JP2958019B2 - ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法 - Google Patents
ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規かつペプチド（特に、蛋白質）修飾試剤
として有用なポリエチレングリコール誘導体、および当
該ポリエチレングリコール誘導体によって修飾されたグ
アニジノ基を有するペプチドおよびその製造方法に関す
る。
として有用なポリエチレングリコール誘導体、および当
該ポリエチレングリコール誘導体によって修飾されたグ
アニジノ基を有するペプチドおよびその製造方法に関す
る。
近年、蛋白質の研究の発展に伴い種々の作用を持つペ
プチド、特に生理活性蛋白質が数多く発見されている。
また、遺伝子組み換え技術やペプチドの有機合成法の進
歩によりこれら生理活性ペプチド、またはその類似構造
化合物を大量に入手することが可能となってきた。これ
らの特殊な活性を持つペプチドには医薬品として非常に
有用のものが多い。
プチド、特に生理活性蛋白質が数多く発見されている。
また、遺伝子組み換え技術やペプチドの有機合成法の進
歩によりこれら生理活性ペプチド、またはその類似構造
化合物を大量に入手することが可能となってきた。これ
らの特殊な活性を持つペプチドには医薬品として非常に
有用のものが多い。
しかしながら、循環系に投与されたペプチドのクリア
ランスは一般に非常に速いことが知られているので、当
該ペプチドの持続性の改善が待望される。また、ペプチ
ドが異種動物から得られたものやペプチド・蛋白質工学
にて設計されたペプチドのようにヒト由来のものとは構
造の異なるものである場合には、抗体が産生されて重篤
な症状を引き起こす危険性が懸念されるので、当該ペプ
チドの抗原性の改善が待望される。
ランスは一般に非常に速いことが知られているので、当
該ペプチドの持続性の改善が待望される。また、ペプチ
ドが異種動物から得られたものやペプチド・蛋白質工学
にて設計されたペプチドのようにヒト由来のものとは構
造の異なるものである場合には、抗体が産生されて重篤
な症状を引き起こす危険性が懸念されるので、当該ペプ
チドの抗原性の改善が待望される。
これらのペプチドを医薬品として用いるためにはこれ
らの抗原性や持続性に対する問題を解決しなければなら
ない。このような問題点を解決する手段としてペプチド
を高分子化合物により化学的に修飾する方法はきわめて
有効な手段であることが知られている。
らの抗原性や持続性に対する問題を解決しなければなら
ない。このような問題点を解決する手段としてペプチド
を高分子化合物により化学的に修飾する方法はきわめて
有効な手段であることが知られている。
しかして、ポリエチレングリコール誘導体は、それ自
体免疫原性が無く、また水溶液中でペプチド（蛋白質）
の３次構造に影響を与えないという優れた特徴を持って
いるため、ペプチドの高分子修飾試剤として多用されて
いる。
体免疫原性が無く、また水溶液中でペプチド（蛋白質）
の３次構造に影響を与えないという優れた特徴を持って
いるため、ペプチドの高分子修飾試剤として多用されて
いる。
ポリエチレングリコール誘導体を用いてペプチドを修
飾するに際して、その活性化法としてはトリアジン誘導
体による活性化法〔稲田等Jpn.J.Cancer Res.（Gen
n），77,1264−1270（1986）．〕、Ｎ−ヒドロキシコハ
ク酸イミドによる活性エステル法〔レオナルド・エム等
Tetrahedron,40,1581−1584（1984）．〕、カルボニル
ジイミダゾールによる活性化法〔チャールズ・オー．ビ
ーチャム等Anal.Biochem,131,25−33（1983）．〕、ア
ルデヒドによる活性化法〔藤野等、特開昭61−178926号
公報〕等が一般的のものとして知られている。
飾するに際して、その活性化法としてはトリアジン誘導
体による活性化法〔稲田等Jpn.J.Cancer Res.（Gen
n），77,1264−1270（1986）．〕、Ｎ−ヒドロキシコハ
ク酸イミドによる活性エステル法〔レオナルド・エム等
Tetrahedron,40,1581−1584（1984）．〕、カルボニル
ジイミダゾールによる活性化法〔チャールズ・オー．ビ
ーチャム等Anal.Biochem,131,25−33（1983）．〕、ア
ルデヒドによる活性化法〔藤野等、特開昭61−178926号
公報〕等が一般的のものとして知られている。
しかしながら、これらの修飾法はいずれもペプチドの
Ｎ末端またはリジン残基側鎖のアミノ基を修飾するもの
である。
Ｎ末端またはリジン残基側鎖のアミノ基を修飾するもの
である。
一方、ペプチドには生理活性の発現にＮ末端アミノ基
やリジン側鎖のアミノ基が重要な役割を持つものが数多
く存在する。従って、この様なペプチドの場合には上記
の様な活性化試剤を用いてアミノ基を修飾することは活
性の低下につながるので好ましくない。また、リジン残
基のみを修飾するものではその修飾部位が限られてしま
う。ペプチドの性質をコントロールするためにはアミノ
基以外の種々の部位を修飾することが効果的であると考
えられるので他の官能基を修飾する試剤を開発する意義
は極めて大きい。現在迄に知られている他の官能基の修
飾試剤としては、メルカプト基を修飾するマレインイミ
ド誘導体、カルボキシル基を修飾するアミノ誘導体〔フ
ランクF.デービス等、特公昭56−23587号公報〕等が知
られている。しかしながら、メルカプト基は分子表面に
メルカプト基の形で存在しなければ修飾困難であると考
えられるが、その様な構造を持つペプチドは非常に少な
い。
やリジン側鎖のアミノ基が重要な役割を持つものが数多
く存在する。従って、この様なペプチドの場合には上記
の様な活性化試剤を用いてアミノ基を修飾することは活
性の低下につながるので好ましくない。また、リジン残
基のみを修飾するものではその修飾部位が限られてしま
う。ペプチドの性質をコントロールするためにはアミノ
基以外の種々の部位を修飾することが効果的であると考
えられるので他の官能基を修飾する試剤を開発する意義
は極めて大きい。現在迄に知られている他の官能基の修
飾試剤としては、メルカプト基を修飾するマレインイミ
ド誘導体、カルボキシル基を修飾するアミノ誘導体〔フ
ランクF.デービス等、特公昭56−23587号公報〕等が知
られている。しかしながら、メルカプト基は分子表面に
メルカプト基の形で存在しなければ修飾困難であると考
えられるが、その様な構造を持つペプチドは非常に少な
い。
また、アミノ誘導体による修飾の場合、ペプチド中の
アミノ基による副反応が起きる為に修飾試剤のみを選択
的に反応させることが困難である。
アミノ基による副反応が起きる為に修飾試剤のみを選択
的に反応させることが困難である。
一方、ペプチド中のグアニジノ基の低分子修飾試剤と
しては、フェニルグリオキザール（ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー、248巻、6171（196
8））、2,3−ブタンジオン（バイオケミストリー、12
巻、3915（1973））、1,2−シクロヘキサンジオン（ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、250
巻、557（1975）などが知られているが、ポリエチレン
グリコール誘導体でペプチド中のグアニジノ基を修飾で
きる誘導体は、未だ知られていない。
しては、フェニルグリオキザール（ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー、248巻、6171（196
8））、2,3−ブタンジオン（バイオケミストリー、12
巻、3915（1973））、1,2−シクロヘキサンジオン（ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、250
巻、557（1975）などが知られているが、ポリエチレン
グリコール誘導体でペプチド中のグアニジノ基を修飾で
きる誘導体は、未だ知られていない。
本発明の目的は、ペプチドのグアニジノ基を選択的に
修飾することのできるポリエチレングリコール誘導体を
提供することである。
修飾することのできるポリエチレングリコール誘導体を
提供することである。
本発明の他の目的は、当該ポリエチレングリコール誘
導体を使用することによって得られる修飾ペプチドを提
供することである。
導体を使用することによって得られる修飾ペプチドを提
供することである。
本発明のさらに他の目的は、当該修飾ペプチドの製造
方法を提供することである。
方法を提供することである。
本発明者らは上記目的を達成するために種々研究を重
ねて来たところ、下記ポリエチレングリコール誘導体
（Ｉ）がペプチドにおけるグアニジノ基を選択的に修飾
することを知見し、さらに研究を重ねて本発明を完成す
るに至った。
ねて来たところ、下記ポリエチレングリコール誘導体
（Ｉ）がペプチドにおけるグアニジノ基を選択的に修飾
することを知見し、さらに研究を重ねて本発明を完成す
るに至った。
本願第１番目の発明は式 （式中、Ｒは低級アルキル基を表し、ｎはポリエチレン
グリコール部分の平均分子量が約1,000〜12,000となる
任意の正の整数であることを表す。）で表されるポリエ
チレングリコール誘導体（Ｉ）である。
グリコール部分の平均分子量が約1,000〜12,000となる
任意の正の整数であることを表す。）で表されるポリエ
チレングリコール誘導体（Ｉ）である。
本願の第２番目の発明は、ポリエチレングリコール誘
導体（Ｉ）とグアニジノ基を有するペプチドとを反応さ
せることによって得られる修飾ペプチドである。
導体（Ｉ）とグアニジノ基を有するペプチドとを反応さ
せることによって得られる修飾ペプチドである。
本願の第３番目の発明は、ポリエチレングリコール誘
導体（Ｉ）とグアニジノ基を有するペプチドとを反応さ
せることによって得られる修飾ペプチド製造方法であ
る。
導体（Ｉ）とグアニジノ基を有するペプチドとを反応さ
せることによって得られる修飾ペプチド製造方法であ
る。
式（Ｉ）においてＲで表される低級アルキル基は、直
鎖状、分岐状のいずれでもよく、たとえばメチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル等の炭素
数１〜４の低級アルキル基が好適である。
鎖状、分岐状のいずれでもよく、たとえばメチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル等の炭素
数１〜４の低級アルキル基が好適である。
本発明のポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）は以下
の方法にて容易に製造することができる。
の方法にて容易に製造することができる。
即ち、式 ＲOCH2CH2）ｎ−OH （II） （式中、Ｒおよびｎは前記と同意義） で表されるモノアルコキシポリエチレングリコール（I
I）と適当な活性化試薬とを好適には塩基の存在下で反
応させることにより、式 ＲOCH2CH2）ｎ−Ｘ′ （III） 〔式中、Ｘ′はアルキルスルホニルオキシ（たとえば、
メチルスルホニルオキシ、エチルスルホニルオキシ等の
炭素数１〜４の低級アルキルスルホニルオキシ）、芳香
族スルホニルオキシ（たとえば、トルエンスルホニルオ
キシ等）またはハロゲン（塩素、臭素等）を表す〕 で表される活性体（III）に導びく。
I）と適当な活性化試薬とを好適には塩基の存在下で反
応させることにより、式 ＲOCH2CH2）ｎ−Ｘ′ （III） 〔式中、Ｘ′はアルキルスルホニルオキシ（たとえば、
メチルスルホニルオキシ、エチルスルホニルオキシ等の
炭素数１〜４の低級アルキルスルホニルオキシ）、芳香
族スルホニルオキシ（たとえば、トルエンスルホニルオ
キシ等）またはハロゲン（塩素、臭素等）を表す〕 で表される活性体（III）に導びく。
この際用いられる活性化試薬としては、たとえばア
ルキルスルホニルクロリド（そのアルキル部分としては
前記と同様の低級アルキルが好ましく、たとえばメチル
スルホニルクロリド、エチルスルホニルクロリド等が例
示される）〔Ronald K.Crossland等、J.Org.Chem.35,31
95（1970）〕、芳香族スルホニルクロリド（たとえ
ば、トルエンスルホニルクロリド等）〔Vladimir C.Sek
era等、J.Amer.Chem.Soc.55,345（1933）〕、五臭化
リン〔James Cason等、J.Org.Chem.26,3645（1961）〕
などが挙げられ、さらに式（Ｒ′）3P〔式中、Ｒ′は
アルキル基（たとえばオクチルなど）、アリル基（たと
えばフェニルなど）またはジアルキルアミノ基（たとえ
ばジメチルアミノなど）を表す。〕で表される化合物の
存在下で用いられる式Ｃ（Ｘ）４〔式中、Ｘはハロゲン
（たとえば、塩素、臭素等）を示す〕で表わされる化合
物〔J.Hooz等、Can.J.Chem.46,86（1968）〕等が挙げら
れる。
ルキルスルホニルクロリド（そのアルキル部分としては
前記と同様の低級アルキルが好ましく、たとえばメチル
スルホニルクロリド、エチルスルホニルクロリド等が例
示される）〔Ronald K.Crossland等、J.Org.Chem.35,31
95（1970）〕、芳香族スルホニルクロリド（たとえ
ば、トルエンスルホニルクロリド等）〔Vladimir C.Sek
era等、J.Amer.Chem.Soc.55,345（1933）〕、五臭化
リン〔James Cason等、J.Org.Chem.26,3645（1961）〕
などが挙げられ、さらに式（Ｒ′）3P〔式中、Ｒ′は
アルキル基（たとえばオクチルなど）、アリル基（たと
えばフェニルなど）またはジアルキルアミノ基（たとえ
ばジメチルアミノなど）を表す。〕で表される化合物の
存在下で用いられる式Ｃ（Ｘ）４〔式中、Ｘはハロゲン
（たとえば、塩素、臭素等）を示す〕で表わされる化合
物〔J.Hooz等、Can.J.Chem.46,86（1968）〕等が挙げら
れる。
この際用いられる塩基としては、ピリジン、トリアル
キルアミン（たとえば、トリエチルアミン）のような三
級の有機塩基もしくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、炭酸ナトリウム、水素化ナトリウム等の無機塩基が
挙げられる。反応溶媒はN,N−ジメチルホルムアミド、
ベンゼン、トルエン、低級ジアルキルエーテル、四塩化
炭素、クロロホルム、塩化メチレン、ジオキサン、テト
ラヒドロフラン等自体不活性な溶媒であればいずれでも
よく、またピリジンのように上記の塩基そのものを溶媒
にすることもできる。反応温度は、通常０℃〜150℃の
範囲である。
キルアミン（たとえば、トリエチルアミン）のような三
級の有機塩基もしくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、炭酸ナトリウム、水素化ナトリウム等の無機塩基が
挙げられる。反応溶媒はN,N−ジメチルホルムアミド、
ベンゼン、トルエン、低級ジアルキルエーテル、四塩化
炭素、クロロホルム、塩化メチレン、ジオキサン、テト
ラヒドロフラン等自体不活性な溶媒であればいずれでも
よく、またピリジンのように上記の塩基そのものを溶媒
にすることもできる。反応温度は、通常０℃〜150℃の
範囲である。
次いで活性体（III）をN,N−ジメチルホルムアミドや
テトラヒドロフラン等の適当な溶媒中で炭酸カリウム、
炭酸ナトリウム等の適当な無機塩基もしくはトリエチル
アミン、トリノルマルブチルアミン、ジアザビシクロ−
2,2,2−ウンデセン等の有機塩基を用いて60〜120℃の加
熱下にてヒドロキシアセトフェノンと反応させて式 （式中、Ｒおよびｎは前記と同意義） で表されるアセトフェノン誘導体（IV）を得る。
テトラヒドロフラン等の適当な溶媒中で炭酸カリウム、
炭酸ナトリウム等の適当な無機塩基もしくはトリエチル
アミン、トリノルマルブチルアミン、ジアザビシクロ−
2,2,2−ウンデセン等の有機塩基を用いて60〜120℃の加
熱下にてヒドロキシアセトフェノンと反応させて式 （式中、Ｒおよびｎは前記と同意義） で表されるアセトフェノン誘導体（IV）を得る。
得られたアエトフェノン誘導体（IV）を二酸化セレン
等の適当な酸化剤を用いてN,N−ジメチルホルムアミ
ド、ジオキサン等の反応に不活性な溶媒中、60〜120℃
にて酸化して目的とするポリエチレングリコール誘導体
（Ｉ）を製造することができる。
等の適当な酸化剤を用いてN,N−ジメチルホルムアミ
ド、ジオキサン等の反応に不活性な溶媒中、60〜120℃
にて酸化して目的とするポリエチレングリコール誘導体
（Ｉ）を製造することができる。
かくして製造されたポリエチレングリコール誘導体
（Ｉ）は自体既知の手段にて任意の純度のものとして単
離、精製することができる。
（Ｉ）は自体既知の手段にて任意の純度のものとして単
離、精製することができる。
本明細書において、ペプチドとは２個以上のアミノ酸
がペプチド結合により結合したものであり、好適には蛋
白質およびその類似構造物質である。その構成アミノ酸
の少なくとも一つは、少なくとも１個のグアニジノ基を
有するもの（たとえば、アルギニン）である。
がペプチド結合により結合したものであり、好適には蛋
白質およびその類似構造物質である。その構成アミノ酸
の少なくとも一つは、少なくとも１個のグアニジノ基を
有するもの（たとえば、アルギニン）である。
かかるペプチド、特に蛋白質としては、たとえばサブ
スタンスＰ（視床下部ホルモン）、コルチコトロピン、
リポトロピン、メラノトロピン（下垂体腺部ホルモ
ン）、アルギニン−バソプレシン（神経下垂体ホルモ
ン）、パラチロイドホルモン（甲状腺ホルモン）、サイ
モポエチン（胸腺因子）、インシュリン、グルカゴン
（膵臓ホルモン）、神経成長因子、上皮成長因子、イン
シュリン様成長因子−Ｉ、ヒト形質転換発育因子、成長
ホルモン放出因子即ちGRF、塩基性繊維芽細胞成長因子
（成長因子）、セクレチン、コレシストキニン、バソア
クティブインスチナルペプチド、モチリン（胃腸管ホル
モン）、ゴナドトロピン（絨毛膜ホルモン）、性腺刺戟
ホルモン放出ホルモン（性腺刺戟ホルモン）、レラキシ
ン（卵巣ホルモン）、血液凝固因子VIII因子およびIX因
子（血友病因子）、ストレプトキナーゼ、フィブリノリ
シン、デオキシリボヌクレアーゼ、スーパーオキシドジ
スムターゼ、エラスターゼ、アスパラギナーゼ（酵
素）、組織プラスミノ−ゲン活性化因子、即ちtPA、ウ
ロキナーゼ（線溶因子）、リンホカイン〔たとえば、イ
ンターロイキンＩおよびII〕、顆粒球マクロファージ・
コロニー刺戟因子即ちGM−CSF（刺戟因子）、エリスロ
ポエチン（増血因子）、カルシトニン遺伝子関連ペプチ
ド（Ca調節ホルモン）、心房性ナトリウム利尿ペプチド
（利尿ホルモン）等の生理活性を有するペプチドならび
にここに例示したペプチドと同様の生理活性を有する類
似構造物質が例示される。なお、上記の例示において
（ ）内は当該ペプチドの用途を記載するものである。
スタンスＰ（視床下部ホルモン）、コルチコトロピン、
