JP2906632B2 - Method for analyzing ascorbic acid and dehydroascorbic acid - Google Patents
Method for analyzing ascorbic acid and dehydroascorbic acidInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアスコルビン酸およびデヒドロアスコルビン
酸を分析する方法に関する。The present invention relates to a method for analyzing ascorbic acid and dehydroascorbic acid.
アスコルビン酸およびデヒドロアスコルビン酸は、ビ
タミンＣと呼ばれ、生体に広く分布し、生体の酸化還元
作用に関与している。Ascorbic acid and dehydroascorbic acid, called vitamin C, are widely distributed in living organisms and are involved in the oxidation-reduction action of living organisms.
また、アスコルビン酸は、食品に添加され、強化剤、
酸上防止剤として使用されている。そのため生化学、食
品工学分野においては、該両成分の定量から重要な情報
を得ることができる。Also, ascorbic acid is added to foods, fortifiers,
Used as an acid inhibitor. Therefore, in the fields of biochemistry and food engineering, important information can be obtained from the quantification of both components.
従来、アスコルビン酸およびデヒドロアスコルビン酸
の定量分析には下記の方法があった。Conventionally, there has been the following method for quantitative analysis of ascorbic acid and dehydroascorbic acid.
アスコルビン酸を2,6−ジクロロフェノールインド
フェノールで酸化してデヒドロアスコルビン酸とし、こ
れを2,4−ジニトロフェニルヒドラジンと反応させてビ
ス−2,4−ジニトロフェニルヒドラゾンとし、520nmでの
吸光度を測定する方法。Ascorbic acid is oxidized with 2,6-dichlorophenolindophenol to dehydroascorbic acid, which is reacted with 2,4-dinitrophenylhydrazine to form bis-2,4-dinitrophenylhydrazone, and the absorbance at 520 nm is measured. how to.
アスコルビン酸を2,6−ジクロロフェノールインド
フェノールで酸化してデヒドロアスコルビン酸とし、こ
れをｏ−フェニレンジアミンと反応させてキノキサリン
誘導体とし、Ex＝350nm、Em＝430nmでの螢光を測定する
方法。A method in which ascorbic acid is oxidized with 2,6-dichlorophenolindophenol to form dehydroascorbic acid, which is reacted with o-phenylenediamine to form a quinoxaline derivative, and the fluorescence is measured at Ex = 350 nm and Em = 430 nm.
高速液体クロマトグラフィーにより分離し、220nm
における吸光度を測定する方法。Separated by high performance liquid chromatography, 220nm
Method for measuring absorbance at
しかしながら、前記した従来技術の、では分析操
作が煩雑である上に、アスコルビン酸とデヒドロアスコ
ルビン酸を同時に分析することができないという課題が
あった。However, in the above-mentioned prior art, there are problems that the analysis operation is complicated and that ascorbic acid and dehydroascorbic acid cannot be analyzed simultaneously.
また、前記した従来技術のでは、夾雑成分の影響を
受けやすく、感度も低いという課題があった。In addition, the above-described prior art has a problem that it is easily affected by contaminants and has low sensitivity.
本件発明者は、鋭意検討した結果、アスコルビン酸お
よびデヒドロアスコルビン酸が塩基性条件下で300nmに
吸収極大を有する物質に誘導されることを見出し、本発
明をなすに至った。すなわち、本発明は、前記従来技術
の課題を解決するため、アスコルビン酸およびデヒドロ
アスコルビン酸を高速液体クロマトグラフィーにより分
離し、カラムからの溶出液を塩基性にし、反応によって
生じる生成物を吸光度法により検出し、分析することに
より、感度と選択性に優れたアスコルビン酸とデヒドロ
アスコルビン酸の一斉分析方法を提供する。As a result of intensive studies, the present inventors have found that ascorbic acid and dehydroascorbic acid can be induced into a substance having an absorption maximum at 300 nm under basic conditions, and have accomplished the present invention. That is, the present invention, in order to solve the above-mentioned problems of the prior art, to separate ascorbic acid and dehydroascorbic acid by high performance liquid chromatography, to make the eluate from the column basic, and to determine the product generated by the reaction by the absorbance method. By providing detection and analysis, a method for simultaneous analysis of ascorbic acid and dehydroascorbic acid with excellent sensitivity and selectivity is provided.
カラムからの溶出液を塩基性にするには、溶出液にア
ルカリ溶液又は還元剤を含有するアルカリ溶液を混合す
る。In order to make the eluate from the column basic, the eluate is mixed with an alkaline solution or an alkaline solution containing a reducing agent.
ここで、アルカリ溶液とは、例えば、水酸化ナトリウ
ム、或は水酸化カリウムの水溶液を挙げることができ、
これらは有機溶媒を含有しても良い。Here, the alkaline solution includes, for example, an aqueous solution of sodium hydroxide or potassium hydroxide,
These may contain an organic solvent.
