JP2960804B2 - グルコース転移酵素 - Google Patents
グルコース転移酵素Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はグルコース転移酵素に関
するものであり、詳しくは、糖脂質の生合成上重要とさ
れるグルコース転移酵素に関するものである。
するものであり、詳しくは、糖脂質の生合成上重要とさ
れるグルコース転移酵素に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】細胞膜に存在する酵素は、その基質、及
び生成物が水溶性物質だけでなく、水に不溶の脂質成分
も反応にあずかることができ、その膜は生体の複合脂質
の生合成の場となっている。また、膜酵素は同じ脂質２
重層の中に存在する場合、一つの酵素の反応生成物が直
ちに他の酵素の基質となり、一連の酵素系による連続反
応の効率を高めている。
び生成物が水溶性物質だけでなく、水に不溶の脂質成分
も反応にあずかることができ、その膜は生体の複合脂質
の生合成の場となっている。また、膜酵素は同じ脂質２
重層の中に存在する場合、一つの酵素の反応生成物が直
ちに他の酵素の基質となり、一連の酵素系による連続反
応の効率を高めている。
【０００３】連続反応により合成される糖脂質の中に
は、有機合成反応ではその合成が困難な化合物が多い。
生体膜の構成成分であり、膜蛋白質の機能、さらに細胞
の機能にとって重要な役割を持つ一連の糖脂質の生合成
では、１つの糖転移酵素がただ１種類の糖転移反応しか
触媒しないので、糖鎖を合成するためには構成単糖の数
だけの酵素反応が行われなければならない。これらの糖
転移酵素は転移される単糖のヌクレオチド誘導体を基質
とする。糖ヌクレオチドはヌクレオチド３燐酸と糖燐酸
からピロホスホリラーゼにより合成され、糖転移反応の
結果生じたヌクレオチド２燐酸はＡＴＰを消費して、ヌ
クレオチド３燐酸へと再生される。
は、有機合成反応ではその合成が困難な化合物が多い。
生体膜の構成成分であり、膜蛋白質の機能、さらに細胞
の機能にとって重要な役割を持つ一連の糖脂質の生合成
では、１つの糖転移酵素がただ１種類の糖転移反応しか
触媒しないので、糖鎖を合成するためには構成単糖の数
だけの酵素反応が行われなければならない。これらの糖
転移酵素は転移される単糖のヌクレオチド誘導体を基質
とする。糖ヌクレオチドはヌクレオチド３燐酸と糖燐酸
からピロホスホリラーゼにより合成され、糖転移反応の
結果生じたヌクレオチド２燐酸はＡＴＰを消費して、ヌ
クレオチド３燐酸へと再生される。
【０００４】このような複雑に存在する膜酵素の中に
は、グルコシルセラミドを合成するグルコース転移酵素
の存在が知られており、このグルコース転移酵素は上記
生理機能をもった糖脂質の生合成の第一段階である反応
を司る重要な酵素と考えられている。
は、グルコシルセラミドを合成するグルコース転移酵素
の存在が知られており、このグルコース転移酵素は上記
生理機能をもった糖脂質の生合成の第一段階である反応
を司る重要な酵素と考えられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記グ
ルコシルセラミドを合成するグルコース転移酵素につい
ては、現在までにいくつかの臓器に存在することが知ら
れているのみである。従って、本発明の目的は、医学、
薬学等の分野に利用され、スフィンゴ糖脂質合成の第一
段階を司るものとして有用なグルコース転移酵素及びそ
の精製物を提供することにある。
ルコシルセラミドを合成するグルコース転移酵素につい
ては、現在までにいくつかの臓器に存在することが知ら
れているのみである。従って、本発明の目的は、医学、
薬学等の分野に利用され、スフィンゴ糖脂質合成の第一
段階を司るものとして有用なグルコース転移酵素及びそ
の精製物を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、本酵素の
存在する膜の脂質組成物によって、本酵素活性が抑制さ
れていることを知見すると共に、膜画分の脂質分解酵素
処理及び脂質添加の実験において、本酵素にはリン脂質
が必須であり、また逆に活性を抑制する膜中脂質の存在
を知見した。
存在する膜の脂質組成物によって、本酵素活性が抑制さ
れていることを知見すると共に、膜画分の脂質分解酵素
処理及び脂質添加の実験において、本酵素にはリン脂質
が必須であり、また逆に活性を抑制する膜中脂質の存在
を知見した。
【０００７】本発明は、上記知見に基づいてなされたも
ので、分子量が３乃至１０万で、UDP-グルコースからグ
ルコースをセラミドに転移させる至適PHが６乃至７の範
囲にあるグルコース転移酵素を提供することにより、上
記目的を達成したものである。
ので、分子量が３乃至１０万で、UDP-グルコースからグ
ルコースをセラミドに転移させる至適PHが６乃至７の範
囲にあるグルコース転移酵素を提供することにより、上
記目的を達成したものである。
