JP2968095B2

JP2968095B2 - 免疫グロブリン含有組成物

Info

Publication number: JP2968095B2
Application number: JP3189878A
Authority: JP
Inventors: クリストファー・サーマン・コードル; ジョゼフ・ポール・シャラー
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1990-07-30
Filing date: 1991-07-30
Publication date: 1999-10-25
Anticipated expiration: 2014-10-25
Also published as: IE76730B1; IE912159A1; CA2047843C; CA2047843A1; EP0469359A2; EP0469359B1; DE69121999T2; JPH04330099A; AU640495B2; EP0469359A3; ES2094170T3; NZ238674A; AU8020791A; DE69121999D1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、一般に免疫グロブリン
組成物に関する。さらに詳しくは、ヘリコバクター・ピ
ロリ(Helicobactor pylori)で免疫した哺乳動物(ウシな
ど)の初乳または乳汁から単離したヘリコバクター・ピ
ロリに特異的な免疫グロブリンの単離法に関する。本発
明はさらに、これら免疫グロブリン(抗体)を胃疾患の腸
溶治療(enteric treatment)に有用な製剤の調製に使用
することに関する。

【０００２】本発明は、免疫学的因子(好ましくは乳汁
由来のもの)を含有するタンパク質濃縮物の製造および
特定の免疫グロブリン集団に関する。さらに詳しくは、
本発明は、微生物ヘリコバクター・ピロリ[以前は文献
中でカンピロバクター・ピロリ(Campylobacter pylori)
と呼ばれていた]に対する特異性を示す活性免疫グロブ
リンおよびこのタンパク質を胃腸管中でのヘリコバクタ
ー・ピロリのコロニー形成の管理に使用することに関す
る。さらに詳しくは、本発明は、乳汁分泌する哺乳動物
にヘリコバクター・ピロリを注射し、ついで該免疫哺乳
動物により産生された初乳(または乳汁)から抗体を単離
濃縮すること、および胃腸管中に生息するヘリコバクタ
ー・ピロリの感染性を腸溶摂取により減少させるために
該濃縮物を使用することに関する。該タンパク質(免疫
グロブリン)濃縮物は、ヘリコバクター・ピロリの胃腸
管中でのコロニー形成に付随する後発症(胃炎および消
化性潰瘍を含む)の治療に有用である。

【０００３】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】一般
に、従来の文献には、乳汁由来の免疫学的因子を新生児
および乳幼児のための栄養製品中に導入および使用する
ことが開示されている。これら栄養製品を経口摂取する
ことにより、上記免疫学因子を胃腸管内における微生物
感染の結果に対する保護に利用することができる。米国
特許第３,９９２,５２１号および同第３,９８４,５３９
号各明細書には、ウマまたはウシの血清から得た抗体を
含有する免疫製品の製造方法および免疫グロブリン製品
自体が開示されている。しかしながら、これら特許に
は、本発明の特定の免疫グロブリン、その製造および単
離方法、該免疫グロブリンをヘリコバクター・ピロリに
より誘発された胃炎の治療に使用することのいずれも示
唆も開示もされていない。

【０００４】米国特許第３，１２８，２３０号明細書に
は、乳汁分泌哺乳動物に死菌微生物の混合物を注射し、
ついで血清または乳汁から抗体を単離することからなる
抗体の調製方法が開示されている。しかしながら、この
特許には、ヘリコバクター・ピロリが抗体応答を引き起
こし得ること、および本発明の特定の治療剤は示唆も開
示もされていない。英国特許第１，５７３，９９５号明
細書には、大腸菌に対する特異性を示す免疫グロブリン
の調製および単離方法が開示されている。しかしなが
ら、この特許は、大腸菌以外の微生物の有用性について
は示唆していない。同様に、下記文献には同様の方法が
開示されている：（１）ヒルパート（Ｈ．Ｈｉｌｐｅｒ
ｔ）ら、プロシーディングス・オブ・ザ・サーティーン
ス・シンポジウム・スイーディッシュ・ニュートリーシ
ョナル・ファウンデイション（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆｔｈｅ１３ｔｈＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｗｅ
ｄｉｓｈＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｌＦｏｕｎｄａｔｉ
ｏｎ）；およびミーテンス（Ｃ．Ｍｉｅｔｅｎｓ）ら、
ＥｕｒｏｐｅａｎＪ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１３
２、２３９〜２５２（１９７９）。

【０００５】エビナ(Ebina)および同僚は、ヒトロータ
ウイルスによるウシの免疫および該ウイルスに対する免
疫グロブリンのウシ乳汁からの単離を開示している。こ
の免疫グロブリンは、経口で子供に投与すると下痢の発
生頻度を減少させることがわかった[エビナら、The Lan
cet(10/29/1983)、１０２９〜１０３０、(１９８３)；
およびエビナら、Med.Microbiol.Immunol.,１７４、１
７７〜１８５、(１９８５)参照]。しかしながら、これ
ら文献は、ヘリコバクター・ピロリに対する免疫グロブ
リンがヘリコバクター・ピロリにより誘発された胃炎の
管理に有用であることを示唆も開示もしていない。