また、第２番目の方法における還元剤とは、例えば、
水素化ほう素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどであ
り、デヒドロアスコルビン酸をアスコルビン酸に還元す
る目的に使用する。The reducing agent in the second method is, for example,
Sodium borohydride, sodium sulfite and the like are used for the purpose of reducing dehydroascorbic acid to ascorbic acid.
カラムには、例えば、イオン排除クロマトグラフィー
用カラム「Shim−pack SCR−102H」（8mm 1.D.×300mm
L.）が用いられる。ただし、カラムは、アスコルビン酸
およびデヒドロアスコルビン酸を分離することができる
ものであれば、どのようなものであっても良い。The column includes, for example, a column for ion exclusion chromatography “Shim-pack SCR-102H” (8 mm 1.D. × 300 mm
L.) is used. However, the column may be any column as long as it can separate ascorbic acid and dehydroascorbic acid.
移動相には、一例として、5mM過塩素酸水溶液を用い
る。ただし、移動相は、該両成分を分離することができ
るものであれば、組成や濃度などに何ら制約はない。As the mobile phase, for example, a 5 mM aqueous solution of perchloric acid is used. However, as long as the mobile phase can separate the two components, there is no restriction on the composition, concentration, and the like.
カラムからの溶出液を塩基性にする試薬には、例えば
100mM水素化ほう素ナトリウムを含有する100mM水酸化ナ
トリウム水溶液を用い、カラム溶出液と混合して30〜60
℃下で、10〜60秒間、反応させる。Reagents that make the eluate from the column basic include, for example,
Using 100 mM sodium hydroxide aqueous solution containing 100 mM sodium borohydride, mix with column eluate 30-60
Incubate at 10 ° C for 10-60 seconds.
ただし、反応試薬のアルカリには、水酸化ナトリウム
以外に、水酸化カリウムなどでも良く、また緩衝液を用
いても良い。また、該アルカリは、カラムからの溶出液
と混合したときの混合液が塩基性となるように調整され
た濃度であれば、どのようなものでも良いが、pHが高く
なるものほど好ましく、50〜200mMが適当である。However, in addition to sodium hydroxide, potassium hydroxide or the like may be used as the alkali of the reaction reagent, or a buffer may be used. The alkali may be of any concentration as long as the mixture is adjusted to be basic when mixed with the eluate from the column, but the higher the pH, the more preferable it is. ~ 200 mM is appropriate.
還元剤には、水素化ほう素ナトリウム以外に、亜硫酸
ナトリウムなどを用いることができるが、水素化ほう素
ナトリウムが好ましく、50〜200mMの濃度で用いるのが
適当である。As the reducing agent, sodium sulfite and the like can be used in addition to sodium borohydride. Sodium borohydride is preferable, and it is appropriate to use it at a concentration of 50 to 200 mM.
検出は、300nmの波長であることが好ましく許容範囲
は±20nmであることが好ましい。Detection is preferably at a wavelength of 300 nm, and the allowable range is preferably ± 20 nm.
前記した本発明の構成によれば、分析すべきアスコル
ビン酸およびデヒドロアスコルビン酸を高速液体クロマ
トグラフィーにより分離し、カラムからの溶出液を塩基
性にし、反応によって生じる生成物を吸光度法により検
出することにより、アスコルビン酸とデヒドロアスコル
ビン酸を同時にかつ選択的に、感度良く分析することが
できる。According to the configuration of the present invention described above, ascorbic acid and dehydroascorbic acid to be analyzed are separated by high performance liquid chromatography, the eluate from the column is made basic, and the product generated by the reaction is detected by an absorbance method. As a result, ascorbic acid and dehydroascorbic acid can be simultaneously and selectively analyzed with high sensitivity.
以下、実施例を用いて、本発明をさらに詳細に説明す
る。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものでは
ない。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. In addition, this invention is not limited to a following example.
まず、分析装置について説明する。 First, the analyzer will be described.
第１図は本発明で用いる高速液体クロマトグラフの流
路図を示す。第１図において、1.2は送液ポンプ、３は
試料導入器、４は恒温槽、５は吸光度検出器、６はデー
タ処理器、７は反応器、８はカラム、９は移動相、10は
反応試薬（アルカリ溶液）である。FIG. 1 shows a flow diagram of a high performance liquid chromatograph used in the present invention. In FIG. 1, 1.2 is a liquid feed pump, 3 is a sample introduction device, 4 is a thermostat, 5 is an absorbance detector, 6 is a data processor, 7 is a reactor, 8 is a column, 9 is a mobile phase, and 10 is Reaction reagent (alkaline solution).
