JP2989429B2 - Synthetic marker for cytodiagnosis - Google Patents
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、細胞診断用マーカーに
関し、特にフローサイトメトリーでの肝細胞の標識に用
いられる、蛍光物質を固定した糖質を有する合成マーカ
ーに関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a marker for cytodiagnosis, and more particularly to a synthetic marker having a fluorescent substance-immobilized saccharide, which is used for labeling hepatocytes by flow cytometry.
【０００２】[0002]
【従来の技術】細胞生物学、細胞免疫学、癌の細胞診断
などの分野において、取り扱う細胞を、その大きさや形
態、生物学的活性等の性質によって分類し、これらを明
確に識別して目的とする細胞群のみを分取することは非
常に重要である。2. Description of the Related Art In the fields of cell biology, cell immunology, and cytodiagnosis of cancer, cells to be treated are classified according to their size, morphology, biological activity, and other properties. It is very important to sort only a group of cells.
【０００３】近年、そのような分類を行う有力な手段と
して、フローサイトメトリーが知られている。このフロ
ーサイトメトリーでは、蛍光色素で標識した細胞を、１
個ずつ遊離した形で細管を通過させ、その細胞にレーザ
ー光線等をあてることにより発した蛍光の強弱により、
細胞に関する種々の情報を得ることができる。In recent years, flow cytometry has been known as a powerful means for performing such classification. In this flow cytometry, cells labeled with a fluorescent dye
By passing through the tubule in a released form, and irradiating the cells with a laser beam, etc.,
Various information about cells can be obtained.
【０００４】細胞にレーザー光線等を照射した時、照射
光線の軸方向の光である前方散乱光と、軸に直角な方向
に発生した光である側方散乱光の２種の光が検出され
る。この前方散乱光は細胞の大きさを、側方散乱光は細
胞質の状態を反映するものである。また、これらとは別
に、細胞に固定された蛍光色素にレーザー光等があたる
ことによって発生する蛍光も検知され、その蛍光強度は
細胞の生物学的活性を表すものである。When a cell is irradiated with a laser beam or the like, two types of light are detected: forward scattered light which is light in the axial direction of the irradiated light, and side scattered light which is light generated in a direction perpendicular to the axis. . The forward scattered light reflects the size of the cell, and the side scattered light reflects the state of the cytoplasm. In addition, separately from these, the fluorescence generated by the irradiation of a laser dye or the like on the fluorescent dye fixed to the cells is also detected, and the fluorescence intensity indicates the biological activity of the cells.
【０００５】一般に、細胞表面には種々のタイプのレセ
プターが散在しており、それらのレセプターの分布状態
によって細胞の生物学的活性が異なるといわれている。
フローサイトメトリーで測定される細胞表面には、マー
カーあるいは標識剤と呼ばれる物質が結合している。こ
のマーカーは、細胞表面に存在する特定のレセプターと
特異的親和性を有する物質に蛍光色素等の発色団を結合
してなるものである。[0005] In general, various types of receptors are scattered on the cell surface, and it is said that the biological activity of the cell differs depending on the distribution of these receptors.
A substance called a marker or a labeling agent is bound to the cell surface measured by flow cytometry. This marker is formed by binding a chromophore such as a fluorescent dye to a substance having a specific affinity for a specific receptor present on the cell surface.
【０００６】細胞をこのマーカーとともに処理すること
により、細胞表面のレセプターにマーカーが結合し、蛍
光色素で標識される。その標識された細胞の表面蛍光強
度の変化を、上記のフローサイトメーターで測定し、レ
セプターの密度や活性を知ることができる。従って、こ
のマーカーとして用いられる物質としては、目的とする
レセプターに対して特異的な親和性を有するものでなけ
ればならない。[0006] By treating cells with this marker, the marker binds to the receptor on the cell surface and is labeled with a fluorescent dye. The change in the surface fluorescence intensity of the labeled cells can be measured with the above-described flow cytometer to determine the density and activity of the receptor. Therefore, the substance used as this marker must have a specific affinity for the target receptor.