リポトロピン、メラノトロピン（下垂体腺部ホルモ
ン）、アルギニン−バソプレシン（神経下垂体ホルモ
ン）、パラチロイドホルモン（甲状腺ホルモン）、サイ
モポエチン（胸腺因子）、インシュリン、グルカゴン
（膵臓ホルモン）、神経成長因子、上皮成長因子、イン
シュリン様成長因子−Ｉ、ヒト形質転換発育因子、成長
ホルモン放出因子即ちGRF、塩基性繊維芽細胞成長因子
（成長因子）、セクレチン、コレシストキニン、バソア
クティブインスチナルペプチド、モチリン（胃腸管ホル
モン）、ゴナドトロピン（絨毛膜ホルモン）、性腺刺戟
ホルモン放出ホルモン（性腺刺戟ホルモン）、レラキシ
ン（卵巣ホルモン）、血液凝固因子VIII因子およびIX因
子（血友病因子）、ストレプトキナーゼ、フィブリノリ
シン、デオキシリボヌクレアーゼ、スーパーオキシドジ
スムターゼ、エラスターゼ、アスパラギナーゼ（酵
素）、組織プラスミノ−ゲン活性化因子、即ちtPA、ウ
ロキナーゼ（線溶因子）、リンホカイン〔たとえば、イ
ンターロイキンＩおよびII〕、顆粒球マクロファージ・
コロニー刺戟因子即ちGM−CSF（刺戟因子）、エリスロ
ポエチン（増血因子）、カルシトニン遺伝子関連ペプチ
ド（Ca調節ホルモン）、心房性ナトリウム利尿ペプチド
（利尿ホルモン）等の生理活性を有するペプチドならび
にここに例示したペプチドと同様の生理活性を有する類
似構造物質が例示される。なお、上記の例示において
（ ）内は当該ペプチドの用途を記載するものである。
本発明においてペプチドは遺伝子工学産物、ヒトを含
む各種動物由来のもの、合成品等のいずれの方法で製造
されたものでもよい。
む各種動物由来のもの、合成品等のいずれの方法で製造
されたものでもよい。
本発明の修飾ペプチドの製造は、ポリエチレングリコ
ール誘導体（Ｉ）とグアニジノ基を有するペプチドとを
反応させることによって行われる。
ール誘導体（Ｉ）とグアニジノ基を有するペプチドとを
反応させることによって行われる。
当該反応に際しては、ポリエチレングリコール誘導体
（Ｉ）をグアニジノ基を有するペプチド中のグアニジノ
基に対して１〜100倍モル程度用いることが好ましい。
ただし低修飾率のペプチドを得たい場合には１モル程度
以下のもの（たとえば、0.1倍モル〜１倍モル）も用い
ることができる。当該ププチドとペリエチレングリコー
ル誘導体（Ｉ）のモル比、反応温度、pH等を調節するこ
とにより修飾の程度を任意に選択することが出来る。ま
た、反応に用いる溶媒は反応を妨害しないものであれば
いずれでもよく、たとえばトリス塩酸緩衝液、炭酸ナト
リウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、Ｎ−エチル
モルホリン−酢酸緩衝液、マレイン酸ナトリウム緩衝
液、酢酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液が挙げられる。ま
た、当該ペプチドを失活させず、かつ反応に不活性な有
機溶媒、たとえばメタノール、エタノール、プロパノー
ル等の低級アルコールやアセトニトリル、ジオキサン、
テトラヒドロフラン等を添加してもよい。反応のpHは一
般的に６〜10の範囲で選択することが好ましいが、中性
から弱塩基性が特に好ましい。ただし、アミノ末端に保
護されていないα−アミノ基を有するペプチドの場合
は、やや酸性側のpH5.5〜6.5が好ましい。反応温度は当
該ペプチドが失活しない温度であればいずれでもよく、
たとえば０〜25℃の範囲が好ましい。反応は通常暗所で
行い、反応時間は３〜72時間で充分である。
（Ｉ）をグアニジノ基を有するペプチド中のグアニジノ
基に対して１〜100倍モル程度用いることが好ましい。
ただし低修飾率のペプチドを得たい場合には１モル程度
以下のもの（たとえば、0.1倍モル〜１倍モル）も用い
ることができる。当該ププチドとペリエチレングリコー
ル誘導体（Ｉ）のモル比、反応温度、pH等を調節するこ
とにより修飾の程度を任意に選択することが出来る。ま
た、反応に用いる溶媒は反応を妨害しないものであれば
いずれでもよく、たとえばトリス塩酸緩衝液、炭酸ナト
リウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、Ｎ−エチル
モルホリン−酢酸緩衝液、マレイン酸ナトリウム緩衝
液、酢酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液が挙げられる。ま
た、当該ペプチドを失活させず、かつ反応に不活性な有
機溶媒、たとえばメタノール、エタノール、プロパノー
ル等の低級アルコールやアセトニトリル、ジオキサン、
テトラヒドロフラン等を添加してもよい。反応のpHは一
般的に６〜10の範囲で選択することが好ましいが、中性
から弱塩基性が特に好ましい。ただし、アミノ末端に保
護されていないα−アミノ基を有するペプチドの場合
は、やや酸性側のpH5.5〜6.5が好ましい。反応温度は当
該ペプチドが失活しない温度であればいずれでもよく、
たとえば０〜25℃の範囲が好ましい。反応は通常暗所で
行い、反応時間は３〜72時間で充分である。
反応終了後、反応液を塩析やゲル濾過、イオン交換ク
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフィー、限外濾過、逆相HPLCによる分
取等の通常の蛋白質の精製法で精製して目的の修飾ペプ
チドを得ることができる。
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフィー、限外濾過、逆相HPLCによる分
取等の通常の蛋白質の精製法で精製して目的の修飾ペプ
チドを得ることができる。
ところで、低分子修飾試剤であるフェニルグリオキザ
ールの研究において、試薬濃度を大きくするなど条件を
過酷にすると、アミノ末端のα−アミノ基が脱アミノ反
応を起こすという副反応が知られている。（生物化学実
験法12、蛋白質の化学修飾（上）、62〜69頁、（学会出
版センター、1981）、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、248巻、6171（1968））本発明のポ
リエチレングリコール誘導体（Ｉ）を用いた修飾におい
ても同様の副反応の可能性が考えられる。そこでこのよ
うな副反応が懸念される場合には、グアニジノ基を有す
るペプチドのアミノ基を適当な保護基で保護した後、ポ
リエチレングリコール誘導体（Ｉ）と反応させ、続いて
アミノ基の保護基を脱保護するという方法によって、修
飾ペプチドを製造する方が得策な場合もある。アミノ基
の保護基は、ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）と反
応性がなく、さらに当該ペプチドを失活させることなく
脱保護されるものであれば良く、例えば、スクシニル
基、マレイル基、２−メチルマレイル基、2,3−ジメチ
ルマレイル基、エキソ−シス−3,6−エンドオキソ−Δ
４−テトラヒドロフタロイル基、エキソ−シス−3,6−
エンドオキシヘキサヒドロフタロイル基、テトラフルオ
ロスクシニル基等が挙げられる。保護基の導入は、当該
分野の公知の方法によって行うことができる。導入試剤
としては、相当する酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エ
ステル等が用いられるが、一般的には相当する酸無水物
が多く用いられる。反応溶媒としては、反応を妨害しな
いものであればいずれでもよく、たとえば、炭酸ナトリ
ウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、Ｎ−エチルモ
ルホリン−酢酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸
緩衝液等が挙げられる。また当該ペプチドを失活させ
ず、かつ反応に不活性な有機溶媒、たとえばメタノー
ル、エタノール、プロパノール等の低級アルコールやア
セトニトリル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等を添
加しても良い。反応のpHは６〜10の範囲で選択すること
が好ましいが、中性から弱塩基性が特に好ましい。反応
温度は当該ペプチドが失活しない温度であれば、いずれ
でも良く、たとえば−５〜25℃の範囲が好ましい。反応
時間は30分〜36時間で充分である。
ールの研究において、試薬濃度を大きくするなど条件を
過酷にすると、アミノ末端のα−アミノ基が脱アミノ反
応を起こすという副反応が知られている。（生物化学実
験法12、蛋白質の化学修飾（上）、62〜69頁、（学会出
版センター、1981）、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、248巻、6171（1968））本発明のポ
リエチレングリコール誘導体（Ｉ）を用いた修飾におい
ても同様の副反応の可能性が考えられる。そこでこのよ
うな副反応が懸念される場合には、グアニジノ基を有す
るペプチドのアミノ基を適当な保護基で保護した後、ポ
リエチレングリコール誘導体（Ｉ）と反応させ、続いて
アミノ基の保護基を脱保護するという方法によって、修
飾ペプチドを製造する方が得策な場合もある。アミノ基
の保護基は、ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）と反
応性がなく、さらに当該ペプチドを失活させることなく
脱保護されるものであれば良く、例えば、スクシニル
基、マレイル基、２−メチルマレイル基、2,3−ジメチ
ルマレイル基、エキソ−シス−3,6−エンドオキソ−Δ
４−テトラヒドロフタロイル基、エキソ−シス−3,6−
エンドオキシヘキサヒドロフタロイル基、テトラフルオ
ロスクシニル基等が挙げられる。保護基の導入は、当該
分野の公知の方法によって行うことができる。導入試剤
としては、相当する酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エ
ステル等が用いられるが、一般的には相当する酸無水物
が多く用いられる。反応溶媒としては、反応を妨害しな
いものであればいずれでもよく、たとえば、炭酸ナトリ
ウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、Ｎ−エチルモ
ルホリン−酢酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸
緩衝液等が挙げられる。また当該ペプチドを失活させ
ず、かつ反応に不活性な有機溶媒、たとえばメタノー
ル、エタノール、プロパノール等の低級アルコールやア
セトニトリル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等を添
加しても良い。反応のpHは６〜10の範囲で選択すること
が好ましいが、中性から弱塩基性が特に好ましい。反応
温度は当該ペプチドが失活しない温度であれば、いずれ
でも良く、たとえば−５〜25℃の範囲が好ましい。反応
時間は30分〜36時間で充分である。
反応終了後、反応液を塩析やゲル濾過、イオン交換ク
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフィー、限外濾過、逆相HPLCによる分
取等の通常のペプチドおよび蛋白質の精製法で精製して
目的のアミノ基が保護されたペプチドを得ることができ
るが、単離精製することなく引き続いてポリエチレング
リコール誘導体（Ｉ）と反応させアミノ基が保護された
ポリエチレングリコール修飾ペプチドを得ることもでき
る。
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフィー、限外濾過、逆相HPLCによる分
取等の通常のペプチドおよび蛋白質の精製法で精製して
目的のアミノ基が保護されたペプチドを得ることができ
るが、単離精製することなく引き続いてポリエチレング
リコール誘導体（Ｉ）と反応させアミノ基が保護された
ポリエチレングリコール修飾ペプチドを得ることもでき
る。
アミノ基が保護されたグアニジノ基を有するペプチド
とポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）との反応および
反応終了後の精製は、前述の反応条件および精製法と同
様の反応条件および精製法で行うことができる。
とポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）との反応および
反応終了後の精製は、前述の反応条件および精製法と同
様の反応条件および精製法で行うことができる。
アミノ基の保護基の脱保護は反応液を酸性に保つこと
によって行うことができる。反応のpHは１〜６の範囲で
選択することが好ましい。酸性に保つ方法としては、当
該ペプチドが失活しない方法ならばどのような方法でも
良く、たとえば酸（酢酸、トリフルオロ酢酸、有機スル
ホン酸等の有機酸、塩酸等の無機酸等）を用いる方法、
ダウエックス50W等の酸性樹脂を用いる方法、リン酸緩
衝液、クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等の緩衝
液を用いる方法、およびこれらを組み合わせた方法等が
挙げられる。反応は一般的には水溶液のみで行うが、場
合によっては、当該ペプチドを失活させず、かつ反応に
不活性な有機溶媒、たとえばメタノール、エタノール、
プロパノール等の低級アルコールやアセトニトリル、ジ
オキサン、テトラヒドロフラン等を添加しても良い。反
応温度は当該ペプチドが失活しない温度であればいずれ
でも良く、たとえば０〜40℃の範囲が好ましい。反応時
間は５分〜60時間で充分である。
によって行うことができる。反応のpHは１〜６の範囲で
選択することが好ましい。酸性に保つ方法としては、当
該ペプチドが失活しない方法ならばどのような方法でも
良く、たとえば酸（酢酸、トリフルオロ酢酸、有機スル
ホン酸等の有機酸、塩酸等の無機酸等）を用いる方法、
ダウエックス50W等の酸性樹脂を用いる方法、リン酸緩
衝液、クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等の緩衝
液を用いる方法、およびこれらを組み合わせた方法等が
挙げられる。反応は一般的には水溶液のみで行うが、場
合によっては、当該ペプチドを失活させず、かつ反応に
不活性な有機溶媒、たとえばメタノール、エタノール、
プロパノール等の低級アルコールやアセトニトリル、ジ
オキサン、テトラヒドロフラン等を添加しても良い。反
応温度は当該ペプチドが失活しない温度であればいずれ
でも良く、たとえば０〜40℃の範囲が好ましい。反応時
間は５分〜60時間で充分である。
反応終了後、反応液を塩析やゲル濾過、イオン交換ク
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフィー、限外濾過、逆相HPLCによる分
取等の通常の蛋白質の精製法で精製した目的の修飾ペプ
チドを得ることができる。
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフィー、限外濾過、逆相HPLCによる分
取等の通常の蛋白質の精製法で精製した目的の修飾ペプ
チドを得ることができる。
本修飾ペプチドは通常の精製、たとえば皮下的、筋肉
内的もしくは静寂内的適用のための注射溶液のような適
切な通常の投与形態に調製することが出来る。かかる製
剤は自体既知の方法によって製造される。
内的もしくは静寂内的適用のための注射溶液のような適
切な通常の投与形態に調製することが出来る。かかる製
剤は自体既知の方法によって製造される。
調製された修飾ペプチドは医薬品組成物として哺乳動
物（ヒト、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ブタ等）に投与す
ることができる。
物（ヒト、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ブタ等）に投与す
ることができる。
その投与量は、たとえば実施例３で得た化学修飾tPA
を心筋硬塞の治療のために投与する場合には通常１〜10
0mgを１日１回から数回に分けて投与される。
を心筋硬塞の治療のために投与する場合には通常１〜10
0mgを１日１回から数回に分けて投与される。
本発明のポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）はペプ
チド中のグアニジノ基を選択的に修飾することができる
ものである。
チド中のグアニジノ基を選択的に修飾することができる
ものである。
当該ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）にて修飾さ
れたペプチドは対応する非修飾ペプチドと比較すると、
非常に安定な化合物であり、さらに生体内クリアランス
も著しく遅延（即ち、持続性が延長）され、長時間有効
にその生理活性を示す。しかも本修飾ペプチドは非修飾
ペプチドの有する生理活性をそのまま有するものであ
り、当該修飾ペプチドは医薬品として極めて有効であ
る。
れたペプチドは対応する非修飾ペプチドと比較すると、
非常に安定な化合物であり、さらに生体内クリアランス
も著しく遅延（即ち、持続性が延長）され、長時間有効
にその生理活性を示す。しかも本修飾ペプチドは非修飾
ペプチドの有する生理活性をそのまま有するものであ
り、当該修飾ペプチドは医薬品として極めて有効であ
る。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明する
が、本発明はこれらによって制限されるものではない。
が、本発明はこれらによって制限されるものではない。
なお、以下の記載において各略号はそれぞれ次のこと
を意味する。
を意味する。
Asx :アスパラギン酸またはアスパラギン Glx :グルタミン酸またはグルタミン Ser :セリン Gly :グリシン His :ヒスチジン Arg :アルギニン Thr :スレオニン Ala :アラニン Pro :プロリン Tyr :チロシン Val :バリン Met :メチオニン Ile :イソロイシン Leu :ロイシン Phe :フエニルアラニン Lys.:リジン 実施例１ （１） モノメトキシポリエチレングリコールトシレー
ト ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（平均分
子量5000、40g）をトルエン160mlおよび塩化メチレン80
mlの混合溶媒に溶解した。
ト ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（平均分
子量5000、40g）をトルエン160mlおよび塩化メチレン80
mlの混合溶媒に溶解した。
塩化パラトルエンスルホニル（8.0g）、ついでトリエ
チルアミン5.8mlを加え室温で６時間攪拌した。次に塩
化パラトルエンスルホニル（8.0g）を追加し、10時間攪
拌した。不溶物を濾別し濾液を減圧濃縮した。得られた
残渣をシリカゲルカラムで精製し標記モノメトキシポリ
エチレングリコールトシレート32.4gを得た。（収率78.
