H−チミジンによ
って標識付けした。Ｉ−Ａ形質発現は同じセクションの
免疫組織化学およびオートラジオグラフィーによる³H−
チミジン吸収によって調べた。Ｉ−Ａポジティブ及びＩ
−Ａネガティブ細胞における銀粒子の数は４種の病変に
おいて数えた（病変当りの50個のＩ−Ａポジティブおよ
び50個のＩ−Ａネガティブ細胞）。動物間には有意な差
がなかったので、すべての５種の病変からのデータは統
計的分析にプールした。Ｉ−Ａポジティブ細胞とＩ−Ａ
ネガティブ細胞間における銀粒子の差はＰ＜0.01で異な
り、平均±SDを図面に示している。細胞の³H−チミジン
標識増殖集団において、該当りの銀粒子の平均数は、Ｉ
−Ａポジティブ細胞と比較した場合に、Ｉ−Ａネガティ
ブ細胞におけるより約２倍高かった。多くの³H−チミジ
ンは各付加増殖により細胞に蓄積すると予想されてお
り、細胞当りの粒子数は明らかに細胞当りの放射能に関
係する。それ故、Ｉ−Ａポジティブ平滑筋細胞とＩ−Ａ
ネガティブ平滑筋細胞との間の差は、Ｉ−Ａポジティブ
細胞がＩ−Ａを発現しない平滑筋細胞よりDNA合成の少
数サイクルで生ずることである（このタイプの合成につ
いて討議するため；クローエスAWおよびシュワルツSM
氏：損傷頸動脈における平滑筋移行の重要性Circ Res」
56:139〜145（1985）。

動物実験II ８匹の雄スプラギュー−ダウレイラットを含む生体
内実験パイロットを行った。内膜病変を上述するように
フォガーティ2Pバルーンカテーテルによって普通頸動
脈に加えた。４匹のラットには、組換えラットγ−イン
ターフェロンを７日間にわたり１日に200,000U.s.cで与
え、他の４匹のラットには同量の賦形薬（塩化ナトリウ
ム溶液）を注射した。

すべてのラットをバルーニング後14日目に犠牲にし、
１％パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液を注いで
固定した。処理（左）および未処理（右）頸動脈をOCT
培地に埋置し、ｎ−ヘキサン／液体窒素中でスナップ凍
結した。10μｍクリオスタットセクションを100μｍ
ごとにカットし、ネオインチマで占める区域をポイント
−サンプリング法を用いる形態計測により調べた。結果
を表IIIに示す。

γ−インターフェロンによる処理は内膜肥厚の進展を
有意に抑制することを示しており、この抑制がγインタ
ーフェロン処理中止後、１週間持続することは注目すべ
きことである。この事は、内側細胞が損傷後、臨界的な
時点において複製および移行するという仮説を支持す
る。この時点における増殖の抑制は病変の大きさを持続
的に減少するように思われる。

上述する実験は、明らかに、平滑筋細胞複製における
γ−インターフェロンの抑制作用を示している。

このように、γ−インターフェロンは、例えば内膜過
形成により生ずる脈管狭窄の治療に、および好適例にお
いて脈管手術および／または血管形成による動脈狭窄の
治療に用いることができる。γ−インターフェロンは治
療効果を生ずるのに十分な量でかかるγ−インターフェ
ロンを含有する薬剤を患者に投与する必要がある。特定
の場合において要求される実際の投与量および治療時間
は医師によって定めることができる。投与量は標的細
胞、例えば表皮ケラチン細胞にクラスII−MHC抗原の形
質発現を誘導するのに十分な量にする必要がある。

γ−インターフェロンとは、欧州公開特許出願明細書
第77670号に記載されているように生（native）γ−イ
ンターフェロンのセクションを有するポリペプチド、お
よびここに記載する方法により狭窄を抑制することので
きるすべてのアミノ酸配列またはその他のの変異体、ま
たは他の動物からの細胞を用いる類似体を意味する。か
かる変異体としては、アミノ酸残基を除去、挿入または
置換する特定部位の突然変異誘発の体位遺伝子または生
成物を例示できる（例えば、欧州公開特許明細書第1463
54号参照）。獣医学治療の場合、γ−インターフェロン
は治療すべき動物の種類に一致させて、または作用する
ように用いる。ヒト治療においては、欧州特許出願明細
書（EP）77670号に示されている配列のdesCysTyrCys変
異体の必要があり、必要に応じて最後の４つの残基を翻
訳プロセシングにおいて除去するＣ−末端変異体を用い
ることができる。生配列を利用するγ−インターフェロ
ンは既知方法を用いる自然源から精製により得ることが
できる。同じ分子またはその変異体は既知方法により組
換え源（recombinant sources）から得ることができ
る。

代表的な調剤はpH5.0で注射/mlにおいてγ−インター
フェロン（20×10fb）1.0または0.2mg/ml、コハク酸0.2
7mg/ml、コハク酸二ナトリウム六水和物0.73mg/ml,マン
ニトール40mg/ml、ポリソルベート20 0.1mg/mlまたは
（qs ts）水1gを含有する。この水性調剤は臨床により
定められるように、ヒトにおいて最大致死量以下の治療
投与量で投与す。また、γ−インターフェロンは再構成
凍結乾燥調剤から投与することができる。

γ−インターフェロンは、内膜損傷部位に治療投与量
で任意の普通の投与経路で、例えば静脈内または肺内経
路で投与することができる。投与は治療レベルを維持す
るのに十分に連続注入または丸薬投与することができ
る。γ−インターフェロンは、必要に応じて狭窄を生ず
る過程において少なくとも使用し、しかる後に脈管構造
を適当に治療するのに十分は時間にわたって継続使用す
ることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ヨナソンレナスウェーデン国エス―575 33 エクショグレナガータン８ (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 38/21 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】治療効果を生み出すのに十分な量のγ−イ
ンターヘロンを含有することを特徴とする脈管狭窄治療
用医薬組成物。
【請求項２】前記脈管狭窄が血管細胞の成長あるいは拡
散活動によって引き起こされた請求項１に記載した脈管
狭窄治療用医薬組成物。
【請求項３】前記脈管狭窄が閉塞性の動脈硬化を治療す
ることに伴う再狭窄である請求項２に記載した脈管狭窄
治療用医薬組成物。
【請求項４】前記再狭窄が脈管手術及び／または血管形
成に伴う動脈硬化である請求項３に記載した脈管狭窄治
療用医薬組成物。