JP2979722B2 - 生理活性ポリペプチド、その製造法および抗菌剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規生理活性ポリペプ
チド、その製造法およびその用途としての抗菌剤に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】昆虫などの無脊椎動物では、ワクチンな
どの接種などによって体液中に抗菌活性物質が誘導出現
することが知られている（ヨーロピアン・ジャーナル・
オブ・バイオケミストリー第１０６巻、第７ページ（１
９８０年））。これらの物質の性状、抗菌作用のメカニ
ズムなどについては、まだ十分に明らかにされていな
い。

【０００３】また、近年高等哺乳動物でも精液中（ネー
チャー第２４９巻、第７２５ページ（１９７９年））
や、血清中（バイオケミストリー第２０巻、第５９７３
ページ（１９８１年））に、抗菌力が強く幅広い抗菌ス
ペクトルを持つ蛋白の存在が明らかとなり、一般に動物
または昆虫の体液中の抗菌性蛋白が重要視されている。

【０００４】本発明者らは、センチニクバエ（Sarcopha
ga peregrina) の幼虫の体表に傷害を与えることによっ
て、その体液中に大腸菌や枯草菌に対して強い抗菌活性
を有するポリペプチドが出現することを明らかにしてい
る（特開昭５９−１３７３０号公報、特開昭６１−１２
２２９９号公報）。さらに、センチニクバエ胚由来の培
養細胞の培養上清中にも抗菌活性を有するポリペプチド
（抗菌ポリペプチド）が存在することを見出し、それを
精製しその理化学的性質および構造を明らかにした（特
開昭６３−１８５９９７号公報）。

【０００５】上記センチニクバエ由来の抗菌ポリペプチ
ドは、他の昆虫において認められると同様に、センチニ
クバエの幼虫の体表障害時に特異的に誘導されることか
ら、細菌感染を防ぐための一種の生体防御物質であると
考えられる。さらに、複数の抗菌活性を有する蛋白質が
見出されることから、これらの蛋白が相互に関係しあっ
てセンチニクバエの生体防御機構を構成しているものと
考えられる。

【０００６】これらセンチニクバエ由来の抗菌ポリペプ
チドは、広い抗菌スペクトルを持つと同時にその抗菌活
性が強く、また蛋白質であることから可食性の抗菌剤と
して期待されている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかし、好ましくない
病原体およびその他の微生物に対して高い効果を持つ新
規な抗菌剤が常に望まれており、センチニクバエ由来の
抗菌ポリペプチドにおいてもさらに新規な抗菌性ポリペ
プチドの発見およびその生産方法の開発が望まれてい
た。

【０００８】本発明は、センチニクバエ由来の新規な抗
菌ポリペプチドと、その生産方法およびその利用方法を
提供する。

【０００９】

【課題を解決するための手段および作用】すなわち本発
明は、下記のアミノ酸配列式で示される生理活性ポリペ
プチドであり、また、センチニクバエの胚由来の培養細
胞の培養上清から下記のアミノ酸配列式で示されるポリ
ペプチドを取得することを特徴とする生理活性ポリペプ
チドの製造法であり、さらに、下記のアミノ酸配列式で
示される生理活性ポリペプチドを主成分とする抗菌剤で
ある。

【００１０】Ｈ₂ Ｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ
−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｙ
ｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ
−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−ＣＯＯ
Ｈ。

【００１１】本発明で提供されるポリペプチドは、セン
チニクバエ胚由来細胞の培養上清から得られ、特に、多
くのシステインおよびアルギニン、リジン、ヒスチジン
などの塩基性アミノ酸を多く含む塩基性のポリペプチド
である。つまり、本発明のポリペプチドは、下記のアミ
ノ酸配列式で示される。

【００１２】Ｈ₂ Ｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ
−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｙ
ｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ
−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−ＣＯＯ
Ｈ。

【００１３】また、本発明のポリペプチドの製造方法
は、センチニクバエ胚由来の細胞を培養したのち、その
培養上清から一般の高分子蛋白類の分画と精製において
用いられる方法によって精製、分離することに関するも
のである。例えば、本発明のポリペプチドは、センチニ
クバエ胚由来細胞の培養上清から、イオン交換クロマト
グラフィー、熱処理、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィ
ーなどの通常の方法によって、高い純度を持って得られ
る。また、本物質は蛋白質なので、精製にあたっては、
蛋白あたりの抗菌活性の上昇を指標とすることが有効で
ある。

【００１４】本発明で得られるポリペプチドは、目的に
応じて種々の組成物として抗菌剤として利用することが
できる。すなわち、それ単独でまたは適当な液体、固体
などと組合せた形態で抗菌剤として利用できる。また、
他の薬剤と組合せて用いることもできる。

【００１５】例えば、コンタクトレンズの洗浄液、軟膏
剤、石鹸、シャンプー、医薬、食品、飼料、ペットフー
ド、歯磨ペーストなどの防腐剤および消毒剤として使用
することができる。

【００１６】また、本発明のポリペプチドは、細菌性疾
患に対する治療および予防用の薬剤として用いることが
できる。この場合は、疾患の種類、症状に応じて本発明
の抗菌ポリぺプチドが活性を有する限り任意の投与方法
および投与量が選択可能である。

