JP2900526B2

JP2900526B2 - 酵素活性化剤

Info

Publication number: JP2900526B2
Application number: JP14726190A
Authority: JP
Inventors: 篤司橋本; 英彦日比野; 理仲地
Original assignee: NIPPON YUSHI KK
Current assignee: NIPPON YUSHI KK
Priority date: 1990-06-07
Filing date: 1990-06-07
Publication date: 1999-06-02
Anticipated expiration: 2014-06-02
Also published as: JPH0441426A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はアルツハイマー病の治療剤等の医薬として有
用な酵素活性化剤に関し、さらに詳しくはＮ−ミリスト
イルアミノ酸及びその誘導体を有効成分とするインゲン
シン酵素活性化剤に関する。

（従来の技術）インゲンシン酵素はアルツハイマー病で脳に蓄積して
いるA4（β−プロテイン）を分解する酵素であることが
知られている。

石浦ら（FEBS Lett.,189巻、119頁、1985年）は、Ca
依存性プロテアーゼの人工基質のスクリーニング中に、
DEAEセルロースに結合し高塩濃度で溶出される物質で、
サクシニル−ロイシル−ロイシル−−バリル−チロシン
−メチルクマリルアミドを分解する活性を示す物質を見
出し、この酵素をインゲンシン（マルチキャタリティッ
クプロテイン）と命名した。この酵素活性はゲル濾過で
50万以上の高分子物に回収されること、リノール酸で活
性化されるなどの性質を示し、ラット肝臓、ヒト胎盤、
ウサギ網状赤血球から単一分離精製されたこの酵素が全
て分子量3.5〜2.5万の20数個のサブユニットからなるこ
とが記されている。

インゲンシンの作用は長い間明らかではなかったが、
石浦ら（FEBS Lett.,201巻、87頁、1986年）は、ウサギ
網状赤血球でのATP依存性蛋白質分解がインゲンシンの
阻害剤により抑制されることを明らかにし、インゲンシ
ンがアブノーマルな蛋白の分解に関係していることを示
している。特に、アルツハイマー病では、脳にアミロイ
ドが蓄積することが知られているが、このアミロイドの
主要成分であるA4（β−プロテイン）の生成過程でA4よ
りも３ペプチド小さいA4′の生成にこのインゲンシンが
作用していることがわかっており、アブノーマルな蛋白
質であるA4の分解に役立っている可能性があるとしてい
る（FEBS Lett.,257巻、388頁、1989年）。

また、インゲンシンは赤芽細胞やヒーラ（Hela）細胞
のポリゾームに結合していないフリーのmRNAに結合して
いる19S粒子（プロソーム）と同一物質であることが記
されている。この19S粒子が結合したmRNAは不活性化さ
れているが、この複合体から蛋白質を除去すると翻訳可
能となることより、プロソームがmRNAによる蛋白翻訳を
抑制していると考えられている（J.Mol.Biol.,187巻、4
79頁、1986年）。

また、マルチキャタリティック・プロテインには、イ
ンゲンシンの他にプロテアソーム、マクロパイン、プロ
ソームなどが知られているが、これらの物質は同一物質
であることが明らかにされている（Biochem.J.,255巻、
750頁、1988年）。

（発明が解決しようとする課題）これまでにインゲンシンの酵素活性を増加させる物質
として、リノール酸、ミリスチン酸等の脂肪酸が、それ
ぞれ５〜10倍活性化することが知られているが、この活
性化の程度はまだ不十分である（Biochem.Biophys.Act
a,882巻、305頁、1986年）。

本発明は、インゲンシンの酵素活性を著しく増大する
ための、天然物に近い低毒性の化合物からなる酵素活性
化剤を提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段）本発明は一般式：（式中、Ａはアミノ酸残基を表す）で示されるＮ−ミリ
ストイルアミノ酸及びその誘導体を有効成分として含む
インゲンシン酵素活性化剤である。