6％）、m.p.55〜57℃ 1H−NMR（CDCl3）,TMS,90（MHz），δ2.18（ｓ），δ
3.38（ｓ），δ3.62（ｓ），δ7.3（ABq） （２） ４−モノメトキシポリエチレングリコール−ア
セトフェノン （１）で得たモノメトキシポリエチレングリコールト
シレート（20g）および４−ヒドロキシアセトフェノン
（5.6g）をN,N−ジメチルホルムアミド200mlに溶解し
た。炭酸カリウム（5.6g）を加え120℃の油浴中で４時
間攪拌した。
チルアミン5.8mlを加え室温で６時間攪拌した。次に塩
化パラトルエンスルホニル（8.0g）を追加し、10時間攪
拌した。不溶物を濾別し濾液を減圧濃縮した。得られた
残渣をシリカゲルカラムで精製し標記モノメトキシポリ
エチレングリコールトシレート32.4gを得た。（収率78.
6％）、m.p.55〜57℃ 1H−NMR（CDCl3）,TMS,90（MHz），δ2.18（ｓ），δ
3.38（ｓ），δ3.62（ｓ），δ7.3（ABq） （２） ４−モノメトキシポリエチレングリコール−ア
セトフェノン （１）で得たモノメトキシポリエチレングリコールト
シレート（20g）および４−ヒドロキシアセトフェノン
（5.6g）をN,N−ジメチルホルムアミド200mlに溶解し
た。炭酸カリウム（5.6g）を加え120℃の油浴中で４時
間攪拌した。
不溶物を濾別し濾液を減圧濃縮した。得られた残渣を
シリカゲルカラム精製し、標記４−モノメトキシポリエ
チレングリコール−アセトフェノン（14.7g）を得た。
（収率73.9％）、m.p.55〜57℃ 1H−NMR（CDCl3）,TMS,90（MHz），δ2.42（ｓ），δ
3.32（ｓ），δ2.64（ｓ），δ7.64（ABq） （３） ４−モノメトキシポリエチレングリコール−フ
ェニルグリオキザール （２）で得た４−モノメトキシポリエチレングリコー
ル−アセトフェノン（50g）を1,4−ジオキサン500mlに
溶解した。二酸化セレン（10.8g）を加え４時間還流し
た。不溶物を濾別し濾液を減圧濃縮した。得られた残渣
をシリカゲルカラム精製し４−モノメトキシポリエチレ
ングリコール−フェニルグリオキザール27gを得た。
（収率53.8％）、m.p.55〜57℃ 1H−NMR（CDCl3）,TMS,90（MHz），δ3.38（ｓ），δ
3.66（ｓ），δ7.48（ABq） 実施例２ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾組織プラスミ
ノーゲン活性化因子（ｔ−PA）の製造： ｔ−PA溶液（12mg/ml、0.1M塩化ナトリウム、pH3）42
0μに0.2M炭酸水素ナトリウム水（1MKSCN、pH8.5）4.
6mlを加えた後、実施例１で得た４−モノメトキシポリ
エチレングリコール−フェニルグリオキザール150mgを
加え室温にて４時間攪拌した。1N塩酸水にてpH3に調整
した。0.6％酢酸水中で透析した後凍結乾燥した。得ら
れた凍結乾燥品をセファクリルＳ−200カラムにてゲル
濾過精製した後、セファデックスＧ−50Fにより精製
し、目的物1.9mgを得た。酸分解物（6N塩酸、110℃、24
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 49.0（50）;Glx 51.8（52）； Ser 46.7（48）;Gly 45.4（43）； His 16.4（16）;Arg 26.7（35）； Thr 24.3（25）;Ala＊32 （32）； Pro 30.8（29）;Tyr 23.7（24）； Val 21.8（25）;Met 4.1（５）； Ile 17.1（19）;Leu 40.6（39）； Phe 16.6（16）;Lys 22.8（21）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 この結果Arg残基が選択的に修飾されていることがわ
かる。
シリカゲルカラム精製し、標記４−モノメトキシポリエ
チレングリコール−アセトフェノン（14.7g）を得た。
（収率73.9％）、m.p.55〜57℃ 1H−NMR（CDCl3）,TMS,90（MHz），δ2.42（ｓ），δ
3.32（ｓ），δ2.64（ｓ），δ7.64（ABq） （３） ４−モノメトキシポリエチレングリコール−フ
ェニルグリオキザール （２）で得た４−モノメトキシポリエチレングリコー
ル−アセトフェノン（50g）を1,4−ジオキサン500mlに
溶解した。二酸化セレン（10.8g）を加え４時間還流し
た。不溶物を濾別し濾液を減圧濃縮した。得られた残渣
をシリカゲルカラム精製し４−モノメトキシポリエチレ
ングリコール−フェニルグリオキザール27gを得た。
（収率53.8％）、m.p.55〜57℃ 1H−NMR（CDCl3）,TMS,90（MHz），δ3.38（ｓ），δ
3.66（ｓ），δ7.48（ABq） 実施例２ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾組織プラスミ
ノーゲン活性化因子（ｔ−PA）の製造： ｔ−PA溶液（12mg/ml、0.1M塩化ナトリウム、pH3）42
0μに0.2M炭酸水素ナトリウム水（1MKSCN、pH8.5）4.
6mlを加えた後、実施例１で得た４−モノメトキシポリ
エチレングリコール−フェニルグリオキザール150mgを
加え室温にて４時間攪拌した。1N塩酸水にてpH3に調整
した。0.6％酢酸水中で透析した後凍結乾燥した。得ら
れた凍結乾燥品をセファクリルＳ−200カラムにてゲル
濾過精製した後、セファデックスＧ−50Fにより精製
し、目的物1.9mgを得た。酸分解物（6N塩酸、110℃、24
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 49.0（50）;Glx 51.8（52）； Ser 46.7（48）;Gly 45.4（43）； His 16.4（16）;Arg 26.7（35）； Thr 24.3（25）;Ala＊32 （32）； Pro 30.8（29）;Tyr 23.7（24）； Val 21.8（25）;Met 4.1（５）； Ile 17.1（19）;Leu 40.6（39）； Phe 16.6（16）;Lys 22.8（21）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 この結果Arg残基が選択的に修飾されていることがわ
かる。
目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
通りである。
○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム：マイクロボンダスフェアーC4（3.9×150mm）
（ウォーターズ社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフロロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:214nm 保持時間:15.2分 ○分子ふるい高速液体クロマトグラフィー カラム:TSK G3000SW 7.5×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M 食塩水（pH4.0） 流速:1ml/分 保持時間:11.4分 実施例３ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾組織プラスミ
ノーゲン活性化因子（ｔ−Pa）IIの製造： ｔ−PA溶液（12mg/ml、0.1M塩化ナトリウム、pH3）42
0μに0.2M炭酸水素ナトリウム水（1MKSCN、pH8.5）4.
6mlを加えた後、実施例１で得た４−モノメトキシポリ
エチレングリコール−フェニルグリオキザール25.2mgを
加え室温にて３時間攪拌した。1N塩酸水溶液にてpH4に
調整した。反応液をウォーターズ製マイクロボンダスフ
ェアーC4、５μ、300Å、φ3.9×150mmカラムを使用し
て高速液体クロマトグラフィーにて分取精製した。目的
物の溶出はトリフロロ酢酸を0.1％加えたアセトニトリ
ル水溶液を用い毎分1mlの流速でアセトニトリル濃度を3
3％から43％に毎分0.5％の割合で上昇させることにより
行った。得られた生成物の上記条件での高速液体クロマ
トグラフィーの溶出時間は13.2分であった。収量0.8m
g。本操作により低修飾率のポリエチレングリコール誘
導体（Ｉ）修飾ｔ−PAが得られた。
（ウォーターズ社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフロロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:214nm 保持時間:15.2分 ○分子ふるい高速液体クロマトグラフィー カラム:TSK G3000SW 7.5×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M 食塩水（pH4.0） 流速:1ml/分 保持時間:11.4分 実施例３ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾組織プラスミ
ノーゲン活性化因子（ｔ−Pa）IIの製造： ｔ−PA溶液（12mg/ml、0.1M塩化ナトリウム、pH3）42
0μに0.2M炭酸水素ナトリウム水（1MKSCN、pH8.5）4.