【０００８】
【作用】本発明に係るグルコース転移酵素は、一旦、細
胞の膜画分を界面活性剤で可溶化した後、該界面活性剤
を除いて得られ、またリン脂質を存在させると、PH６乃
至７の範囲において、グルコシルセラミドを生合成する
作用、即ち図１に示すような作用を充分に発揮するもの
である。
胞の膜画分を界面活性剤で可溶化した後、該界面活性剤
を除いて得られ、またリン脂質を存在させると、PH６乃
至７の範囲において、グルコシルセラミドを生合成する
作用、即ち図１に示すような作用を充分に発揮するもの
である。
【０００９】
【実施の態様】以下、本発明に係るグルコース転移酵素
及び、その酵素含有精製物について詳述する。本発明に
係るグルコース転移酵素は、分子量が３乃至１０万で、
UDP-グルコースからグルコースをセラミドに転移させる
至適PHが６乃至７の範囲にあるものである。
及び、その酵素含有精製物について詳述する。本発明に
係るグルコース転移酵素は、分子量が３乃至１０万で、
UDP-グルコースからグルコースをセラミドに転移させる
至適PHが６乃至７の範囲にあるものである。
【００１０】具体的には、本転移酵素はラット脳、マウ
ス脳及びマウス表皮等の動物細胞等の膜画分から得ら
れ、一旦界面活性剤で可溶化後、ゲル濾過等により界面
活性剤を除いて、脂質二重膜中に再構成することにより
酵素活性を回復させることのできるものである。尚、ラ
ットの脳においては３週齢のものが望ましく、成長期に
したがって酵素活性の低下がみられる。また、本酵素は
カンジダ、アルビカンスの膜画分にも存在することを本
発明者は明らかにしている。
ス脳及びマウス表皮等の動物細胞等の膜画分から得ら
れ、一旦界面活性剤で可溶化後、ゲル濾過等により界面
活性剤を除いて、脂質二重膜中に再構成することにより
酵素活性を回復させることのできるものである。尚、ラ
ットの脳においては３週齢のものが望ましく、成長期に
したがって酵素活性の低下がみられる。また、本酵素は
カンジダ、アルビカンスの膜画分にも存在することを本
発明者は明らかにしている。
【００１１】本発明に係るグルコース転移酵素は、UDP-
グルコース：セラミドに特異性のあるグルコース転移酵
素で、図１に示す作用を有する。また、これらの基質を
用いた酵素反応における至適PHを調べた結果、図２乃至
４に示す如く、ラット脳、マウス脳、及びマウス表皮か
らの本酵素は、緩衝液の種類を２−（Ｎ−モルホリノ）
エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（モルフォリノ）プ
ロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、トリス−マレイン酸の
それぞれに換えた場合、その活性の至適PHは６．５付近
であった。
グルコース：セラミドに特異性のあるグルコース転移酵
素で、図１に示す作用を有する。また、これらの基質を
用いた酵素反応における至適PHを調べた結果、図２乃至
４に示す如く、ラット脳、マウス脳、及びマウス表皮か
らの本酵素は、緩衝液の種類を２−（Ｎ−モルホリノ）
エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（モルフォリノ）プ
ロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、トリス−マレイン酸の
それぞれに換えた場合、その活性の至適PHは６．５付近
であった。
【００１２】更に、本発明に係るグルコース転移酵素を
説明すると、本酵素は、図５に示す如く、脂質などの添
加によって、その酵素活性が変化するものである。図５
に示す如く、カルジオリンピンが活性促進作用をみせ、
その他の脂質においては活性に影響を与えないかあるい
は抑制作用がみられた。特にスフィンゴミエリンおよび
スフィンゴシンには著しい活性抑制作用がみられ、これ
らの膜中脂質は本酵素の活性制御に寄与している可能性
が示唆され、本酵素が膜そのものに存在する場合に、そ
の活性発現を阻害していると考えられる。
説明すると、本酵素は、図５に示す如く、脂質などの添
加によって、その酵素活性が変化するものである。図５
に示す如く、カルジオリンピンが活性促進作用をみせ、
その他の脂質においては活性に影響を与えないかあるい
は抑制作用がみられた。特にスフィンゴミエリンおよび
スフィンゴシンには著しい活性抑制作用がみられ、これ
らの膜中脂質は本酵素の活性制御に寄与している可能性
が示唆され、本酵素が膜そのものに存在する場合に、そ
の活性発現を阻害していると考えられる。
【００１３】また、天然由来（大豆および卵黄）のホス
ファチジルコリンと合成品ジミリストイルホスファチジ
ルコリン（ＤＭＰＣ）とではその酵素活性に対する効果
が異なったが、これはそれぞれの脂肪酸鎖組成が異なる
ためと考えられる。図６にはホスホリパーゼ処理した膜
画分における本酵素活性を示したものである。ここに示
すようにホスホリパーセＤは酵素活性にほとんど影響を