【００１７】本発明ポリペプチドを抗菌剤の医薬品とし
て用いる場合、本発明のポリペプチドの有効量を含む治
療剤を臨床において投与する場合、経口または非経口経
路により投与される。その剤形は、錠剤、糖衣錠、丸
剤、カプセル剤、散剤、トローチ剤、溶剤、坐剤、注射
剤などを包含し、これらは、医薬上許容される賦形剤(e
xcipient) を配合して製造される。賦形剤としては次の
ようなものを例示することができる。乳糖、ショ糖、ブ
ドウ糖、ソルビトール、マンニトール、ばれいしょでん
ぷん、アミロペクチン、その他各種でんぷん、セルロー
ズ誘導体（例えば、カルボキシメチルセルローズ、ハイ
ドロキシエチルセルローズなど）、ゼラチン、ステアリ
ン酸マグネシウム、ポリビニルアルコール、ステアリン
酸カルシウム、ポリエチレングリコールワックス、アラ
ビアゴム、タルク、二酸化チタン、オリーブ油、ピーナ
ツ油、ゴマ油などの植物油、パラフィン油、中性脂肪基
剤、エタノール、プロピレングリコール、生理食塩水、
滅菌水、グリセリン、着色剤、調味剤、濃厚剤、安定
剤、等張剤、緩衝剤などおよびその他医薬上許容される
賦形剤。

【００１８】本発明の抗菌剤は、本発明のポリペプチド
を０．００１〜８５重量％、好ましくは０．００５〜６
０重量％含有することができる。

【００１９】本発明の治療剤の投与量は、主として症状
により左右されるが、１日成人体重あたり１〜５００m
g、好ましくは１〜５０mgである。

【００２０】また、本発明による抗菌剤は蛋白質である
ことから少なくとも経口で摂取される場合、その毒性は
ほとんどないと考えられる。したがって、本抗菌性ポリ
ペプチドは、人および動物用の薬剤および食品ないし飼
料添加物として利用することにおいて特に有用である。
例えば、ガムなどの食品や歯磨ペースト中に本抗菌性ポ
リペプチドを添加することによって、口腔内の殺菌およ
び虫歯や歯周病の予防や治療に有用である。また、魚類
の養殖において、用いる飼料に本発明のポリペプチドを
添加することによって、養殖魚類を感染から防ぐことが
可能である。

【００２１】つまり、換言すれば、本発明のポリペプチ
ドは、本物質を有効成分とする防腐剤または医薬品製剤
そして食品添加物として利用することができる。

【００２２】

【実施例】以下に、製造例、抗菌作用などについて示
し、本発明をさらに詳細に説明する。

【００２３】実施例１ 製造例 (a) 細胞培養 Mitsuhashiらの培地（塩化ナトリウム７ｇ／ｌ、塩化カ
リウム０．２ｇ／ｌ、塩化カルシウム２水和物０．２ｇ
／ｌ、塩化マグネシウム６水和物０．１ｇ／ｌ、リン酸
２水素ナトリウム２水和物０．２ｇ／ｌ、炭酸水素ナト
リウム０．１２ｇ／ｌ、グルコース４ｇ／ｌ、ラクトア
ルブミンハイドロライゼート６．５ｇ／ｌおよびイース
トレート５ｇ／ｌを含有。ｐＨ６．５）を無菌濾過した
のち、センチニクバエ胚由来細胞（ＮＩＨ ｓａｐｅ−
４細胞）を１×１０⁶ 個／mlとなるように植えた。２５
℃において７日から１０日培養し、細胞数が約２×１０
⁷ 個／mlとなった時点で継代を行い、遠心分離により培
養上清を回収した。

【００２４】(b) 抗菌性ポリペプチドの分離精製 上記(a）項で得られた培養上清９００mlにリン酸バッフ
ァー（ｐＨ６．０）を２，７００ml添加してｐＨおよび
塩濃度を調整した。得られた溶液をＣＭセルロースカラ
ム（３．０×９．０cm）に通液し、上記と同じリン酸バ
ッファーで洗浄した。その後、５２０mMＮａＣｌを含む
同一リン酸バッファーを通液し、溶出液を４mlずつ分取
し、２８０nmにおける吸光度と抗菌活性を測定した。抗
菌活性はジャーナル・オブ・バイオケミストリー第２１
１巻第７２４−７３４ページ（１９８３年）記載の方法
に準じて、スタフィロコッカス アウレウス(Stapnyroc
occus aureus）ＩＦＯ１２７３２を用いて測定した。こ
の結果を図１に示した。

【００２５】抗菌活性の認められた画分を集め、１００
℃で１０分間加熱処理し、生成した沈殿を遠心分離によ
り除去し、得られた上清を限外ろ過により濃縮した。得
られた濃縮液をセファデックスＧ−５０カラム（１．５
×１２０cm）に通液し、さらに１３０mMＮａＣｌを含む
リン酸バッファーで溶出した。溶出液を４mlずつ画分
し、２８０nmにおける吸光度と上記と同じ方法を用いて
抗菌活性を測定した。結果を図２に示した。

