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JP2999480B2 - 百日咳感染及び毒性過程に対する保護抗原を得るための方法 - Google Patents
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JP2999480B2 - 百日咳感染及び毒性過程に対する保護抗原を得るための方法 - Google Patents

百日咳感染及び毒性過程に対する保護抗原を得るための方法

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JP2999480B2 JP1096538A JP9653889A JP2999480B2 JP 2999480 B2 JP2999480 B2 JP 2999480B2 JP 1096538 A JP1096538 A JP 1096538A JP 9653889 A JP9653889 A JP 9653889A JP 2999480 B2 JP2999480 B2 JP 2999480B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、百日咳感染及び毒性過程に対する保護抗原
を得るための方法に関する。
B.ペルタシス及びB.パラペルタシスの両者は、百日咳
の発生の原因物質である。
百日咳の病因に強く関与する毒性因子に対する研究
が、病因の主要決定因子及び効果的な免疫原として、B.
ペルタシスの２種の生成物、すなわち繊維性赤血球凝集
素（FHA）及び百日咳毒素（Ptx）に対して行なわれて来
た。
これまでの研究（Institut Pasteur and Insermの名
義での1986年11月10日のFR特許出願第8615968号）にお
いては、発明者は、急性水腫性出血性肺胞炎（AEHA）を
マウスに誘発することにより明示されるように、肺の細
胞変性症候群における主要毒素及び従って可能性ある保
護抗原としてアデニル酸シクラーゼ（AC）の役割を示す
ために、B.ペルタシスにより合成された他の生成物、す
なわちACに対して発生せしめられた抗体を用いていた。
本発明者は、他の百日咳種により生成され、そして開
放されるアデニル酸シクラーゼの役割を調べ、そしてマ
ウスの実験的感染において病因及び免疫性におけるその
役割を調べた。
B.ペルタシスとは異なる百日咳菌種を用いて、百日咳
に対する保護抗原として有用なアデニル酸シクラーゼ調
製物を提供することが本発明の目的である。
活性アデニル酸シクラーゼ及び／又は交差反応性不活
性タンパク質を得るための本発明の方法は、B.パラペル
タシス又はその変異体の使用を特徴とする。
本明細書に使用される用語“活性”又は“不活性”と
はアデニル酸シクラーゼ酵素活性を言及する。
活性アデニル酸シクラーゼは、約43±4.3〜45±4.5K
ドルトン（対照として使用されるオボアルブミンに対し
て決定されるような分子量範囲Mr）の分子量を有する。
それは特に、特定のポリクローナル及びモノクローナル
抗−B.ペルタシスAC抗体により認識される。
前記活性アデニル酸シクラーゼは、B.ペルタシスACと
抗原的に交差反応することができる。
百日咳に存在する局部の肺病変の原因の細胞毒素であ
る前記アデニル酸シクラーゼは、都合良く免疫原特性を
付与される。
不活性タンパク質は、“病原性細菌に対する免疫保護
性抗原性タンパク質”に関係する、同じ日に出願された
EP特許出願に開示される。
前記不活性タンパク質は、精製されたAC調製物に対し
て生ぜしめられたポリクローナル抗−AC抗体により特異
的に認識され、そしてアデニル酸シクラーゼCaM−活性
可能な活性及びCaMに対する親和性を欠いている。それ
はまた、B.ペルタシスACと抗原的に交差反応することが
できる。
活性アデニル酸シクラーゼ及び不活性交差反応性タン
パク質の複合体は、 B.パラペルタシス又は交差反応性を有するタンパク質を
発現する変異体から得ることができる。
従って、活性形及び不活性形は、通常の精製技法によ
り単離され得る。
驚くべきことに、前記アデニレート・シクラーゼ調製
物は、ボルデテラ・パラペルタシスから得ることができ
る。なぜなら、交差免疫性はボルデテラ・ペルタシス感
染とボルデテラ・パラペルタシス感染との間に存在しな
いことが認められていたからである。
本発明のこの観点はひじょうに興味あるものである。
なぜならばB.パラペルタシスは、それがよく知られてい
るようにPtxを発現せず、ところが前記毒素はB.ペルタ
シスによってのみ発現されるからである。
従って、本発明は、Ptに関連する副作用、たとえばア
レルギー性脳炎の危険を持たない抗原性アデニル酸シク
ラーゼ調製物を得るための手段を提供する。
本発明の方によれば、Ptxを含まない抗原性AC調製物
がB.パラペルタシスhly+クローンから得ることができ