6mlを加えた後、実施例１で得た４−モノメトキシポリ
エチレングリコール−フェニルグリオキザール25.2mgを
加え室温にて３時間攪拌した。1N塩酸水溶液にてpH4に
調整した。反応液をウォーターズ製マイクロボンダスフ
ェアーC4、５μ、300Å、φ3.9×150mmカラムを使用し
て高速液体クロマトグラフィーにて分取精製した。目的
物の溶出はトリフロロ酢酸を0.1％加えたアセトニトリ
ル水溶液を用い毎分1mlの流速でアセトニトリル濃度を3
3％から43％に毎分0.5％の割合で上昇させることにより
行った。得られた生成物の上記条件での高速液体クロマ
トグラフィーの溶出時間は13.2分であった。収量0.8m
g。本操作により低修飾率のポリエチレングリコール誘
導体（Ｉ）修飾ｔ−PAが得られた。
得られた目的物はSDSゲル電気泳動において、蛋白質
換算で約9000の０位置に泳動した。
換算で約9000の０位置に泳動した。
実施例４ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾成長ホルモン
放出因子〔GRF（１−29）NH2〕の製造： 成長ホルモン放出因子〔GRF（１−29）NH2〕100mgを
水7.3mlに溶解した。0.1Mリン酸緩衝液（pH7.2）66mlお
よび実施例１で得た４−モノメトキシポリエチレングリ
コール−フェニルグリオキザール3.6gを加え、暗所室温
で終夜攪拌した。反応液20mlを透析した後凍結乾燥し粗
生成物657mgを得た。このものをファルマシア製セファ
クリルＳ−200カラムφ２×70cmを使用し、0.1M食塩水
で流速1ml毎分の条件でゲル濾過精製を行った。得られ
た分画を山村科学製YMCパックAM304ODSφ１×30cmカラ
ムを用い、高速液体クロマトグラフィーにて分取精製し
た。目的物の溶出はトリフロロ酢酸を0.1％加えたアセ
トニトリル水溶液を用い毎分3mlの流速でアセトニトリ
ル濃度を０％から80％に毎分２％の割合で上昇させるこ
とにより行った。収量30.0mg。
放出因子〔GRF（１−29）NH2〕の製造： 成長ホルモン放出因子〔GRF（１−29）NH2〕100mgを
水7.3mlに溶解した。0.1Mリン酸緩衝液（pH7.2）66mlお
よび実施例１で得た４−モノメトキシポリエチレングリ
コール−フェニルグリオキザール3.6gを加え、暗所室温
で終夜攪拌した。反応液20mlを透析した後凍結乾燥し粗
生成物657mgを得た。このものをファルマシア製セファ
クリルＳ−200カラムφ２×70cmを使用し、0.1M食塩水
で流速1ml毎分の条件でゲル濾過精製を行った。得られ
た分画を山村科学製YMCパックAM304ODSφ１×30cmカラ
ムを用い、高速液体クロマトグラフィーにて分取精製し
た。目的物の溶出はトリフロロ酢酸を0.1％加えたアセ
トニトリル水溶液を用い毎分3mlの流速でアセトニトリ
ル濃度を０％から80％に毎分２％の割合で上昇させるこ
とにより行った。収量30.0mg。
酸分解物（6N塩酸110℃24時間）中のアミノ酸分析値 Asx 2.94（３）;Glx 2.97（２）； Ser 2.81（３）;Gly 1.36（１）； Arg 1.04（３）;Thr 0.97（１）； Ala 1.48（３）;Tyr 1.02（２）； Val 0.77（１）;Met 0.70（１）； Ile 2.01（２）;Leu＊4.00（４）； Phe 0.96（１）;Lys 1.52（２）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
通りである。
○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム：マイクロボンダスフェアーC18（3.9×150m
m）（ウォーターズ社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフロロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフロロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:20％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 保持時間:26.9分 ○分子ふるい高速液体クロマトグラフィー カラム:Shodex OH−B804 7.6×500mm（昭和電工） 溶出液:0.1M 食塩水（pH4） 流速:1ml/分 保持時間:13.8分 実施例５ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾顆粒球マクロ
ファージコロニー刺戟因子（GM−CSF）の製造： GM−CSF（500μg/500ml水溶液）に実施例１で得た４
−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグリ
オキザール11.0mgを0.1Mリン酸緩衝液（pH8.5）500μ
に溶解した溶液を加えた。室温で７時間攪拌した。反応
生成物をウォーターズ社製マイクロボンダスフェアーC
18（５μ、100Å、φ3.9×150mm）カラムを使用し高速
液体クロマトグラフィーにて分取精製した。目的物の溶
出はトリフロロ酢酸を0.1％加えたアセトニトリル水溶
液を用い、アセトニトリル濃度を36％から56％に毎分１
％の割合で上昇させることにより行った。収量0.4mg。
得られた精製物は上記条件での高速液体クロマトグラフ
ィーで12.3分の溶出時間を示した。
m）（ウォーターズ社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフロロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフロロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:20％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 保持時間:26.9分 ○分子ふるい高速液体クロマトグラフィー カラム:Shodex OH−B804 7.6×500mm（昭和電工） 溶出液:0.1M 食塩水（pH4） 流速:1ml/分 保持時間:13.8分 実施例５ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾顆粒球マクロ
ファージコロニー刺戟因子（GM−CSF）の製造： GM−CSF（500μg/500ml水溶液）に実施例１で得た４
−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグリ
オキザール11.0mgを0.1Mリン酸緩衝液（pH8.5）500μ
に溶解した溶液を加えた。室温で７時間攪拌した。反応
生成物をウォーターズ社製マイクロボンダスフェアーC
18（５μ、100Å、φ3.9×150mm）カラムを使用し高速
液体クロマトグラフィーにて分取精製した。目的物の溶
出はトリフロロ酢酸を0.1％加えたアセトニトリル水溶
液を用い、アセトニトリル濃度を36％から56％に毎分１
％の割合で上昇させることにより行った。収量0.4mg。
得られた精製物は上記条件での高速液体クロマトグラフ
ィーで12.3分の溶出時間を示した。
実施例６ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾成長ホルモン
放出因子〔GRF（１−44）NH2〕の製造： 成長ホルモン放出因子〔GRF（１−44）NH2〕（20mg）
の0.2M NaHCO3（pH8.18、20ml）溶液に４−モノメトキ
シポリエチレングリコールフェニルグリオキザール18.5
mg（グアニジノ基に対して1/6当量）を加え、遮光下室
温にて5.5時間放置した。1N塩酸水溶液を用いて反応液
のpHを2.4とした後、セファクリルＳ−200スーパーファ
イン（ファルマシア製、スウェーデン）のカラム（2.6c
mφ×84cm）を用いたゲル濾過により精製し、目的とす
る分画を限外濾過（アミコン社製、米国、膜YM−10）に
より脱塩濃縮した。得られた目的物の水溶液を、さらに
YMC−ODS、Ａ−211、５μ、4.6mmφ×250mmカラム（山
村化学製）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーに
より二次精製し、目的物Ａ、目的物Ｂを得た。
放出因子〔GRF（１−44）NH2〕の製造： 成長ホルモン放出因子〔GRF（１−44）NH2〕（20mg）
の0.2M NaHCO3（pH8.18、20ml）溶液に４−モノメトキ
シポリエチレングリコールフェニルグリオキザール18.5
mg（グアニジノ基に対して1/6当量）を加え、遮光下室
温にて5.5時間放置した。1N塩酸水溶液を用いて反応液
のpHを2.4とした後、セファクリルＳ−200スーパーファ
イン（ファルマシア製、スウェーデン）のカラム（2.6c
mφ×84cm）を用いたゲル濾過により精製し、目的とす
る分画を限外濾過（アミコン社製、米国、膜YM−10）に
より脱塩濃縮した。得られた目的物の水溶液を、さらに
YMC−ODS、Ａ−211、５μ、4.6mmφ×250mmカラム（山
村化学製）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーに
より二次精製し、目的物Ａ、目的物Ｂを得た。
目的物Ａの酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、2
4時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 3.83（４）;Glx 7.18（７）;Ser 3.82（４）； Gly 3.49（３）;Arg 4.87（６）;Thr 1.17（１）； Ala 5.18（５）;Tyr 1.89（２）;Val 1.10（１）； Met 0.78（１）;Ile 1.95（２）;Leu＊5.00（５）； Phe 0.99（１）;Lys 2.26（２） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 目的物Ａの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下
の通りである。
4時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 3.83（４）;Glx 7.18（７）;Ser 3.82（４）； Gly 3.49（３）;Arg 4.87（６）;Thr 1.17（１）； Ala 5.18（５）;Tyr 1.89（２）;Val 1.10（１）； Met 0.78（１）;Ile 1.95（２）;Leu＊5.00（５）； Phe 0.99（１）;Lys 2.26（２） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 目的物Ａの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下
の通りである。
○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS,A−211,5μ， 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:214nm 保持時間:20.2分 目的物Ｂの酸分解物（6N塩酸−フェノール:110℃、24
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 3.82（４）;Glx 6.89（７）;Ser 3.70（４）； Gly 3.17（３）;Arg 4.17（６）;Thr 1.12（１）； Ala 5.31（５）;Tyr 1.80（２）;Val 1.05（１）； Met 0.91（１）;Ile 2.05（２）;Leu＊5.00（５）； Phe 0.98（１）;Lys 2.31（２） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 目的物Ｂの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下
の通りである。
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 3.82（４）;Glx 6.89（７）;Ser 3.70（４）； Gly 3.17（３）;Arg 4.17（６）;Thr 1.12（１）； Ala 5.31（５）;Tyr 1.80（２）;Val 1.05（１）； Met 0.91（１）;Ile 2.05（２）;Leu＊5.00（５）； Phe 0.98（１）;Lys 2.31（２） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 目的物Ｂの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下
の通りである。
○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS,A−211,5μ， 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:214nm 保持時間:21.8分 実施例７ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾成長ホルモン
放出因子〔GRF（１−29）NH2〕IIの製造： 成長ホルモン放出因子〔GRF（１−29）NH2〕（30mg）
の0.02Mリン酸緩衝液（pH5.52、3ml）溶液に４−モノメ
トキシポリエチレングリコール−フェニルグリオキザー
ル128.5mg（グアニジノ基に対して１当量）を加え、遮
光下室温にて72時間放置した。この反応液をセファクリ
ルＳ−200スーパーファイン（ファルマシア製、スウェ
ーデン）のカラム（2.6cmφ×81cm）を用いたゲル濾過
により精製し、目的とする分画を限界濾過（アミコン社
製、米国、膜YM−５）により脱塩濃縮した。得られた目
的物の水溶液を、さらにYMC−ODS、Ａ−211、５μ、4.6
mmφ×250mmカラム（山村化学製）を用いた逆相高速液
体クロマトグラフィーにより二次精製し、目的物を得
た。
放出因子〔GRF（１−29）NH2〕IIの製造： 成長ホルモン放出因子〔GRF（１−29）NH2〕（30mg）
の0.02Mリン酸緩衝液（pH5.52、3ml）溶液に４−モノメ
トキシポリエチレングリコール−フェニルグリオキザー
ル128.5mg（グアニジノ基に対して１当量）を加え、遮
光下室温にて72時間放置した。この反応液をセファクリ
ルＳ−200スーパーファイン（ファルマシア製、スウェ
ーデン）のカラム（2.6cmφ×81cm）を用いたゲル濾過
により精製し、目的とする分画を限界濾過（アミコン社
製、米国、膜YM−５）により脱塩濃縮した。得られた目
的物の水溶液を、さらにYMC−ODS、Ａ−211、５μ、4.6
mmφ×250mmカラム（山村化学製）を用いた逆相高速液
体クロマトグラフィーにより二次精製し、目的物を得
た。
目的物の酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 3.09（３）;Glx 2.26（２）;Ser 2.86（３）； Gly 1.17（１）;Arg 1.92（３）;Thr 0.98（１）； Ala 2.95（３）;Tyr 1.84（２）;Val 1.03（１）； Met 1.10（１）;Ile 1.84（２）;Leu＊4.00（４）； Phe 1.01（１）;Lys 2.03（２） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 3.09（３）;Glx 2.26（２）;Ser 2.86（３）； Gly 1.17（１）;Arg 1.92（３）;Thr 0.98（１）； Ala 2.95（３）;Tyr 1.84（２）;Val 1.03（１）； Met 1.10（１）;Ile 1.84（２）;Leu＊4.00（４）； Phe 1.01（１）;Lys 2.03（２） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS,A−211,5μ， 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:214nm 保持時間:21.9分 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK G3000PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分 検出波長:254nm 保持時間:23分 実施例８ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾成長ホルモン
放出因子〔GRF（１−29）NH2〕IIIの製造： 成長ホルモンの放出因子〔GRF（１−29）NH2〕（10m
g）の0.02Mリン酸緩衝液（pH6.53、5ml）溶液に４−モ
ノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグリオキ
ザール43mg（グアニジノ基に対して１当量）を加え、遮
光下室温にて39時間放置した。この反応液をセファクリ
ルＳ−200スーパーファイン（ファルマシア製、スウェ
ーデン）のカラム（2.6cmφ×81cm）を用いたゲル濾過
により精製し、目的とする分画を限外濾過（アミコン社
製、米国、YM−５）により脱塩濃縮した。得られた目的
物の水溶液を、さらにYMC−ODS、Ａ−211、５μ、4.6mm
φ×250mmカラム（山村化学製）を用いた逆相高速液体
クロマトグラフィーにより二次精製し、目的物を得た。
放出因子〔GRF（１−29）NH2〕IIIの製造： 成長ホルモンの放出因子〔GRF（１−29）NH2〕（10m
g）の0.02Mリン酸緩衝液（pH6.53、5ml）溶液に４−モ
ノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグリオキ
ザール43mg（グアニジノ基に対して１当量）を加え、遮
光下室温にて39時間放置した。この反応液をセファクリ
ルＳ−200スーパーファイン（ファルマシア製、スウェ
ーデン）のカラム（2.6cmφ×81cm）を用いたゲル濾過
により精製し、目的とする分画を限外濾過（アミコン社
製、米国、YM−５）により脱塩濃縮した。得られた目的
物の水溶液を、さらにYMC−ODS、Ａ−211、５μ、4.6mm
φ×250mmカラム（山村化学製）を用いた逆相高速液体
クロマトグラフィーにより二次精製し、目的物を得た。
目的物の酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 2.63（３）;Glx 2.00（２）;Ser 2.65（３）； Gly 1.04（１）;Arg 1.60（３）;Thr 0.81（１）； Ala 2.96（３）;Tyr 1.75（２）;Val 1.01（１）； Met 1.19（１）;Ile 1.83（２）;Leu＊4.00（４）； Phe 0.85（１）;Lys 1.95（２） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 2.63（３）;Glx 2.00（２）;Ser 2.65（３）； Gly 1.04（１）;Arg 1.60（３）;Thr 0.81（１）； Ala 2.96（３）;Tyr 1.75（２）;Val 1.01（１）； Met 1.19（１）;Ile 1.83（２）;Leu＊4.00（４）； Phe 0.85（１）;Lys 1.95（２） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS,A−211,5μ， 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:214nm 保持時間:21.9分 実施例９ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾組織プラスミ
ノーゲン活性化因子（ｔ−PA）IIIの製造： tPA5.0mg/0.85％NaCl−0.01％Tween80（170μ）に
0.02M NaH2PO4−H3PO4（1M KSCN含有、pH6.0）5.0ml
を加え、1N NaOHでpH6.0に調整する。実施例１で得た
４−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグ
リオキザール66.5mg（グアニジノ基に対して５当量）を
加え、遮光化室温にて16時間放置後、さらに修飾試剤6
6.5mgを加え、同様にして16時間放置した。反応液を限
外濾過（アミコン社製、米国、膜YM−30）により過剰の
試剤と塩類を除去した後、セファクリルＳ−200（ファ
ルマシア社製、スウェーデン）のカラム（2.6cmφ×94c
m）を用いたゲル濾過により目的物Ａを含む分画、目的
物Ｂを含む分画が得られた。それらをそれぞれ限外濾過
（アミコン社製、米国、膜YM−30）により、脱塩・濃縮
することによって、目的物ＡおよびＢの水溶液を得た。
ノーゲン活性化因子（ｔ−PA）IIIの製造： tPA5.0mg/0.85％NaCl−0.01％Tween80（170μ）に
0.02M NaH2PO4−H3PO4（1M KSCN含有、pH6.0）5.0ml
を加え、1N NaOHでpH6.0に調整する。実施例１で得た
４−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグ
リオキザール66.5mg（グアニジノ基に対して５当量）を
加え、遮光化室温にて16時間放置後、さらに修飾試剤6
6.5mgを加え、同様にして16時間放置した。反応液を限
外濾過（アミコン社製、米国、膜YM−30）により過剰の
試剤と塩類を除去した後、セファクリルＳ−200（ファ
ルマシア社製、スウェーデン）のカラム（2.6cmφ×94c
m）を用いたゲル濾過により目的物Ａを含む分画、目的
物Ｂを含む分画が得られた。それらをそれぞれ限外濾過
（アミコン社製、米国、膜YM−30）により、脱塩・濃縮
することによって、目的物ＡおよびＢの水溶液を得た。
目的物Ａの酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、2
