JP2965284B2 - 食欲抑制剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はヒラタケの子実体か
ら分離される糖蛋白質の糖鎖を切断したもの或はまた該
糖蛋白質の蛋白質を部分的に分解したものを有効成分と
する食欲抑制剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、きのこの子実体から分離される糖
タンパク質に抗腫瘍作用のあることが報告されている
（特開昭５８−１１８５１９、特開昭５８−１２１２９
７）。一方、テトラヒドロピリジン化合物、デオキシ−
Ｄ−グルコール誘導体、キチン等のアミノ多糖類、トリ
グリセリド誘導体に食欲抑制作用のあることが報告され
ている（特開昭５７−１５９７１４、特開昭６０−８１
１２７、特開昭６２−１２３１２２、特開平３−２２０
１２３）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、ヒラタケの子
実体から分離される糖蛋白質の糖鎖を切断したもの或は
また該糖蛋白質の蛋白質を部分的に分解したものについ
て、これらに食欲抑制作用のあることは報告されていな
い。

【０００４】

【課題を解決するための手段】しかして本発明者らは、
叙上の如き実情に鑑み、ヒラタケの子実体から分離され
る糖蛋白質の糖鎖を切断したもの或はまた該糖蛋白質の
蛋白質を部分的に分解したものについて、これらの食欲
抑制作用を研究した結果、ヒラタケの子実体に所定の処
理を施すと、特定の糖蛋白質が分離され、更に該糖蛋白
質に所定の処理を施すと、該糖蛋白質の糖鎖が切断され
て、或はまた該糖蛋白質の蛋白質が部分的に分解され
て、これらが優れた食欲抑制作用を示すことを見出し
た。

【０００５】すなわち本発明は、ヒラタケの子実体から
ヒラタケ由来の糖蛋白質を含有する抽出物、沈殿物又は
分画物を分離する分離工程と、該抽出物、沈殿物又は分
画物に含まれる糖蛋白質の糖鎖を切断し或はまた蛋白質
を部分的に分解する分解工程とを経て得られる、詳しく
は後述するような切断物、透析物、切断分解物、分解物
又は分解切断物を有効成分とする食欲抑制剤に係る。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明において、原料として用い
るヒラタケ ( Pleurotus ostreatus ) は、ハラタケ目
( Agaricales ) 、シメジタケ科 ( Tricholomataceae )
に属するきのこである。本発明ではヒラタケの子実体
（傘部及び／又は柄部）を用い、該子実体は人工栽培物
又は天然物のどちらでもよいが、土伏栽培物又は原木栽
培物を用いるのが好ましく、なかでも傘部が大きくて柄
部の太いものを用いるのが特に好ましい。後述する分解
工程の処理対象となるヒラタケ由来の糖蛋白質は上記し
たヒラタケの子実体から得られる下記の抽出物、沈殿物
又は分画物に含まれてくる。

【０００７】抽出物は、ヒラタケの子実体、その破砕物
若しくは磨砕物、その乾燥物又はその乾燥粉砕物を水、
生理的食塩水又は２０重量％以下の範囲内にて極性有機
溶媒を溶解した水溶液で抽出処理して得られる抽出液、
その濃縮液又はその乾燥物である。この場合の極性有機
溶媒としてはメチルアルコール、エチルアルコール、ア
セトン等がある。例えば、ヒラタケの子実体の乾燥粉砕
物に１０〜３０倍量の水を加え、室温下で、好ましくは
４０℃以下で、更に好ましくは撹拌しつつ、１０〜３０
時間程度抽出処理し、濾過又は遠心分離して、抽出液を
得る。ヒラタケ由来の糖蛋白質は抽出液に含まれてくる
ので、該抽出液、その濃縮液又はその乾燥物を後述する
分解工程に供することができる。