る。前記クローンは、インビトロで選択され、又はチャ
レンジ後の肺のホモジネートから回収され、そして急性
水腫性出血性肺胞炎に関与することができる。
高い量の活性ACを都合良く発現する特定のhly+クロー
ンが肺から回収され、そして1988年４月15日にCollecti
on Nationale de Culture de Microorganisms（CNCM）
にＩ−749として寄託されている63−2Sクローンから成
る。
109CFU/mlでの標準化された細菌懸濁液に対応する63
−2Sの培養上清液は、約20〜25単位のAC酵素活性を有す
る。
低いACの自発的発現を有するhly+クローンが、AC活性
を高めるために、マウスの鼻腔内注入され、そして肺か
ら再単離され得る。
hly+,AC+表現型の発現を維持する誘導体化されたクロ
ーンは、本発明の範囲内にある。たとえば、クローン63
−2TCS〔トリプト−ガゼイン−ソイ（trypto−casein−
soy）〕は、同じ収率及びhly+,AC+発現の維持を伴っ
て、百日咳に関する非特異的媒体上で増殖する63−2S株
から得られた。
B.ペルタシスとB.パラペルタシスとの間の交差免疫性
は、抗−B.ペルタシスアデニル酸シクラーゼ抗体による
受身交差保護により明示された。本発明に従って得られ
たアデニル酸シクラーゼ調製物に対して行なわれた研究
は、前記分子が保護抗原であることを示した。
従って、前記アデニル酸シクラーゼ調製物は、それら
が宿主のアデニル酸シクラーゼと交差反応しない条件下
で、ワクチン調製物を製造するために本発明に従って都
合良く使用される。そのアデニル酸シクラーゼ調製物
は、活性及び不活性タンパク質の両者又は前記タンパク
質の１つのみを含有する。
B.パラペルタシスから得られたアデニル酸シクラーゼ
調製物から得られるそのようなワクチンは、分子ワクチ
ンであり、そしてヒト及び動物において百日咳感染及び
毒性効果を防ぐことができる。通常の投与量及び投与形
が都合良く使用される。ワクチンは、好ましくは鼻腔
内、経口又は非経口製剤の形として存在する。
ワクチン組成物において、アデニル酸シクラーゼ調製
物は、同じ接種物においてFHAと組合しても良く又はし
なくても良い。FHAは、アデニル酸シクラーゼ調製物と
同時に又は異なった時に投与され得る。FHA調製物は、
たとえばSatoなど.,Infect.Immun.,1983,41,313〜320ペ
ージ又はImaizumiなど.,Journal of Microbiol.Method
s,2,334〜347ページ（1984）の方法を用いて都合良く得
られる。
本発明のアデニル酸シクラーゼ調製物はまた、1986年
11月17日に出願されたFR特許第8615963号に開示される
精製されたAC調製物、及び場合によってはFHAとも組合
され得る。
好都合には、本発明のワクチン組成物は、百日咳菌、
たとえばB.ペルタシス、B.パラペルタシス、B.ブロンキ
スペチカ（B.bronchispetica）及びB.アビウム（B.aviu
m）により引き起こされる感染を阻止する。
他の態様によれば、細菌性の完全な細胞ワクチンはB.
パラペルタシスから調製される。そのようなワクチン
は、B.パラペルタシス及びB.ペルタシスの両者に対して
保護効果を有する。
本発明の他の特徴及び利点は、次の例で付与されるで
あろう。
この例に使用される材料及び方法は次の通りである： ａ−細菌株及び培養条件： B.ペルタシス18323（ATCC9797）及びB.パラペルタシ
ス（CIP63−２）を、溶血性（hly）又は非溶血性クロー
ンを選択するために、脱フィブリン化された馬の血液に
より補充されたBordet Gengou寒天培地（最終濃度15
％）（BG）上にプレートし、そしてStainer Scholteブ
イヨンに継代培養した。
ｂ−AC及びPtxのためのアッセイ： 酵素活性又は生物学的活性のいづれかからの、又はウ
ェスターンブロット分析によるAC及びPtxの検出方法
は、White A.Aなど.,Methods Enzymol.,38c,41〜46ペー
ジ、1974及びManouneなど.,J.Biol.Chem.,252,2039〜20
46ページ、1977により記載されている。
ｃ−マウスの感染： 特定の病原体を有さない３週歳のSwiss OF1雌マウス
（16g±1gの体重）を、ferme exprimentale de Renne
moulin（Institut Pasteur,78Villeprenx,France）から
購入し、そしてフィルターカップを上部に備えたカゴ
（Techniplast,UAR,France）中に５匹のグループで維持
し、そしてγ線により殺菌された食物（granul'es RO3,
UAR,France）及びオートクレーブされた飲み水を供給し
た。４週歳でのマウスを、エーテル麻酔した後、B.ペル
タシス株Kendrick18323（菌株タイプATCC9797）又はB.