24時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 47.5（50）;Glx 54.8（52）； Ser 45.4（48）;Gly 47.9（43）； His 15.0（16）;Arg 25.8（35）； Thr 20.7（25）;Ala 31.8（32）； Pro 29.4（29）;Tyr 22.3（24）； Val 21.1（25）;Met 4.30（５）； Ile 16.1（19）;Leu＊39.0（39）； Phe 17.1（16）;Lys 22.8（21） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 目的物Ａの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下
の通りである。
24時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 47.5（50）;Glx 54.8（52）； Ser 45.4（48）;Gly 47.9（43）； His 15.0（16）;Arg 25.8（35）； Thr 20.7（25）;Ala 31.8（32）； Pro 29.4（29）;Tyr 22.3（24）； Val 21.1（25）;Met 4.30（５）； Ile 16.1（19）;Leu＊39.0（39）； Phe 17.1（16）;Lys 22.8（21） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 目的物Ａの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下
の通りである。
○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS,A−211,5μ， 4.6mmφ×250mm（山村化学社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:214nm 保持時間:14.6分 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK G3000PW 7.5mmφ×600mm（東洋ソーダ社
製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分 検出波長:254nm 保持時間:21.4分 目的物Ｂの酸分解物（6N塩酸フェノール、110℃、24
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 46.5（50）;Glx 48.0（52）； Ser 46.3（48）;Gly 47.1（43）； His 14.6（16）;Arg 27.2（35）； Thr 21.2（25）;Ala 32.1（32）； Pro 30.4（29）;Tyr 24.2（24）； Val 21.9（25）;Met 6.06（５）； Ile 16.5（19）;Leu＊39.0（39）； Phe 16.5（16）;Lys 20.9（21） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 目的物のＢの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以
下の通りである。
製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分 検出波長:254nm 保持時間:21.4分 目的物Ｂの酸分解物（6N塩酸フェノール、110℃、24
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 46.5（50）;Glx 48.0（52）； Ser 46.3（48）;Gly 47.1（43）； His 14.6（16）;Arg 27.2（35）； Thr 21.2（25）;Ala 32.1（32）； Pro 30.4（29）;Tyr 24.2（24）； Val 21.9（25）;Met 6.06（５）； Ile 16.5（19）;Leu＊39.0（39）； Phe 16.5（16）;Lys 20.9（21） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 目的物のＢの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以
下の通りである。
○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS,A−211,5μ， 4.6mmφ×250mm（山村化学社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:214nm 保持時間:14.5分 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK G3000PW 7.5mmφ×600mm（東洋ソーダ社
製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分 検出波長:254nm 保持時間:22.1分 実施例10 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾ヒトCu,Zn−
スーパーオキシドジスムターゼ（Cu,Zn−hSOD）の製
造： Cu,Zn−hSOD（4.89mg、シグマ社製、ヒト赤血球由
来）の0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（pH8.97、2.5ml）
溶液に４−モノメトキシポリエチレングリコール−フェ
ニルグリオキザール70mg（グアニジノ基に対して10当
量）を加え、遮光下室温に23.5時間攪拌した。酢酸を用
いて反応液のpHを5.0とした後、限外濾過（アミコン社
製、米国、YM−30）により過剰の試剤と塩類を除去した
後、セファクリルＳ−200（ファルマシア社製、スウェ
ーデン）のカラム（2.6cmφ×94cm）を用いたゲル濾過
により精製し、目的とする分画を限外濾過（アミコン社
製、米国、YM−30）により、脱塩・濃縮することによっ
て、目的物を含む水溶液（10ml、蛋白含量14.0μＭ）を
得た。
製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分 検出波長:254nm 保持時間:22.1分 実施例10 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾ヒトCu,Zn−
スーパーオキシドジスムターゼ（Cu,Zn−hSOD）の製
造： Cu,Zn−hSOD（4.89mg、シグマ社製、ヒト赤血球由
来）の0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（pH8.97、2.5ml）
溶液に４−モノメトキシポリエチレングリコール−フェ
ニルグリオキザール70mg（グアニジノ基に対して10当
量）を加え、遮光下室温に23.5時間攪拌した。酢酸を用
いて反応液のpHを5.0とした後、限外濾過（アミコン社
製、米国、YM−30）により過剰の試剤と塩類を除去した
後、セファクリルＳ−200（ファルマシア社製、スウェ
ーデン）のカラム（2.6cmφ×94cm）を用いたゲル濾過
により精製し、目的とする分画を限外濾過（アミコン社
製、米国、YM−30）により、脱塩・濃縮することによっ
て、目的物を含む水溶液（10ml、蛋白含量14.0μＭ）を
得た。
酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 33.2（36）;Glx 26.6（26）； Ser 18.7（20）;Gly 49.4（50）； His 14.1（16）;Arg 4.7（８）； Thr 13.5（16）;Ala＊20.0（20）； Pro 11.1（10）;Val 26.2（28）； Ile 13.1（18）;Leu 19.6（18）； Phe 8.4（８）;Lys 19.9（22） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 本操作により、アルギニン残基が修飾されたポリエチ
レングリコール修飾SODが得られた。目的物の高速液体
クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 33.2（36）;Glx 26.6（26）； Ser 18.7（20）;Gly 49.4（50）； His 14.1（16）;Arg 4.7（８）； Thr 13.5（16）;Ala＊20.0（20）； Pro 11.1（10）;Val 26.2（28）； Ile 13.1（18）;Leu 19.6（18）； Phe 8.4（８）;Lys 19.9（22） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 本操作により、アルギニン残基が修飾されたポリエチ
レングリコール修飾SODが得られた。目的物の高速液体
クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである。
○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK G3000PW 7.5mmφ×600mm（東洋ソーダ社
製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分 検出波長:254nm 保持時間:20.6分 実施例11 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾牛Cu,Zn−ス
ーパーオキシドデスムターゼの製造： 牛Cu,Zn−スーパーオキシドデスムターゼ（Cu,Zn−bS
OD）7.5mgを0.2M NaHCO3水（pH8.5）1.875mlに溶かし
た後、実施例１で得た４−メトキシポリエチレングリコ
ール−フェニルグリオキザール47.5mgを加え、遮光下室
温にて19時間反応させた。反応終了後水2mlを加え、２
規定酢酸にて約pH4とした。この溶液をセファクリルＳ
−200を用いたゲル濾過（カラムサイズ2.6cmφ×80cm、
溶出液0.1M酢酸水＋0.2M食塩水（pH2.8）、流速2ml/
分）にて精製を行った。目的物を含む分画を集め、限外
濾過により脱塩・濃縮を行い、目的物を含む0.01M酢酸
水溶液10ml（蛋白含量4.2mg）を得た。
製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分 検出波長:254nm 保持時間:20.6分 実施例11 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾牛Cu,Zn−ス
ーパーオキシドデスムターゼの製造： 牛Cu,Zn−スーパーオキシドデスムターゼ（Cu,Zn−bS
OD）7.5mgを0.2M NaHCO3水（pH8.5）1.875mlに溶かし
た後、実施例１で得た４−メトキシポリエチレングリコ
ール−フェニルグリオキザール47.5mgを加え、遮光下室
温にて19時間反応させた。反応終了後水2mlを加え、２
規定酢酸にて約pH4とした。この溶液をセファクリルＳ
−200を用いたゲル濾過（カラムサイズ2.6cmφ×80cm、
溶出液0.1M酢酸水＋0.2M食塩水（pH2.8）、流速2ml/
分）にて精製を行った。目的物を含む分画を集め、限外
濾過により脱塩・濃縮を行い、目的物を含む0.01M酢酸
水溶液10ml（蛋白含量4.2mg）を得た。
酸分解物（6N塩酸、110℃、24時間処理）中のアミノ
酸分析値 Asx 27.4（34）;Glx 21.5（22）； Ser 14.5（16）;Gly 42.1（50）； His 12.7（16）;Arg 5.7（８）； Thr 19.1（24）;Ala 18.0＊（18）； Pro 12.9（12）;Tyr 2.8（２）； Val 22.4（30）;Met 2.8（２）； Ile 12.8（18）;Leu 17.1（16）； Phe 8.4（８）;Lys 16.0（20） ＊を基準として、（ ）内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
酸分析値 Asx 27.4（34）;Glx 21.5（22）； Ser 14.5（16）;Gly 42.1（50）； His 12.7（16）;Arg 5.7（８）； Thr 19.1（24）;Ala 18.0＊（18）； Pro 12.9（12）;Tyr 2.8（２）； Val 22.4（30）;Met 2.8（２）； Ile 12.8（18）;Leu 17.1（16）； Phe 8.4（８）;Lys 16.0（20） ＊を基準として、（ ）内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム：マイクロボンダスフェアーC18 （3.9mmφ×150mm） （ウォーターズ社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:35％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:220nm 保持時間:12.3分 ○分子ふるい高速液体クロマトグラフィー カラム:TSK G3000PW×Ｌ （7.8mmφ×300mm）×２ （東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分 検出波長:254nm 保持時間:22.6分 実施例12 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾インシュリン
様成長因子−１（IGF−１）の製造： IGF−１（4.3mg）の0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（p
H8.97、3.0ml）溶液に室温で攪拌下、２−メチルマレイ
ン酸無水物（20μ）を10分間隔で５回加えた。この間
反応液のpHを８〜９になる様に1N NaOHを加え調節し
た。さらに、１時間反応液のpHを８〜8.5になる様1N N
aOHを加えながら室温で攪拌した。ついで、上記バッフ
ァー1mlを加え、1N NaOHでpH8.97とした後、実施例１
で得た４−モノメトキシポリエチレングリコール−フェ
ニルグリオキザール12.63mg（グアニジノ基に対して0.7
当量）を加え、遮光下室温にて16時間攪拌した。酢酸を
用いて反応液のpHを6.74とした後、セファクリルＳ−20
0（ファルマシア社製、スウェーデン）のカラム（2.6cm
φ×94cm）を用いたゲル濾過により精製し、目的とする
分画を限外濾過（アミコン社製、米国、膜YM−10）によ
り、塩脱・濃縮した。この濃縮物に酢酸を加えpH2.12と
し、37℃で9.5時間攪拌した。1N NaOHで中和後、限外
濾過（アミコン社製、米国、膜YM−10）により、脱塩・
濃縮し、更に、限外濾過（ミリポア社製、米国、UFPI
TGC）により濃縮することによって、目的物を含む水溶
液（500μ、蛋白含量148μＭ）を得た。
様成長因子−１（IGF−１）の製造： IGF−１（4.3mg）の0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（p
H8.97、3.0ml）溶液に室温で攪拌下、２−メチルマレイ
ン酸無水物（20μ）を10分間隔で５回加えた。この間
反応液のpHを８〜９になる様に1N NaOHを加え調節し
た。さらに、１時間反応液のpHを８〜8.5になる様1N N
aOHを加えながら室温で攪拌した。ついで、上記バッフ
ァー1mlを加え、1N NaOHでpH8.97とした後、実施例１
で得た４−モノメトキシポリエチレングリコール−フェ
ニルグリオキザール12.63mg（グアニジノ基に対して0.7
当量）を加え、遮光下室温にて16時間攪拌した。酢酸を
用いて反応液のpHを6.74とした後、セファクリルＳ−20
0（ファルマシア社製、スウェーデン）のカラム（2.6cm
φ×94cm）を用いたゲル濾過により精製し、目的とする
分画を限外濾過（アミコン社製、米国、膜YM−10）によ
り、塩脱・濃縮した。この濃縮物に酢酸を加えpH2.12と
し、37℃で9.5時間攪拌した。1N NaOHで中和後、限外
濾過（アミコン社製、米国、膜YM−10）により、脱塩・
濃縮し、更に、限外濾過（ミリポア社製、米国、UFPI
TGC）により濃縮することによって、目的物を含む水溶
液（500μ、蛋白含量148μＭ）を得た。
酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 4.75（５）;Glx 5.60（６）;Ser 4.81（５）； Gly 6.96（７）;Arg 3.58（６）;Thr 2.95（３）； Ala 6.35（６）;Pro 5.22（５）;Tyr 3.08（３）； Val 2.37（３）;Met 0.37（１）;Ile 0.42（１）； Leu＊6.00（６）;Phe 3.94（４）;Lys 3.32（３） 基準アミノ酸、（ ）内は理論値 この結果、Arg残基が選択的に修飾されていることが
わかる。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 4.75（５）;Glx 5.60（６）;Ser 4.81（５）； Gly 6.96（７）;Arg 3.58（６）;Thr 2.95（３）； Ala 6.35（６）;Pro 5.22（５）;Tyr 3.08（３）； Val 2.37（３）;Met 0.37（１）;Ile 0.42（１）； Leu＊6.00（６）;Phe 3.94（４）;Lys 3.32（３） 基準アミノ酸、（ ）内は理論値 この結果、Arg残基が選択的に修飾されていることが
わかる。
目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
通りである。
○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS,A−211,5μ， 4.6mmφ×250mm（山村化学社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:214nm 保持時間:21.0分 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK G3000PW 7.5mmφ×600mm（東洋ソーダ社
製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分 検出波長:254nm 保持時間:21.6分 実施例13 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾インシュリン
様成長因子−１（IGF−１）IIの製造： IGF−１（4.71mg）の0.2M NaHCO3−Na2CO3（pH8.9
7、2.0ml）溶液に攪拌下、室温で、２−メチルマレイン
酸無水物（20μ）を10分間隔で５回加えた。この間反
応液のpHを８〜９になる様に1N NaCHを加え調節した。
さらに、１時間反応液のpHを８〜8.5になる様1N NaOH
を加えながら室温で攪拌した。ついで、上記バッファー
1mlを加え、1N NaOHでpH8.97とした後、実施例１で得
た４−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニル
グリオキザール3.3mg（グアニジノ基に対して0.17当
量）を加え、遮光下室温にて17時間攪拌した。セファク
リルＳ−200（ファルマシア社製、スウェーデン）のカ
ラム（2.6cmφ×94cm）を用いたゲル濾過により精製
し、目的とする分画を限外濾過（アミコン社製、米国、
膜YM−10）により、脱塩、濃縮した。この濃縮物に酢酸
を加えpH2.12とし、37℃で８時間攪拌した。1N NaOHで
中和後、限外濾過（アミコン社製、米国、膜YM−10）に
より、脱塩・濃縮し、さらに限外濾過（ミリポア社製、
米国、UFPI TGC）により濃縮することによって、目的
物を含む水溶液（500μ、蛋白含量133.5μＭ）を得
た。
製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分 検出波長:254nm 保持時間:21.6分 実施例13 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾インシュリン
様成長因子−１（IGF−１）IIの製造： IGF−１（4.71mg）の0.2M NaHCO3−Na2CO3（pH8.9
7、2.0ml）溶液に攪拌下、室温で、２−メチルマレイン
酸無水物（20μ）を10分間隔で５回加えた。この間反
応液のpHを８〜９になる様に1N NaCHを加え調節した。
さらに、１時間反応液のpHを８〜8.5になる様1N NaOH
を加えながら室温で攪拌した。ついで、上記バッファー
1mlを加え、1N NaOHでpH8.97とした後、実施例１で得
た４−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニル
グリオキザール3.3mg（グアニジノ基に対して0.17当
量）を加え、遮光下室温にて17時間攪拌した。セファク
リルＳ−200（ファルマシア社製、スウェーデン）のカ
ラム（2.6cmφ×94cm）を用いたゲル濾過により精製
し、目的とする分画を限外濾過（アミコン社製、米国、
膜YM−10）により、脱塩、濃縮した。この濃縮物に酢酸
を加えpH2.12とし、37℃で８時間攪拌した。1N NaOHで
中和後、限外濾過（アミコン社製、米国、膜YM−10）に
より、脱塩・濃縮し、さらに限外濾過（ミリポア社製、
米国、UFPI TGC）により濃縮することによって、目的
物を含む水溶液（500μ、蛋白含量133.5μＭ）を得
た。
酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 5.19（５）;Glx 6.81（６）;Ser 5.00（５）； Gly 7.21（７）;Arg 4.14（６）;Thr 3.01（３）； Ala 5.79（６）;Pro 4.47（５）;Tyr 2.68（３）； Val 2.65（３）;Met 0.63（１）;Ile 1.32（１）； Leu＊6.00（６）;Phe 3.94（４）;Lys 3.04（３） 基準アミノ酸、（ ）内は理論値 本操作により、低修飾率のポリエチレングリコール修
飾IGF−１が得られた。目的物の高速液体クロマトグラ
フィーの挙動は以下の通りである。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 5.19（５）;Glx 6.81（６）;Ser 5.00（５）； Gly 7.21（７）;Arg 4.14（６）;Thr 3.01（３）； Ala 5.79（６）;Pro 4.47（５）;Tyr 2.68（３）； Val 2.65（３）;Met 0.63（１）;Ile 1.32（１）； Leu＊6.00（６）;Phe 3.94（４）;Lys 3.04（３） 基準アミノ酸、（ ）内は理論値 本操作により、低修飾率のポリエチレングリコール修