【０００７】そのような特異的結合の一例として抗原−
抗体反応があり、従来から用いられているマーカーは、
その抗原−抗体反応を利用して製造したモノクローナル
抗体に蛍光色素を固定したものであった。しかしなが
ら、モノクローナル抗体は、その製造には非常に手間が
かかり、従ってモノクローナル抗体を使用した従来のマ
ーカーは、極めて高価なため入手が困難であった。[0007] One example of such specific binding is antigen-
There is an antibody reaction, the marker that has been used conventionally is
A fluorescent dye was immobilized on a monoclonal antibody produced using the antigen-antibody reaction. However, the production of a monoclonal antibody is extremely troublesome, and therefore, a conventional marker using the monoclonal antibody is extremely expensive and difficult to obtain.
【０００８】[0008]
【発明が解決しようとする課題】よって、本発明におけ
る課題は、細胞表面のレセプターと特異的親和性を有
し、細胞診断のマーカーとして使用することができ、な
おかつ安価で入手が容易な細胞診断用合成マーカーを提
供することにある。SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, an object of the present invention is to provide an inexpensive and easily available cell diagnostic which has a specific affinity for a cell surface receptor and can be used as a marker for cytodiagnosis. To provide a synthetic marker for use.
【０００９】[0009]
【課題を解決するための手段】かかる課題は、ポリビニ
ルベンジルラクトンアミドに蛍光色素を固定してなるこ
とを特徴とする細胞診断用合成マーカーによって解決で
きる。This problem can be solved by a synthetic marker for cytodiagnosis characterized by fixing a fluorescent dye to polyvinylbenzyllactone amide.
【００１０】以下に本発明の細胞診断用合成マーカーに
ついて詳細に説明する。本発明の合成マーカーは、下式
で示されるポリビニルベンジルラクトンアミド（以後Ｐ
ＶＬＡと略記する）に蛍光色素を固定してなることを特
徴とする。Hereinafter, the synthetic marker for cytodiagnosis of the present invention will be described in detail. The synthetic marker of the present invention is a polyvinyl benzyl lactone amide (hereinafter referred to as P
VLA) (abbreviated as VLA) with a fluorescent dye fixed thereon.
【００１１】[0011]
【化１】 Embedded image
【００１２】本発明の合成マーカーをなすＰＶＬＡは、
スチレン誘導体ポリマーであるポリビニルベンジルアミ
ンを主鎖とし、そのアミノ基とラクトースの末端カルボ
キシル基とがアミド結合して側鎖を形成している。この
ＰＶＬＡは、そのモノマーであるＮ−ｐ−ビニルベンジ
ル−ｏ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−４）−Ｄ
−グルコンアミドを単独重合して合成するのが好まし
い。このＰＶＬＡの分子量は、水溶液中に溶解した際に
ミセルを形成し可溶化する程度であれば特に限られるも
のではないが、通常は３万から５万程度のものが用いら
れる。The synthetic marker of the present invention, PVLA,
The main chain is polyvinylbenzylamine, which is a styrene derivative polymer, and its amino group and the terminal carboxyl group of lactose are amide-bonded to form a side chain. This PVLA has the monomer Np-vinylbenzyl-obD-galactopyranosyl- (1-4) -D
It is preferred to synthesize gluconamide by homopolymerization. The molecular weight of this PVLA is not particularly limited as long as it forms micelles and becomes solubilized when dissolved in an aqueous solution, but usually a molecular weight of about 30,000 to 50,000 is used.
