JP2944700B2 - インディカ型イネプロトプラスト用培地 - Google Patents
インディカ型イネプロトプラスト用培地Info
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、インディカ型イネプロトプラスト用培地に
関する。
関する。
［従来の技術］ イネのプロトプラストからの植物体再生についてはい
くつかの研究グループで報告がされてる（Fujimuraら
（1985）、Abdullahら（1986）、Toriyamaら（1986）、
Yamadaら（1986）、Kyozukaら（1987））。しかしこれ
らの技術はすべてジャポニカ型イネの品種のみでの成功
であった。
くつかの研究グループで報告がされてる（Fujimuraら
（1985）、Abdullahら（1986）、Toriyamaら（1986）、
Yamadaら（1986）、Kyozukaら（1987））。しかしこれ
らの技術はすべてジャポニカ型イネの品種のみでの成功
であった。
インディカ型イネは世界的に最も栽培面積が広く、イ
ネの品種改良には非常に重要なものであるが、ジャポニ
カ型イネと遺伝的に大きな差があることや品種間差も大
きい等の理由から上記の技術をインディカ型イネに応用
することは困難であった。
ネの品種改良には非常に重要なものであるが、ジャポニ
カ型イネと遺伝的に大きな差があることや品種間差も大
きい等の理由から上記の技術をインディカ型イネに応用
することは困難であった。
また、ジャポニカ型のイネのプロトプラスト培養にお
いて効率良くプロトプラストの分裂、増殖を行なうこと
ができるコンディションド培地やイネのプロトプラスト
を取るために用いられるMS培地の窒素源をアミノ酸で置
換えたAA培地（Toriyamaら（1986）、Theor.,Appl.,Gen
et73:16−19）及びコンディションド培地にビタミン等
の養分及び植物ホルモンを補った培地等によるインディ
カ型のイネのプロトプラスト培養も行なわれているが培
養が容易ではなく、再現性も低いものである。すなわ
ち、従来のジャポニカ型のイネプロトプラストの培養に
用いられる培地を用いてインディカ型イネのプロトプラ
ストを培養しても必ずしもプロトプラストの分裂、その
後の細胞の増殖が行なわれることは少なく、品種によっ
ては培地がプロトプラストの培養に不適当なものもあっ
た。
いて効率良くプロトプラストの分裂、増殖を行なうこと
ができるコンディションド培地やイネのプロトプラスト
を取るために用いられるMS培地の窒素源をアミノ酸で置
換えたAA培地（Toriyamaら（1986）、Theor.,Appl.,Gen
et73:16−19）及びコンディションド培地にビタミン等
の養分及び植物ホルモンを補った培地等によるインディ
カ型のイネのプロトプラスト培養も行なわれているが培
養が容易ではなく、再現性も低いものである。すなわ
ち、従来のジャポニカ型のイネプロトプラストの培養に
用いられる培地を用いてインディカ型イネのプロトプラ
ストを培養しても必ずしもプロトプラストの分裂、その
後の細胞の増殖が行なわれることは少なく、品種によっ
ては培地がプロトプラストの培養に不適当なものもあっ
た。
近年、インディカ型イネでもプロトプラストの培養が
報告された（Kyozuka（1988）Theor Appl.Genet.,67,88
7−890、Wang（1989）Plant Cell Report8、329−332）
が、これらの方法もインディカ型イネの中では限られた
品種のみに適用されるに留まったものであった。
報告された（Kyozuka（1988）Theor Appl.Genet.,67,88
7−890、Wang（1989）Plant Cell Report8、329−332）
が、これらの方法もインディカ型イネの中では限られた
品種のみに適用されるに留まったものであった。
［発明が解決しようとする課題］ 従って、本発明の目的は、インディカ型イネのプロト
プラストの培養に共通して用いることができ、かつ高率
で再現性の良い培養ができるインディカ型イネプロトプ