前記一般式において、Ａは天然型または合成のアミノ
酸残基を表し、そのアミノ酸としてはα−アミノ酸であ
るグリシン、セリン、アラニン、フェニルアラニン、ス
レオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、バリン、ロ
イシン、プロリンなどが好ましく、特にグリシン、Ｄ−
セリン、Ｌ−セリン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン等が
好適である。Ｎ−ミリストイルアミノ酸としては、ミリ
スチン酸にアミノ酸が結合したすべての化合物を含む
が、代表的化合物としては以下のものが例示される。

Ｎ−ミリストイル−グリシンＮ−ミリストイル−Ｌ−セリンＮ−ミリストイル−Ｌ−アラニンＮ−ミリストイル−Ｌ−フェニルアラニンＮ−ミリストイル−Ｌ−スレオニンＮ−ミリストイル−Ｌ−グルタミン酸Ｎ−ミリストイル−Ｌ−アスパラギン酸Ｎ−ミリストイル−Ｌ−バリンＮ−ミリストイル−Ｌ−ロイシンＮ−ミリストイル−Ｌ−プロリンＮ−ミリストイル−Ｄ−セリンＮ−ミリストイル−Ｄ−アラニンＮ−ミリストイル−Ｄ−フェニルアラニンＮ−ミリストイル−Ｄ−スレオニンＮ−ミリストイル−Ｄ−グルタミン酸Ｎ−ミリストイル−Ｄ−アスパラギン酸Ｎ−ミリストイル−Ｄ−バリンＮ−ミリストイル−Ｄ−ロイシンＮ−ミリストイル−Ｄ−プロリンまた、Ｎ−ミリストイルアミノ酸誘導体としては上記
化合物の塩類も含まれる。最も一般に使用される塩は、
ナトリウム、カリウム、カルシウムなどの塩である。

前記一般式で示される化合物は、天然物でる脂肪酸と
アミノ酸とを、例えば４−ヒドロキシフェニルジメチル
スルホメチルサルフェートやジシクロヘキシルカルボジ
イミド等の触媒の存在下で反応させることにより合成す
ることができる。

前記一般式で示される化合物を有効成分として含有す
る本発明の酵素活性化剤は、経口的または非経口的に投
与することができる。すなわち、通常用いられる投与形
態である錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の形
で経口的に投与することができ、あるいは、その溶液、
乳剤、懸濁液等の液剤の形で注射等、非経口投与するこ
とができる。これらの調製には通常の賦形剤、崩壊剤、
結合剤、滑沢剤、色素、希釈剤などが用いられる。

投与量、投与回数は症状、年齢、体重、投与形態等に
よって異なるが、通常成人一人一日当り、0.1〜5000m
g、好ましくは10〜1000mgの範囲で投与することができ
る。

得られた本発明による活性化剤がインゲンシン酵素を
どの程度活性化しているかは、アミロイドのA4（β−プ
ロテイン）の酵素分解に直接対応することが酵素学的に
知られているサクシニル−ロイシル−ロイシル−バリル
−チロシン−メチルクマリルアミド（SLLVT）の酵素分
解反応を用いて、容易に測定することができる。

（発明の効果）本発明の酵素活性化剤は顕著なインゲンシン酵素活性
化作用を有している。また、主成分であるＮ−ミリスト
イルアミノ酸は、天然に存在する脂肪酸であるミリスチ
ン酸とアミノ酸から構成されているので、毒性も少なく
安全であり、インゲンシンを活性化することによってア
ルツハイマー病において脳に蓄積するアミロイドの主要
成分であるA4（β−プロテイン）の分解を促進し、アル
ツハイマー病の予防および治療のための医薬として有用
である。