次に、第１図に示した分析装置を用いた本発明の一実
施例について、その作用を説明する。Next, the operation of one embodiment of the present invention using the analyzer shown in FIG. 1 will be described.
まず、送液ポンプ１により移動相９を送液する。アス
コルビン酸およびデヒドロアスコルビン酸を含有する試
料を、試料導入器３からマイクロシリンジなどにより導
入し、該両成分をカラム８によって分離する。カラムか
ら連続的に溶出する移動相に、送液ポンプ２により還元
剤を含有するアルカリ溶液10を送液して混合し、反応器
７に送る。ここで、両成分を、300nmに吸収極大を有す
る化合物に導き、吸光度検出器５で検出し、これをデー
タ処理器６で処理するものである。First, the mobile phase 9 is sent by the solution sending pump 1. A sample containing ascorbic acid and dehydroascorbic acid is introduced from the sample introduction device 3 with a microsyringe or the like, and the two components are separated by the column 8. The alkaline solution 10 containing the reducing agent is sent to the mobile phase continuously eluted from the column by the liquid sending pump 2, mixed, and sent to the reactor 7. Here, both components are led to a compound having an absorption maximum at 300 nm, detected by an absorbance detector 5, and processed by a data processor 6.
次に、具体的な分析例を示す。 Next, a specific analysis example will be described.
（１） 分離条件 カラム:Shim−pack SCR−102H （8mmI.D.×300mL.） 移動相:5mM過塩素酸水溶液 流 量:1.0mL/min 温 度:40℃ （２） 検出条件 試 薬:100mM水素化ほう素ナトリウムを含有する100m
M水酸化ナトリウム水溶液 流 量:0.5mL/min 温 度:40℃ 検 出：吸光度 300nm （３） 分析結果 以上の結果を第２図に示す。第２図は高速液体クロマ
トグラフィーによって得られたクロマトグラムである。
この結果、被検試料には、各々、約100nmol/mLのアスコ
ルビン酸およびデヒドロアスコルビン酸が認められた。(1) Separation conditions Column: Shim-pack SCR-102H (8 mm ID × 300 mL.) Mobile phase: 5 mM aqueous solution of perchloric acid Flow rate: 1.0 mL / min Temperature: 40 ° C (2) Detection conditions Reagents: 100m containing 100mM sodium borohydride
M sodium hydroxide aqueous solution Flow rate: 0.5 mL / min Temperature: 40 ° C Detection: Absorbance 300 nm (3) Analysis results The above results are shown in FIG. FIG. 2 is a chromatogram obtained by high performance liquid chromatography.
As a result, about 100 nmol / mL of ascorbic acid and dehydroascorbic acid were observed in each of the test samples.
以上の実施例によれば、分析すべきアスコルビン酸お
よびデヒドロアルコルビン酸を高速液体クロマトグラフ
ィーにより分離し、カラムからの溶出液を塩基性にし、
反応によって生じる生成物を吸光度法により検出するこ
とにより、アスコルビン酸とデヒドロアスコルビン酸を
同時に、かつ選択的に、感度良く分析することができる
ことが確認できた。According to the above examples, ascorbic acid and dehydroalcorbic acid to be analyzed are separated by high performance liquid chromatography, and the eluate from the column is made basic,
By detecting the product generated by the reaction by the absorbance method, it was confirmed that ascorbic acid and dehydroascorbic acid can be analyzed simultaneously, selectively and with high sensitivity.
以上、説明した通り、本発明は、アスコルビン酸およ
びデヒドロアスコルビン酸を選択性で高感度に分析する
ことができるという効果を達成することができる。As described above, the present invention can achieve the effect that ascorbic acid and dehydroascorbic acid can be selectively analyzed with high sensitivity.
第１図は本発明の一実施例で用いる分析装置（高速液体
クロマトグラフ）を示し、第２図は本発明の一実施例の
クロマトグラムを示す。FIG. 1 shows an analyzer (high performance liquid chromatograph) used in one embodiment of the present invention, and FIG. 2 shows a chromatogram of one embodiment of the present invention.
Claims (1)
ン酸を高速液体クロマトグラフィーにより分離しカラム
からの溶出液を塩基性にし、反応によって生じる生成物
を吸光度法により検出することを特徴とするアスコルビ
ン酸およびデヒドロアスコルビン酸の分析方法。(1) Ascorbic acid and dehydroascorbic acid, wherein ascorbic acid and dehydroascorbic acid are separated by high performance liquid chromatography, the eluate from the column is made basic, and the product produced by the reaction is detected by an absorbance method. Acid analysis method.
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| JP27371490A JP2906632B2 (en) | 1990-10-11 | 1990-10-11 | Method for analyzing ascorbic acid and dehydroascorbic acid |
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| JPH04148861A JPH04148861A (en) | 1992-05-21 |
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