ラスト用培地を提供することである。
プラストの培養に共通して用いることができ、かつ高率
で再現性の良い培養ができるインディカ型イネプロトプ
ラスト用培地を提供することである。
［課題を解決するための手段］ 本発明者らは鋭意研究の結果、アミノ酸及びコンディ
ションド培地を含む培地を用いてインディカ型イネのプ
ロトプラストを培養することにより、従来の培地に比べ
著しく分裂頻度が高く、再現性の高い培養ができること
を見出し、この発明を完成した。
ションド培地を含む培地を用いてインディカ型イネのプ
ロトプラストを培養することにより、従来の培地に比べ
著しく分裂頻度が高く、再現性の高い培養ができること
を見出し、この発明を完成した。
すなわち、本発明は、アミノ酸及びコンディションド
培地を含むインディカ型イネプロトプラスト用培地を提
供する。
培地を含むインディカ型イネプロトプラスト用培地を提
供する。
［発明の効果］ 本発明の培地を用いることにより、インディカ型のイ
ネのプロトプラストを効率良く、安定に分裂・増殖させ
ることができる。この技術はプロトプラストから植物体
を再生するのに利用することができる。また、植物細胞
について細胞融合、遺伝子組み換え等の技術を応用しイ
ネの広範囲での品種改良を図ることが可能になる。
ネのプロトプラストを効率良く、安定に分裂・増殖させ
ることができる。この技術はプロトプラストから植物体
を再生するのに利用することができる。また、植物細胞
について細胞融合、遺伝子組み換え等の技術を応用しイ
ネの広範囲での品種改良を図ることが可能になる。
［発明の具体的な説明］ 上述のように、本発明の培地は、アミノ酸及びコンデ
ィションド培地を含む。
ィションド培地を含む。
本発明において、コンディションド培地とは植物細胞
又はそのプロトプラストが一度以上その中で培養された
ことのある使い古された培地を意味するものである。こ
の使い古す前の培地としては、従来よりプロトプラスト
の培養に用いられている公知のもの、例えばMS培地、B5
培地、R2培地、N6培地等を用いることができる。また、
コンディションド培地を得るために培養する細胞の好ま
しい例としては例えばササニシキやニホンバレのような
イネの未熟種子の胚由来の細胞又は花粉由来の細胞を挙
げることができる。
又はそのプロトプラストが一度以上その中で培養された
ことのある使い古された培地を意味するものである。こ
の使い古す前の培地としては、従来よりプロトプラスト
の培養に用いられている公知のもの、例えばMS培地、B5
培地、R2培地、N6培地等を用いることができる。また、
コンディションド培地を得るために培養する細胞の好ま
しい例としては例えばササニシキやニホンバレのような
イネの未熟種子の胚由来の細胞又は花粉由来の細胞を挙
げることができる。
本発明の培地に含まれるアミノ酸の好ましい例として
は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リジ
ン、グリシン、アラニン、セリン、プロリン及びフェニ
ルアラニンを挙げることができる。培地は１種類のアミ
ン酸単独で含むものであっても、複数種類のアミノ酸を
含むものであっても良い。また、培地は、他の窒素源を
含まないことが好ましい。
は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リジ
ン、グリシン、アラニン、セリン、プロリン及びフェニ
ルアラニンを挙げることができる。培地は１種類のアミ
ン酸単独で含むものであっても、複数種類のアミノ酸を
含むものであっても良い。また、培地は、他の窒素源を
含まないことが好ましい。
本発明の培地は、アミノ酸を含む培地とコンディショ
ンド培地との混合物であってもよいし、コンディション
ド培地にアミノ酸を添加したものであってもよい。さら
にはコンディションド培地がアミノ酸を含んでいるもの
であってもよい。
ンド培地との混合物であってもよいし、コンディション
ド培地にアミノ酸を添加したものであってもよい。さら
にはコンディションド培地がアミノ酸を含んでいるもの
であってもよい。
アミノ酸を含む培地の基本培地は、コンディションド