【００１３】このＰＶＬＡに、フルオレセインイソチオ
シアネート（ＦＩＴＣと略記）等の蛍光色素を固定す
る。その方法としては、例えば、微量のピリジンを添加
した溶媒にＰＶＬＡを溶解し、その溶液にＦＩＴＣをジ
ブチルスズジラウレート等の触媒とともに加えて加熱す
る。得られた反応混合液からエタノール中で数回再結晶
させて濾過することにより、本発明の合成マーカーを得
ることができる。このＦＩＴＣの含有量は、特に限定さ
れないが、その含有量を多くすると感度良く検知でき
る。好ましくは、ＰＶＬＡ中のラクトース２０〜２００
分子に対してＦＩＴＣ１分子程度、さらに好ましくはラ
クトース４０〜６０分子にＦＩＴＣ１分子とする。ま
た、蛍光色素はＦＩＴＣに限られることはなく、テトラ
メチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣと略
記）やフィコエリトリン（ＰＥと略記）等が好適に用い
られる。A fluorescent dye such as fluorescein isothiocyanate (abbreviated as FITC) is immobilized on the PVLA. As the method, for example, PVLA is dissolved in a solvent to which a trace amount of pyridine is added, and FITC is added to the solution together with a catalyst such as dibutyltin dilaurate and heated. The synthetic marker of the present invention can be obtained by recrystallizing the obtained reaction mixture several times in ethanol and filtering the mixture. The content of FITC is not particularly limited, but it can be detected with high sensitivity when the content is increased. Preferably, lactose 20-200 in PVLA
One molecule of FITC is used for one molecule, and more preferably, one molecule of FITC is used for 40 to 60 molecules of lactose. The fluorescent dye is not limited to FITC, and tetramethylrhodamine isothiocyanate (abbreviated as RITC), phycoerythrin (abbreviated as PE), or the like is preferably used.
【００１４】本発明の合成マーカーは、特に、肝細胞表
面に存在するアシアロ糖タンパク質レセプターと特異的
に結合し、その結合を仲介として肝細胞と非常に高い親
和性を示す。従って本発明の合成マーカーは、肝細胞表
面のアシアロ糖タンパク質レセプターを標識し、肝細胞
診断に使用するのが好ましい。The synthetic marker of the present invention specifically binds to an asialoglycoprotein receptor present on the surface of hepatocytes, and exhibits extremely high affinity for hepatocytes via the binding. Therefore, it is preferable that the synthetic marker of the present invention labels an asialoglycoprotein receptor on the surface of a hepatocyte and is used for hepatocyte diagnosis.
【００１５】ここで、アシアロ糖タンパク質とは、シア
ル酸を含む糖タンパク質からシアル酸が取り除かれたも
ののことである。一般に、血清糖タンパク質が血流中に
安定に存在するためにはシアル酸が必要であり、シアル
酸を欠いた血清糖タンパク質、即ちアシアロ糖タンパク
質は、肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質レセプターに
特異的に結合した後、肝細胞内に取り込まれて分解され
る。従って、肝細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質
レセプターの活性を検知することは代謝機能診断上非常
に重要である。Here, the asialoglycoprotein is a glycoprotein containing sialic acid from which sialic acid has been removed. Generally, sialic acid is required for stable presence of serum glycoprotein in the bloodstream, and serum glycoprotein lacking sialic acid, that is, asialoglycoprotein, is specific for asialoglycoprotein receptor on the surface of hepatocytes. After binding to, they are taken up into hepatocytes and decomposed. Therefore, detecting the activity of asialoglycoprotein receptor on the surface of hepatocytes is very important for diagnosis of metabolic function.
【００１６】本発明の合成マーカーで肝細胞表面のアシ
アロ糖タンパク質レセプターを標識するためには、例え
ば、本発明の合成マーカーをリン酸緩衝液（ＰＢＳと略
記）中に溶解し、その溶液を肝細胞を懸濁したＰＢＳに
加えて、冷却下で時々攪拌すればよい。その混合比は、
１００×１０4個の肝細胞に対し、０．１重量％の合成
マーカー溶液を１００μｌ程度とするのが好ましいが、
特に限られるものではない。In order to label the asialoglycoprotein receptor on the surface of hepatocytes with the synthetic marker of the present invention, for example, the synthetic marker of the present invention is dissolved in a phosphate buffer (abbreviated as PBS), and the solution is added to the liver. The cells may be added to the suspended PBS and stirred occasionally under cooling. The mixing ratio is
It is preferable to make the synthetic marker solution of 0.1% by weight about 100 μl per 100 × 10 4 hepatocytes.
There is no particular limitation.
【００１７】このようにして、本発明の合成マーカーで
標識した肝細胞は、フローサイトメトリーによって測定
するのが好ましく、それによって特に肝細胞表面に存在
するアシアロ糖タンパク質レセプターの活性、変質、密
度などを定量的に知ることができ、代謝機能の診断に有
効な情報を得ることができる。Thus, the hepatocytes labeled with the synthetic marker of the present invention are preferably measured by flow cytometry, whereby the activity, alteration, density, etc., of asialoglycoprotein receptor, especially present on the hepatocyte surface, are determined. Can be quantitatively known, and effective information for diagnosis of metabolic function can be obtained.
【００１８】また、本発明の合成マーカーは、肝癌細胞
の標識に使用した場合、その肝癌の種類によって異なっ
た強度の蛍光を発するため、この合成マーカーで標識す
るだけで癌種の識別が可能になる。Further, when the synthetic marker of the present invention is used for labeling liver cancer cells, it emits fluorescence of different intensity depending on the type of liver cancer. Therefore, it is possible to identify cancer types only by labeling with the synthetic marker. Become.
【００１９】本発明の細胞診断用合成マーカーは、従来
のような複雑な操作なしで合成されるため入手が容易で
ある。また、本発明の合成マーカーは、特に肝細胞表面
に存在するアシアロ糖タンパク質レセプターを介して、
肝細胞と高い親和性を有するので、肝細胞及び肝癌の診
断に有効である。The synthetic marker for cytodiagnosis of the present invention is easily available because it is synthesized without complicated operations as in the prior art. Further, the synthetic marker of the present invention, particularly via an asialoglycoprotein receptor present on the surface of a hepatocyte,
Since it has high affinity with hepatocytes, it is effective for diagnosis of hepatocytes and liver cancer.
【００２０】以下に実施例を示し、本発明の合成マーカ
ーを具体的に説明する。 （実施例１）本発明の合成マーカーを、以下のようにし
て合成した。 （１）ＰＶＬＡの合成 まず、モノマーであるＮ−ｐ−ビニルベンジル−ｏ−ｂ
−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−４）−Ｄ−グルコン
アミドを、公知の方法（小林一清ら、ポリマー・ジャー
ナル、第１７巻、５６７〜５７５ページ、１９８５年）
に従って合成した。次に、このモノマーを単独重合して
ＰＶＬＡを合成した。Examples are shown below to specifically describe the synthetic markers of the present invention. (Example 1) The synthetic marker of the present invention was synthesized as follows. (1) Synthesis of PVLA First, the monomer Np-vinylbenzyl-ob
-D-galactopyranosyl- (1-4) -D-gluconamide was prepared by a known method (Kobayashi Kazunori et al., Polymer Journal, Vol. 17, pp. 567-575, 1985).
Was synthesized according to the following procedure. Next, this monomer was homopolymerized to synthesize PVLA.
【００２１】（２）蛍光色素の固定 ３滴のピリジンを添加した５ｍｌの乾燥ジメチルスルホ
キシドに５００ｍｇのＰＶＬＡ（１０×１０-3のモノマ
ーユニットに対応する）を溶解した。その溶液に５０ｍ
ｇのＦＩＴＣ（和光純薬工業製）加え、さらに１５ｍｇ
のジブチルスズジラウレートを加えた後、９０℃で２時
間加熱した。得られた反応混合液からエタノール中で数
回再結晶させて濾過することにより、本発明の合成マー
カーを得た。(2) Fixation of fluorescent dye 500 mg of PVLA (corresponding to 10 × 10 −3 monomer units) was dissolved in 5 ml of dry dimethyl sulfoxide to which 3 drops of pyridine had been added. 50m in the solution
g of FITC (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), and 15 mg
Then, the mixture was heated at 90 ° C. for 2 hours. The resulting reaction mixture was recrystallized several times in ethanol and filtered to obtain the synthetic marker of the present invention.
【００２２】このようにして合成した本発明の合成マー
カーに固定されたＦＩＴＣ量を、蛍光分光光度計（ＲＦ
−５００、島津製作所製）を用いて測定した。その結
果、ＰＶＬＡポリマー中のラクトース４０分子に付き１
分子の割合で固定されていることがわかった。The amount of FITC immobilized on the synthetic marker of the present invention synthesized as described above is measured using a fluorescence spectrophotometer (RF
-500, manufactured by Shimadzu Corporation). As a result, for every 40 molecules of lactose in the PVLA polymer,
It was found that it was fixed at the molecular ratio.
【００２３】次に、本発明の合成マーカーを０．１重量
％となるように、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡと略記）
とＮａＮ3を含むＰＢＳに溶解した。肝細胞として、ラ
ット肝実質細胞を用い、それをＰＢＳ中に懸濁し、遠心
して濃縮した。１００×１０4個の細胞を懸濁したＰＢ
Ｓ中に、上記の合成マーカー溶液１００ｍｌを加えた。
その混合液１００ｍｌを、アイスバス中で、時々攪拌し
ながら４０分間、４℃に冷却し、肝細胞を本発明の合成
マーカーで標識した。標識した肝細胞は、ＮａＮ3を含
む冷却したＰＢＳで２回洗浄し、５０×１０4細胞／ｍ
ｌに希釈した。Next, bovine serum albumin (abbreviated as BSA) was used so that the synthetic marker of the present invention was 0.1% by weight.
And NaN 3 in PBS. Rat hepatocytes were used as hepatocytes, suspended in PBS, centrifuged and concentrated. PB with 100 × 10 4 cells suspended
In S, 100 ml of the above-mentioned synthetic marker solution was added.
100 ml of the mixture was cooled to 4 ° C. in an ice bath for 40 minutes with occasional stirring, and hepatocytes were labeled with the synthetic marker of the present invention. The labeled hepatocytes were washed twice with cold PBS containing NaN 3 and 50 × 10 4 cells / m 2
diluted to 1.
【００２４】このようにして、本発明の合成マーカーで
標識した肝細胞の蛍光強度を、フローサイトメーター
（ＦＡＣＳｃａｎ、ベクトン・ディッキンソン・イムノ
サイトメトリー・システム社製）で測定した。その結果
を、横軸に蛍光強度、縦軸に細胞数をとったヒストグラ
ムとして図１（Ａ）に示す。比較のため、未処理の肝細
胞で測定した結果を、同様に図１（Ｂ）に示す。本発明
の合成マーカーで標識した肝細胞（Ａ）は、未処理の肝
細胞（Ｂ）に比較して明らかに蛍光強度が増加してお
り、本発明の合成マーカーが有効に肝細胞を標識してい
ることがわかる。Thus, the fluorescence intensity of the hepatocytes labeled with the synthetic marker of the present invention was measured with a flow cytometer (FACScan, manufactured by Becton Dickinson Immunocytometry System). The result is shown in FIG. 1A as a histogram in which the horizontal axis represents the fluorescence intensity and the vertical axis represents the cell number. For comparison, the results measured on untreated hepatocytes are also shown in FIG. 1 (B). The hepatocytes (A) labeled with the synthetic marker of the present invention have clearly increased fluorescence intensity as compared with the untreated hepatocytes (B), and the hepatocytes of the present invention effectively label the hepatocytes. You can see that it is.
【００２５】（実施例２）本発明の合成マーカーが、肝
細胞表面に存在するアシアロ糖タンパク質レセプターに
特異的に結合していることを確認するために、アシアロ
糖タンパク質とそのレセプターの結合形成に不可欠なＣ
ａ2+イオンの有無による蛍光強度の違いを評価した。結
果を図２に示す。図２において、横軸は肝細胞の標識処
理時の合成マーカーの濃度であり、縦軸は、合成マーカ
ー濃度が０．１重量％のときの蛍光強度を１００％とし
て計算した相対蛍光強度である。Example 2 In order to confirm that the synthetic marker of the present invention specifically binds to an asialoglycoprotein receptor present on the surface of a hepatocyte, the formation of a bond between asialoglycoprotein and its receptor was examined. Essential C
The difference in fluorescence intensity depending on the presence or absence of a 2+ ions was evaluated. The results are shown in FIG. In FIG. 2, the horizontal axis represents the concentration of the synthetic marker at the time of the hepatocyte labeling treatment, and the vertical axis represents the relative fluorescence intensity calculated assuming that the fluorescence intensity when the concentration of the synthetic marker is 0.1% by weight is 100%. .
【００２６】Ｃａ2+イオンがある場合（Ａ）は、処理時
のＰＶＬＡ濃度が０．００１重量％であっても高い蛍光
強度を示しているが、Ｃａ2+イオンが無い場合（Ｂ）に
は、全般的に蛍光強度が低く、合成マーカー濃度の減少
にともなう蛍光強度の低下も著しかった。従って、本発
明の合成マーカーによる標識は、肝細胞表面に存在する
アシアロ糖タンパク質レセプターを仲介としてなされて
いることが確認された。In the case where Ca 2+ ions are present (A), a high fluorescence intensity is exhibited even when the PVLA concentration at the time of treatment is 0.001% by weight, but when there is no Ca 2+ ions (B). The fluorescence intensity was generally low, and the decrease in the fluorescence intensity accompanying the decrease in the concentration of the synthetic marker was also remarkable. Therefore, it was confirmed that the labeling with the synthetic marker of the present invention was carried out through the asialoglycoprotein receptor present on the surface of hepatocytes.
【００２７】（実施例３）標識すべき肝細胞を、ＰＶＬ
Ａ、アシアロフェツイン、フェツインで前処理した後、
本発明の合成マーカーで標識処理した肝細胞について評
価した。アシアロフェツインとは、アシアロ糖タンパク
質レセプターの天然リガンドであり、フェツインとは、
そのアシアロフェツインにシアル酸が結合したものであ
る。この前処理は、上記各物質を０．０１重量％、ＢＳ
Ａを０．１重量％、及びＮａＮ3を０．１重量％含むＰ
ＢＳ中に肝細胞を懸濁し、４℃で４０分間行った。(Example 3) Hepatocytes to be labeled were subjected to PVL
A, After pretreatment with asialofetwin and fetuin,
Hepatocytes labeled with the synthetic marker of the present invention were evaluated. Asialofetuin is a natural ligand of asialoglycoprotein receptor, and fetuin is
The sialic acid is bonded to the asialofetuin. In this pretreatment, 0.01% by weight of each of the above substances was
P containing 0.1% by weight of A and 0.1% by weight of NaN 3
Hepatocytes were suspended in BS and performed at 4 ° C for 40 minutes.
【００２８】このように前処理した肝細胞を、実施例１
と同様に本発明の合成マーカーで標識処理し、フローサ
イトメトリー測定を行った。その結果を、前処理なしで
標識した肝細胞の蛍光強度に対する相対強度（％）で表
し、表１にまとめて示す。The hepatocytes pretreated as described above were used in Example 1
In the same manner as described above, labeling treatment was performed with the synthetic marker of the present invention, and flow cytometry was measured. The results are expressed as relative intensity (%) to the fluorescence intensity of hepatocytes labeled without pretreatment, and are shown in Table 1.
【００２９】 [0029]
【００３０】本発明の合成マーカーをなすＰＶＬＡで前
処理したものは、肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質レ
セプターが、ＰＶＬＡによって塞がれているため、その
後の標識処理で結合する合成マーカー量が減少し、相対
蛍光強度が著しく低下している。それに対して、アシア
ロフェツインで前処理した肝細胞では、蛍光強度の低下
が少なく、フェツインで前処理した肝細胞では蛍光強度
の変化は殆ど見られない。即ち、本発明の合成マーカー
をなすＰＶＬＡは、アシアロ糖タンパク質レセプターに
対して、天然リガンドであるアシアロフェツインよりも
大きな親和性を有していることがわかった。In the case of pretreatment with PVLA, which is the synthetic marker of the present invention, the amount of the synthetic marker bound by the subsequent labeling treatment is reduced because the asialoglycoprotein receptor on the hepatocyte surface is blocked by PVLA. , The relative fluorescence intensity is significantly reduced. On the other hand, in hepatocytes pretreated with asialofetuin, the decrease in fluorescence intensity is small, and in hepatocytes pretreated with fetuin, there is almost no change in the fluorescence intensity. That is, it was found that PVLA, which is a synthetic marker of the present invention, has a greater affinity for asialoglycoprotein receptor than asialofetuin, which is a natural ligand.
【００３１】（実施例４）本発明の合成マーカーで標識
した肝癌細胞を用いてフローサイトメーターで測定を行
った。標識処理の方法は実施例１と同様にした。用いた
癌細胞の種類は、ヒト由来のＨｅｐ Ｇ２とＣｈａｎｇ
Ｌｉｖｅｒとした。その結果を、Ｈｅｐ Ｇ２につい
ては図３（Ａ）に、Ｃｈａｎｇ Ｌｉｖｅｒについては
図４（Ａ）に示した。結果は、ラットの通常肝細胞を
０．１重量％の合成マーカーで標識したときの蛍光強度
に対する相対強度で表した。(Example 4) Measurement was performed with a flow cytometer using liver cancer cells labeled with the synthetic marker of the present invention. The labeling method was the same as in Example 1. The types of cancer cells used were human-derived Hep G2 and Chang.
Liver. The results are shown in FIG. 3 (A) for Hep G2 and in FIG. 4 (A) for Chang Liver. The results were expressed as relative intensity to the fluorescence intensity when normal rat hepatocytes were labeled with 0.1% by weight of a synthetic marker.
【００３２】比較のため、ＦＩＴＣを固定したアシアロ
フェツインで標識した同様の肝癌細胞についても測定
し、結果を図３（Ｂ）及び図４（Ｂ）に示す。これらの
結果からわかるように、アシアロフェツインで標識した
肝癌細胞は、その種類によらず同様の強度の蛍光を発す
るが、本発明の合成マーカーで標識した場合は、癌種に
よって蛍光強度が異なり、Ｈｅｐ Ｇ２を用いた方がＣ
ｈａｎｇ Ｌｉｖｅｒを用いたものより強い蛍光を発す
ることがわかった。For comparison, similar liver cancer cells labeled with asialofetuin having FITC immobilized thereon were also measured, and the results are shown in FIGS. 3 (B) and 4 (B). As can be seen from these results, liver cancer cells labeled with asialofetuin emit the same level of fluorescence regardless of their type, but when labeled with the synthetic marker of the present invention, the fluorescence intensity differs depending on the type of cancer. , Hep G2 uses C
It was found to emit stronger fluorescence than that using hang River.
【００３３】これらの結果を定量的に表すため、例え
ば、本発明の合成マーカー０．０１重量％で標識処理し
た場合の相対蛍光強度と、ＦＩＴＣを固定したアシアロ
フェツイン０．００１重量％で標識した場合の相対蛍光
強度を、各々の癌細胞及びラットの通常細胞について表
２に示す。In order to quantitatively express these results, for example, the relative fluorescence intensity when labeling was performed with 0.01% by weight of the synthetic marker of the present invention and the labeling with 0.001% by weight of asialofetwin immobilized FITC were performed. Table 2 shows the relative fluorescence intensities for each of the cancer cells and rat normal cells.
【００３４】 [0034]
【００３５】以上の結果より、本発明の合成マーカーで
標識した肝癌細胞は、その癌の種類によって異なった強
度の蛍光を発し、さらにその強度は、通常肝細胞が発す
る強度とも異なっている。従って、本発明の合成マーカ
ーで標識することにより、肝細胞をフローサイトメトリ
ー測定するだけで、発癌の有無や、癌の種類を識別する
ことができることがわかった。From the above results, liver cancer cells labeled with the synthetic marker of the present invention emit fluorescence of different intensities depending on the type of the cancer, and the intensity is also different from that of normal hepatocytes. Therefore, it was found that by labeling with the synthetic marker of the present invention, the presence or absence of carcinogenesis and the type of cancer can be identified only by flow cytometry measurement of hepatocytes.
【００３６】[0036]
【発明の効果】本発明の細胞診断用合成マーカーは、従
来のような複雑な操作なしで合成できるため、製造コス
トがかからず安価であり容易に入手できる。また、本発
明の合成マーカーは、特に肝細胞表面に存在するアシア
ロ糖タンパク質レセプターと、天然リガンドを凌ぐ高い
親和性を有しているため、本発明の合成マーカーを肝細
胞診断に有効使用することができる。さらに、本発明の
合成マーカーで肝癌細胞を標識した場合、その癌種によ
って異なった強度の蛍光を発するため、肝癌診断及び癌
種の識別に非常に有効に使用することができる。Industrial Applicability The synthetic marker for cytodiagnosis of the present invention can be synthesized without a complicated operation as in the prior art, so that it is inexpensive and easy to obtain without any production cost. In addition, since the synthetic marker of the present invention has a higher affinity than the asialoglycoprotein receptor present on the surface of hepatocytes, in particular, over natural ligands, the synthetic marker of the present invention can be effectively used for hepatocyte diagnosis. Can be. Furthermore, when liver cancer cells are labeled with the synthetic marker of the present invention, they emit fluorescence of different intensities depending on the type of cancer, and thus can be used very effectively for diagnosis of liver cancer and identification of cancer type.
【図１】 本発明の合成マーカーで標識した肝細胞及び
未処理の肝細胞の発する蛍光強度を表すグラフである。FIG. 1 is a graph showing the fluorescence intensity emitted from hepatocytes labeled with the synthetic marker of the present invention and untreated hepatocytes.
【図２】 本発明の合成マーカーの、肝細胞に対する親
和性のＣａ2+イオン依存性を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the Ca 2+ ion dependency of the affinity of the synthetic marker of the present invention for hepatocytes.
【図３】 本発明の合成マーカー及びＦＩＴＣを固定し
たアシアロフェツインで標識した肝癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ
２）の蛍光強度を示すグラフである。FIG. 3 shows a liver cancer cell (Hep G) labeled with asialofetwin immobilized with the synthetic marker of the present invention and FITC.
It is a graph which shows the fluorescence intensity of 2).
【図４】 本発明の合成マーカー及びＦＩＴＣを固定し
たアシアロフェツインで標識した肝癌細胞（Ｃｈａｎｇ
Ｌｉｖｅｒ）の蛍光強度を示すグラフである。FIG. 4 shows liver cancer cells (Chang) labeled with asialofetuin having the synthetic marker of the present invention and FITC immobilized thereon.
5 is a graph showing the fluorescence intensity of (Liver).
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平５−105637（ＪＰ，Ａ) 生体材料，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．５, （1990），ｐ．16−22 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/58 G01N 15/14 G01N 33/48 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (56) References JP-A-5-105637 (JP, A) Biomaterials, Vol. 8, No. 5, (1990), p. 16-22 (58) Field surveyed (Int.Cl. 6 , DB name) G01N 33/58 G01N 15/14 G01N 33/48
Claims (3)
光色素を固定してなることを特徴とする肝癌細胞診断用
合成マーカー。1. A synthetic marker for diagnosing liver cancer cells, comprising a fluorescent dye fixed on polyvinylbenzyllactone amide.
シアネートであることを特徴とする請求項１記載の肝癌
細胞診断用合成マーカー。2. The synthetic marker for liver cancer cell diagnosis according to claim 1, wherein the fluorescent dye is fluorescein isothiocyanate.
を、請求項１または２に記載の肝癌細胞診断用合成マー
カーで標識し、標識した肝癌細胞をフローサイトメータ
ーで測定し、測定した蛍光の相対強度から肝癌の有無及
び癌種を識別することからなる肝癌細胞識別方法。3. Hepatocytes contained in a sample obtained from a subject
The synthetic mer for liver cancer cell diagnosis according to claim 1 or 2.
Labeled liver cancer cells with a flow cytometer
The presence or absence of liver cancer based on the relative intensity of the measured fluorescence.
A method for identifying liver cancer cells, comprising identifying cancer cells and cancer types .
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP5176988A JP2989429B2 (en) | 1993-07-16 | 1993-07-16 | Synthetic marker for cytodiagnosis |
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| JPH0735754A JPH0735754A (en) | 1995-02-07 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US9645154B2 (en) | 2010-12-24 | 2017-05-09 | Arkray, Inc. | Method for detecting cancer cell |
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|---|---|---|---|---|
| AU7348998A (en) * | 1997-05-16 | 1998-12-08 | Hospital For Sick Children, The | Inhibition of angiogenesis by verotoxins |
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1993
- 1993-07-16 JP JP5176988A patent/JP2989429B2/en not_active Expired - Fee Related
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| Title |
|---|
| 生体材料，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．５，（１９９０），ｐ．１６−２２ |
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| US9645154B2 (en) | 2010-12-24 | 2017-05-09 | Arkray, Inc. | Method for detecting cancer cell |
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|---|---|
| JPH0735754A (en) | 1995-02-07 |
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