パラペルタシスCIP63−２からの標準化された細菌接種
物（50μの体積で）の鼻腔内注入により感染せしめ
た。
ｄ−組織病理学： 感染されたマウスからの肺を、選択された時間で集
め、10％ホルムアルデヒド中に固定し、パラフィン中に
固定し、そして光学顕微鏡による試験のためにヘマトキ
シリン−エオシン又はGiemsaにより染色する前、連続的
に区分した。
結 果： −B.パラペルタシスによる肺感染力 ２種のグループのマウスを、BGに基づいて選択された
hly+クローン（63−2H）又はチャレンジ後３日でのマウ
スの肺のホモジネートから回収された、I749として寄託
されている前記hly+クローン（63−2S）のいづれかから
調製された接種物を鼻腔内に注入することによって感染
せしめた。
鼻腔内感染の投与量−効果が第１図に報告され、そし
てこれは63−2H（曲線●…●）及び63−2S（曲線▲−
▲）を伴って日数に対するog10CFU/肺（コロニー形成
単位）の変化の関数を示す。垂直の線は、５匹のマウス
のSEMの平均である。
第１図に示されるように、両接種物は類似する毒性を
有し（細菌の増殖／生存割合に関して）、ところがクロ
ーン63−2Sはクローン63−2Hよりも有意により病原性で
あった。103CFUの鼻腔内注入は、63−2Sの場合、LD50％
に相当し、そして63−2Hの場合、LD25％に相当した。
−組織病理学的発見 チャレンジ後24時間で死んだマウスの肺は、Brezin
C.など.,dans FEMS Microbilo.Lett.,42,75〜80,1987に
より報告されているように、B.ベルタシスに由来するhl
y+AC+クローンにより観察される典型的なAEHAを示し
た。
−AC活性 10CFU/mlでの標準化された細菌懸濁液に相当する63−
2S及び63−2Hの培養上清液中のACの用量は、AC酵素活性
がそれぞれ20〜25単位及び４〜７単位であることを示し
た。
−B.ペルタシスとB.パラペルタシスとの間の交差免疫性 B.パラペルタシスにより感染されたマウスのACに対する
免疫応答： 特定のポリクローナル抗−AC抗体によりB.パラペルタ
シスの尿素抽出物のウェスターンブロット分析を行なっ
た。
尿素抽出物は次のようにして得られた： 細菌部分を緩衝液Ａ（Tris HCl 25mM,MgCl2 6mM,NP40
0.1％,pH8）（1/3;w/w）中でホモジネート１、そして
緩衝液Ａ中8Mの尿素の同量を添加した。培地を30℃で40
分間撹拌した。緩衝液Ａ中での透析を行ない、続いて６
℃で30分間遠心分離にかけた（5000gで）。その上清液
を回収し、そして尿素抽出物を構成する。
ポリクローナル抗−ACを、B.ペルタシスから得られた
精製されたAC調製物により動物を免疫化し、そして免疫
血清からの調製物に対して生ぜしめられた抗体を回収す
ることによって得る。
抗体を生ぜしめるために使用される好ましいAC調製物
は、“精製されたAC調節物、前記のものを得るための方
法及びそれらの生物学的適用”に関する、1986年11月17
日に出願されたFR特許出願第86/15963号に開示される精
製されたAC調製物である。
そのような調製物は、それらが高度の純度を有し、そ
して汚染性細菌物質、特に百日咳毒素、リポ多糖（又は
LPS）及び繊維性赤血球凝集素（又はFHA）を完全に欠く
ことを特徴とする。従って、ACは、スクロース密度グラ
ジェントにおいて3,6に等しいＳ係数で沈殿し、そして
それぞれ45及び43Kドルトンの２種の構造的に関連する
分子形で存在する均一形で得ることができる。
もう１つの観点によれば、AC調製物は、それらが達成
することができ、そしてさらに1600μモルのCAMP/分・m
gを越える活性を有することを特徴とする。
前記精製されたAC調製物は、前もって濃縮された、ア
デニル酸シクラーゼを示す細菌培養物の上清液又はこれ
らの細菌の抽出物とカルモジュリンとを接触することに
よって得ることができる。
ポリクローナル抗体は、ACが遊離状態で存在するか又
は真核タンパク質、特にカルモジュリンとの複合体の形
で存在する問題のAC調製物により動物、たとえばウサギ
又はマウスを免疫化し、そして抗体を含む抗血清及び次
に抗体自体を標準方法により回収することによって生成
される。
モノクローナル抗体は、マウス骨髄腫と精製されたア
デニル酸シクラーゼにより免疫化されたマウスに由来す
る脾臓リンパ球との融合により得ることができる。
モノクローナル抗体（８〜25）が特に使用される。そ
れらは、50,45及び43Kドルトンのトリプレット及び粗抽
出物における100Kドルトン以上の分子量のタンパク質並
びに細菌細胞から精製された酵素の調製物を免疫沈殿せ
しめる。
モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ株は、
1986年10月９日、Ｉ−610としてNational Collection o
f Culture a of Microorganisms（CNCM）に寄託され
た。
結果が第２図上に与えられ、ここでレーン１〜４はそ
れぞれ下記に相当する： 1. 抗−B.ペルタシスAC抗体により示されるB.パラペル
タシス抽出物、 2. B.パラペルタシスにより感染されたマウスからの血
清により示される精製されたB.ペルタシスAC、 3. B.パラペルタシスにより感染されたマウスからの血
清により示されるB.パラペルタシス抽出物、及び 4. 抗−Ｂ百日咳AC抗体を有するB.パラペルタシス抽出
物に示されるB.パラペルタシスAC。
前記ウェスターンブロット分析は、B.ペルタシスACと
交差反応した分子量43〜45Kドルトンの抗原の存在を示
した（第２図）。
さらに、鼻腔内チャレンジの後27日目で集められた、
精製されたB.ペルタシスACとB.パラペルタシス感染が回
復に向かっているマウスからの血清との比較免疫ブロッ
ト（第１図）は、抗−B.ペルタシスAC抗体の存在を示し
た。
−B.パラペルタシスによるマウスの呼吸器の致命的な感
染に対する抗−B.ペルタシスAC抗体の保護効果 ａ）B.パラペルタシス接種物を、ポリクローナル又はモ
ノクローナル抗−B.ペルタシスAC抗体と共に予備インキ
ュベートした。その結果は、下記の第１表に示される： 表に示されるように、ポリクローナル又はモノクローナ
ル抗−B.ペルタシスAC抗体と共にインキュベートされた
前記B.パラペルタシス接種物は、投与量依存性態様で致
命的なチャレンジを抑制した。
B.パラペルタシスとB.ペルタシスとの間の交差免疫原
性が、第２表に示されるように交差予防接種実験により
評価された。
【図面の簡単な説明】
第１図は、B.パラペルタシスクローンによる肺感染の動
力学を示し、そして 第２図は、ポリクローナル抗−B.ペルタシスAC抗体によ
る、B.パラペルタシス及びB.ペルタシスからのAC含有抽
出物の免疫ブロットを示し、そしてこれは図面に代わる
写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 コレット ブレザン フランス国，75007 パリ，アブニュ エ．デシャネル 11ベ. (72)発明者 ジャン―ルク ブコー フランス国，69470 クール‐ラ‐ビル, リュ イ．ジロー 35 (72)発明者 マレク スザタニク フランス国，78210 サン‐シール レ コル，リュ アルフレ ドレイフェ ２ (72)発明者 ジャン―ミシェル アロンソ フランス国，78180 モンティニール- ブレトヌー，リュ ドゥ コルヌアユ 51 (56)参考文献 ＲＩＣＨＡＲＤ Ｄ．ＰＥＡＲＳＯ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ ｌ．，139（８），1987，ｐｐ．2749− 2754 ＥＲＩＫ．Ｌ．ＨＥＷＬＥＴＴ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇ ｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，23 （２），1983，ｐｐ．201−206 ＧＡＩＬ Ｗ．ＷＡＬＴＥＲ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｔｃｒｏｂｉｏｓ．，33, 1982，ｐｐ．45−52 ＭＡＳＡＨＩＫＯ ＥＮＤＯＨ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍ ｕｎｏｌ．，24（２），1980，ｐｐ．95 −104 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 39/10 C12N 5/00 - 15/00 C12P 15/00 - 21/08 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ボルデテラ・パラペルタシス（Bordetella
    parapertussis）又はその変異体から得られた、百日咳
    に対する保護抗原のためのアデニレート・シクラーゼ調
    製物であって、特定のポリクローナル及びモノクローナ
    ル抗−ボルデテラ・ペルタシス（Bordetella pertussi
    s）AC抗体により特異的に認識され、かつ、ボルデテラ
    ・ペルタシスACと抗原的に交差反応することができる43
    ±4.3〜45±4.5kDaの分子量（Mr）を有する活性アデニ