与えなかったが、ホスホリパーゼＡ2およびホスホリパ
ーゼＣは、膜画分処理時のリパーゼ活性に従って本酵素
の活性を低下させた。特にホスホリパーゼＡ2による抑
制は著しく、２５units/ml, ３０分処理により本酵素活
性はコントロールの6.7 ％にまで低下した。一方、膜画
分をスフィンゴミエリナーゼ処理（1.32units/ml）した
ところ、活性は著しく上昇（１８０％）した（データは
示さない）。これは、スフィンゴミエリナーゼにより膜
中のスフィンゴミエリンが分解されてセラミドとなり、
この脂質の有しているグルコース酵素活性阻害作用が消
失したためと考えられる。
ファチジルコリンと合成品ジミリストイルホスファチジ
ルコリン（ＤＭＰＣ）とではその酵素活性に対する効果
が異なったが、これはそれぞれの脂肪酸鎖組成が異なる
ためと考えられる。図６にはホスホリパーゼ処理した膜
画分における本酵素活性を示したものである。ここに示
すようにホスホリパーセＤは酵素活性にほとんど影響を
与えなかったが、ホスホリパーゼＡ2およびホスホリパ
ーゼＣは、膜画分処理時のリパーゼ活性に従って本酵素
の活性を低下させた。特にホスホリパーゼＡ2による抑
制は著しく、２５units/ml, ３０分処理により本酵素活
性はコントロールの6.7 ％にまで低下した。一方、膜画
分をスフィンゴミエリナーゼ処理（1.32units/ml）した
ところ、活性は著しく上昇（１８０％）した（データは
示さない）。これは、スフィンゴミエリナーゼにより膜
中のスフィンゴミエリンが分解されてセラミドとなり、
この脂質の有しているグルコース酵素活性阻害作用が消
失したためと考えられる。
【００１４】以上のことから、本発明に係るグルコース
転移酵素は、リン脂質の存在が好ましく、特にカルジオ
ピリン及びホスファチジル系リン脂質の存在が良いこと
が考えられる。本発明に係るグルコース転移酵素の基質
特異性は、反応溶液中にＵＤＰ−［14Ｃ］グルコースと
ともに、グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）・Ｎ−アセチルグ
ルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）・ガラクトース（Ｇａｌ）
・Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧｕｌＮＡｃ）のそれ
ぞれの糖ヌクレオチドを最終濃度が０．１，１ｍＭとな
るように添加し、グルコース転移酵素の活性阻害率をみ
ることにより、間接的にＵＤＰ−グルコースに対する基
質特異性をみた結果、表１に示すようにＵＤＰ−ガラク
トースおよびＵＤＰ−グルクロン酸に若干の阻害活性が
認められた。しかし反応溶液中のＵＤＰ−グルコース濃
度は５０μＭであることから、本酵素はＵＤＰ−グルコ
ースに対して高い基質特異性を有することが示唆され
た。
転移酵素は、リン脂質の存在が好ましく、特にカルジオ
ピリン及びホスファチジル系リン脂質の存在が良いこと
が考えられる。本発明に係るグルコース転移酵素の基質
特異性は、反応溶液中にＵＤＰ−［14Ｃ］グルコースと
ともに、グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）・Ｎ−アセチルグ
ルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）・ガラクトース（Ｇａｌ）
・Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧｕｌＮＡｃ）のそれ
ぞれの糖ヌクレオチドを最終濃度が０．１，１ｍＭとな
るように添加し、グルコース転移酵素の活性阻害率をみ
ることにより、間接的にＵＤＰ−グルコースに対する基
質特異性をみた結果、表１に示すようにＵＤＰ−ガラク
トースおよびＵＤＰ−グルクロン酸に若干の阻害活性が
認められた。しかし反応溶液中のＵＤＰ−グルコース濃
度は５０μＭであることから、本酵素はＵＤＰ−グルコ
ースに対して高い基質特異性を有することが示唆され
た。
【００１５】
【表１】 糖ヌクレオチドのグルコース転移酵素活性への影響 ────────────────────────────────── ［UDP-sugar ］ UDP-Gal UDP-GlcUA UDP-GalNAc UDP-GlcNAｃ ──────────────────────────────── 阻害率（％） 0.1mM 2.6 7.4 -2.7 -5.8 1.0mM 9.6 25.5 -10.6 -1.7 ────────────────────────────────── また、本酵素は、マンガン、マグネシウム等の金属要
求性があり、特にマンガン・マグネシウムの両者を存在
させたときに、高い酵素活性が示されるものである。
求性があり、特にマンガン・マグネシウムの両者を存在
させたときに、高い酵素活性が示されるものである。