【０００８】沈殿物は、上記抽出物を塩析又は極性有機
溶媒で沈殿処理して得られる沈殿物又はその乾燥物であ
る。この場合の塩析では硫酸アンモニウム等の多価の陰
イオンを含む塩を加え、また極性有機溶媒としてはメチ
ルアルコール、エチルアルコール、アセトン等を用い
る。抽出物として抽出液又はその濃縮液を用いる場合、
これらに対して、硫酸アンモニウムは６０〜９０重量％
飽和の範囲で加え、また極性有機溶媒は等量〜３倍量の
範囲で加えると、目的とする糖蛋白質を含有する物質が
沈殿する。例えば、抽出液に硫酸アンモニウムを９０重
量％飽和まで加え、室温下に静置して目的とする糖蛋白
質を含有する物質を沈殿させ、濾過又は遠心分離して、
沈殿物を得る。ヒラタケ由来の糖蛋白質は沈殿物に含ま
れてくるので、該沈殿物又はその乾燥物を後述する分解
工程に供することができる。

【０００９】分画物は、上記沈殿物をクロマト分画処理
して得られる分画液、その濃縮液又はその乾燥物であ
る。クロマト分画処理は、詳しくは実施例で後述するよ
うに、異なる担体及び移動相の組合わせで繰り返して行
ない、ヒラタケ由来の糖蛋白質を順次分画して、単離す
ることができるが、沈殿物を水に対して透析処理し、そ
の残留液（透析膜の内液）を減圧下に、好ましくは４０
℃以下の減圧下に留去して、更に同温度以下で凍結乾燥
した後、その凍結乾燥物をアフィニティークロマトグラ
フィーに供して、ヒラタケ由来の糖蛋白質を単離するこ
ともできる。ヒラタケ由来の糖蛋白質は分画液に含まれ
ているので、該分画液、その濃縮液又はその乾燥物を後
述する分解工程に供することができる。

【００１０】抽出、沈殿及び分画を経て単離されるヒラ
タケ由来の糖蛋白質は下記１）〜５）の特性を有してお
り、特に等電点が８．２〜９．２の塩基性を示し、レク
チン活性を有するという特性がある。 １）数平均分子量（ゲル濾過法、デキストラン換算）：
７００００〜９００００ ２）等電点：８．２〜９．２ ３）糖含量（フェノール−硫酸法）：２．２〜３．０重
量％ ４）Ｎ末端アミノ酸配列：アラニン−スレオニン−バリ
ン−リジン−イソロイシン−スレオニン−アラニン−ス
レオニン−プロリン−アルギニン−グルタミン−フェニ
ルアラニン−グリシン ５）レクチン活性：有

【００１１】単離されるヒラタケ由来の糖蛋白質は、ｐ
Ｈ５．８〜１０．０の領域で人の赤血球凝集能を示す
が、２’−フコシルラクトースとの特異的結合によりか
かるレクチン活性を失い、また湿潤状態では６５℃以上
の温度で急激にレクチン活性を失う。したがって本発明
では、抽出、沈殿及び分画の分離工程において、また後
述する分解工程において、これらの全処理を６５℃以下
の温度で行なうのが好ましく、４０℃以下の温度で行な
うのが更に好ましい。

【００１２】次に、分解工程について説明する。分解工
程では、前述した抽出物、沈殿物又は分画物に含まれる
ヒラタケ由来の糖蛋白質の糖鎖を切断し、或はまた蛋白
質を部分的に分解して、下記の切断物、透析物、切断分
解物、分解物又は分解切断物を得る。