【００２６】図２において抗菌活性の認められた画分を
集めて、ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィーを用いて分画
した。この結果を図３に示した。図３において示される
ピークを分取することによって目的とする抗菌ポリペプ
チドＳＰ−５を得た。ＨＰＬＣの条件は以下のとおりで
ある。

【００２７】カラム：シンクロパックＲＰ−Ｐ 溶出液：Ａ液０．０５％トリフルオロ酢酸／水 Ｂ液０．０５％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル グラディエント条件：Ａ液中のＢ液が１５％から４０％
までのリニアグラディエント 流速：２ml／min 。

【００２８】以上の精製操作をまとめると表１のように
なった。

【００２９】

【表１】

【００３０】(c) ＳＰ−５のアミノ酸配列 上記ＨＰＬＣで分取した抗菌性ポリペプチドＳＰ−６を
気相式シーケンサー（アプライドバイオシステムズ社４
７７Ａ型）でエドマン分解を行い、得られたＰＴＨ−ア
ミノ酸をＰＴＨ−アナライザー（アプライドバイオシス
テムズ社１２０Ａ型）で同定分析し、アミノ酸配列を決
定した結果以下のとおりであった。

【００３１】Ｈ₂ Ｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ
−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｙ
ｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ
−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−ＣＯＯ
Ｈ。

【００３２】(d) ＳＰ−５のアミノ酸組成分析 上記ＰＨＬＣで分取した抗菌性ポリペプチドＳＰ−５
を、真空封管中で４％チオグリコール酸を含む６規定塩
酸により、１１０℃、２２時間加水分解した。この加水
分解物中のアミノ酸を日立アミノ酸分析計８３５型によ
り分析した結果、ＳＰ−５のアミノ酸組成のモル比は表
２のとおりであった。

【００３３】

【表２】

【００３４】（ただし、モル比はロイシンの値を６．０
として示した。また、カッコ内の数値は、上記アミノ酸
配列から計算される各アミノ酸残基数を示したものであ
る）。

【００３５】このアミノ酸組成分析結果は、アミノ酸配
列分析で得られた結果と矛盾しなかった。

【００３６】(d) 抗菌活性の測定 ジャーナル・オブ・バイオケミストリー第２１１巻第７
２７−７３４ページ（１９８３年）記載の方法にしたが
い、ＳＰ−５の抗菌活性を測定した結果を表２に示す。

【００３７】

【表３】

【００３８】

【発明の効果】本発明によれば、新規な生理活性ポリペ
プチドを提供できる。本発明の生理活性ポリペプチド
は、抗菌活性を有しており毒性はほとんどない。したが
って、この性質を利用した様々な用途が考えられるが、
特に本物質を有効成分とする抗菌剤あるいは食品添加物
としての用途が期待できる。特に本物質は蛋白質であ
り、しかも熱安定性に優れていることから、加工工程に
おいて熱処理を必要とする食品用の抗菌性食品添加物と
して有望である。

【００３９】また、本発明方法によれば、センチニクバ
エ胚由来の細胞の培養規模を拡大することによって、該
ポリペプチドの商業的大量生産が可能となる。

【００４０】

【配列表】配列の長さ：３４ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配 列：Leu Thr Cys Glu Ile Asp Arg Ser Leu Cy
s Leu Leu His Cys ArgLeu Lys Gly Tyr Leu Arg Ala T
yr Cys Ser Gln Gln Lys Val Cys Arg Cys ValGln

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明による抗菌性ポリペプチドの精製段階
でＣＭセルロースカラムを用いた時の溶出パターンを示
すクロマトグラム。

【図２】 セファデックスＧー５０を用いた時の溶出パ
ターンを示すクロマトグラムである。

【図３】 抗菌ポリペプチドの精製における最終精製段
階であるＨＰＬＣによる溶出パターンを示すクロマトグ
ラムである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/435 C12P 21/00 - 21/02 A23L 3/3526 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記のアミノ酸配列式で示される生理活
   性ポリペプチド。 Ｈ₂ Ｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａ
   ｓｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
   ｕ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ
   −Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−
   Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ａ
   ｒｇ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−ＣＯＯＨ
2. 【請求項２】 センチニクバエ（Sarcophaga peregrin
   a) の胚由来の培養細胞が産生する請求項１記載の生理
   活性ポリペプチド。
3. 【請求項３】 下記のアミノ酸配列式で示される生理活
   性ポリペプチドを主成分とする抗菌剤。 Ｈ₂ Ｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａ
   ｓｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
   ｕ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ
   −Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−
   Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ａ
   ｒｇ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−ＣＯＯＨ
4. 【請求項４】 センチニクバエ（Sarcophaga peregrin
   a) の胚由来の培養細胞の培養上清から、下記のアミノ
   酸配列式で示されるポリペプチドを取得することを特徴
   とする生理活性ポリペプチドの製造法。 Ｈ₂ Ｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａ
   ｓｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
   ｕ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ
   −Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−
   Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ａ
   ｒｇ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−ＣＯＯＨ