【００１６】本酵素には、２価カチオンとしてマンガン
およびマグネシウムが要求され、２価カチオンとして、
バリウム・カルシウム・カドニウム・マグネシウム・マ
ンガン・亜鉛をそれぞれ反応溶液中に５ｍＭ添加しその
影響をみたところ、表２に示すように、マンガン・マグ
ネシウム・バリウム・カルシウムの各イオンについて促
進効果が認められ、その効果の順位はマンガン＞マグネ
シウム＞バリウム＞カルシウムであった。また、マンガ
ン・マグネシウムの両カチオンを反応溶液中に添加する
ことにより相加的効果が認められ、マンガンにバリウム
又はカルシウムを加えた時についても同様の効果が認め
られた。マンガンの反応溶液中の濃度を１０ｍＭとした
場合においてもその活性促進効果は同じであったことか
ら、マンガンの濃度は必要十分であると考えられ、従っ
て、相加的効果はマグネシウム等が不足したマンガン濃
度を補っているものではない。
およびマグネシウムが要求され、２価カチオンとして、
バリウム・カルシウム・カドニウム・マグネシウム・マ
ンガン・亜鉛をそれぞれ反応溶液中に５ｍＭ添加しその
影響をみたところ、表２に示すように、マンガン・マグ
ネシウム・バリウム・カルシウムの各イオンについて促
進効果が認められ、その効果の順位はマンガン＞マグネ
シウム＞バリウム＞カルシウムであった。また、マンガ
ン・マグネシウムの両カチオンを反応溶液中に添加する
ことにより相加的効果が認められ、マンガンにバリウム
又はカルシウムを加えた時についても同様の効果が認め
られた。マンガンの反応溶液中の濃度を１０ｍＭとした
場合においてもその活性促進効果は同じであったことか
ら、マンガンの濃度は必要十分であると考えられ、従っ
て、相加的効果はマグネシウム等が不足したマンガン濃
度を補っているものではない。
【００１７】
【表２】 グルコース転移酵素活性に於ける金属要求性 ─────────────────────────────── 金属イオン 酵素活性（％） ─────────────────────────────── ＥＤＴＡ（基準） １０ｍＭ １００ Ｃｄ++ ５ｍＭ １７．１ Ｚｎ++ ５ｍＭ １８．１ Ｂａ++ ５ｍＭ １４６ Ｃａ++ ５ｍＭ １２６ Ｍｇ++ ５ｍＭ １５０ Ｍｎ++ ５ｍＭ ２０６ Ｍｎ++ ５ｍＭ plus Ｍｇ++ ２．５ｍＭ ２３１ ─────────────────────────────── また、ホスホリパーゼＡ2 処理による酵素活性の低下の
原因は、リン脂質分解による膜の破壊あるいは流動性の
変化によるものばかりではなく、生成した脂肪酸による
ものである可能性がある。
原因は、リン脂質分解による膜の破壊あるいは流動性の
変化によるものばかりではなく、生成した脂肪酸による
ものである可能性がある。
【００１８】本発明に係るグルコース転移酵素の分子量
は、３万乃至１０万の範囲にあり、可溶化した酵素溶液
を限外濾過膜を通して、各濾液のグルーコス転移酵素の
活性を測定した結果、分画分子量１０万の限外濾過膜を
用いた場合は濾液に酵素活性があり、分画分子量３万の
限外濾過膜を用いた場合は濾液に酵素活性がほとんどな
いことが示された。尚、可溶化した本酵素は脂質を含ん
でいるため又は蛋白質同士の会合のため、見掛けの分子
量は、界面活性剤の存在下でのゲル濾過で３０万以上を
示す場合がある。
は、３万乃至１０万の範囲にあり、可溶化した酵素溶液
を限外濾過膜を通して、各濾液のグルーコス転移酵素の
活性を測定した結果、分画分子量１０万の限外濾過膜を
用いた場合は濾液に酵素活性があり、分画分子量３万の
限外濾過膜を用いた場合は濾液に酵素活性がほとんどな
いことが示された。尚、可溶化した本酵素は脂質を含ん
でいるため又は蛋白質同士の会合のため、見掛けの分子
量は、界面活性剤の存在下でのゲル濾過で３０万以上を
示す場合がある。
【００１９】次に、本発明に係るグルコース転移酵素含
有精製物は、上記グルコース転移酵素の活性を有する細
胞膜画分を界面活性剤で可溶化した後、リン脂質を含ま
せた緩衝液を用いて、可溶化物をクロマトグラフィーに
より精製してなるものである。上記グルコース転移酵素
の活性を有する細胞膜画分は、上述したラットの脳、マ
ウスの脳及びその表皮などをホモジナイザーで破砕し
て、緩衝溶液を加えて遠心分離した沈澱画分より得られ
る。
有精製物は、上記グルコース転移酵素の活性を有する細
胞膜画分を界面活性剤で可溶化した後、リン脂質を含ま
せた緩衝液を用いて、可溶化物をクロマトグラフィーに
より精製してなるものである。上記グルコース転移酵素
の活性を有する細胞膜画分は、上述したラットの脳、マ
ウスの脳及びその表皮などをホモジナイザーで破砕し
て、緩衝溶液を加えて遠心分離した沈澱画分より得られ
る。
【００２０】a. 可溶化 可溶化の為に用いる界面活性剤としては、両イオン界面
活性剤、特に３−〔（３−クロラミドプロピル）ジメチ
ルアンモニオ〕−１−プロパンスルホネート（３−
［（３−cholamidopropyl ）dimethylammonio ］−１-p