飾IGF−１が得られた。目的物の高速液体クロマトグラ
フィーの挙動は以下の通りである。
○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS,A−211,5μ， 4.6mmφ×250mm（山村化学社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:214nm 保持時間:19.2分 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK G3000PW 7.5mmφ×600mm（東洋ソーダ社
製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分 検出波長:254nm 保持時間:23.1分 実施例14 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾インシュリン
様成長因子（IGF−１）IIIの製造： IGF−１（5.00mg）の0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO
3（pH8.97、2.0ml）溶液に攪拌下室温で、２−メチルマ
レイン酸無水物（20μ）を５分間隔で５回加えた。こ
の間1N NaOHを用いて、反応液のpHを８〜９に調節し
た。さらに、１時間1N NaOHを加えながら、反応液のpH
を８〜8.5に保持した。ついで、反応液のpHを8.97に調
整した後、実施例１で得た４−モノメトキシポリエチレ
ングリコール−フェニルグリオキザール3.4mg（グアニ
ジノ基に対して0.17当量）を加え、遮光下室温にて16時
間放置した。反応混合物をセファクリルＳ−200（ファ
ルマシア社製、スウェーデン）のカラム（26cmφ×94c
m）を用いたゲル濾過により精製し、目的とする分画を
限外濾過（アミコン社製、米国、膜YM−10）により、脱
塩・濃縮した。この濃縮物に酢酸を加えpH2.01とし、40
℃で11時間攪拌した。1N NaOHでpH5.0とした後、限外
濾過（アミコン社製、米国、膜YM−10）により、脱塩・
濃縮し、さらに限外濾過（ミリポア社製、米国、UFPI
TGC）により再濃縮することによって、目的物の水溶液
（800μ、蛋白含量144μＭ）を得た。
製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分 検出波長:254nm 保持時間:23.1分 実施例14 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾インシュリン
様成長因子（IGF−１）IIIの製造： IGF−１（5.00mg）の0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO
3（pH8.97、2.0ml）溶液に攪拌下室温で、２−メチルマ
レイン酸無水物（20μ）を５分間隔で５回加えた。こ
の間1N NaOHを用いて、反応液のpHを８〜９に調節し
た。さらに、１時間1N NaOHを加えながら、反応液のpH
を８〜8.5に保持した。ついで、反応液のpHを8.97に調
整した後、実施例１で得た４−モノメトキシポリエチレ
ングリコール−フェニルグリオキザール3.4mg（グアニ
ジノ基に対して0.17当量）を加え、遮光下室温にて16時
間放置した。反応混合物をセファクリルＳ−200（ファ
ルマシア社製、スウェーデン）のカラム（26cmφ×94c
m）を用いたゲル濾過により精製し、目的とする分画を
限外濾過（アミコン社製、米国、膜YM−10）により、脱
塩・濃縮した。この濃縮物に酢酸を加えpH2.01とし、40
℃で11時間攪拌した。1N NaOHでpH5.0とした後、限外
濾過（アミコン社製、米国、膜YM−10）により、脱塩・
濃縮し、さらに限外濾過（ミリポア社製、米国、UFPI
TGC）により再濃縮することによって、目的物の水溶液
（800μ、蛋白含量144μＭ）を得た。
酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 5.29（５）;Glx 6.58（６）;Ser 5.11（５）； Gly 8.47（７）;Arg 4.67（６）;Thr 2.76（３）； Ala 7.35（６）;Pro 6.85（５）;Tyr 3.08（３）； Val 2.63（３）;Met 1.15（１）;Ile 0.58（１）； Leu＊6.00（６）;Phe 3.64（４）;Lys 2.17（３） 基準アミノ酸、（ ）内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 5.29（５）;Glx 6.58（６）;Ser 5.11（５）； Gly 8.47（７）;Arg 4.67（６）;Thr 2.76（３）； Ala 7.35（６）;Pro 6.85（５）;Tyr 3.08（３）； Val 2.63（３）;Met 1.15（１）;Ile 0.58（１）； Leu＊6.00（６）;Phe 3.64（４）;Lys 2.17（３） 基準アミノ酸、（ ）内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS,A−211,5μ， 4.6mmφ×250mm（山村化学社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:214nm 保持時間:17.4分 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK G3000PW 7.5mmφ×600mm（東洋ソーダ社
製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分 検出波長:254nm 保持時間:24.7分 実施例15 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾成長ホルモン
放出因子〔GRF（１−29）NH2〕IVの製造： 成長ホルモン放出因子〔GRF（１−29）NH2〕100mgを
0.2M NaHCO3−Na2CO3（pH9）50mlに溶解した。この溶
液に無水マレイン酸260mgを含むアセトン溶液3mlを氷冷
下加え、氷冷下２時間反応させた。反応終了後反応液を
そのまま、ウォーターズ製マクロボンダスフェアー
C18、φ19×150mmカラムを使用して高速液体クロマトグ
ラフィーにて分取精製した。目的物の溶出はアセトニト
リル水溶液を用い、毎分9.9mlの流速でアセトニトリル
濃度を30％から75％まで毎分１％の割合で上昇させるこ
とにより行った。目的物を含む分画を凍結乾燥すること
により目的とするマレイルGRF（１−29）NH2を45mg得
た。このようにして得たマレイル化GRF（１−29）NH215
mgを0.2M NaHCO3（pH8.2）に溶かし、実施例１で得た
４−メトキシポリエチレングリコール−フェニルグリオ
キザール615mgを加え、暗所室温にて８時間反応した。
反応終了後1N−酢酸にて中和し、その溶液を２回に分
け、セファクリルＳ−200を用いたゲル濾過精製（カラ
ムサイズ2.6cmφ×94cm、溶出液0.2M食塩水、流速2ml/
分）を行った。目的物を含む分画を集め、脱塩・濃縮を
行い、目的物を含む水溶液4.5mlを得た。続いて、この
溶液2.5mlに２規定酢酸水2.5mlを加え、37℃にて40時間
反応させ、脱マレイル化を行い、目的とするポリエチレ
ングリコール誘導体（Ｉ）修飾成長ホルモン放出因子
〔GRF（１−29）NH2〕を得た。
製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分 検出波長:254nm 保持時間:24.7分 実施例15 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾成長ホルモン
放出因子〔GRF（１−29）NH2〕IVの製造： 成長ホルモン放出因子〔GRF（１−29）NH2〕100mgを
0.2M NaHCO3−Na2CO3（pH9）50mlに溶解した。この溶
液に無水マレイン酸260mgを含むアセトン溶液3mlを氷冷
下加え、氷冷下２時間反応させた。反応終了後反応液を
そのまま、ウォーターズ製マクロボンダスフェアー
C18、φ19×150mmカラムを使用して高速液体クロマトグ
ラフィーにて分取精製した。目的物の溶出はアセトニト
リル水溶液を用い、毎分9.9mlの流速でアセトニトリル
濃度を30％から75％まで毎分１％の割合で上昇させるこ
とにより行った。目的物を含む分画を凍結乾燥すること
により目的とするマレイルGRF（１−29）NH2を45mg得
た。このようにして得たマレイル化GRF（１−29）NH215
mgを0.2M NaHCO3（pH8.2）に溶かし、実施例１で得た
４−メトキシポリエチレングリコール−フェニルグリオ
キザール615mgを加え、暗所室温にて８時間反応した。
反応終了後1N−酢酸にて中和し、その溶液を２回に分
け、セファクリルＳ−200を用いたゲル濾過精製（カラ
ムサイズ2.6cmφ×94cm、溶出液0.2M食塩水、流速2ml/
分）を行った。目的物を含む分画を集め、脱塩・濃縮を
行い、目的物を含む水溶液4.5mlを得た。続いて、この
溶液2.5mlに２規定酢酸水2.5mlを加え、37℃にて40時間
反応させ、脱マレイル化を行い、目的とするポリエチレ
ングリコール誘導体（Ｉ）修飾成長ホルモン放出因子
〔GRF（１−29）NH2〕を得た。
酸分解物（6N塩酸、110℃、24時間処理中）のアミノ
酸分析値 Asx 3.06（３）;Glx 1.97（２）;Ser 2.80（３）； Gly 1.02（１）;Arg 1.19（３）;Thr 1.03（１）； Ala 3.32（３）;Tyr 1.99（２）;Val 1.04（１）； Met 1.09（１）;Ile 2.09（２）;Leu 4.00＊（４）； Phe 1.09（１）;Lys 1.84（２） ＊を基準として、（ ）内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。
酸分析値 Asx 3.06（３）;Glx 1.97（２）;Ser 2.80（３）； Gly 1.02（１）;Arg 1.19（３）;Thr 1.03（１）； Ala 3.32（３）;Tyr 1.99（２）;Val 1.04（１）； Met 1.09（１）;Ile 2.09（２）;Leu 4.00＊（４）； Phe 1.09（１）;Lys 1.84（２） ＊を基準として、（ ）内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。
○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム：マイクロボンダスフェアーC18 （3.9mmφ×150mm） （ウォーターズ社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:35％ 濃度勾配:2％／分 流速:1ml/分 検出波長:220nm 保持時間:10.5分 ○分子ふるい高速液体クロマトグラフィー カラム:TSK G3000PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分 検出波長:254nm 保持時間:22.1分 実施例16 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾ヒトCu,Zn−
スーパーオキシドジスムターゼ（Cu,Zn−hSOD）IIの製
造： Cu,Zn−hSOD（15.12mg、シグマ社製、ヒト赤血球由
来）の0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（pH9.25、7.5ml）
溶液に４−モノメトキシポリエチレングリコール−フェ
ニルグリオキザール19.6mg（グアニジノ基に対して１当
量）を加え、遮光下室温にて８時間攪拌した。さらに試
剤39.2mg（グアニジノ基に対して２当量）を加え、同様
にして、16時間放置した。2N−酢酸を用いて反応液のpH
を6.95とした後、セファクリルＳ−200（ファルマシア
社製、スウェーデン）のカラム（2.6cmφ×94cm）を用
いたゲル濾過および高速ゲル濾過クロマトグラフィー
（TSK G3000SW）により精製し、目的物Ａを含む分画、
目的物Ｂを含む分画が得られた。各同の分画を限外濾過
（アミコン社製、米国、膜YM−30）により、脱塩・濃縮
することによって、目的物Ａを含む水溶液1.8ml（蛋白
含量1.78mg/ml）および目的物Ｂを含む水溶液1.8ml（蛋
白含量460μg/ml）を得た。
スーパーオキシドジスムターゼ（Cu,Zn−hSOD）IIの製
造： Cu,Zn−hSOD（15.12mg、シグマ社製、ヒト赤血球由
来）の0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（pH9.25、7.5ml）
溶液に４−モノメトキシポリエチレングリコール−フェ
ニルグリオキザール19.6mg（グアニジノ基に対して１当
量）を加え、遮光下室温にて８時間攪拌した。さらに試
剤39.2mg（グアニジノ基に対して２当量）を加え、同様
にして、16時間放置した。2N−酢酸を用いて反応液のpH
を6.95とした後、セファクリルＳ−200（ファルマシア
社製、スウェーデン）のカラム（2.6cmφ×94cm）を用
いたゲル濾過および高速ゲル濾過クロマトグラフィー
（TSK G3000SW）により精製し、目的物Ａを含む分画、
目的物Ｂを含む分画が得られた。各同の分画を限外濾過
（アミコン社製、米国、膜YM−30）により、脱塩・濃縮
することによって、目的物Ａを含む水溶液1.8ml（蛋白
含量1.78mg/ml）および目的物Ｂを含む水溶液1.8ml（蛋
白含量460μg/ml）を得た。
目的物Ａの酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、2
4時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 33.5（36）;Glx 26.0（26）； Ser 18.7（20）;Gly 49.0（50）； His 16.8（16）;Arg 6.21（８）； Thr 14.7（16）;Ala＊20.0（20）； Pro 10.9（10）;Val 25.8（28）； Ile 13.9（18）;Leu 19.4（18）； Phe 8.1（８）; Lys 18.3（22）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 目的物Ａの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下
の通りである。
4時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 33.5（36）;Glx 26.0（26）； Ser 18.7（20）;Gly 49.0（50）； His 16.8（16）;Arg 6.21（８）； Thr 14.7（16）;Ala＊20.0（20）； Pro 10.9（10）;Val 25.8（28）； Ile 13.9（18）;Leu 19.4（18）； Phe 8.1（８）; Lys 18.3（22）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 目的物Ａの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下
の通りである。
○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK G3000SW 7.5mmφ×600mm（東洋ソーダ社
製） 溶出液:0.2M食塩水 （５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分 検出波長:220nm 保持時間:22.45分 目的物Ｂの酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、2
4時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 34.2（36）;Glx 26.5（26）； Ser 18.4（20）;Gly 48.8（50）； His 16.4（16）;Arg 7.03（８）； Thr 14.6（16）;Ala＊20.0（20）； Pro 11.0（10）;Val 25.4（28）； Ile 13.1（18）;Leu 18.4（18）； Phe 7.4（８）; Lys 17.1（22）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 目的物Ｂの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下
の通りである。
製） 溶出液:0.2M食塩水 （５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分 検出波長:220nm 保持時間:22.45分 目的物Ｂの酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、2
4時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 34.2（36）;Glx 26.5（26）； Ser 18.4（20）;Gly 48.8（50）； His 16.4（16）;Arg 7.03（８）； Thr 14.6（16）;Ala＊20.0（20）； Pro 11.0（10）;Val 25.4（28）； Ile 13.1（18）;Leu 18.4（18）； Phe 7.4（８）; Lys 17.1（22）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 目的物Ｂの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下
の通りである。
○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK G3000SW 7.5mmφ×600mm（東洋ソーダ社
製） 溶出液:0.2M食塩水 （５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分 検出波長:220nm 保持時間:25.16分 実施例17 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾ヒトCu,Zn−
スーパーオキシドジスムターゼ（Cu,Zn−hSOD）IIIの製
造： Cu,Zn−hSOD（10.20mg、シグマ社製、ヒト赤血球由
来）の0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（pH9.25、5.0ml）
溶液に４−モノメトキシポリエチレングリコール−フェ
ニルグリオキザール70mg（グアニジノ基に対して５当
量）を加え、遮光下室温にて18時間放置した。2N−酢酸
を用いて反応液のpHを6.9とした後、セファクリルＳ−2
00（ファルマシア社製、スウェーデン）のカラム（2.6c
mφ×94cm）を用いたゲル濾過により精製し、目的とす
る分画を限外濾過（アミコン社製、米国、膜YM−30）に
より、脱塩・濃縮することによって、目的物を含む水溶
液1.8ml（蛋白含量1.59mg/ml）を得た。酸分解物（6N塩
酸−フェノール、110℃、24時間処理後の分解物）中の
アミノ酸分析値 Asx 33.0（36）;Glx 26.2（26）； Ser 18.6（20）;Gly 48.2（50）； His 16.4（16）;Arg 5.89（８）； Thr 14.4（16）;Ala＊20.0（20）； Pro 11.1（10）;Val 26.4（28）； Ile 13.9（18）;Leu 19.5（18）； Phe 7.9（８）; Lys 17.0（22） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 本操作により、アルギニン残基が修飾されたポリエチ
レングリコール修飾SODが得られた。目的物の高速液体
クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである。
製） 溶出液:0.2M食塩水 （５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分 検出波長:220nm 保持時間:25.16分 実施例17 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾ヒトCu,Zn−
スーパーオキシドジスムターゼ（Cu,Zn−hSOD）IIIの製
造： Cu,Zn−hSOD（10.20mg、シグマ社製、ヒト赤血球由
来）の0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（pH9.25、5.0ml）
溶液に４−モノメトキシポリエチレングリコール−フェ
ニルグリオキザール70mg（グアニジノ基に対して５当
量）を加え、遮光下室温にて18時間放置した。2N−酢酸
を用いて反応液のpHを6.9とした後、セファクリルＳ−2
00（ファルマシア社製、スウェーデン）のカラム（2.6c
mφ×94cm）を用いたゲル濾過により精製し、目的とす
る分画を限外濾過（アミコン社製、米国、膜YM−30）に
より、脱塩・濃縮することによって、目的物を含む水溶
液1.8ml（蛋白含量1.59mg/ml）を得た。酸分解物（6N塩
酸−フェノール、110℃、24時間処理後の分解物）中の
アミノ酸分析値 Asx 33.0（36）;Glx 26.2（26）； Ser 18.6（20）;Gly 48.2（50）； His 16.4（16）;Arg 5.89（８）； Thr 14.4（16）;Ala＊20.0（20）； Pro 11.1（10）;Val 26.4（28）； Ile 13.9（18）;Leu 19.5（18）； Phe 7.9（８）; Lys 17.0（22） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 本操作により、アルギニン残基が修飾されたポリエチ
レングリコール修飾SODが得られた。目的物の高速液体
クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである。