培地を場合と同様、従来よりプロトプラストの培養に用
いられている公知のもの、例えばMS培地、B5培地、R2培
地、N6培地等を用いることができる。
培地を場合と同様、従来よりプロトプラストの培養に用
いられている公知のもの、例えばMS培地、B5培地、R2培
地、N6培地等を用いることができる。
アミノ酸の濃度は、本発明の培地全体の重量に対して
1mMないし60mM程度が好ましく、さらに好ましくは10mM
ないし20mM程度である。
1mMないし60mM程度が好ましく、さらに好ましくは10mM
ないし20mM程度である。
本発明の好ましい一態様では、アミノ酸を含む培地が
AA培地である。AA培地とは、MS培地を基本培地として硝
酸カリウム、硫酸アンモニウムを全く含まず、グルタミ
ン（12mM）、アスパラギン（2mM）、アルギニン（2m
M）、リジン（0.05mM）の４種類のアミノ酸を含む培地
をさす。
AA培地である。AA培地とは、MS培地を基本培地として硝
酸カリウム、硫酸アンモニウムを全く含まず、グルタミ
ン（12mM）、アスパラギン（2mM）、アルギニン（2m
M）、リジン（0.05mM）の４種類のアミノ酸を含む培地
をさす。
本発明において、コンディションド培地とアミノ酸含
有培地との混合比は、好ましくは1:0.1〜1:9、より好ま
しくは1:0.5〜1:2である。
有培地との混合比は、好ましくは1:0.1〜1:9、より好ま
しくは1:0.5〜1:2である。
また、本発明の培地は、カゼイン加水分解物を含むこ
とが好ましい。カゼイン加水分解物を含む場合には、プ
ロトプラストの分裂頻度がさらに高くなる。カゼイン加
水分解物の量は、培地全体の重量に対しては好ましくは
0.01〜１％、より好ましくは0.1〜0.5％である。
とが好ましい。カゼイン加水分解物を含む場合には、プ
ロトプラストの分裂頻度がさらに高くなる。カゼイン加
水分解物の量は、培地全体の重量に対しては好ましくは
0.01〜１％、より好ましくは0.1〜0.5％である。
本発明の培地を用いてインディカ型イネプロトプラス
トを培養すると、プロトプラストの分裂が高頻度に再現
性良く起きる。プロトプラストの培養は、好ましくは20
〜30℃、さらに好ましくは26〜28℃の暗所で行なうこと
ができる。なお、インディカ型イネプロトプラストは、
下記実施例に示すような、従来より公知の方法により得
ることができる。
トを培養すると、プロトプラストの分裂が高頻度に再現
性良く起きる。プロトプラストの培養は、好ましくは20
〜30℃、さらに好ましくは26〜28℃の暗所で行なうこと
ができる。なお、インディカ型イネプロトプラストは、
下記実施例に示すような、従来より公知の方法により得
ることができる。
［実施例］ 以下、本発明をより詳細に具体例を挙げて説明する
が、本発明の実施例はこれらに限られるものではない。
が、本発明の実施例はこれらに限られるものではない。
実施例１ プロトプラストの調製 インディカ型のイネ（品種:IR24）の葯培養によって
得られた花粉由来のカルスをAA培地に2.4−D 1ppm、カ
ゼイン加水分解物0.3g/l及びショ糖３％を添加した培地
で懸濁培養し、継代培養後５日目の懸濁培養細胞からプ
ロトプラストを分離した。得られた懸濁培養細胞は７日
毎に継代培養した。プロトプラストの単離に用いた酵素
液はセルラーゼ・オノズカRS4％、マセロザイムＲ−10
1％、、ペクトライエースＹ−23 0.3％、CaCl2・2H20O
.5％、デキストラン硝酸カリウム塩0.5％、浸透圧調整
剤としてマンニトール0.4Mから成るものであった。細胞
をこの酵素液中に入れ27℃で５時間酵素処理を行なっ
た。酵素液はナイロン篩で篩い、未消化の細胞塊を除
き、50gで５分間遠沈して酵素液を取り除きプロトプラ
ストを得た。得られたプロトプラストは0.4Mのマンニト
ールで３回洗浄した後、培養に供した。
得られた花粉由来のカルスをAA培地に2.4−D 1ppm、カ
ゼイン加水分解物0.3g/l及びショ糖３％を添加した培地
で懸濁培養し、継代培養後５日目の懸濁培養細胞からプ
ロトプラストを分離した。得られた懸濁培養細胞は７日