（実施例）以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明す
る。

〔製造例〕

先ず、Ｎ−ミリストイルアミノ酸及びその誘導体の製
造例を示す。

製造例１Ｌ−セリン2.0g（0.02mol）およびトリエチルアミン
2.8ml（0.02mol）を60mlの水に溶解させ、４−ヒドロキ
シフェニルジメチルスルホメチルサルフェートのミリス
チン酸エステル（商品名、サンセラーMy−DSP（三新化
学工業株式会社製））9.52g（0.02mol）を加え、室温で
12時間撹拌した。1N−HClで反応液をpH2〜３にし、反応
混合物を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を無水硫
酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。生成物を
酢酸エチル−メタノール（3:1v/v）に溶解し、減圧濃縮
し、結晶化した生成物を酢酸エチル及びヘキサンで洗浄
してＮ−ミリストイル−Ｌ−セリン3.6gを得た。

製造例２Ｄ−セリン2.0g（0.02mol）およびトリエチルアミン
2.8ml（0.02mol）を60mlの水に溶解させ、サンセラーMy
−DSP（三新化学工業株式会社）9.52g（0.02mol）を加
え、室温で12時間撹拌した。1N−HClで反応液をpH2〜３
にし、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル
層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し
た。生成物を酢酸エチル−メタノール（3:1v/v）に溶解
し、減圧濃縮し、結晶化した生成物を酢酸エチル及びヘ
キサンで洗浄してＮ−ミリストイル−Ｄ−セリン3.8gを
得た。

製造例３Ｌ−アラニン1.78g（0.02mol）およびトリエチルアミ
ン2.8ml（0.02mol）を60mlの水に溶解させ、サンセラー
My−DSP（三新化学工業株式会社）9.52g（0.02mol）を
加え、室温で12時間撹拌した。1N−HClで反応液をpH2〜
３にし、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチ
ル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し
た。生成物を酢酸エチル−メタノール（3:1v/v）に溶解
し、減圧濃縮し、結晶化した生成物を酢酸エチル及びヘ
キサンで洗浄してＮ−ミリストイル−Ｌ−アラニン3.6g
を得た。

製造例４４−ヒドロキシフェニルジメチルスルホメチルサルフ
ェート（商品名、サンセラーDSP（三新化学工業株式会
社製））2.66g（0.01mol）を40mlのアセトニトリルに加
熱溶解し、ミリスチン酸2.28g（0.01mol）を加え、０℃
で撹拌した。この溶液にジシクロヘキシルカルボジイミ
ド2.06g（0.01mol）を徐々に加え、０℃で２時間、さら
に室温で２時間撹拌した。反応液を濾過してジシクロヘ
キシルウレアを除き、濾液を減圧留去して油状物を得
た。水10mlにグリシン0.75g（0.01mol）およびトリエチ
ルアミン1.4ml（0.01mol）を加えて撹拌しながら、前記
油状物のアセトニトリル溶液を加えて室温で10時間撹拌
した。反応後、反応液を減圧下濃縮し、6N−HClを加え
てpH2〜３とし、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層
を水洗した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減
圧留去した。生成物を酢酸エチル−メタノール（3:1v/
v）に溶解し、減圧濃縮し、結晶化した生成物を酢酸エ
チル及びヘキサンで洗浄して、Ｎ−ミリストイル−グリ
シン1.1gを得た。

製造例５サンセラーDSP（三新化学工業株式会社））2.66g（0.
01mol）を40mlのアセトニトリルに加熱溶解し、窒素気
流下、ミリスチン酸2.28g（0.01mol）を加え０℃で撹拌
した。この溶液にジシクロヘキシルカルボジイミド2.06
g（0.01mol）を徐々に加え、０℃で２時間、さらに室温
で２時間撹拌した。反応液を濾過して副生したジシクロ
ヘキシルウレアを除き、濾液を減圧留去して油状物を得
た。水10mlにＬ−セリン1.0g（0.01mol）およびトリエ
チルアミン1.4ml（0.01mol）を加えて撹拌しながら、前
記油状物のアセトニトリル溶液を加えて室温で10時間撹
拌した。反応後、反応液を減圧下濃縮し、6N−HClを加
えてpH2〜３とし、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル
層を水洗した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を
減圧留去した。生成物を酢酸エチル−メタノール（3:1v
/v）に溶解し、10％水酸化ナトリウム溶液でpH11に調整
し、沈殿が生じたことを確認してから減圧濃縮し、結晶
化した生成物を酢酸エチル及びヘキサンで洗浄して、Ｎ
−ミリストイル−Ｌ−セリンナトリウム塩1.9gを得た。