○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK G3000SW 7.5mmφ×600mm（東洋ソーダ社
製） 溶出液:0.2M食塩水 （５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分 検出波長:220nm 保持時間:20.79分 実施例18 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾ヒトCu,Zn−
スーパーオキシドジスムターゼ（Cu,Zn−hSOD）IVの製
造： Cu,Zn−hSOD（4.92mg、シグマ社製、ヒト赤血球由
来）の0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（pH9.25、2.5ml）
溶液に４−モノメトキシポリエチレングリコール−フェ
ニルグリオキザール70mg（グアニジノ基に対して10当
量）を加え、遮光下室温にて24時間攪拌した。2N−酢酸
を用いて反応液のpHを6.89とした後、セファクリルＳ−
200（ファルマシア社製、スウェーデン）のカラム（2.6
cmφ×94cm）を用いたゲル濾過により精製し、目的とす
る分画を限外濾過（アミコン社製、米国、膜YM−30）に
より、脱塩・濃縮することによって、目的物を含む水溶
液1.8ml（蛋白含量1.34mg/ml）を得た。酸分解物（6N塩
酸−フェノール、110℃、24時間処理後の分解物）中の
アミノ酸分析値 Asx 33.1（36）;Glx 24.9（26）； Ser 18.6（20）;Gly 48.7（50）； His 16.8（16）;Arg 5.5（８）； Thr 14.5（16）;Ala＊20.0（20）； Pro 11.4（10）;Val 25.1（28）； Ile 13.2（18）;Leu 18.5（18）； Phe 7.3 （８）; Lys 15.0（22） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 本操作により、アルギニン残基が修飾されたポリエチ
レングリコール修飾SODが得られた。目的物の高速液体
クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである。
製） 溶出液:0.2M食塩水 （５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分 検出波長:220nm 保持時間:20.79分 実施例18 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾ヒトCu,Zn−
スーパーオキシドジスムターゼ（Cu,Zn−hSOD）IVの製
造： Cu,Zn−hSOD（4.92mg、シグマ社製、ヒト赤血球由
来）の0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（pH9.25、2.5ml）
溶液に４−モノメトキシポリエチレングリコール−フェ
ニルグリオキザール70mg（グアニジノ基に対して10当
量）を加え、遮光下室温にて24時間攪拌した。2N−酢酸
を用いて反応液のpHを6.89とした後、セファクリルＳ−
200（ファルマシア社製、スウェーデン）のカラム（2.6
cmφ×94cm）を用いたゲル濾過により精製し、目的とす
る分画を限外濾過（アミコン社製、米国、膜YM−30）に
より、脱塩・濃縮することによって、目的物を含む水溶
液1.8ml（蛋白含量1.34mg/ml）を得た。酸分解物（6N塩
酸−フェノール、110℃、24時間処理後の分解物）中の
アミノ酸分析値 Asx 33.1（36）;Glx 24.9（26）； Ser 18.6（20）;Gly 48.7（50）； His 16.8（16）;Arg 5.5（８）； Thr 14.5（16）;Ala＊20.0（20）； Pro 11.4（10）;Val 25.1（28）； Ile 13.2（18）;Leu 18.5（18）； Phe 7.3 （８）; Lys 15.0（22） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値 本操作により、アルギニン残基が修飾されたポリエチ
レングリコール修飾SODが得られた。目的物の高速液体
クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである。
○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK G3000SW 7.5mmφ×600mm（東洋ソーダ社
製） 溶出液:0.2M食塩水 （５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分 検出波長:220nm 保持時間:19.58分 実施例19 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾ヒトカルシト
ニン遺伝子関連ペプチド（hCGRP）の製造： hCGRP（0.5mg）の0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（pH
8.97、100μ）溶液に、室温で20％２−メチルマレイ
ン酸無水物アセトン溶液（10μ）を10分間隔で２回加
えた。この間1N NaOHを用いて、反応液のpHを９〜10に
調節した。さらに1N NaOHでpHを９〜10とし、１時間室
温にて放置した。次いで実施例１で得た４−モノメトキ
シポリエチレングコール−フェニルグリオキザール2.6m
gおよび0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（50μ）を加
え、1N NaOHでpH9〜10に調整し、遮光下室温にて6.5時
間放置した後、酢酸を加えpH3とし、40℃で20時間放置
した。反応混合物をTSKgelG3000SW（東ソー社製、7.5mm
φ×60cm）を用いたゲル濾過により精製し、目的物Ａを
含む分画、目的物Ｂを含む分画が得られた。各々の分画
を凍結乾燥後、遠心濾過チューブ（ミリポア社製、ウル
トラフリーC3LGC）により、脱塩・濃縮することによっ
て、目的物Ａを含む水溶液50μおよび目的物Ｂを含む
水溶液50μを得た。
製） 溶出液:0.2M食塩水 （５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分 検出波長:220nm 保持時間:19.58分 実施例19 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾ヒトカルシト
ニン遺伝子関連ペプチド（hCGRP）の製造： hCGRP（0.5mg）の0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（pH
8.97、100μ）溶液に、室温で20％２−メチルマレイ
ン酸無水物アセトン溶液（10μ）を10分間隔で２回加
えた。この間1N NaOHを用いて、反応液のpHを９〜10に
調節した。さらに1N NaOHでpHを９〜10とし、１時間室
温にて放置した。次いで実施例１で得た４−モノメトキ
シポリエチレングコール−フェニルグリオキザール2.6m
gおよび0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（50μ）を加
え、1N NaOHでpH9〜10に調整し、遮光下室温にて6.5時
間放置した後、酢酸を加えpH3とし、40℃で20時間放置
した。反応混合物をTSKgelG3000SW（東ソー社製、7.5mm
φ×60cm）を用いたゲル濾過により精製し、目的物Ａを
含む分画、目的物Ｂを含む分画が得られた。各々の分画
を凍結乾燥後、遠心濾過チューブ（ミリポア社製、ウル
トラフリーC3LGC）により、脱塩・濃縮することによっ
て、目的物Ａを含む水溶液50μおよび目的物Ｂを含む
水溶液50μを得た。
目的物Ａの酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、2
4時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 3.8（４）;Ser 2.9（３）； Gly 4.4（４）;His 1.0（１）； Arg 0.8（２）;Thr 3.4（４）； Ala＊４ （４）;Pro 1.0（１）； Val 4.2（５）;Cys −（２）； Leu 2.0（３）;Phe 1.9（２）； Lys 1.9（２）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値、−は未測定 目的物Ａの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下
の通りである。
4時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 3.8（４）;Ser 2.9（３）； Gly 4.4（４）;His 1.0（１）； Arg 0.8（２）;Thr 3.4（４）； Ala＊４ （４）;Pro 1.0（１）； Val 4.2（５）;Cys −（２）； Leu 2.0（３）;Phe 1.9（２）； Lys 1.9（２）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値、−は未測定 目的物Ａの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下
の通りである。
○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSKgelG3000SW （7.5mmφ×60cm）（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.7ml/分 検出波長:214nm 保持時間:19.6分 目的物Ｂの酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、2
4時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 3.8（４）;Ser 2.7（３）； Gly 4.4（４）;His 1.1（１）； Arg 0.8（２）;Thr 3.4（４）； Ala＊４ （４）;Pro 1.0（１）； Val 4.2（５）;Cys −（２）； Leu 3.0（３）;Phe 1.9（２）； Lys 1.9（２）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値、−は未測定 目的物Ｂの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下
の通りである。
4時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 3.8（４）;Ser 2.7（３）； Gly 4.4（４）;His 1.1（１）； Arg 0.8（２）;Thr 3.4（４）； Ala＊４ （４）;Pro 1.0（１）； Val 4.2（５）;Cys −（２）； Leu 3.0（３）;Phe 1.9（２）； Lys 1.9（２）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値、−は未測定 目的物Ｂの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下
の通りである。
○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSKgelG3000SW （7.5mmφ×60cm）（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.7ml/分 検出波長:214nm 保持時間:21.4分 実施例20 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾エラスターゼ
の製造： エラスターゼ（0.5mg）の0.2M NaHCO3−0.02M Na2C
O3（pH8.97、150μ）溶液に、室温で10％２−メチル
マレイン酸無水物アセトン溶液（10μ）を５分間隔で
５回加えた。この間1N NaOHを用いて、反応液のpHを９
〜10に調節した。さらに1N NaOHでpHを９〜10とし、2.
5時間室温にて放置した。次いで実施例１で得た４−モ
ノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグリオキ
ザール（2.3mg）を加え、1N NaOHでpH9〜10に調整し、
遮光下室温にて18時間放置した後、酢酸を加えpH3と
し、40℃で４時間放置した。反応混合物をTSKgelG3000S
W（東ソー社製、7.5mmφ×60cm）を用いたゲル濾過によ
り精製し、目的とする分画を凍結乾燥後、遠心濾過チュ
ーブ（ミリポア社製、ウルトラフリーC3LGC）により、
脱塩・濃縮することによって、目的物の水溶液50μを
得た。
の製造： エラスターゼ（0.5mg）の0.2M NaHCO3−0.02M Na2C
O3（pH8.97、150μ）溶液に、室温で10％２−メチル
マレイン酸無水物アセトン溶液（10μ）を５分間隔で
５回加えた。この間1N NaOHを用いて、反応液のpHを９
〜10に調節した。さらに1N NaOHでpHを９〜10とし、2.
5時間室温にて放置した。次いで実施例１で得た４−モ
ノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグリオキ
ザール（2.3mg）を加え、1N NaOHでpH9〜10に調整し、
遮光下室温にて18時間放置した後、酢酸を加えpH3と
し、40℃で４時間放置した。反応混合物をTSKgelG3000S
W（東ソー社製、7.5mmφ×60cm）を用いたゲル濾過によ
り精製し、目的とする分画を凍結乾燥後、遠心濾過チュ
ーブ（ミリポア社製、ウルトラフリーC3LGC）により、
脱塩・濃縮することによって、目的物の水溶液50μを
得た。
酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 22.3（24）;Glx 17.6（19）； Ser 16.6（22）;Gly 27.6（25）； His 6.9（６）;Arg 8.43（12）； Thr 15.8（19）;Ala＊17 （17）； Pro 6.9（７）;Tyr 9.9（11）； Val 23.7（27）;Met 0.5（２）； Cys − （８）;Ile 8.3（10）； Leu 18.7（18）;Phe 3.2（３）； Lys 2.6（３）;Trp − （７） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値、−は未測定 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 22.3（24）;Glx 17.6（19）； Ser 16.6（22）;Gly 27.6（25）； His 6.9（６）;Arg 8.43（12）； Thr 15.8（19）;Ala＊17 （17）； Pro 6.9（７）;Tyr 9.9（11）； Val 23.7（27）;Met 0.5（２）； Cys − （８）;Ile 8.3（10）； Leu 18.7（18）;Phe 3.2（３）； Lys 2.6（３）;Trp − （７） ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値、−は未測定 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSKgelG4000PWxL（7.8mmφ×30cm）２本連結
＋TSKguardcolomunPWxL（6.0mmφ×4cm）（東ソー社
製） 溶出液:0.2M NaCl 流速:0.6ml/分 検出波長:214nm 保持時間:24.9分 実施例21 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾ヒト心房性ナ
トリウム利尿ペプチド（hANP）の製造： hANP（216μｇ）の0.2M NaHCO3−Na2CO3（pH8.97、1
00μ）溶液に、室温で10％２−メチルマレイン酸無水
物含有アセトン溶液（９μ）を５分間隔で２回加え
た。この間1N NaOHを用いて、反応液のpHを８〜９に調
節した。１時間30分後、実施例１で得た４−モノメトキ
シポリエチレングリコール−フェニルグリオキザール
（0.87mg）を含む0.2M NaHCO3−Na2Co3（pH8.97）水溶
液（50μ）を加え、1N NaOHでpH8〜９とした後、遮
光下室温にて２時間30分放置した。1N酢酸水にてpHを２
〜３とし、37℃にて遮光下８時間30分放置した。反応液
をTSKgelG3000SW（東ソー社製、7.5mmφ×60cm）を用い
たゲル濾過により精製し、目的物を含む分画を限外濾過
により、脱塩・濃縮することにより、目的物を含む水溶
液（60μ）を得た。
＋TSKguardcolomunPWxL（6.0mmφ×4cm）（東ソー社
製） 溶出液:0.2M NaCl 流速:0.6ml/分 検出波長:214nm 保持時間:24.9分 実施例21 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾ヒト心房性ナ
トリウム利尿ペプチド（hANP）の製造： hANP（216μｇ）の0.2M NaHCO3−Na2CO3（pH8.97、1
00μ）溶液に、室温で10％２−メチルマレイン酸無水
物含有アセトン溶液（９μ）を５分間隔で２回加え
た。この間1N NaOHを用いて、反応液のpHを８〜９に調
節した。１時間30分後、実施例１で得た４−モノメトキ
シポリエチレングリコール−フェニルグリオキザール
（0.87mg）を含む0.2M NaHCO3−Na2Co3（pH8.97）水溶
液（50μ）を加え、1N NaOHでpH8〜９とした後、遮
光下室温にて２時間30分放置した。1N酢酸水にてpHを２
〜３とし、37℃にて遮光下８時間30分放置した。反応液
をTSKgelG3000SW（東ソー社製、7.5mmφ×60cm）を用い
たゲル濾過により精製し、目的物を含む分画を限外濾過
により、脱塩・濃縮することにより、目的物を含む水溶
液（60μ）を得た。
目的物の酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 1.7（２）;Glx 0.9（１）； Ser 3.7（５）;Gly 4.9（５）； Arg 2.4（５）;Ala 1.1（１）； Tyr 0.9（１）;Met 0.4（１） Ile 1.0（１）;Leu＊2.0（２）； Phe 2.1（２）;Cys −（２）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値、−は未測定 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 1.7（２）;Glx 0.9（１）； Ser 3.7（５）;Gly 4.9（５）； Arg 2.4（５）;Ala 1.1（１）； Tyr 0.9（１）;Met 0.4（１） Ile 1.0（１）;Leu＊2.0（２）； Phe 2.1（２）;Cys −（２）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値、−は未測定 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSKgelG3000SW （7.5mmφ×60cm）（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.5ml/分 検出波長:220nm 保持時間:26.42分 実施例22 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾性腺刺激ホル
モン放出ホルモン（LHRH）の製造： LHRH224μｇを含む0.2M NaHCO3−Na2CO3（pH9）200
μの溶液に、室温にて、実施例１で得た４−モノメト
キシポリエチレングリコール−フェニルグリオキザール
1.9mgを加え、遮光下室温にて24時間放置した。1N酢酸
水にてpHを約７とした後、逆相高速液体クロマトグラフ
ィー〔YMC−ODS、4.6mmφ×250mm:溶出液Ａ液＝0.1％TF
A水とＢ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）を用いたグラ
ジェント（初期Ｂ液濃度30％、勾配１％／分）；流速1m
l/分〕により精製を行い、目的物を含む分画を凍結乾燥
した後、水60μを加え、目的物を含む水溶液として得
た。
モン放出ホルモン（LHRH）の製造： LHRH224μｇを含む0.2M NaHCO3−Na2CO3（pH9）200
μの溶液に、室温にて、実施例１で得た４−モノメト
キシポリエチレングリコール−フェニルグリオキザール
1.9mgを加え、遮光下室温にて24時間放置した。1N酢酸
水にてpHを約７とした後、逆相高速液体クロマトグラフ
ィー〔YMC−ODS、4.6mmφ×250mm:溶出液Ａ液＝0.1％TF
A水とＢ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）を用いたグラ
ジェント（初期Ｂ液濃度30％、勾配１％／分）；流速1m
l/分〕により精製を行い、目的物を含む分画を凍結乾燥
した後、水60μを加え、目的物を含む水溶液として得
た。
目的物の酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Glx 1.0（１）;Ser 1.0（１）； Gly 2.3（２）;His 1.0（１）； Arg 0.2（１）;Pro;1.1（１）； Tyr 0.8（１）;Leu＊１（１）； Trp −（１）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値、−は未測定 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Glx 1.0（１）;Ser 1.0（１）； Gly 2.3（２）;His 1.0（１）； Arg 0.2（１）;Pro;1.1（１）； Tyr 0.8（１）;Leu＊１（１）； Trp −（１）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値、−は未測定 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSKgelG3000SW （7.5mmφ×60cm）（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.5ml/分 検出波長:220nm 保持時間:34.46分 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS,AM−303,5μ 4.6mmφ×250mm（山