毎に継代培養した。プロトプラストの単離に用いた酵素
液はセルラーゼ・オノズカRS4％、マセロザイムＲ−10
1％、、ペクトライエースＹ−23 0.3％、CaCl2・2H20O
.5％、デキストラン硝酸カリウム塩0.5％、浸透圧調整
剤としてマンニトール0.4Mから成るものであった。細胞
をこの酵素液中に入れ27℃で５時間酵素処理を行なっ
た。酵素液はナイロン篩で篩い、未消化の細胞塊を除
き、50gで５分間遠沈して酵素液を取り除きプロトプラ
ストを得た。得られたプロトプラストは0.4Mのマンニト
ールで３回洗浄した後、培養に供した。
コンディションド培地の調製 イネの栽培品種“ササニシキ”の未熟種子の胚由来の
液体培養細胞を７日目毎に継代培養した。この培養細胞
約100mgを100mlのフラスコのR2培地30mlに植え、27℃、
90rpm/分、４日間培養した対数増殖期のちょうど中間に
あるものを15,000gで15分間遠心分離した。得られた上
清をコンディションド培地とした。これを冷凍保存した
ものを必要に応じて適宜利用した。
液体培養細胞を７日目毎に継代培養した。この培養細胞
約100mgを100mlのフラスコのR2培地30mlに植え、27℃、
90rpm/分、４日間培養した対数増殖期のちょうど中間に
あるものを15,000gで15分間遠心分離した。得られた上
清をコンディションド培地とした。これを冷凍保存した
ものを必要に応じて適宜利用した。
プロトプラストの培養 上記の方法で得られたプロトプラストは、上記で調製
したコンディションド培地のみ及びAA培地と1:1の割合
で混合した培地に培地1ml当たり３×105個のプロトプラ
スト密度になるように懸濁し、26℃の暗所に２週間放置
した後、プロトプラストの分裂率を調べた。結果を表１
に示す。
したコンディションド培地のみ及びAA培地と1:1の割合
で混合した培地に培地1ml当たり３×105個のプロトプラ
スト密度になるように懸濁し、26℃の暗所に２週間放置
した後、プロトプラストの分裂率を調べた。結果を表１
に示す。
表１から明らかなように、コンディションド培地単独
では全く分裂が観察されず、AA培地との混合培地では分
裂が観察された。
では全く分裂が観察されず、AA培地との混合培地では分
裂が観察された。
実施例２ カゼイン加水分解物0.3％及び2,4−D 1ppmを含むR2培
地（OohiraらPlant cell physiol.,14,1113−21（197
3））でイネの栽培品種“ニホンバレ”の胚盤由来のカ
ルスを培養し、その培養ろ液を得た。得られたろ液は単
独又はAA培地あるいはN6培地（Chuら（1975）Sientia S
cinica18,659−663）と1:1の割合で混合し、培地の最終
濃度で2,4−Ｄを1ppm、ショ糖を0.4Mになるように添加
し、pH4.2に調整後、濾過減菌して培養培地として用い
た。
地（OohiraらPlant cell physiol.,14,1113−21（197
3））でイネの栽培品種“ニホンバレ”の胚盤由来のカ
ルスを培養し、その培養ろ液を得た。得られたろ液は単
独又はAA培地あるいはN6培地（Chuら（1975）Sientia S
cinica18,659−663）と1:1の割合で混合し、培地の最終
濃度で2,4−Ｄを1ppm、ショ糖を0.4Mになるように添加
し、pH4.2に調整後、濾過減菌して培養培地として用い
た。
この培地1ml当たり３×105個のプロトプラスト密度に
なるようにプロトプラストを懸濁し、26℃の暗所に２週
間放置した。分裂した細胞数は顕微鏡で観察した。
なるようにプロトプラストを懸濁し、26℃の暗所に２週
間放置した。分裂した細胞数は顕微鏡で観察した。
結果を表２に示す。なお、分裂が全く観察されなかっ
たものを『−』、３％以上のプロトプラストの分裂が観
察されたものを『＋＋』と評価した。表２から明らかな
ように、AA培地単独及びコンディションド培地と通常イ
ネの培養によく使われるN6培地とを混合した培地では分
裂が観察されなかった。AA培地とコンディションド培地
を混合した培地でのみ分裂が観察された。