ropane-sulfonate以下、ＣＨＡＰＳという。）が望まし
い。また、この時の可溶化の為の緩衝溶液中、界面活性
剤であるＣＨＡＰＳは０．５乃至１０％、特に１乃至５
％の範囲にあることが望ましい。
活性剤、特に３−〔（３−クロラミドプロピル）ジメチ
ルアンモニオ〕−１−プロパンスルホネート（３−
［（３−cholamidopropyl ）dimethylammonio ］−１-p
ropane-sulfonate以下、ＣＨＡＰＳという。）が望まし
い。また、この時の可溶化の為の緩衝溶液中、界面活性
剤であるＣＨＡＰＳは０．５乃至１０％、特に１乃至５
％の範囲にあることが望ましい。
【００２１】緩衝溶液は、蛋白質濃度が２乃至８mg／m
l、塩化マグネシウムが５乃至２０mMの範囲で添加され
ていることが可溶化の上で望ましい。また、可溶化の際
の緩衝液のPHは６乃至８、可溶化時間が０．５時間以
上、温度が０乃至１０度の範囲にあることが望ましい。
このような好条件での可溶化率は約６０％以上である。
また、このような可溶化により界面活性剤が存在して
も、リン脂質の存在下で、界面活性剤を除けば、再び本
転移酵素の活性が戻る。
l、塩化マグネシウムが５乃至２０mMの範囲で添加され
ていることが可溶化の上で望ましい。また、可溶化の際
の緩衝液のPHは６乃至８、可溶化時間が０．５時間以
上、温度が０乃至１０度の範囲にあることが望ましい。
このような好条件での可溶化率は約６０％以上である。
また、このような可溶化により界面活性剤が存在して
も、リン脂質の存在下で、界面活性剤を除けば、再び本
転移酵素の活性が戻る。
【００２２】b. 分離精製 上記可溶化物の分離精製はクロマトグラフィーにより行
われる。酵素活性の測定は分画後、界面活性剤を除去し
たのちに行われる。分離精製に用いられるクロマトグラ
フィーとしては、イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー、疎水性カラムクロマトグラフィー、ゲルクロマトグ
ラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィー等が
挙げられる。
われる。酵素活性の測定は分画後、界面活性剤を除去し
たのちに行われる。分離精製に用いられるクロマトグラ
フィーとしては、イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー、疎水性カラムクロマトグラフィー、ゲルクロマトグ
ラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィー等が
挙げられる。
【００２３】クロマトグラフィーに用いる緩衝液中に
は、リン脂質、好ましくはホスファチジル系リン脂質、
更に好ましくは、ホスファチジルコリンを添加させるこ
とが重要であり、具体的には大豆レシチン等である。リ
ン脂質の添加は、精製中の酵素活性を維持すると考えら
れ、また精製における酵素の安定性に寄与すると考えら
れる。リン脂質の緩衝液中での濃度は１mg/ml 以上であ
ることが望ましい。
は、リン脂質、好ましくはホスファチジル系リン脂質、
更に好ましくは、ホスファチジルコリンを添加させるこ
とが重要であり、具体的には大豆レシチン等である。リ
ン脂質の添加は、精製中の酵素活性を維持すると考えら
れ、また精製における酵素の安定性に寄与すると考えら
れる。リン脂質の緩衝液中での濃度は１mg/ml 以上であ
ることが望ましい。
【００２４】具体的なクロマトグラフィーとしては、 i イオン交換カラクロマトグラフィー 本転移酵素は、pH7.4 の緩衝液（大豆レシチン２mg／ml
を含有する）中でＤＥＡＥ−トヨパールに吸着し、溶離
液中の塩濃度の上昇にともなってカラムより溶出でき
る。この操作により、比活性を約2.4 倍に上昇させるこ
とができる。 ii 疎水性カラムクロマトグラフィー 本酵素は、３Ｍ 塩化ナトリウム存在下ブチル−トヨパ
ールに吸着し、溶離液中の塩濃度の低下にともないカラ
ムより溶出できる。この操作により、比活性は約５倍に
上昇させることができる。 iii ゲルろ過 本酵素は、２％ＦＣＨＡＰＳ，２mg／ml大豆レシチン存
在下セファローズ４Ｂ又はセファロース６Ｂで分離する
ことができ、活性の回収率は８０％以上であった。ま
た、溶離液中のＣＨＡＰＳ濃度により、溶出パターンに
変化が見られた。
を含有する）中でＤＥＡＥ−トヨパールに吸着し、溶離
液中の塩濃度の上昇にともなってカラムより溶出でき
る。この操作により、比活性を約2.4 倍に上昇させるこ
とができる。 ii 疎水性カラムクロマトグラフィー 本酵素は、３Ｍ 塩化ナトリウム存在下ブチル−トヨパ
ールに吸着し、溶離液中の塩濃度の低下にともないカラ
ムより溶出できる。この操作により、比活性は約５倍に
上昇させることができる。 iii ゲルろ過 本酵素は、２％ＦＣＨＡＰＳ，２mg／ml大豆レシチン存
在下セファローズ４Ｂ又はセファロース６Ｂで分離する