【００１３】切断物は、前記の抽出物、沈殿物又は分画
物を酸加水分解後、アルカリ加水分解法又は糖鎖切断酵
素を用いた酵素分解法で処理し、該抽出物、該沈殿物又
は該分画物に含まれるヒラタケ由来の糖蛋白質の糖鎖を
切断したものである。ヒラタケ由来の糖蛋白質の糖鎖
は、ヒドラジンやトリメチルスルホン酸を用いた酸加水
分解法、或はテトラヒドロホウ酸ナトリウムを用いたア
ルカリ加水分解法で切断することができるが、これらの
化学的切断法のなかではトリフルオロメタンスルホン酸
を用いた酸加水分解法で切断するのが好ましい。例え
ば、ヒラタケ由来の糖蛋白質を含む前記の抽出物、沈殿
物又は分画物の水溶液に１／１００〜１０倍量（重量
比）のトリフルオロメタンスルホン酸を加え、−１０〜
１０℃、好ましくは０℃近くで、３０〜９０分間、好ま
しくは６０分間程度、窒素ガス気流下に静置する。静置
後、−２５〜−１５℃、好ましくは−２０℃近くで、５
０〜７０重量％、好ましくは６０重量％程度のピリジン
水溶液を反応液に対して１／１０〜等量（重量比）加え
て、糖鎖の切断反応を停止させる。かくして糖鎖の切断
反応を停止した液から、沈殿処理や透析処理等の精製手
段によりトリフルオロメタンスルホン酸等を除去する。

【００１４】ヒラタケ由来の糖蛋白質の糖鎖は、糖鎖切
断酵素を用いた酵素分解法で切断することもできる。本
発明は用いる糖鎖切断酵素の種類を特に制限するもので
なく、市販されている各種の糖鎖切断酵素を用いること
ができるが、かかる糖鎖切断酵素としてはＮ−グリカナ
ーゼ群、グリコペプチダーゼ群及びエンド−β−Ｎ−ア
セチルグルコサミニダーゼ群から選ばれる１種又は２種
以上を用いるのが好ましい。

【００１５】透析物は、上記の切断物を透析処理し、該
切断物に含まれる切断糖類を除去したものである。例え
ば、上記の切断物の水溶液を０．０１重量％の炭酸アン
モニウム水溶液に対して透析処理し、透析膜の内液とし
て得られる残留液、その濃縮液又はその乾燥物である。

【００１６】切断分解物は、前記の切断物又は透析物を
蛋白質分解酵素を用いた酵素分解法で処理し、該切断物
又は透析物に含まれる蛋白質を部分的に分解したもので
ある。蛋白質分解酵素としては、市販されている各種の
プロティナーゼ群及びペプチダーゼ群から選ばれる１種
又は２種以上のプロテアーゼを用いることができる。例
えば、前記の切断物又は透析物の水溶液に、これらに含
まれる蛋白質の０．１〜１００重量倍に相当するプロテ
アーゼを加え、３０〜５５℃、好ましくは４０℃近く
で、０．５〜７２時間、好ましくは２４時間程度静置す
る。かくして静置した反応液は濃縮し、更には乾燥する
こともできる。

【００１７】分解物は、前記の抽出物、沈殿物又は分画
物を蛋白分解酵素を用いた酵素分解法で処理し、該抽出
物、該沈殿物又は該分画物に含まれるヒラタケ由来の糖
蛋白質の蛋白質を部分的に分解したものである。

【００１８】分解切断物は、上記の分解物を酸加水分解
法、アルカリ加水分解法又は糖鎖切断酵素を用いた酵素
分解法で処理し、該分解物に含まれる糖蛋白質の糖鎖を
切断したものである。

【００１９】本発明の食欲抑制剤は、ヒラタケの子実体
から分離したヒラタケ由来の糖蛋白質を含有する抽出
物、沈殿物又は分画物にそれぞれ所定の処理を施して得
られる以上説明したような切断物、透析物、切断分解
物、分解物又は分解切断物を有効成分とするものであ
る。切断物には、ヒラタケ由来の糖蛋白質の糖鎖が切断
され、したがって切断糖鎖と糖蛋白質から分離された蛋
白質とが共存する。透析物には、上記切断糖鎖が除去さ
れ、したがって糖蛋白質から分離された蛋白質が存在す
る。上記の切断物から得られる切断分解物には、ヒラタ
ケ由来の糖蛋白質の糖鎖が切断され、また糖蛋白質から
分離された蛋白質が部分的に分解されていて、したがっ
て切断糖鎖と低分子量化された蛋白質とが共存する。上
記透析物から得られる切断分解物には、上記切断糖鎖が
除去され、したがって低分子量化された蛋白質が存在す
る。分解物には、ヒラタケ由来の糖蛋白質の蛋白質が部
分的に分解され、したがって糖鎖と低分子量化された蛋
白質とが共存する。分解切断物には、上記糖鎖が切断さ
れ、したがって切断糖鎖と低分子量化された蛋白質とが
共存する。

【００２０】いずれの場合も、ヒラタケ由来の糖蛋白質
から蛋白質が分離されており、或はまた該蛋白質が低分
子量化されていて、該蛋白質又は低分子量化された蛋白
質の吸収性が良くなって本来の機能を発揮し易くなるた
めと考えられるが、前記の切断物、透析物、切断分解
物、分解物及び分解切断物は優れた食欲抑制作用を示
す。

【００２１】

【実施例】

試験区分１（抽出物、沈殿物又は分画物の調製） 原料として岩手県産の土伏栽培したヒラタケの子実体を
用いた。平均傘径が４．５cmの子実体を４０℃以下で凍
結乾燥し、ミキサーで粉砕した。その粉砕物２００ｇに
４℃の水４リットルを加え、同温度で、撹拌しつつ、２
４時間抽出処理し、濾過して、抽出液を得た。抽出液を
４０℃で１／２量に減圧濃縮し、その濃縮液に硫酸アン
モニウムを９０重量％飽和まで加え、室温下に静置して
沈殿させ、遠心分離して沈殿物を得た。

【００２２】上記の沈殿物を流水中で透析処理し、その
残留液（透析膜の内液）を４０℃以下で凍結乾燥して、
その凍結乾燥物を下記のクロマト分画処理に供した。先
ず、凍結乾燥物を５００mlの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ５．０）に溶解し、同緩衝液で予め平衡化しておいた
ＣＭトヨパール（商品名、東ソー社製）に供した。同緩
衝液で充分に洗浄した後、０→１Ｍの濃度勾配で直線的
に塩化ナトリウム水溶液を流出させ、０．２５Ｍの塩化
ナトリウム水溶液で流出した分画液Ａを得た。

【００２３】次に、上記の分画液Ａに硫酸アンモニウム
を１Ｍの濃度となるよう加え、予め１Ｍの硫酸アンモニ
ウム水溶液で平衡化しておいたブチルトヨパール（商品
名、東ソー社製）に供した。同硫酸アンモニウム水溶液
で充分に洗浄した後、１→０Ｍの濃度勾配で直線的に硫
酸アンモニウム水溶液を流出させ、０．２５Ｍの硫酸ア
ンモニウム水溶液で流出した分画液Ｂを得た。

【００２４】更に、上記の分画液Ｂを流水に対して透析
処理し、脱塩した残留液（透析膜の内液）を得、予め１
０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡
化しておいたヒドロキシアパタイトに供した。同緩衝液
で充分に洗浄した後、１０ｍＭ→３Ｍの濃度勾配で直線
的にリン酸ナトリウム緩衝液を流出させ、０．１７Ｍの
リン酸ナトリウム緩衝液で流出した分画液Ｃを得た。

【００２５】最後に、上記の分画液Ｃを流水に対して透
析処理し、その残留液（透析膜の内液）を４０℃以下で
凍結乾燥した。その凍結乾燥物を５mlのＰＢＳ｛１０ｍ
Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）＋０．１５Ｍの塩化ナ
トリウム水溶液｝に溶解し、予め同ＰＢＳで平衡化して
おいたトヨパールＨＷ５５Ｆ（商品名、東ソー社製）に
供して、ゲル濾過した。かくして、前記した特性を有す
るヒラタケ由来の糖蛋白質１４０mgを得た。この糖蛋白
質を分画物とした。

【００２６】上記で得た糖蛋白質のアミノ酸組成を表１
に示した。

【表１】

【００２７】別に、前述した場合と同様にして、ヒラタ
ケの子実体の粉砕物を水で抽出処理し、更にその抽出液
を硫酸アンモニウムで沈殿処理して、その沈殿物を得た
後、４０℃以下の温度で凍結乾燥して、凍結乾燥物を得
た。この凍結乾燥物を沈殿物とした。また別に、上記し
た場合と同様にして、ヒラタケの子実体の粉砕物を水で
抽出処理し、その抽出液を４０℃以下の温度で凍結乾燥
して、凍結乾燥物を得た。この凍結乾燥物を抽出物とし
た。

【００２８】試験区分２（切断物、透析物、切断分解
物、分解物又は分解切断物の調製） 試験区分１の抽出物１４０mgを溶解した水溶液１０mlに
Ｎ−グリカナーゼ（生化学工業社製のグリコペプチダー
ゼＡ）とエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
（生化学工業社製のエンドグリコシダーゼＤ）との等量
混合物３０mgを加え、４０℃で４８時間静置した後、４
０℃で凍結乾燥して切断物Ａを得た。同様にして、試験
区分１の沈殿物及び分画物を処理し、それぞれ切断物
Ｂ、切断物Ｃを得た。

【００２９】試験区分１の抽出物１４０mgを溶解した水
溶液１０mlにトリフルオロメタンスルホン酸２１mlを加
え、０℃で６０分間、窒素ガス気流下に静置し、そして
−２０℃で６０重量％のピリジン水溶液３３．６mgを加
えた後、０．０１重量％の炭酸アンモニウム水溶液に対
して透析処理し、その残留液を４０℃で凍結乾燥して透
析物Ａを得た。同様にして、試験区分１の沈殿物及び分
画物を処理し、それぞれ透析物Ｂ、透析物Ｃを得た。

【００３０】前記の切断物Ａ１４０mgを溶解した水溶液
１４０mlにプロテアーゼ（科研製薬社製のアクチナーゼ
Ｅ）１４０mgを加え、４０℃で２４時間静置した後、４
０℃で凍結乾燥して切断分解物１Ａを得た。同様にし
て、前記の切断物Ｂ及び切断物Ｃを処理し、それぞれ切
断分解物１Ｂ、切断分解物１Ｃを得た。

【００３１】切断物Ａに代えて、前記の透析物Ａを上記
と同様に処理し、切断分解物２Ａを得た。同様にして、
前記の透析物Ｂ及び透析物Ｃを処理し、それぞれ切断分
解物２Ｂ、切断分解物２Ｃを得た。

【００３２】試験区分１の抽出物１４０mgを溶解した水
溶液１４０mlにプロテアーゼ（科研製薬社製のアクチナ
ーゼＥ）１４０mgを加え、４０℃で２４時間静置した
後、４０℃で凍結乾燥して分解物Ａを得た。同様にし
て、試験区分１の沈殿物及び分画物を処理し、それぞれ
分解物Ｂ、分解物Ｃを得た。

【００３３】前記の分解物１４０mgを溶解した水溶液１
０mlにＮ−グリカナーゼ（生化学工業社製のグリコペプ
チダーゼＡ）とエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニ
ダーゼ（生化学工業社製のエンドグリコシダーゼＤ）と
の等量混合物３０mgを加え、４０℃で４８時間静置した
後、４０℃で凍結乾燥して分解切断物Ａを得た。同様に
して、前記の分解物Ｂ及び分解物Ｃを処理し、それぞれ
分解切断物Ｂ、分解切断物Ｃを得た。

【００３４】試験区分３（食欲抑制作用の試験） 表２に記載した基本飼料と試験飼料とを調製した。これ
らの飼料を各群で５匹づつのラットに自由摂食させ、自
由摂食３日後の合計摂食量（ｇ）及び体重増減量（ｇ）
を測定し、結果を表３、表４及び表５に示した。

【００３５】

【表２】

【００３６】表２において、 試料：試験区分１又は試験区分２で得た表３、表４及び
表５に記載の抽出物等

【００３７】

【表３】

【００３８】

【表４】

【００３９】

【表５】

【００４０】表３、表４及び表５において、 対照群：基本飼料を自由摂食させた群 各投与群：試験飼料を自由摂食させた群 合計摂食量及び体重増減量の数値：平均値±ＳＥＭ 抑制率：｛（対照群の合計摂食量の平均値−各投与群の
合計摂食量の平均値）／対照群の合計摂食量の平均値｝
×１００ ＊：対照群に対し危険率０．１％で有意

【００４１】

【発明の効果】既に明らかなように、以上説明した本発
明には優れた食欲抑制作用を示すという効果がある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平７−238091（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 35/84 A61K 38/00 C12N 9/24 C12P 1/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の抽出物、沈殿物又は分画物を酸加
   水分解法、アルカリ加水分解法又は糖鎖切断酵素を用い
   た酵素分解法で処理し、該抽出物、該沈殿物又は該分画
   物に含まれるヒラタケ由来の糖蛋白質の糖鎖を切断した
   切断物を有効成分とする食欲抑制剤。 抽出物：ヒラタケの子実体、その破砕物若しくは磨砕
   物、その乾燥物又はその乾燥粉砕物を水、生理的食塩水
   又は２０重量％以下の範囲内にて極性有機溶媒を溶解し
   た水溶液で抽出処理して得られる抽出液、その濃縮液又
   はその乾燥物 沈殿物：上記抽出物を塩析又は極性有機溶媒で沈殿処理
   して得られる沈殿物又はその乾燥物 分画物：上記沈殿物をクロマト分画処理して得られる分
   画液、その濃縮液又はその乾燥物
2. 【請求項２】 請求項１記載の切断物を透析処理し、該
   切断物に含まれる切断糖鎖を除去した透析物を有効成分
   とする食欲抑制剤。
3. 【請求項３】 請求項１記載の切断物又は請求項２記載
   の透析物を蛋白質分解酵素を用いた酵素分解法で処理
   し、該切断物又は該透析物に含まれる蛋白質を部分的に
   分解した切断分解物を有効成分とする食欲抑制剤。
4. 【請求項４】 請求項１記載の抽出物、沈殿物又は分画
   物を蛋白質分解酵素を用いた酵素分解法で処理し、該抽
   出物、該沈殿物又は該分画物に含まれるヒラタケ由来の
   糖蛋白質の蛋白質を部分的に分解した分解物を有効成分
   とする食欲抑制剤。
5. 【請求項５】 請求項４記載の分解物を酸加水分解法、
   アルカリ加水分解法又は糖鎖切断酵素を用いた酵素分解
   法で処理し、該分解物に含まれる糖蛋白質の糖鎖を切断
   した分解切断物を有効成分とする食欲抑制剤。
6. 【請求項６】 トリフルオロメタンスルホン酸を用いた
   酸加水分解法で処理する請求項１、２、３又は５記載の
   食欲抑制剤。
7. 【請求項７】 糖類切断酵素としてＮ−グリカナーゼ
   群、グリコペプチダーゼ群及びエンド−β−Ｎ−アセチ
   ルグルコサミニダーゼ群から選ばれる１種又は２種以上
   を用いた酵素分解法で処理する請求項１、２、３又は５
   記載の食欲抑制剤。
8. 【請求項８】 糖蛋白質又は蛋白質に対して０．１〜１
   ００重量倍の蛋白質分解酵素を３０〜５５℃で０．５〜
   ７２時間作用させる酵素分解法で処理する請求項３、４
   又は５記載の食欲抑制剤。
9. 【請求項９】 全処理を６５℃以下の温度で行なう請求
   項１、２、３、４、５、６、７又は８記載の食欲抑制
   剤。