たものを『−』、３％以上のプロトプラストの分裂が観
察されたものを『＋＋』と評価した。表２から明らかな
ように、AA培地単独及びコンディションド培地と通常イ
ネの培養によく使われるN6培地とを混合した培地では分
裂が観察されなかった。AA培地とコンディションド培地
を混合した培地でのみ分裂が観察された。
実施例３ 実施例１の酵素液からペクトライエースＹ−23を除い
た以外は実施例１と同様にしてプロトプラストを分離し
た。得られたプロトプラストは、実施例１で用いたコン
ディションド培地とAA培地とを1:1の割合で混合したも
の、それにカゼイン加水分解物（シグマ社製＃Ｃ−062
6）を0.3g/l添加したもの及びコンディションド培地とN
6培地とを1:1の割合で混合し、さらにカゼイン加水分解
物を0.36g/lを添加した培養液で実施例１と同様にして
培養を行なった後、プロトプラストの分裂率を調べた。
結果を表３に示す。
た以外は実施例１と同様にしてプロトプラストを分離し
た。得られたプロトプラストは、実施例１で用いたコン
ディションド培地とAA培地とを1:1の割合で混合したも
の、それにカゼイン加水分解物（シグマ社製＃Ｃ−062
6）を0.3g/l添加したもの及びコンディションド培地とN
6培地とを1:1の割合で混合し、さらにカゼイン加水分解
物を0.36g/lを添加した培養液で実施例１と同様にして
培養を行なった後、プロトプラストの分裂率を調べた。
結果を表３に示す。
表３から明らかなように、コンディションド培地とAA
培地との混合培地よりもカゼイン加水分解物を添加した
培地の方が分裂率が高くなり、カゼイン加水分解物の添
加がプロトプラストの分裂に効果的であることが分かっ
た。
培地との混合培地よりもカゼイン加水分解物を添加した
培地の方が分裂率が高くなり、カゼイン加水分解物の添
加がプロトプラストの分裂に効果的であることが分かっ
た。
Claims (3)
- 【請求項１】アミノ酸及びコンディションド培地を含む
インディカ型イネプロトプラスト用培地。 - 【請求項２】AA培地及びコンディションド培地を含む請
求項１記載の培地。 - 【請求項３】カゼイン加水分解物をさらに含む請求項１
又は２記載インディカ型イネプロトプラスト用培地。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2063574A JP2944700B2 (ja) | 1990-03-14 | 1990-03-14 | インディカ型イネプロトプラスト用培地 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2063574A JP2944700B2 (ja) | 1990-03-14 | 1990-03-14 | インディカ型イネプロトプラスト用培地 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03262482A JPH03262482A (ja) | 1991-11-22 |
| JP2944700B2 true JP2944700B2 (ja) | 1999-09-06 |
Family
ID=13233162
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2063574A Expired - Fee Related JP2944700B2 (ja) | 1990-03-14 | 1990-03-14 | インディカ型イネプロトプラスト用培地 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2944700B2 (ja) |
-
1990
- 1990-03-14 JP JP2063574A patent/JP2944700B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03262482A (ja) | 1991-11-22 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |