JP2899415B2

JP2899415B2 - 血液凝固のカスケードにおいて治療上活性である新規ペプチド誘導体、その製造方法、及びそれらを含有する医薬組成物

Info

Publication number: JP2899415B2
Application number: JP7510650A
Authority: JP
Inventors: フォシェール，ジャン−リュク; テュリオ，クリストフ; ヴェルボラン，トニー; リュパン，アラン; シモネ，セルジュ
Original assignee: ADEIIRU
Current assignee: ADEIIRU
Priority date: 1993-10-07
Filing date: 1994-10-06
Publication date: 1999-06-02
Anticipated expiration: 2014-06-02
Also published as: NO961357L; EP0722460B1; FR2710917A1; NO961357D0; GR3031254T3; CN1053451C; NZ274524A; FI961505A0; JPH09503221A; DK0722460T3; CA2173598A1; FR2710917B1; AU7858794A; ES2138668T3; FI961505L; WO1995009869A1; ATE184287T1; EP0722460A1; AU680696B2; CN1134706A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、血液凝固のカスケードにおいて治療上活性
である新規ペプチド誘導体、その製造方法、及びそれら
を含有する医薬組成物に関する。

血液中の前凝固及び抗凝固因子の間のバランスが崩れ
ると、血栓又は血餅が形成されることは、現在広く知ら
れている。血栓症の発症は、本質的に、血流の停滞又は
低下、凝固亢進状態、及び血管壁内皮の病巣の３つの主
要な病原因子による影響を受ける。従って、これらの病
原に対して、その主要要素の１つが抗凝固剤である治療
法を確実することが勧められている。

抗凝固剤は、事実、急性静脈性血栓症、肺塞栓症、四
肢の動脈性塞栓症、心筋梗塞などの動脈性血栓症、アテ
ローム性動脈硬化、その他のすべての血栓塞栓症の症状
発現の治療、ならびに特に体外循環における血液のホメ
オスタシスの保持に使用することができる。

公知の抗凝固剤のうち、65個のアミノ酸からなるポリ
ペプチドであるヒルジンは、医用ヒルの唾液腺から単離
された特異的トロンビン阻害剤である（Biochemistry 2
5,4622−28,1986）。

トロンビン阻害剤として使用することのできるヒルジ
ンの変種については、すでに記載されている。例えば、
特許EP209061又はEP332523記載の化合物は、これに相当
する。更に、抗凝固特性を有するヒルジン断片の合成ア
ナログもまた記載されている。例えば、特許EP276014,E
P291981、EP291982及びEP333356において請求されてい
る化合物は、これに相当する。天然のモデルと比較する
と、これらのより短い断片（10〜20のアミノ酸）には、
「より扱いやすい」との利点、詳細には、その合成が簡
単であるとの利点がある。

より最近では、ヨーロッパ特許出願EP0,372,503は、
天然アミノ酸が、合成アミノ酸により置換されている、
ヒルジンのアナログであるペプチドを請求している。

ヨーロッパ特許出願EP0,443,598は、天然アミノ酸
が、スルホン化又はホスホン酸化誘導体により置換され
ている、ヒルジンのアナログであるペプチドを請求して
いる。

出願PCT91/01328、EP443429及びEP552999は、その修
飾が、非天然アミノ酸の導入ばかりでなく、スルホノ−
オキソ又はホスホノ−オキソ−アミノ酸の導入の形をと
っている、ヒルジンのアナログを請求している。

最後に、P.Bourdonら（FEBS Letters,294（３）,163
−166,1991）は、ペプチドとトロンビンとの相互作用に
関する構造活性の研究を行っている。