ことができ、活性の回収率は８０％以上であった。ま
た、溶離液中のＣＨＡＰＳ濃度により、溶出パターンに
変化が見られた。
【００２５】
【実験例】以下に本発明に係るグルコース転移酵素の精
製及びその活性について具体的に示す。 (1) 材料 酵素抽出臓器である脳は、３週齢の Wister 系雄性ラッ
トより摘出した。
製及びその活性について具体的に示す。 (1) 材料 酵素抽出臓器である脳は、３週齢の Wister 系雄性ラッ
トより摘出した。
【００２６】セラミド、 ＵＤＰ−グルコース、 ＵＤ
Ｐ−グルクロン酸、 ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミ
ン、ＵＤＰ−ガラクトース、 ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガ
ラクトサミンおよび各種リン脂質、グルコシルセラミ
ド、コレステロール、セラミドはシグマ社より、ＭＯＰ
Ｓ、ＣＨＡＰＳ、２，３−ジメルカプトプロパノールは
和光純薬工業（株）より、ＵＤＰ−［Ｕ−14Ｃ］グルコ
ース（11.1ＧＢｑ／mmol）はアマシャム社よりそれぞれ
購入した。シリカゲル（ＨＰＬＣ充填剤）およびＤＥＡ
Ｅ−トヨパール、プチル−トヨパールは東ソー（株）よ
り購入した。ＤＥＡＥ−セルロースはワットマン社よ
り、スーパーローズ１２、セファロース４Ｂ、セファロ
ース６Ｂ、ＥＡＨ−セファロースはファルマシア社より
それぞれ購入した。
Ｐ−グルクロン酸、 ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミ
ン、ＵＤＰ−ガラクトース、 ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガ
ラクトサミンおよび各種リン脂質、グルコシルセラミ
ド、コレステロール、セラミドはシグマ社より、ＭＯＰ
Ｓ、ＣＨＡＰＳ、２，３−ジメルカプトプロパノールは
和光純薬工業（株）より、ＵＤＰ−［Ｕ−14Ｃ］グルコ
ース（11.1ＧＢｑ／mmol）はアマシャム社よりそれぞれ
購入した。シリカゲル（ＨＰＬＣ充填剤）およびＤＥＡ
Ｅ−トヨパール、プチル−トヨパールは東ソー（株）よ
り購入した。ＤＥＡＥ−セルロースはワットマン社よ
り、スーパーローズ１２、セファロース４Ｂ、セファロ
ース６Ｂ、ＥＡＨ−セファロースはファルマシア社より
それぞれ購入した。
【００２７】ホスホリパーゼＡ2 （Naja Naja Venom 由
来）、ホスホリパーゼＣ（Clostridium perfringens 由
来）、ホスホリパーゼＤ（Cabbage 由来）、スフィンゴ
ミエリナーゼ（Staphylococcus aureus 由来）はシグマ
社より購入した。 (2) 方 法 a. 臓器破砕および細胞分画 以下の操作はすべて０〜４℃で行った。脳を摘出後ハサ
ミで細切し、重量の３倍容の緩衝液Ａ〔0.32Ｍショ糖、
0.25ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ エチレンジア
ミン四酢酸（pH7.4 ）〕を加え、ポッター型のガラス／
テフロンホモジナイザーにて破砕し、臓器ホモジェネー
トした。これを８００g にて１０分間遠心して上清を取
り除き、沈澱に上清と同容量の緩衝液Ａを加えて再び破
砕の操作を行った。さらに８００g にて１０分間遠心し
て上清と沈澱に分離し、２つの上清を合わせて８００g
上清とした。これを１０，０００g にて３０分間遠心し
て、１０，０００g 沈澱画分とし、液体窒素中で凍結し
たのち−８０℃にて保存した。 b. グルコース転移酵素の可溶化 ラット脳の１０，０００g 沈澱画分を緩衝液Ｂ〔0.25Ｍ
ショ糖、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオ
スレイトール、0.02％ アジ化ナトリウム、0.5 ｍＭ
フェニルメチルスルフォニルフルオリド、 ５０ｍＭ
トリス−塩酸（PH7.4 ）〕に懸濁し、界面活性剤ＣＨＡ
ＰＳを添加して４℃にて攪伴した。これを１００，００
０g にて６０分間遠心し、上清および沈澱画分を得た。 c. 可溶化グルコース転移酵素の分離イ オン交換カラムクロマトグラフィー ＤＥＡＥ−トヨバールカラムを緩衝液Ｃ〔２％ ＣＨＡ
ＰＳ、２mg／ml 大豆レシチン、及びプロテアーゼ阻害
剤を含む上記緩衝液Ｂ〕にて平衡化した。b.で得た上清
画分に緩衝液Ｂおよび大豆レシチンを加えてＣＨＡＰＳ
１％, 大豆レシチン２mg／mlとし、これをカラムに添加
した。緩衝液Ｃにてカラムを洗浄し、０〜0.5 Ｍの塩化
ナトリウム直線勾配にて溶出し、活性画分を集めた。 d. グルコース転移酵素活性測定法 グルコース転移酵素活性測定は、セラミド２０μg を少
量のＣＨＣｌ3 に溶解してシリカゲル１mgを添加し、攪
伴後窒素気流にて乾燥しこれを基質とした。反応液には
セラミド２０μg 、ＵＤＰ−［Ｕ−14Ｃ］グルコース5.