【０００６】米国特許第４，０５１，２３５号明細書に
は、ワクチン接種したウシの乳汁を凝固させ、抗乳血清
（ホエー）を回収し、硫酸アンモニウムで免疫グロブリ
ンを選択的に沈殿させ、水に対して透析し、濾過し、乾
燥することによりワクチン接種したウシの乳汁から免疫
グロブリンを単離する方法が開示されている。血清保護
（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）試験によれば、米国
特許第４，０５１，２３５号に開示のタンパク質濃縮物
は、吸収なく、また消化管の作用を有意に損なうことな
く、局所的な受動免疫を付与することにより、ある種の
腸内病原性細菌および／またはウイルスに対する全身受
動保護を付与することが示された。しかしながら、この
特許は、そのような抗体がヘリコバクター・ピロリによ
り誘発された胃炎の進行を緩和するように働くことにつ
いては示唆も開示もしていない。

【０００７】ヘリコバクター・ピロリ自体に関しては多
くの刊行物が存在する。ヘリコバクター・ピロリは、直
径が約０.８５μｍで平均長が２.９μｍである。この微
生物は、滑らかな被覆、および鞘で覆われ末端が球根状
の４〜６個の極性鞭毛を有している。この微生物は、新
鮮な培地中では細長く曲がったグラム陰性桿菌として認
められる。ヘリコバクター・ピロリは、鞭毛に軸糸が存
在しないことにより他の胃内細菌およびスピロヘータか
ら容易に識別可能である。さらに、ヘリコバクター・ピ
ロリの最適増殖条件は普通ではないため、他の腸内病原
菌から分離するのに役立つ。たとえば、ヘリコバクター
・ピロリは増殖を維持するのに微空気(microaerophili
c)ガス環境(すなわち、低酸素含量)を必要とする。ヘリ
コバクター・ピロリは、広範囲の局所ｐＨ条件に耐性で
あるように思われ、また酸性条件に対しては比較的耐性
である。この耐性は、一部は該微生物の外部タンパク質
構造によるものと思われる。すなわち、該外部タンパク
質構造が大量のウレアーゼを含有している結果、胃液中
に天然に存在する尿素を開裂し、そのため該微生物のす
ぐ周囲にアンモニアの緩衝層を形成するためと思われ
る。

【０００８】すべての哺乳動物の口および下部消化管に
は多数の螺旋菌が生息するが、ヘリコバクター・ピロリ
を他の菌から区別するものは、該菌が胃および十二指腸
の内腔粘膜表面に殆ど限定されて局在し、しかも一般に
胃小窩の深部に存在するという観察である。ヘリコバク
ター・ピロリの撲滅および治療を困難にしているのは、
上記異常な増殖条件と胃腸管内での生息部位との組み合
わせである。ヘリコバクター・ピロリによる胃炎の治療
に適した理想的な抗菌剤は、局所活性を示さなければな
らず、低ｐＨ値で安定でなければならず、胃粘膜に容易
に浸透できなければならない。これら抗菌剤の望ましい
特性は容易に達成することができず、それゆえ抗菌剤を
用いたヘリコバクター・ピロリの満足のいく治療は未だ
行われていない。ヘリコバクター・ピロリにより引き起
こされる胃炎の管理に有効な薬剤の開発は、長年の念願
を達成するものである。

【０００９】胃腸学の分野では、胃炎および消化性潰瘍
疾患の進行の主要な原因はヘリコバクター・ピロリであ
るという同意が浮上しつつある。詳しくは、下記文献が
本発明の背景を理解するのに有用である：カンピロバク
ター・ピロリ(Campylobactorpylori)、ティトガット(G.
N.Tytgat)編、Adis Press Intntl.(１９８９)。一般
に、この文献は、ヘリコバクター・ピロリが胃炎および
消化性潰瘍疾患の進行に果す役割を開示している。これ
ら条件でヘリコバクター・ピロリが病因であることを支
持する重要な証拠は、抗生物質および／またはビスマス
化合物の使用により胃からヘリコバクター・ピロリを除
去すると胃疾患が緩解するという観察に基づいている。

【００１０】現在のところ、慢性活性胃炎および消化性
潰瘍疾患の治療に用いられる主要な治療法は、ヒスタミ
ンＨ２−レセプターアンタゴニスト、ビスマス化合物、
および抗生物質などである。しかしながら、現在用いら
れているすべての治療法モダリティは治療後の再発割合
が許容できないほどに高いため、臨床的に適当でないこ
とが一般に受け入れられている。加えて、これら治療法
の幾つかは有意の副作用を伴う。たとえば、ヘリコバク
ター・ピロリ感染の有効な抗生物質治療には長期間(４
〜６週間)にわたる治療が必要であり、その結果、下痢
や消化器系の不快感が認められる。ビスマス化合物もま
た多くの望ましくない副作用を示すことが知られてい
る。