〔製剤例〕

各製造例で得られたＮ−ミリストイルアミノ酸及びそ
の誘導体を活性成分として用いて下記の製剤を調製し
た。

製剤例１（錠剤）１錠（150mg）中下記成分を含有する。

活性成分（製造例１） 50 mg 乳糖 48 mg でんぷん 50 mg ポリビニルピロリドン 1.5mg ステアリン酸マグネシウム 0.5mg 計 150 mg 製剤例２（カプセル剤）ゼラチンカプセル１錠中に下記成分（150mg）を含有
する。

活性成分（製造例２） 50 mg 乳糖 59.5mg でんぷん 40 mg 軽質無水ケイ酸 0.5mg 計 150 mg 製剤例３（顆粒）顆粒1g中に下記成分を含有する。

活性成分（製造例３） 200 mg 乳糖 450 mg でんぷん 300 mg ヒドロキシプロピルセルロース 50 mg 計 1000 mg 〔酵素活性測定〕インゲンシンの酵素活性は次のようにして測定した。
インゲンシン、50mMトリス−塩酸緩衝液、0.1mMサクシ
ニル−ロイシル−ロイシル−バリル−チロシン−メチル
クマトリルアミド（SLLVT）に、それぞれの酵素活性化
剤を所定量加え、37℃で30分間インキュベートした後、
10％ドデシル硫酸ナトリウムを加えることによって反応
を停止させた。酵素分解によりSLLVTから遊離してくる
アミノメチルクマリンを、蛍光吸光度計（励起380nm、
蛍光460nm）を用いて測定した。結果を第１図および第
２図に示す。図中、○はＮ−ミリストイル−Ｌ−セリ
ン、●はＮ−ミリストイル−Ｄ−セリン、△はＮ−ミリ
ストイル−Ｌ−アラニン、▲はＮ−ミリストイル−Ｄ−
アラニンをそれぞれ含有する酵素活性化剤を示し、□は
これらの化合物に代えてミリスチン酸を含有するコント
ロールを示す。

〔結果〕

第１図に示すように、Ｎ−ミリストイル−Ｌ−セリン
（○）では、添加量0.25mg/mlでインゲンシンの酵素活
性を5.5から128.0に活性化（23倍）していた。一方、ミ
リスチン酸（□）では、同量で、酵素活性を５倍しか活
性化していなかった。Ｎ−ミリストイル−Ｄ−セリン
（●）では、0.75mg/mlで酵素活性を21倍に活性化して
いた。

また、第２図に示すように、Ｎ−ミリストイル−Ｌ−
アラニン（△）では、添加量0.1mg/mlで酵素活性を26倍
に活性化し、Ｎ−ミリストイル−Ｄ−アラニン（▲）で
は、0.5mg/mlで32倍に活性化していた。これにより、Ｎ
−ミリストイルアミノ酸が、従来知られていたミリスチ
ン酸よりもインゲンシンを活性化することが証明され
た。

【図面の簡単な説明】

第１図はＮ−ミリストイルセリンの添加量と酵素活性の
関係を示すグラフである。第２図はＮ−ミリストイルアラニンの添加量と酵素活性
の関係を示すグラフである。図中の○はＮ−ミリストイル−Ｌ−セリン、●はＮ−ミ
リストイル−Ｄ−セリン、△はＮ−ミリストイル−Ｌ−
アラニン、▲はＮ−ミリストイル−Ｄ−アラニンをそれ
ぞれ含有する酵素活性化剤を示し、□はこれらの化合物
に代えてミリスチン酸を含有するコントロールを示す。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（式中、Ａはアミノ酸残基を表す）で示されるＮ−ミリ
ストイルアミノ酸及びその誘導体を有効成分として含む
インゲンシン酵素活性化剤。