4 ｎｍｏｌ（13.9ＫＢｑ）、３−（モルフォリノ）プロ
パンスルホン酸（PH6.5 ）5.5 μmol 、塩化マンガン５
５０nmol、塩化マグネシウム２７５nmol、還元型β−ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド１１０ｎｍｏｌ、
２，３−ジメルカプトプロパノール５５０ｎｍｏｌ,
ＣＨＡＰＳ６６０μg，タンパク１２５μg 〜５５０μg
をそれぞれ加え、最終容量を１１０μl とした。反応は
ＵＤＰ−［Ｕ−14Ｃ］グルコースを添加することにより
開始し、３７℃にて３０分間インキュベーションした。
反応の停止は冷リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと
いう。）１００μl を添加することにより行った。これ
を２０００rpm にて５分間遠心し、沈澱したゲルをＰＢ
Ｓ２００μl にて３回洗浄した。洗浄したゲルはＰＢＳ
２００μlに懸濁し、Aquasol −２（パッカード社製）
を４ml加えて液体シンチレーションカウンターにて放射
活性を測定した。
来）、ホスホリパーゼＣ（Clostridium perfringens 由
来）、ホスホリパーゼＤ（Cabbage 由来）、スフィンゴ
ミエリナーゼ（Staphylococcus aureus 由来）はシグマ
社より購入した。 (2) 方 法 a. 臓器破砕および細胞分画 以下の操作はすべて０〜４℃で行った。脳を摘出後ハサ
ミで細切し、重量の３倍容の緩衝液Ａ〔0.32Ｍショ糖、
0.25ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ エチレンジア
ミン四酢酸（pH7.4 ）〕を加え、ポッター型のガラス／
テフロンホモジナイザーにて破砕し、臓器ホモジェネー
トした。これを８００g にて１０分間遠心して上清を取
り除き、沈澱に上清と同容量の緩衝液Ａを加えて再び破
砕の操作を行った。さらに８００g にて１０分間遠心し
て上清と沈澱に分離し、２つの上清を合わせて８００g
上清とした。これを１０，０００g にて３０分間遠心し
て、１０，０００g 沈澱画分とし、液体窒素中で凍結し
たのち−８０℃にて保存した。 b. グルコース転移酵素の可溶化 ラット脳の１０，０００g 沈澱画分を緩衝液Ｂ〔0.25Ｍ
ショ糖、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオ
スレイトール、0.02％ アジ化ナトリウム、0.5 ｍＭ
フェニルメチルスルフォニルフルオリド、 ５０ｍＭ
トリス−塩酸（PH7.4 ）〕に懸濁し、界面活性剤ＣＨＡ
ＰＳを添加して４℃にて攪伴した。これを１００，００
０g にて６０分間遠心し、上清および沈澱画分を得た。 c. 可溶化グルコース転移酵素の分離イ オン交換カラムクロマトグラフィー ＤＥＡＥ−トヨバールカラムを緩衝液Ｃ〔２％ ＣＨＡ
ＰＳ、２mg／ml 大豆レシチン、及びプロテアーゼ阻害
剤を含む上記緩衝液Ｂ〕にて平衡化した。b.で得た上清
画分に緩衝液Ｂおよび大豆レシチンを加えてＣＨＡＰＳ
１％, 大豆レシチン２mg／mlとし、これをカラムに添加
した。緩衝液Ｃにてカラムを洗浄し、０〜0.5 Ｍの塩化
ナトリウム直線勾配にて溶出し、活性画分を集めた。 d. グルコース転移酵素活性測定法 グルコース転移酵素活性測定は、セラミド２０μg を少
量のＣＨＣｌ3 に溶解してシリカゲル１mgを添加し、攪
伴後窒素気流にて乾燥しこれを基質とした。反応液には
セラミド２０μg 、ＵＤＰ−［Ｕ−14Ｃ］グルコース5.