【００１１】現在では、好ましい治療法は、酸およびペ
プシンの分泌を抑制するＨ２−アンタゴニストの使用に
よって占められている。しかしながら、治療後の再発割
合は極めて高い。不確定の維持治療を行うことなく症候
の軽減および潰瘍の治癒を行うことが治療の主要な目的
であるので、ヘリコバクター・ピロリに対する抗菌作用
を有する粘膜「保護剤」が望ましいことがますます明らか
になりつつある。それゆえ、医療社会では医薬および／
または栄養製剤に容易に利用することのできる保護剤を
必要としている。本発明は、ヘリコバクター・ピロリで
免疫した乳汁分泌哺乳動物から得た免疫グロブリンを腸
内摂取することによりそのような保護を得ることができ
るという発見によりそのような必要を満たすものであ
る。

【００１２】従来の技術は、上記本発明の発見を示唆、
開示または想起することができなかった。本発明の発見
は、その一部が胃粘膜のヘリコバクター・ピロリ感染の
治療に抗体(免疫グロブリン)を使用することおよび該抗
体自体に関する。ヘリコバクター・ピロリで免疫したウ
シから得た乳汁分泌由来の抗体は、他の免疫グロブリン
製造法に比べて多くの利点をもたらすであろう。そのよ
うな利点としては、他の分離法に基づく抗体および製品
製造物に比べて多量、容易かつ高再生産性で免疫グロブ
リンを単離できること、製品の製造が容易であること、
および費用が有意に節約できることなどが挙げられる。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明の態様の一つは、
ヘリコバクター・ピロリに対して高度の免疫学的特異活
性を有する乳汁ベースの製品の製造方法に関する。本発
明の他の態様は、本明細書に開示した方法に従って製造
した特定の免疫グロブリン自体に関する。本発明のさら
に別の態様は、吸飲する個体にヘリコバクター・ピロリ
に対する保護を与える免疫学的成分を有する乳汁を産生
させるために哺乳動物を処置する方法に関する。本発明
のさらに他の態様は、これら特定の抗体(免疫グロブリ
ン)をヘリコバクター・ピロリにより引き起こされた胃
炎の治療に使用することに関する。

【００１４】本発明は、細菌ヘリコバクター・ピロリに
対する特異的活性を示す非変性免疫グロブリン、さらに
詳しくは、哺乳動物の乳汁分泌物から単離されヘリコバ
クター・ピロリに対する特異的活性を示す免疫グロブリ
ンを含有する組成物に関する。本発明はさらに、ヘリコ
バクター・ピロリに対する特異性を示す非変性免疫グロ
ブリンを含有することを特徴とする、ヘリコバクター・
ピロリにより引き起こされた胃炎の治療剤に関する。本
発明の治療剤は、単独または薬理学的および／または栄
養学的に許容し得る担体と組み合わせて用いることがで
き、粉末または液体の形状であってよい。

【００１５】本発明はさらに、ヘリコバクター・ピロリ
に対する特異性を示す免疫グロブリンの製造方法であっ
て、(１)乳汁分泌するまたは妊娠した哺乳動物をアジュ
バント中に乳化したヘリコバクター・ピロリの細胞懸濁
液で免疫し、(２)該哺乳動物から初乳または乳汁を得、
ついで(３)該分泌物から免疫グロブリンを単離すること
を特徴とする方法に関する。一般に本発明の組成物は、
ヘリコバクター・ピロリで免疫した哺乳動物の乳汁分泌
物から免疫グロブリンを単離して調製したものであり、
該免疫グロブリンはヘリコバクター・ピロリに対して特
異的な抗菌作用を示す。

【００１６】ヘリコバクター・ピロリ感染の治療方法
は、有効量のヘリコバクター・ピロリ特異的免疫グロブ
リン(ヘリコバクター・ピロリで免疫した哺乳動物の乳
汁分泌物から得たもの)をそのような治療を要する患者
に経口摂取することからなる。この免疫グロブリンは単
独または脂肪、油およびタンパク質などの他の物質と併
用して摂取してよい。最も広い態様において、本発明は
ヘリコバクター・ピロリに対する抗菌作用を示す新規組
成物に関する。

【００１７】本発明の新規組成物は、ヘリコバクター・
ピロリで免疫した哺乳動物の乳汁分泌物から単離した免
疫グロブリンからなり、単独で、または脂質、タンパク
質または油などの他の天然または合成の可食製品と併用
して利用することができる。該組成物は、容易に単独か
または他の可食製品と併用して用い、胃疾患の治療に有
用な混合物とすることができる。