本発明は、より詳細には、式（Ｉ）：（式中、 A₁は、プロリン残基（Pro）、オクタヒドロインドール
−２−カルボニル（Oic）、２−アザビシクロ［2.2.1］
ヘプタン−３−カルボニル（Abh）又は２−アザビシク
ロ［2.2.2］オクタン−３−カルボニル（Abo）を示し、 A₂は、パラ又はメタにおいて基:PO₃H₂により置換された
フェニルアラニン残基（Phe（pPO₃H₂）又はPhe（mPO
₃H₂））を示す）により示される化合物又はその薬学的に許容しうる酸も
しくは塩基による付加塩であって、本ペプチド配列の各
アミノ酸が、光学的に純粋であり、その略語が大文字で
始まるアミノ酸は、Ｌ配置のものであり、その略語が小
文字で始まるアミノ酸は、Ｄ配置のものである化合物に
関する。

薬学的に許容しうる酸としては、塩化水素酸、臭化水
素酸、硫酸、ホスホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、乳
酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フ
マル酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、アスコルビン
酸、シュウ酸、メタンスルホン酸及びショウノウ酸など
が挙げられるが、これらに限定されることを意味するわ
けではない。

薬学的に許容しうる塩基としては、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、トリエチルアミン、tert−ブチル
−アミンなどが挙げられるが、これらに限定されること
を意味するわけではない。

本発明はまた、逐次固相合成、断片合成及び溶液中で
のそのカップリング、酵素的合成、クローニングによる
遺伝子合成及び形質転換細菌における遺伝子の発現など
の各種方法、又はこれらの技術の各種組み合わせによっ
て得ることのできる式（Ｉ）の誘導体を調製する方法に
も及ぶ。

固相ペプチド合成のための一般的方法は、B.W.Ericks
on及びR.B.Merrifield（“The Proteins",Solid−phase
Peptide Synthesis,3rd edition,257−527,1976）に記
載されている。

固相合成は、反復的かつプログラム可能な方法によ
り、ペプチド鎖へのアミノ酸の逐次的導入に必要な、脱
保護化、カップリング及び洗浄のサイクルを行う自動化
機械によって行うことができる。アミノ酸、好ましくは
Ｃ末端アミノ酸を、通常、ポリペプチドの調製に使用さ
れる樹脂、好ましくはジビニルベンゼン0.5〜3.0％によ
り架橋され、最初のアミノ酸が樹脂に共有結合するのを
可能とするためのクロロメチレン又はヒドロキシメチレ
ンなどの活性化残基を備えたポリスチレンに結合させ
る。樹脂を適宜選択することによって、Ｃ末端カルボン
酸、アミド又はアルコール官能基の固定が可能となる。

次に、アミノ酸を、オペレーターが決定した順序によ
り、一つづつ導入する。アミノ酸の導入に対応するそれ
ぞれの合成サイクルは、脱保護化、好ましくはペプチド
鎖のＮ末端の脱保護化、試薬の除去又は樹脂の膨潤のた
めの連続洗浄、アミノ酸の活性化によるカップリング、
及び新規洗浄からなる。これらの操作のそれぞれに続け
て、ろ過を行うが、これは、合成を行う反応器内に導入
したガラスろ過器で行う。

用いるカップリング試薬は、ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド（DCC）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（H
OBT）もしくはベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ
トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオ
ロホスフェート（BOP）あるいはジフェニルホスホリル
アジド（DPPA）などのペプチド合成のための通常の試薬
である。

混合無水物の形成による活性化も、可能である。

樹脂の置換の程度に対して、約４倍過剰量、そしてカ
ップリング試薬に対して、ほぼ当量で、それぞれのアミ
ノ酸を、反応器に導入する。カップリング反応は、E.Ka
iser et al.（Analyt.Biochem.,34,595,1970）記載のニ
ンヒドリン反応試験によって、合成のそれぞれの段階
で、チェックすることができる。

樹脂上にペプチド鎖を組み立てた後、トリフルオロ酢
酸、又はフッ化水素酸などの強酸により、アニソール、
エタンジチオール又は２−メチルインドールの存在下で
処理することによって、ペプチドを樹脂から分離させる
とともに、ペプチドからその保護基を除去することがで
きる。次に化合物を、通例の精製技術、特にクロマトグ
ラフィー技術により精製する。

本発明のペプチドは、固相上又は溶液中のいずれかで
調製することのできる選択的に保護されたペプチド断片
を、溶液中でカップリングさせることによっても得るこ
とができる。保護基の使用及びその安定性の相違を利用
することは、樹脂へのペプチド鎖の結合を除いては、固
相法に類似している。Ｃ末端カルボキシル基は、例え
ば、メチルエステル又はアミド官能基により保護する。
カップリングの間の活性化方法も、固相合成に使用する
方法に類似している。

式（Ｉ）の化合物は、非常に興味深い薬理学的特性を
有している。これらは、抗凝固及び抗血栓症特性を有
し、従って、血餅を溶解することによって、血栓塞栓症
後の合併症を予防するために、又はこれらを直接的かつ
速やかに作用する抗凝固剤として使用することによっ
て、血栓症の過程の延長を予防するための薬剤として使
用することができる。薬理学的試験により得られた結果
により、本発明化合物が、参考化合物であるヒルログ−
１（J.M.Maraganoreら,Biochem.,29,7095−7101,1990）
のそれよりも大きく優れた抗血栓活性を有することが示
されている。優れた活性が得られたのは、トロンビンの
触媒性部位がより大きく阻害されるためである。

また、本発明の主題は、活性成分として、少なくとも
一つの式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容しうる酸
もしくは塩基による付加塩を、単独で、又は一つもしく
はそれ以上の無毒の不活性賦形剤もしくは担体と組み合
わせて含む医薬組成物である。

本発明による医薬組成物としては、より詳細には、経
口、非経口又は鼻腔内投与に適したもの、裸錠もしくは
糖衣錠、舌下錠、サシェエト、パケット、カプセル、グ
ロセット、トローチ、座剤、クリーム、軟膏、皮膚用ゲ
ル、エーロゾル、経口投与用もしくは注射用アンプルな
どが挙げられる。

用量は、患者の年齢及び体重、病状の特性及び重症
度、及び投与経路によりまちまちである。

投与経路は、経口、鼻腔内、直腸内、又は非経口投与
であることができる。一般的には、治療のためには、0.
05〜30mgを、24時間当たり１回又は複数回に分割して投
与する。

以下の実施例は、本発明を説明するものであり、いか
なる方法によっても、本発明を限定するものではない。

以下に示す実施例においては、その略語が大文字で始
まるアミノ酸は、Ｌ配置のものである。その略語が小文
字で始まるアミノ酸は、Ｄ配置のものである。

Aboと称するアミノ酸は、3S配置のものである。

Oicと称するアミノ酸は、2S、3aS、7aS配置のもので
ある。

Phe（pPO₃H₂）は、基：を示す。

Phe（mPO₃H₂）は、基：を示す。

調製例Ａに記載の化合物は、式（Ｉ）の化合物の合成
において有用である中間体である。

調製例A:N−Fmoc−４−（ジメトキシホスホリル）−Ｌ
−フェニルアラニン（又はFmoc−Phe（pPO₃（Me）_２）段階A:N−Boc−４［（トリフルオロメチル）スルホニ
ル）オキシ］−Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステル氷浴上で冷却したジクロロメタン10mlに、Ｎ−Boc−
Ｌ−チロシンベンジルエステル6.8mmol及びフェニルビ
ス（（トリフルオロメチル）スルホニル）アミン7.4mmo
lを含む溶液に、トリエチルアミン7.4mmolを、滴下して
加えた。混合物を、０℃で１時間、そして室温で２時間
撹拌した。ジエチルエーテル60mlを加えた後、有機層
を、水、1N水酸化ナトリウム、水、次に飽和塩化ナトリ
ウム溶液で洗浄し、乾燥して、蒸発させた。次に、溶離
剤としてペンタン／酢酸エチル混合物（80/20）を用
い、シリカカラムクロマトグラフィーで精製後、予想生
成物を、油状物質として得た。

段階B:N−Boc−４−（ジメトキシホスホリル）−Ｌ−フ
ェニルアラニンベンジルエステル無水アセトニトリル3mlに、前段階で得られた化合物
1.1mmol、メチルモルホリン1.4mmol、（EtO）₂POH1.32m
mol及びPd（Ｏ）（pPH₃）₄0.032mmolを含む懸濁液を、
窒素雰囲気下、70℃で15時間撹拌した。冷却後、酢酸エ
チル40mlを加えた。有機層を、５％クエン酸、次に10％
炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、乾燥して、蒸発させ
た。次に、溶離剤として酢酸エチル／ペンタン混合物
（3/7）を用い、シリカカラムクロマトグラフィーで精
製後、予想生成物を、油状物質として得た。

段階C:N−Boc−４−（ジメトキシホスホリル）−Ｌ−フ
ェニルアラニンメタノール60ml及び水40mlに、前段階で得られた化合
物14.4mmolを含む溶液を、触媒として10％パラジウム／
炭素を用い、水素圧下で還元した。ろ過及び溶媒の留去
後、予想生成物を、油状物質として得た。

段階D:Fmoc−Phe（pPO₃（Me）_２）前段階で得られた化合物を、B.Gutteら（J.Biol.Che
m.,246,1922−1941,1971）記載の技術により、脱保護化
して、Carpinoら（J.Org.Chem.,37,3404−3409,1972）
記載の技術により、Fmoc基を導入した。

Fmoc−glu−（OtBu）−OH 0.33mmol/gにより置換さ
れた樹脂2gから、以下の反復操作に従って、実施例１の
化合物を合成した。

これらの操作はそれぞれ溶媒30ml中、室温で撹拌しな
がら行い、次に合成が進行しているガラスセル（反応
器）内に導入したガラスろ過器を用いてろ過した。フィ
ルターは、成長するペプチド鎖の結合した樹脂を保持し
ていた。

選択した保護アミノ酸を、以下の順序で、導入した：カップリングのための活性化（操作６）は、HOBt360m
gにより保護されたアミノ酸４当量（2.64mmol）を、DMF
30mlに溶解し、室温で30分後、DCC618mgを加えることに
よって、各サイクルで得られた。この溶液を、ジクロロ
メタン10mlと共に、反応セル中に、速やかに導入した。

次に、アニソール及びエタンジチオールの存在下、95
％トリフルオロ酢酸（TFA）により、樹脂を通例通りに
処理し、90％TFA、５％（CH₃）₃SiBr、及び５％チオア
ニソールを含む溶液により、ホスフェート基のメチル
を、選択的に脱保護化した後に、予想生成物を得た。次
に、本ペプチドを、分取HPLCにより精製し、凍結乾燥し
た。

これを、6N塩酸中、110℃で18時間加水分解すること
によって、アミノ酸に分解し、HPLCによって得られたア
ミノ酸の定量分析により、得られた生成物の分析を行っ
た。

質量スペクトル（FAB）:MH⁺,m_/Z＝2381 以下の実施例化合物は、実施例１記載の方法を用いて
調製した。

質量スペクトル（FAB）:MH⁺,m_/Z＝2435 本発明化合物の薬理学的研究実施例6:抗血栓活性用いた実験的血栓症モデルは、雄性OFAラットの下大
静脈を結紮することによって誘発した静脈性血栓症であ
る（Milletら,Thrombosis Res.,45:123−133,1987）。
試験動物に、ペントバルビタールナトリウム（50mg/k
g、腹腔内投与）を投与して、麻酔をかけた。結紮の15
分前に、静脈内投与により、動物を被験化合物で処理し
た。結紮の25分後、大静脈から血餅を引き出し、乾燥
（60℃で24時間）後、重量を測定した。本発明化合物
を、0.05〜1mg/kgまでの投与量で試験し、ヒルログ−１
（0.1及び1mg/kg）と比較した。本試験の結果、本発明
化合物が、参考化合物であるヒルログ−１で観察される
よりも大きい、血餅重量の有意な低下をもたらすことが
示された。本モデルにおいて、実施例１の化合物は、ヒ
ルログ−１よりも20倍活性、実施例２の化合物は10倍活
性であった。

実施例7:抗凝固活性、トロンビン時間の測定、及び活性
化ケファリン時間の測定トロンビン又は活性化ケファリンの標準量の存在下、
正常血漿は、トロンビン時間（TT）及び活性化ケファリ
ン時間（ACT）と呼ばれる、限定された一定の時間内に
凝固する。薬理学的物質によるこれらの凝固時間の延長
は、抗凝固効果を反映するものである。

本発明生成物のin vitroにおける効果を、ヒト血漿を
用いて測定した。静脈穿刺により、血液を、クエン酸を
含む試験管に採取した。デカンテーション（1,200g、10
分間）後、血小板含有量の低い血漿を、デカンテーショ
ンして、次に凝固試験を行った。本発明化合物は、TT及
びACTを有意に延長した。実施例１の化合物は、0.05μ
Ｍの濃度でTTを、そして0.14μＭの濃度でACTを２倍に
延長した。本活性はヒルログ−１ 0.07μＭ及び0.2μ
Ｍのそれよりもそれぞれ有意に大きかった。

生成物の効果を、ペントバルビタールナトリウム（60
mg/kg、腹腔内投与）で麻酔を行ったOFAラットにおい
て、ex vivoで試験した。頚動脈及び頚静脈にカテーテ
ルを挿入した。カテーテルの設置後、動脈血1.5cm³を、
クエン酸（0.109M）に採取した。30分後、被験生成物
を、1mlの容積で、静脈内投与した。動脈血試料（1.5cm
³）を、1.5分、３分、５分、15分、30分、及び60分後に
採取した。試料のそれぞれの採取時に、クエン酸を加え
た生理学的血清1.5cm³を、頚動脈を介して、動物に再注
入した。本発明化合物は、ラットにおいて、ex vivo
で、TT及びACTを有意に延長した。これらの化合物は、
ヒルログ−１よりも大きく、TT（増加因子）及びACT
（増加因子）を延長した。

実施例8:トロンビン及び凝固セリンプロテアーゼの阻害本発明生成物の、ヒトトロンビン（Sigma社、特異的
活性3230NIHU/mg）に対する阻害活性を、in vitroで評
価するために、ヒトフィブリノーゲン（精製又は血漿
性）（Fg）又は色素形成性基質Ｈ−Ｄ−Phe−Pip−Arg
−pNa（0.66nM、S2238、Kabi社）を、被験阻害剤と共
に、又は被験阻害剤を含まずにあらかじめインキュベー
ト（20℃、10分間）した所定量のトロンビン（0.7又は2
nM）に加えた。

本生成物の、各種凝固セリンプロテアーゼに対するin
vitroにおける選択性を評価するために、同様の操作
を、精製ヒトプラスミン（2nM、Stago社）、精製ヒト活
性化Ｘ因子（2nM、Stago社）、カリクレイン（2nM、Sig
ma社）、ウロキナーゼ（2nM、Sigma社）、プラスミノー
ゲン組織活性化因子（ｔ−PA;2nM、Stago社）、及び精
製ヒト活性化プロテインＣ（2nM、Stago社）に、基質と
して各種パラニトロアニリド含有ペプチドを用いて、適
用した。阻害剤、酵素及び基質は、同一の緩衝剤（0.01
mMリン酸緩衝液、pH7.4、塩化ナトリウム0.12M及びウシ
血清アルブミン0.05％を含む）で希釈し、50μｌの量
で、ポリスチレンミクロプレートに分配した。

トロンビンにより形成されるフィブリン、又はセリン
プロテアーゼの作用により放出されるパラニトロアニリ
ドを、20℃で、15〜30分間反応させた後に、405nmで、
分光測光法により測定した。

以下に示す結果は、フィブリノーゲン及び色素形成性
基質に関して、ヒルログ−１と比較した場合の、本発明
によるトロンビンの阻害を示す。結果は、酵素活性を50
％阻害する濃度をnMで示した値であるIC₅₀で示す。本発
明化合物は、ヒルログ−１よりも高い活性を有した。色
素形成性基質の存在下での場合に特にそうであり、トロ
ンビンの触媒部位に対する本発明生成物の優れた阻害活
性を証明している。

ヒルログ−１と同様に、本発明生成物は、トロンビン
に対して非常に選択的であった。その他の凝固及び繊維
素溶解セリンプロテアーゼに関するIC₅₀値は、いずれも
30μＭよりも大きかったからである。

実施例9:医薬組成物：注射用溶液注射用溶液：実施例１の化合物:5mg 注射用蒸留水適量を加えて、25mlとする。

錠剤： 1,000錠のための調製処方実施例１の化合物 5g 小麦デンプン 10g トウモロコシデンプン 10g 乳糖 60g ステアリン酸マグネシウム 2g シリカ、ヒドロキシプロピルセルロース 2g 更に外皮があれば、薬剤の胃における耐性を確保する
のに有用であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/55 ＡＥＤＡ６１Ｋ 37/64 ＡＢＸ // Ｃ０７Ｋ 7/08 ＡＥＤ (72)発明者ヴェルボラン，トニーフランス国、エフ―78540 ヴェルニュイユ、リュ・アリスティド―ブリアン、 60ビス (72)発明者リュパン，アランフランス国、エフ―37510 サヴォニエール、ラ・サントリー（番地なし) (72)発明者シモネ，セルジュフランス国、エフ―78700 コンフラン ―サン―トノラン、リュ・デジレ―クレマン、43 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/815 C07K 7/08 A61K 38/58 C07K 14/745 ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】式（Ｉ）：（式中、 A₁は、プロリン残基（Pro）、オクタヒドロインドール
−２−カルボニル（Oic）、２−アザビシクロ［2.2.1］
ヘプタン−３−カルボニル（Abh）又は２−アザビシク
ロ［2.2.2］オクタン−３−カルボニル（Abo）を示し、 A₂は、パラ又はメタにおいて基:PO₃H₂により置換された
フェニルアラニン残基（Phe（pPO₃H₂）又はPhe（mPO
₃H₂））を示す）により示される化合物又はその薬学的に許容しうる酸も
しくは塩基による付加塩であって、本ペプチド配列の各
アミノ酸が、光学的に純粋であり、その略語が大文字で
始まるアミノ酸は、Ｌ配置のものであり、その略語が小
文字で始まるアミノ酸は、Ｄ配置のものである化合物。
【請求項２】A₁が、プロリン残基（Pro）を示す請求の
範囲第１項記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】A₂が、（pPO₃H₂）フェニルアラニン残基を
示す請求の範囲第１項記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項４】Ｈ−phe−Pro−Arg−Pro−（Gly）_４−Asn
−Gly−Asp−Phe−Glu−Abo−Ile−Pro−（Glu）_２−Ph
e（pPO₃H₂）−Leu−glu−OHである請求の範囲第１項記
載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項５】Ｈ−phe−Oic−Arg−Pro−（Gly）_４−Asn
−Gly−Asp−Phe−Glu−Abo−Ile−Pro−（Glu）_２−Ph
e（pPO₃H₂）−Leu−glu−OHである請求の範囲第１項記
載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項６】保護されたアミノ酸からの逐次固相合成、
溶液中でのペプチド断片からの合成、場合によりこれら
の二つの技術の組み合わせによって請求の範囲第１項記
載の式（Ｉ）の化合物を製造し、所望であれば、式
（Ｉ）の誘導体を、その薬学的に許容しうる酸又は塩基
による付加塩に変換する方法。
【請求項７】活性成分として、請求の範囲第１〜５項の
いずれか１項記載の少なくとも一つの化合物を、単独
で、又は一つもしくはそれ以上の薬学的に許容しうる無
毒の不活性賦形剤もしくは担体と組み合わせて含む、急
性静脈性血栓症、肺塞栓症、四肢の動脈性塞栓症、心筋
梗塞、アテローム性動脈硬化、又は血栓塞栓症の症状発
現の治療において抗凝固剤として、あるいは特に体外循
環における血液のホメオスタシスの保持のための医薬組
成物。