村化学社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:35％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:220nm 保持時間:12.71分 実施例23 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾α−メラノト
ロピンの製造： α−メラノトロピン228μｇを含む0.2M NaHCO3−Na2
CO3（pH9）100μの溶液に、室温にて、実施例１で得
た４−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニル
グリオキザール685μｇを含む0.2M NaHCO3−Na2CO3（p
H9）水溶液100μを加え、遮光下室温にて24時間放置
した。1N酢酸水にてpHを約７とした後、TSKgelG3000SW
（東ソー社製、7.5mmφ×60cm）を用いたゲル濾過によ
り精製し、目的物を含む分画を脱塩し、凍結乾燥した
後、水60μを加え、目的物を含む水溶液として得た。
村化学社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:35％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:220nm 保持時間:12.71分 実施例23 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾α−メラノト
ロピンの製造： α−メラノトロピン228μｇを含む0.2M NaHCO3−Na2
CO3（pH9）100μの溶液に、室温にて、実施例１で得
た４−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニル
グリオキザール685μｇを含む0.2M NaHCO3−Na2CO3（p
H9）水溶液100μを加え、遮光下室温にて24時間放置
した。1N酢酸水にてpHを約７とした後、TSKgelG3000SW
（東ソー社製、7.5mmφ×60cm）を用いたゲル濾過によ
り精製し、目的物を含む分画を脱塩し、凍結乾燥した
後、水60μを加え、目的物を含む水溶液として得た。
目的物の酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Glx 0.9（１）;Ser 2.0（２）； Gly 1.1（１）;His 1.0（１）； Arg 0.4（１）;Pro 1.1（１）； Tyr 1.0（１）;Val 1.1（１）； Met 0.9（１）;Phe＊1 （１） Lys 0.9（１）;Trp −（１）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値、−は未測定 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Glx 0.9（１）;Ser 2.0（２）； Gly 1.1（１）;His 1.0（１）； Arg 0.4（１）;Pro 1.1（１）； Tyr 1.0（１）;Val 1.1（１）； Met 0.9（１）;Phe＊1 （１） Lys 0.9（１）;Trp −（１）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値、−は未測定 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSKgelG3000SW（7.5mmφ×60cm）（東ソー社
製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.5ml/分 検出波長:220nm 保持時間:34.42分 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS,AM−303,5μ 4.6mmφ×250mm（山
村化学社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:35％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:220nm 保持時間:12.71分 実施例24 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾パラチロイド
ホルモン（１−34）〔PTH（１−34）〕の製造： PTH（１−34）224μｇを含む0.2M NaHCO3−Na2CO
3（pH8.97）100μの溶液に、室温にて10％２−メチル
マレイン酸無水物含有アセトン溶液（９μ）を５分間
隔で２回加えた。この間1N NaOHを用いて、反応液のpH
を８〜９に調節した。１時間後、実施例１で得た４−モ
ノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグリオキ
ザール272μｇを含む0.2M NaHCO3−Na2CO3（pH8.97）
水溶液50μを加え、1N NaOHでpHを８〜９とした後、
遮光下室温にて２時間放置後、さらに修飾試剤270μｇ
を含む0.2M NaHCO3−Na2CO3（pH8.97）水溶液25μを
加え、遮光下室温にて２時間30分放置した。1N酢酸水に
てpHを２〜３とし、37℃にて遮光下８時間放置した。反
応液をTSKgelG3000SW（東ソー社製、7.5mmφ×60cm）を
用いたゲル濾過により精製し、目的物を含む分画をさら
に逆相高速液体クロマトグラフィー〔YMC−ODS、4.6mm
φ×250mm:溶出液Ａ液＝0.1％TFA水とＢ液＝アセトニト
リル（0.1％TFA）を用いたグラジェント（初期Ｂ液濃度
20％、勾配１％／分）；流速1ml/分〕により精製を行っ
た。目的物を含む分画を凍結乾燥した後、水50μを加
え、目的物を含む水溶液として得た。
製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.5ml/分 検出波長:220nm 保持時間:34.42分 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS,AM−303,5μ 4.6mmφ×250mm（山
村化学社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:35％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:220nm 保持時間:12.71分 実施例24 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾パラチロイド
ホルモン（１−34）〔PTH（１−34）〕の製造： PTH（１−34）224μｇを含む0.2M NaHCO3−Na2CO
3（pH8.97）100μの溶液に、室温にて10％２−メチル
マレイン酸無水物含有アセトン溶液（９μ）を５分間
隔で２回加えた。この間1N NaOHを用いて、反応液のpH
を８〜９に調節した。１時間後、実施例１で得た４−モ
ノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグリオキ
ザール272μｇを含む0.2M NaHCO3−Na2CO3（pH8.97）
水溶液50μを加え、1N NaOHでpHを８〜９とした後、
遮光下室温にて２時間放置後、さらに修飾試剤270μｇ
を含む0.2M NaHCO3−Na2CO3（pH8.97）水溶液25μを
加え、遮光下室温にて２時間30分放置した。1N酢酸水に
てpHを２〜３とし、37℃にて遮光下８時間放置した。反
応液をTSKgelG3000SW（東ソー社製、7.5mmφ×60cm）を
用いたゲル濾過により精製し、目的物を含む分画をさら
に逆相高速液体クロマトグラフィー〔YMC−ODS、4.6mm
φ×250mm:溶出液Ａ液＝0.1％TFA水とＢ液＝アセトニト
リル（0.1％TFA）を用いたグラジェント（初期Ｂ液濃度
20％、勾配１％／分）；流速1ml/分〕により精製を行っ
た。目的物を含む分画を凍結乾燥した後、水50μを加
え、目的物を含む水溶液として得た。
目的物の酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 3.8（４）;Glx 4.5（５）； Ser 2.7（３）;Gly 1.1（１）； His 2.9（３）;Arg 1.3（２）； Val 2.8（３）;Met 0.8（２）； Ile 1.0（１）;Leu＊5 （５）； Phe 1.0（１）;Lys 2.6（３）； Trp −（１）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値、−は未測定 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 3.8（４）;Glx 4.5（５）； Ser 2.7（３）;Gly 1.1（１）； His 2.9（３）;Arg 1.3（２）； Val 2.8（３）;Met 0.8（２）； Ile 1.0（１）;Leu＊5 （５）； Phe 1.0（１）;Lys 2.6（３）； Trp −（１）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値、−は未測定 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSKgelG3000SW （7.5mmφ×60cm）（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.5ml/分 検出波長:220nm 保持時間:34.03分 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS,AM−303,5μ 4.6mmφ×250mm（山村化学社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸） 初期Ｂ液濃度:35％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:220nm 保持時間:11.82分 実施例25 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾インシュリン
様成長因子−II（IGF−II）の製造： IGF−II（200μｇ）の0.2M NaHCO3−Na2CO3（pH8.9
7、100μ）溶液に、室温にて10％２−メチルマレイン
酸無水物含有アセトン溶液（９μ）を５分間隔で２回
加えた。この間1N NaOHを用いて、反応液のpHを８〜９
に調節した。35分後、実施例１で得た４−モノメトキシ
ポリエチレングリコール−フェニルグリオキザール（0.
5mg）を含む0.2MNaHCO3−Na2CO3（pH8.97）水溶液（50
μ）を加え、1N NaOHでpHを８〜９とした後、遮光下
室温にて２時間45分放置した。1N酢酸水にてpHを２〜３
とし、37℃にて遮光下９時間放置した。反応液をTSKgel
G3000SW（東ソー社製、7.5mmφ×60cm）を用いたゲル濾
過により精製し、目的物を含む分画を限外濾過により脱
塩・濃縮することにより、目的物を含む水溶液（50μ
、蛋白含量15.4μg/50μ）を得た。
様成長因子−II（IGF−II）の製造： IGF−II（200μｇ）の0.2M NaHCO3−Na2CO3（pH8.9
7、100μ）溶液に、室温にて10％２−メチルマレイン
酸無水物含有アセトン溶液（９μ）を５分間隔で２回
加えた。この間1N NaOHを用いて、反応液のpHを８〜９
に調節した。35分後、実施例１で得た４−モノメトキシ
ポリエチレングリコール−フェニルグリオキザール（0.
5mg）を含む0.2MNaHCO3−Na2CO3（pH8.97）水溶液（50
μ）を加え、1N NaOHでpHを８〜９とした後、遮光下
室温にて２時間45分放置した。1N酢酸水にてpHを２〜３
とし、37℃にて遮光下９時間放置した。反応液をTSKgel
G3000SW（東ソー社製、7.5mmφ×60cm）を用いたゲル濾
過により精製し、目的物を含む分画を限外濾過により脱
塩・濃縮することにより、目的物を含む水溶液（50μ
、蛋白含量15.4μg/50μ）を得た。
目的物の酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 3.0（３）;Glx 6.1（７）； Ser 6.7（７）;Gly 5.8（５）； Arg 5.4（８）;Thr 3.0（４）； Ala＊5.0（５）;Pro 2.4（３）； Tyr 2.4（３）;Val 3.2（４）； Ile 0.8（１）;Leu 4.7（６）； Phe 3.3（４）;Lys 1.0（１）； Cys −（６）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値、−は未測定 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 3.0（３）;Glx 6.1（７）； Ser 6.7（７）;Gly 5.8（５）； Arg 5.4（８）;Thr 3.0（４）； Ala＊5.0（５）;Pro 2.4（３）； Tyr 2.4（３）;Val 3.2（４）； Ile 0.8（１）;Leu 4.7（６）； Phe 3.3（４）;Lys 1.0（１）； Cys −（６）； ＊基準アミノ酸、（ ）内は理論値、−は未測定 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSKgelG3000SW （7.5mmφ×60cm）（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.5ml/分 検出波長:220nm 保持時間:26.67分 実施例26 ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾ウリカーゼの
製造： ウリカーゼ（0.5mg）の0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3
（pH8.97、100μ）溶液に、室温で20％２−メチルマ
レイン酸無水物アセトン溶液（10μ）を５分間隔で３
回加えた。この間1N NaOHを用いて、反応液のpHを９〜
10に調節した。さらに1N NaOHでpHを９〜10とし６時間
室温にて放置した。次いで、実施例１で得た４−モノメ
トキシポリエチレングリコール−フェニルグリオキザー
ル15mgおよび0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（50μ）
を加え、1N NaOHでpHを９〜10に調整し、遮光下室温に
て24時間放置した後、酢酸を加え、pH3とし、40℃で３
時間放置した。反応混合物をTSKgelG4000PWxL（7.8mmφ
×30cm）２本連結＋TSKguardcolumnPWxLゲル濾過により
精製し、目的とする分画を凍結乾燥後、遠心濾過チュー
ブ（ミリポア社製、ウルトラフリーC3LGC）により、脱
塩・濃縮することによって、目的物の水溶液50μを得
た。
製造： ウリカーゼ（0.5mg）の0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3
（pH8.97、100μ）溶液に、室温で20％２−メチルマ
レイン酸無水物アセトン溶液（10μ）を５分間隔で３
回加えた。この間1N NaOHを用いて、反応液のpHを９〜
10に調節した。さらに1N NaOHでpHを９〜10とし６時間
室温にて放置した。次いで、実施例１で得た４−モノメ
トキシポリエチレングリコール−フェニルグリオキザー
ル15mgおよび0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（50μ）
を加え、1N NaOHでpHを９〜10に調整し、遮光下室温に
て24時間放置した後、酢酸を加え、pH3とし、40℃で３
時間放置した。反応混合物をTSKgelG4000PWxL（7.8mmφ
×30cm）２本連結＋TSKguardcolumnPWxLゲル濾過により
精製し、目的とする分画を凍結乾燥後、遠心濾過チュー
ブ（ミリポア社製、ウルトラフリーC3LGC）により、脱
塩・濃縮することによって、目的物の水溶液50μを得
た。
目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。
通りである。
○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSKgelG4000PWxL（7.8mmφ×30cm）２本連結
＋TSKguardcolomunPWxL（6.0mmφ×4cm）（東ソー社
製） 溶出液:0.2M NaCl 流速:0.6ml/分 検出波長:254nm 保持時間:24.6分
＋TSKguardcolomunPWxL（6.0mmφ×4cm）（東ソー社
製） 溶出液:0.2M NaCl 流速:0.6ml/分 検出波長:254nm 保持時間:24.6分
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小野 圭一 兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号 住友 製薬株式会社内 (56)参考文献 特開 昭62−185029（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，243 ［23］（1968）米 ｐ．6171−6179 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C08G 65/00 - 65/48 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (4)
- 【請求項１】式 （式中、Ｒは炭素数１〜４の低級アルキル基を表し、ｎ
はポリエチレングリコール部分の平均分子量が1,000〜1
2,000となる任意の正の整数であることを表す。）で表
されるポリエチレングリコール誘導体。 - 【請求項２】ペプチド中のグアニジノ基が請求項（１）
記載のポリエチレングリコール誘導体によって修飾され
ている修飾ペプチド。 - 【請求項３】請求項（１）記載のポリエチレングリコー
ル誘導体とグアニジノ基を有するペプチドとを反応させ
ることを特徴とする修飾ペプチドの製造方法。 - 【請求項４】グアニジノ基を有するペプチドのアミノ基
を保護した後、請求項（１）記載のポリエチレングリコ
ール誘導体を反応させ、続いてアミノ基の保護基を脱保
護することを特徴とする修飾ペプチドの製造方法。
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| US5349052A (en) * | 1988-10-20 | 1994-09-20 | Royal Free Hospital School Of Medicine | Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
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| AU3423293A (en) * | 1991-12-19 | 1993-07-19 | Baylor College Of Medicine | Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression |
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| US5730990A (en) * | 1994-06-24 | 1998-03-24 | Enzon, Inc. | Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates |
| US20030053982A1 (en) | 1994-09-26 | 2003-03-20 | Kinstler Olaf B. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
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| US20070092482A1 (en) * | 2005-08-04 | 2007-04-26 | Bossard Mary J | Conjugates of a G-CSF moiety and a polymer |
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| CA2707979A1 (en) * | 2007-12-13 | 2009-06-18 | Biovectra Inc. | Polypeptides modified by protein trans-splicing technology |
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| US8268592B2 (en) | 2008-07-17 | 2012-09-18 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd | Anti-system ASC amino acid transporter 2 (ASCT2) antibody |
| JP5766118B2 (ja) * | 2008-09-11 | 2015-08-19 | ウェルズ ファーゴ バンク ナショナル アソシエイション | ポリマー性アルファ−ヒドロキシアルデヒドおよびケトン反応剤ならびに抱合方法 |
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| CN104411720B (zh) | 2012-07-02 | 2018-05-11 | 协和发酵麒麟株式会社 | 以抗bmp9抗体作为有效成分的、对肾性贫血、癌性贫血等贫血的治疗剂 |
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|---|---|---|---|---|
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