【００１８】以下、本発明をさらに詳しく説明する。本
発明の有用性は、本発明の特定の抗体(免疫グロブリン)
をヘリコバクター・ピロリに感染した無菌のコブタに摂
取させることにより示される。本発明の特定抗体(免疫
グロブリン)を含有する栄養組成物を摂取させると、ア
ガープレート培地再単離および組織学的方法の両方によ
って示されるように、ヘリコバクター・ピロリによって
引き起こされた病理状態の減少または除去並びに種々の
胃上皮部位におけるヘリコバクター・ピロリ細菌のコロ
ニー形成レベルの減少が得られる。

【００１９】ヘリコバクター・ピロリに特異的な抗体は
ウシで産生させ(詳細は下記)、下記標準免疫化学法によ
り特徴付ける。本発明の抗体の他の特徴付けは、たとえ
ば、免疫蛍光法などの一般的な免疫化学法により検出さ
れるように、ヘリコバクター・ピロリ凝集能、ヘリコバ
クター・ピロリ細菌の存在下での補体結合能、細菌増殖
抑制能、およびヘリコバクター・ピロリ抗原に対する特
異的結合能などを評価することにより行うことができ
る。

【００２０】免疫化学的な特徴付けの後、これらヘリコ
バクター・ピロリ特異的抗体を下記給餌計画に従ってヘ
リコバクター・ピロリのみを感染させた無菌のコブタに
与えた。ヘリコバクター・ピロリ特異的抗体を与えた
後、血液試料を取り出し、被験動物を屠殺した後に処理
プロトコールの微生物学的および組織病理学的評価を行
った。これらの研究の結果を、ヘリコバクター・ピロリ
特異的抗体を含有しない栄養調合乳であるシミラック(S
imilac)^R[アボット・ラボラトリーズの子会社のロス・
ラボラトリーズ(Ross Laboratories)、オハイオ州コロ
ンバス、の乳幼児栄養製品]をベースにした非免疫乳汁
を与えたヘリコバクター・ピロリのみを感染させた無菌
コブタ同腹子と比較した。

【００２１】これら実験の結果、本発明者らは、ヘリコ
バクター・ピロリに特異的な抗体を含有する免疫グロブ
リン製剤を腸内摂取させると胃の種々領域に含まれるヘ
リコバクター・ピロリの生菌レベルが減少し、そのため
ヘリコバクター・ピロリにより引き起こされた胃炎の実
際的な治療法が得られることを見いだした。ヘリコバク
ター・ピロリ特異的抗体は単独か(すなわち、液体、錠
剤またはカプセルの形態にて)または種々の脂質、タン
パク質または油などの他の薬理学的に許容し得る担体と
併用して用いることができる(これら担体から栄養上お
よび／または薬理学上の利点が得られるかもしれな
い)。

【００２２】

【実施例】つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。下記実施例は、ヘリコバクター・ピロリに特異的な
抗体の製造および使用並びに該使用の生理学的結果に関
する。さらに詳しく説明すると、実施例１および２は、
ヘリコバクター・ピロリ細菌で免疫した妊娠ウシから単
離した免疫グロブリンの製造および特徴付けに関する。
表１は、ヘリコバクター・ピロリで免疫したウシから単
離した初乳ホエイ製品の免疫学的特徴付けを非免疫(す
なわち、コントロール)ウシからのものと比較して示
す。このデータは、ヘリコバクター・ピロリで免疫した
ウシから得られたホエイ中に含まれるヘリコバクター・
ピロリ特異的抗体(免疫グロブリン)レベルの濃度は、非
免疫ウシからのものに比べて１００倍以上増加している
ことを示している。実施例３は、免疫ウシと非免疫ウシ
から単離しヘリコバクター・ピロリに対して特異的な活
性を示す特定免疫グロブリンの生物物理学的および生物
学的特徴付けに関する。表２および表３に生物学的デー
タおよび生物物理学的データをそれぞれまとめて示す。

【００２３】実施例４、５および６は、前以てヘリコバ
クター・ピロリで免疫した無菌ブタの食餌に上記免疫物
質を調合および使用すること、従って、ヘリコバクター
・ピロリにより引き起こされた胃炎の治療における該物
質の有用性に関する。表４のデータは、実施例５に記載
のようにして経口摂取によりヘリコバクター・ピロリに
暴露させた被験動物がヘリコバクター・ピロリに対する
全身性の(血清に含まれる)抗体を産生させ、それゆえヘ
リコバクター・ピロリ感染を達成する手段としてのヘリ
コバクター・ピロリ経口処理の有効性を確認できたこと
を明らかに示している。

【００２４】実施例７は、上記免疫物質を食餌として与
えることがヘリコバクター・ピロリ細菌の生菌レベルに
及ぼす影響の評価に関するものであり、ヘリコバクター
・ピロリ生菌は、ヘリコバクター・ピロリを前以て感染
させたコブタの種々の胃上皮部位からその後に回収する
ことができる。表５および６は、これら結果をまとめて
示す。このデータは、免疫調製物を与えた被験動物では
非免疫栄養物のみを与えた被験動物に比べて、調べたす
べての胃部位からのヘリコバクター・ピロリ生菌の回収
が顕著に減少したことを示している。これらの結果は、
ヘリコバクター・ピロリによって引き起こされた胃炎の
治療にヘリコバクター・ピロリ特異的抗体(免疫グロブ
リン)を使用することの有効性を明らかに示している。

【００２５】実施例１妊娠中に全ホルマリン殺菌したヘリコバクター・ピロ
リ細菌(ＡＴＣＣ株２６６９５)で免疫したウシの初乳か
ら、ヘリコバクター・ピロリ特異的抗体を含有するホエ
イを調製した。フロイントの不完全アジュバント中に乳
化した該細菌を５×１０⁹コロニー形成単位(ＣＦＵ)／
ｍｌの濃度で用いた。各接種には、この物質１２ｍｌを
用いた。各ウシに対して下記免疫計画を用いた。まず、
ウシの乳の出を止める（drying off）１４日前(Ｄ−１
４)に皮下接種した。ついで、ウシの乳の出を止める７
日後(Ｄ＋７)に乳房内にブースター投与し、Ｄ＋３０に
皮下に２回目のブースター投与を行った。これと同じお
よび同様の免疫計画は従来技術によって教示されてお
り、上記計画はここで使用する方法を完全に記載しては
いるけれども、この記載はヘリコバクター・ピロリに対
する抗体(免疫グロブリン)を産生させることのできる免
疫法を限定することを意図するものではない。というの
は、当業者であれば他の免疫法からもまた同様の結果が
得られることを容易に認識し理解することができるであ
ろうからである。

【００２６】上記で免疫したウシのコウシが生まれた
ら、初乳を回収し、レンネットホエイを調製し、このホ
エイを使用するときまで−２０℃で凍結貯蔵した。ホエ
イを得るための単離法は、米国特許第４,０５１,２３５
号に大略が記載されている。基本的な工程は下記の通り
である。

【００２７】ウシ初乳の回収および凍結。その後、初乳
から脂肪を除く。このことは、凍結した初乳を解凍し、
上部の液体部分を除くことにより部分的には行うことが
できる。ついで、残りの物質を完全に解凍し、遠心分離
により残留脂肪を可能な限り除く。得られた脱脂初乳１
Ｌ当たり１.５ｍｇの塩化カルシウムを加え、同初乳１
Ｌ当たり１.５ｇの市販のレンニンを加えることによ
り、該脱脂初乳を沈殿させる。ついで、この混合物を２
０℃で充分に撹拌する。その後、この溶液を２〜５時間
放置すると溶液中のカゼインが沈殿する。ついで、沈殿
したカゼインを遠心分離により除く。得られた溶液を以
下、「ウシ初乳ホエイ」(ＢＣＷ)と呼ぶ。ついで、この溶
液を濾過により清澄化し、ついで下記方法によりタンパ
ク質および免疫グロブリン濃度を測定する。

【００２８】実施例２(抗体被験試料の特徴付け) 上記ウシ初乳ホエイ(ＢＣＷ)試料を、全タンパク質、免
疫グロブリンアイソタイプのタイプ特徴付け、ＩｇＧ１
含量、および抗ヘリコバクター・ピロリ特異的抗体につ
いて分析した。これらアッセイに用いた方法は当該技術
分野で用いられる標準法であり、それぞれ、染料結合法
(バイオラド)、放射免疫拡散法(ＩＮＣバイオケミカル
ズ)、および酵素結合抗体イムノアッセイ法(ＥＬＩＳ
Ａ)であった。

【００２９】ＥＬＩＳＡプレートをヘリコバクター・ピ
ロリ細胞溶解液(３.２μｇ／ｍｌ)でコーティングし
た。使用した検出抗体は、ウシＩｇＧ１タイプ抗体に対
する免疫特異性を有するモノクローナル抗体にアルカリ
ホスファターゼを結合させたものであった。このアッセ
イの指示試薬基質はｐ−ニトロフェニルホスフェートで
あった。発色の程度をダイナテックＥＬＩＳＡプレート
リーダーで可視波長４９０ｎｍにて測定し、標準統計法
に従ってデータを分析した。これら研究の結果を表１に
まとめて示す。これらデータは、非免疫ウシから得られ
た初乳ホエイに比べてヘリコバクター・ピロリに経口暴
露したウシから得られた初乳ホエイでは、免疫グロブリ
ン(ＩｇＧ１)濃度が１００倍以上増加したことを明らか
に示している。

【００３０】

【表１】 (注)ａ：ヘリコバクター・ピロリで免疫したウシおよび
ヘリコバクター・ピロリで免疫しなかったウシ(コント
ロール)から得られた初乳ホエイ。ｂ：非希釈初乳ホエイでの非調節(nonadjusted)ＥＬＩ
ＳＡ力価(免疫＝７７,０００およびコントロール＝８６
０)。このアッセイでは、ヘリコバクター・ピロリに特
異的な抗体を検出する。

【００３１】実施例３(抗ヘリコバクター・ピロリ抗体
の特徴付け) ヘリコバクター・ピロリ特異的抗体は、多くの方法で特
徴付けることができる。本研究の目的のためには、免疫
グロブリンの生物学的活性は凝集アッセイにより決定し
(表２)、生物物理学的な特徴付けはＢＣＷ中に含まれる
主要な免疫グロブリンアイソタイプの物理特性を考慮し
て得ることができる(表３)。

【００３２】細菌凝集試験は、特定細菌に対する血清中
の特定抗体の存在および相対濃度を決定するのに用いら
れる古典的方法である(たとえば、腸チフスのためのウ
ィダール試験など)。凝集には、細菌の外表面抗原上の
特定部位に特異的抗体が結合した結果、細菌が大きな塊
に集合することが含まれる。それゆえ、適当な細菌懸濁
液と該細菌で前以て免疫した動物から得た免疫グロブリ
ン調製物とを混合すると、細菌のクランピング(凝集)を
容易に観察することができる。所定の抗体調製物の強度
(力価)を評価するには、該抗体を希釈し(たとえば、２
倍系列希釈)、凝集作用を示す最後の希釈を決定すれば
よい。細菌凝集を視覚化するには、Ｕ字型プラスチック
マイクロタイタープレートの底に沈降した細菌のパター
ンを調べればよい。非凝集細菌は沈降して密なボタン(t
ight button)を形成するが、凝集細菌はボタンの形成が
妨げられ、プラスチックウエルの底に拡散パターンとし
て沈降する。

【００３３】マイクロタイタープレート中に被験抗体の
希釈液を調製し、ついで適当に希釈した細菌(ホルマリ
ン固定ヘリコバクター・ピロリまたは大腸菌)を加え
た。ついで、凝集の終点の読み取りを容易にするため、
メチレンブルーを含有する緩衝液を加えた。４℃で１８
時間インキュベートした後、プレートを調べた。その
後、凝集の程度を決定し、上記で定義したように凝集を
示す抗体の最低系列希釈として結果を表した。この研究
の結果を表２に示す。これらデータは、ヘリコバクター
・ピロリに対して産生されＢＣＷ中に含まれる抗体がヘ
リコバクター・ピロリと高力価(すなわち、希釈)で特異
的に反応するが、他のウイルスおよび細菌抗原とは有意
には反応しないことを明らかに示している。同様に、非
免疫ウシまたは関係のない細菌またはウイルス抗原で免
疫したウシからの同様の免疫グロブリン調製物は、ヘリ
コバクター・ピロリとは有意に反応しない。

【００３４】

【表２】

【００３５】(注)ａ：Ｈ.ピロリおよび大腸菌を８×１
０⁹細胞／ｍｌに調節し、マイクロタイタープレート中
の２倍抗体希釈液に加えた。凝集細菌の視覚化を促進す
るため、メチレンブルー(０.０１％)を細菌希釈液(０.
０１Ｍリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７.０)に加えた。ｂ：ヒトロータウイルス(ＨＲＶ) 初乳中に認められる主要な抗体クラスは、ＩｇＧ１アイ
ソタイプサブクラスの免疫グロブリンタイプＧ(ＩｇＧ)
である。これら抗体は、下記表３に記載する物理特性を
有する。

【００３６】

【表３】表３(初乳中に含まれる抗体の生物物理学的特徴付け) 主要な免疫グロブリンクラス：ＩｇＧ１分子量：１６０,０００ダルトン沈降係数(Ｓ₂₀,_w)：６.７ｓ吸光係数(Ｅ１％₂₈₀)：１２.２等電点：５.５〜６.８炭水化物含量：３％

【００３７】実施例４(食餌物質の調製) 上記アッセイに従って、ＢＣＷ試料を市販のシミラック
^R乳幼児用調合乳(ロス・ラボラトリーズ)に添加して１
７ｍｇＩｇＧ１／ｍｌの標準濃度とした。混合後、試
料を加熱処理し、抗生物質混合物を加えて生菌細菌のい
ない生成物を得た。このことは、無菌コブタモデルの必
要条件である。抗生物質の個々の濃度は、ヘリコバクタ
ー・ピロリの増殖に対してだけは抑制しないように選択
した。他のすべての細菌の増殖は抑制された。コントロ
ールの食餌は、上記と同じタイプかつ量の抗生物質混合
物を含有するシミラック^Rであった。

【００３８】実施例５(実験動物) 無菌動物を確立するための標準法に従い、一腹の１３匹
のコブタを無菌的に出産させ、無菌インキュベーター中
に保持した。これら一腹の動物群のうち、１１匹を無作
為に２つの実験群に分けた：群Ｉ：コントロールのシミラック^R栄養物のみを与えた
５匹のコブタ；および群ＩＩ：ヘリコバクター・ピロリ抗体を含有するシミラ
ック^Rを与えた６匹のコブタこれら両実験群とも、シメチジンで前処理した後、３日
齢のときに２×１０⁹ＣＦＵ／ｍｌのヘリコバクター・
ピロリで経口感染させた。

【００３９】ヘリコバクター・ピロリ感染の試験は、表
４に示すように、ＥＬＩＳＡアッセイにより各コブタの
血清試料中のヘリコバクター・ピロリ特異的ブタ抗体を
検出することにより確立した。この表のデータは、感染
前の血清に比べて両群の動物が、３種の免疫グロブリン
アイソタイプのすべてについて各血清中に明らかに有意
なレベルの抗体を産生させたことを示している。

【００４０】

【表４】

【００４１】実施例６(給餌計画) ヘリコバクター・ピロリ感染から１０日後、シミラック
^R単独(群Ｉ)かまたはヘリコバクター・ピロリ特異的抗
体を含有するシミラック^R(群ＩＩ)のいずれかを１７ｍ
ｇＩｇＧ１／ｍｌの濃度にてコブタに与えた。これら
動物に、それぞれ３０ｍｌの食餌物質を１日に３回与え
た。食餌後、抗体を含有しない乳汁代替食餌(１５０ｍ
ｌ)を各動物に与えた。この給餌プロトコールを２０日
間続けた。

【００４２】実施例７(プロトコール後の評価) ３３日齢のときに血液試料を各動物から採取し、動物を
安楽死させ、検死を行った。これら血液試料を血清に処
理し、ブタ抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の存在につい
て分析した。検死のときに胃上皮試料(１〜２ｃｍ²)を
５つの異なる解剖部位から採り、ついで細菌のコロニー
形成および感染の組織学的証拠について評価した。胃の
噴門部、底部、幽門部、洞部、および憩室部から生検を
採取した。

【００４３】生検試料を選択抗生物質混合物を含有する
選択アガープレート上に置き、すじを付けた。接種した
プレートを５％Ｏ₂、１０％ＣＯ₂および８０％Ｎ₂から
なる減酸素雰囲気のガスジャー中、３７℃にてインキュ
ベートした。この気体混合物は、ヘリコバクター・ピロ
リの増殖を選択的に容易にするものである。５〜８日後
に細菌の増殖についてプレートを調べた。推定ヘリコバ
クター・ピロリコロニーを新たな培地上で継代培養し
た。細菌増殖並びに生検に付随する粘液物質の両方にグ
ラム染色を行った。細菌の同定は、標準酵素(カタラー
ゼ、オキシダーゼ、ウレアーゼ)アッセイおよび抗生物
質感度(ナリジクス酸およびセファロシン)アッセイによ
り確認した。これらアッセイで得られたプロフィールに
より、調べた細菌の種類の正確な同定が可能となった。
この方法は、当該技術分野における標準法である。これ
ら研究の結果を表５および６にまとめて示す。

【００４４】調べた種々のコブタ胃部位からの生菌細菌
を再単離して行ったデータを表５に示す。免疫調製物を
与えたコブタと免疫なしの栄養物のみを与えたコブタと
を比較して示した。非免疫栄養物を与えたコブタでは、
アッセイした５つの胃上皮生検部位の８４％においてヘ
リコバクター・ピロリに典型的な小さな細菌コロニーが
認められた。これに対して、抗ヘリコバクター・ピロリ
特異的抗体を含有する栄養物を与えたコブタでは、生検
の３７％しかコロニーが観察されなかった。コントロー
ルのコブタ(すなわち、非免疫調製物を与えた被験動物)
からは生菌ヘリコバクター・ピロリ細菌が１００％単離
されたが、免疫調製物を与えたコブタからは生菌ヘリコ
バクター・ピロリは５０％しか単離されなかった。この
細菌がヘリコバクター・ピロリであるとの同定は、生化
学的アッセイを用いて確認した。片側スチューデント
「ｔ」検定またはノンパラメトリックランキング法(ウイ
ルコクソン検定)を用い、９５％の信頼レベルで差異は
有意である。

【００４５】

【表５】

【００４６】(注)ａ：ヘリコバクター・ピロリで攻撃
(１０日前に)した各コブタに、シミラック中に希釈した
ヘリコバクター・ピロリ免疫初乳(１.５ｇＩｇＧ１／
９０ｍｌ／日、３回の給餌にて)(免疫群)かまたはシミ
ラック単独(非免疫群)を２０日間与えた。ｂ：Ｉ＝希釈免疫初乳を与えたコブタ；ＮＩ＝非免疫調
製物(シミラックＲＴＦ)を与えたコブタｃ：選択アガープレートからのコロニー増殖に基づく。
ヘリコバクター・ピロリの確認は適当な生化学試験(ウ
レアーゼ、カタラーゼ、オキシダーゼおよびナリジクス
酸およびセファロシンに対する感受性)により行った。ｄ：統計的評価(２試料、片側ｔ検定)。免疫付与群は非
免疫付与群に比べて有意に低かった(ｐ＝０.０２９
８)。

【００４７】上記に加えて、インキュベーションの５日
後に組織生検とともに単離した粘液物質にグラム染色を
行った(ヘリコバクター・ピロリはグラム陰性細菌であ
る)。特に、グラム陰性細菌に関して陽性の生検試料の
数を決定した。この情報は表６にまとめて示してある。
これらのデータから、表５に含まれる情報が、非免疫栄
養物を与えたコブタで認められるグラム陰性細菌の発生
頻度が７８％であるのに対して、抗ヘリコバクター・ピ
ロリ特異的抗体を含有する栄養物を与えたコブタで認め
られる同菌の発生頻度は３５％であることを示してい
る。この差異は９０％の信頼レベルにて有意である。

【００４８】

【表６】

【００４９】(注)ａ：Ｉ＝希釈免疫初乳を与えたコブ
タ；ＮＩ＝非免疫調製物(シミラックＲＴＦ)を与えたコ
ブタｂ：選択アガープレートからのコロニー増殖に基づく。
ヘリコバクター・ピロリの確認は適当な生化学試験(ウ
レアーゼ、カタラーゼ、オキシダーゼおよびナリジクス
酸およびセファロシンに対する感受性)により行った。ｃ：典型的なヘリコバクター・ピロリのミクロコロニー
を有するプレートおよび同コロニーを有しないプレート
からの接種物のグラム染色(ＧＮＲ＝グラム陰性桿菌)。

【００５０】上記で検討したデータの解釈における最重
要点は、すべての被験動物がヘリコバクター・ピロリ細
菌で確かに感染されていたという決定にある。このこと
の証拠は、表４に含まれるデータ、すなわち、ヘリコバ
クター・ピロリによる感染後にすべてのコブタがヘリコ
バクター・ピロリに対する抗体を産生し(すなわち、血
清変換)、ヘリコバクター・ピロリに特異的な活性を示
す抗体(免疫グロブリン)を血清中に含有していたことに
より示される。このことは、実験の終了時にコブタ血清
のＥＬＩＳＡ分析を行うことにより決定した。表４に含
まれるデータは、すべての被験動物が有意量の抗ヘリコ
バクター・ピロリ特異的抗体を産生させたこと、それゆ
えヘリコバクター・ピロリにより感染されていたに違い
ないことを明らかに示している。

【００５１】工業的応用可能性：ヒトの胃腸管中にヘリ
コバクター・ピロリが存在すると胃炎が引き起こされる
と考えられる。従来の治療法は重大な副作用を有し、し
ばしば疾患の再発を防ぐことができなかった。医療社会
では該疾患に対する治療または防御策が長い間求められ
てきたが、本発明はその必要性を満たすものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ジョゼフ・ポール・シャラーアメリカ合衆国43232オハイオ州コロンブス、ノース・ビクスビー・ロード1547 番 (56)参考文献特開昭54−113425（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ，Ｖｏｌ. 162，Ｎｏ．１（1990．Ｊｕｌｙ．18) ｐ．156−162 Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．58，Ｎｏ．６（1990．Ｊｕｎｅ) ｐ．1763−1768 Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．57，Ｎｏ．３（1989）ｐ．827−832 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．27，Ｎｏ．２（1989) ｐ．327−330 Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．, Ｖｏｌ．133（1987）ｐ．163−170 Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ，Ｖｏｌ. 156，Ｎｏ．１（1987）ｐ．158−166 Ｌａｎｃｅｔ．Ｏｃｔｏｂｅｒ 29, Ｖｏｌ．，Ｎｏ．（1983）ｐ．1029− 1030 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 39/40 C07K 16/12 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトの胃内に存在する細菌ヘリコバクタ
ー・ピロリに特異的に結合する非変性免疫グロブリンお
よび薬理学的および／または栄養学的に許容し得る担体
を含有する、ヘリコバクター・ピロリに伴う胃炎の治療
剤。
【請求項２】粉末または液体の形態である請求項１に
記載の治療剤。
【請求項３】免疫グロブリンが哺乳動物の乳分泌物か
ら単離したものである請求項１に記載の治療剤。