    レート・シクラーゼ、及び精製されたAC調製物に対して
    作られたポリクローナル抗−AC抗体により特異的に認識
    され、かつ、アデニレート・シクラーゼ・カルモジュリ
    ン（CaM）を活性化することができる活性を欠き、か
    つ、CaMとの親和性を欠く43±4.3kDaの分子量（Mr）を
    有する不活性タンパク質であってボルデテラ・ペルタシ
    スACと交差反応することができるタンパク質を含んで成
    る、前記アデニレート・シクラーゼ調製物。
  2. 【請求項２】急性水腫性出血性肺胞炎を誘発することが
    できるボルデテラ・パラペルタシスのhly+（溶血性）ク
    ローンであって感染後にインビトロ又は肺ホモジネート
    から選択されるクローンから得られる、請求項１に記載
    のアデニレート・シクラーゼ調製物。
  3. 【請求項３】前記hly+クローンが、1988年４月15日にI7
    49として寄託されている63−2Sクローンであり、かつ、
    hly+,AC+表現型の発現を維持する得られたクローンであ
    る、請求項２に記載のアデニレート・シクラーゼ調製
    物。
  4. 【請求項４】109CFU/mlでの標準化された細菌懸濁液に
    対応する培養上清液が、20〜25単位のAC酵素活性を有す
    る、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアデニレート
    ・シクラーゼ調製物。
  5. 【請求項５】1988年４月15日にCollection nationale d
    e Culture de Microorganisme（CNCM）にI749として寄
    託されたボルデテラ・パラペルタシスのhly+クローン。
  6. 【請求項６】ボルデテラ属（Bordetella）により引き起
    こされる感染を防止するためのワクチン製剤の製造方法
    であって、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアデニ
    レート・シクラーゼ調製物を、同一接種物中に、FHA及
    び／又は精製ACと共に又は単独で、使用することを含む
    方法。
  7. 【請求項７】ボルデテラ属感染及び毒性過程を防止する
    ための細菌性の完全細胞ワクチンであって、ボルデテラ
    ・パラペルタシスから調製されることを特徴とする、前
    記ワクチン。
  8. 【請求項８】百日咳（ペルタシス）毒素を含まず、か
    つ、ボルデテラ・ペルタシス・アデニレート・シクラー
    ゼに対するポリクローナル又はモノクローナル抗体との
    特異的反応性を有する活性アデニレート・シクラーゼ及
    び不活性アデニレート・シクラーゼの獲得方法であっ
    て、ボルデテラ・パラペルタシスの溶血性クローンを培
    養し、そしてその培養物から活性アデニレート・シクラ
    ーゼ及び不活性アデニレート・シクラーゼを単離するこ
    とを含み、ここで、その不活性アデニレート・シクラー
    ゼがカルモジュリンにより活性化されることができるア
    デニレート・シクラーゼ活性を欠き、かつ、カルモジュ
    リンとの親和性を欠く、前記獲得方法。
  9. 【請求項９】前記の培養物からの活性アデニレート・シ
    クラーゼ及び不活性アデニレート・シクラーゼの単離工
    程が、その培養されたボルデテラ・パラペルタシスをホ
    モジェナイズし、そしてそのホモジェナイズされたボル
    デテラ・パラペルタシスを尿素で処理することを含む、
    請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】ボルデテラ・パラペルタシス・アデニレ
    ート・シクラーゼのポリクローナル又はモノクローナル
    抗体との特異的反応性を有し、かつ、カルモジュリンに
    より活性化されることができるアデニレート・シクラー
    ゼ活性を欠き、かつ、カルモジュリンとの親和性を欠
    く、43±4.3kDaの分子量を有する不活性アデニレート・
    シクラーゼの獲得方法であって、 （ａ）ボルデテラ・パラペルタシスの溶血性クローンを
    培養し； （ｂ）その培養されたボルデテラ・パラペルタシスをホ
    モジェナイズし； （ｃ）不活性アデニレート・シクラーゼから活性アデニ
    レート・シクラーゼを分離し；そして （ｄ）不活性アデニレート・シクラーゼを回収する、 前記獲得方法。
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