4 ｎｍｏｌ（13.9ＫＢｑ）、３−（モルフォリノ）プロ
パンスルホン酸（PH6.5 ）5.5 μmol 、塩化マンガン５
５０nmol、塩化マグネシウム２７５nmol、還元型β−ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド１１０ｎｍｏｌ、
２，３−ジメルカプトプロパノール５５０ｎｍｏｌ,
ＣＨＡＰＳ６６０μg，タンパク１２５μg 〜５５０μg
をそれぞれ加え、最終容量を１１０μl とした。反応は
ＵＤＰ−［Ｕ−14Ｃ］グルコースを添加することにより
開始し、３７℃にて３０分間インキュベーションした。
反応の停止は冷リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと
いう。）１００μl を添加することにより行った。これ
を２０００rpm にて５分間遠心し、沈澱したゲルをＰＢ
Ｓ２００μl にて３回洗浄した。洗浄したゲルはＰＢＳ
２００μlに懸濁し、Aquasol −２（パッカード社製）
を４ml加えて液体シンチレーションカウンターにて放射
活性を測定した。
【００２８】また、反応後のサンプルの放射活性の測定
に、一部、パッカード製のマトリックス９６直読式ベー
ターカンウンターを用いて行った。すなわち、酵素反応
の後、９６ウェル用のセルハーベスター（パッカード社
製）によりシリカゲルをガラスフィルターに集め、その
フィルター上の放射活性をマトリックス９６により測定
した。
に、一部、パッカード製のマトリックス９６直読式ベー
ターカンウンターを用いて行った。すなわち、酵素反応
の後、９６ウェル用のセルハーベスター（パッカード社
製）によりシリカゲルをガラスフィルターに集め、その
フィルター上の放射活性をマトリックス９６により測定
した。
【００２９】以上のイオン交換カラムクロマトグラフィ
ーにより得られた酵素標品は最適条件で１mgの蛋白当た
り毎時５乃至１０nmolのグルコシルセラミドを生成させ
ることができた。
ーにより得られた酵素標品は最適条件で１mgの蛋白当た
り毎時５乃至１０nmolのグルコシルセラミドを生成させ
ることができた。
【００３０】
【発明の効果】本発明に係るグルコース転移酵素は、医
学、薬学等の分野に利用され、スフィンゴ糖脂質合成の
第一段階を司るものとして有用なものとして活用するこ
とができる。
学、薬学等の分野に利用され、スフィンゴ糖脂質合成の
第一段階を司るものとして有用なものとして活用するこ
とができる。
【図１】本発明に係るグルコース転移酵素の作用機構を
示す図である。
示す図である。
【図２】本発明に係るグルコース転移酵素の酵素活性と
PH条件との関係グラフである。
PH条件との関係グラフである。
【図３】本発明に係るグルコース転移酵素の酵素活性と
PH条件との関係グラフである。
PH条件との関係グラフである。
【図４】本発明に係るグルコース転移酵素の酵素活性と
PH条件との関係グラフである。
PH条件との関係グラフである。
【図５】本発明に係るグルコース転移酵素の酵素活性に
及ぼす脂質の関係グラフである。
及ぼす脂質の関係グラフである。
【図６】膜画分をホスホリパーゼ処理したときの酵素活
性を示す関係グラフである。
性を示す関係グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】 分子量が３乃至１０万で、UDP-グルコー
スからグルコースをセラミドに転移させる至適PHが６乃
至７の範囲にある、グルコース転移酵素。 - 【請求項２】 請求項１記載のグルコース転移酵素の活
性を有する細胞膜画分を界面活性剤で可溶化した後、リ
ン脂質を存在させて、該可溶化物をクロマトグラフィー
により精製してなる、グルコース転移酵素含有精製物。 - 【請求項３】 上記リン脂質がホスファチジル系リン脂
質である請求項２記載のグルコース転移酵素含有精製
物。 - 【請求項４】 上記界面活性剤が両イオン界面活性剤で
ある請求項２又は３記載のグルコース転移酵素含有精製
物。 - 【請求項５】 上記界面活性剤が３─〔（３─クロラミ
ドプロピル）ジメチルアンモニオ〕─１─プロパンスル
ホネートである請求項２又は３記載のグルコース転移酵
素含有精製物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22745991A JP2960804B2 (ja) | 1991-09-06 | 1991-09-06 | グルコース転移酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22745991A JP2960804B2 (ja) | 1991-09-06 | 1991-09-06 | グルコース転移酵素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0564584A JPH0564584A (ja) | 1993-03-19 |
| JP2960804B2 true JP2960804B2 (ja) | 1999-10-12 |
Family
ID=16861207
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22745991A Expired - Fee Related JP2960804B2 (ja) | 1991-09-06 | 1991-09-06 | グルコース転移酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2960804B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2758856B2 (ja) * | 1995-06-15 | 1998-05-28 | 理化学研究所 | セラミドグルコシルトランスフェラーゼ |
| CN1301815A (zh) * | 1999-12-27 | 2001-07-04 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——磷脂酰转移酶14和编码这种多肽的多核苷酸 |
| WO2007063691A1 (ja) | 2005-11-29 | 2007-06-07 | Sanyo Chemical Industries, Ltd. | 溶菌剤 |
-
1991
- 1991-09-06 JP JP22745991A patent/JP2960804B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0564584A (ja) | 1993-03-19 |
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