JP3020602B2 - ターゲット核酸増幅／検出システム - Google Patents
ターゲット核酸増幅／検出システムInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 国際特許出願公開87/06270号および国際特許出願第US
89/01966号明細書（1989年11月公開）を参照し、その記
載全体をここに参考として引用する。
89/01966号明細書（1989年11月公開）を参照し、その記
載全体をここに参考として引用する。
発明の分野 本発明は一般に分子生物学および組み換えDNA技術の
前進に関するものである。
前進に関するものである。
より詳細には、本発明は生物学的試料中のターゲット
RNA種、および推論によりそれらのRNA種がコードする対
応ポリペプチドの存在を、インビトロまたはエクスビボ
（ex vivo）セッティングにおいて検出するための方法
および手段を目的とし、これにはアッセイ法、ならびに
必要な試薬および手段を含む試験キットが含まれる。
RNA種、および推論によりそれらのRNA種がコードする対
応ポリペプチドの存在を、インビトロまたはエクスビボ
（ex vivo）セッティングにおいて検出するための方法
および手段を目的とし、これにはアッセイ法、ならびに
必要な試薬および手段を含む試験キットが含まれる。
本発明は、生物学的試料中のターゲットRNAの検出の
ための核酸プローブハイブリダイゼーションシステムに
用いるために、ターゲット増幅の利点と、RNA依存性RNA
ポリメラーゼにより検出可能なリポーター分子を酵素的
に産生してRNAターゲットのコピー（ターゲット配列を
含み、このポリメラーゼにより自触媒的に複製しうる）
を生成することの利点を、新規な様式で組み合わせるこ
とを特色とする。
ための核酸プローブハイブリダイゼーションシステムに
用いるために、ターゲット増幅の利点と、RNA依存性RNA
ポリメラーゼにより検出可能なリポーター分子を酵素的
に産生してRNAターゲットのコピー（ターゲット配列を
含み、このポリメラーゼにより自触媒的に複製しうる）
を生成することの利点を、新規な様式で組み合わせるこ
とを特色とする。
本発明が利用される用途には、要求されるターゲット
RNAを含有する体液および組織のインビトロまたはエク
スビボ核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイに
より、疾病または病的状態に特徴的なRNA配列を分析す
ることが含まれる。
RNAを含有する体液および組織のインビトロまたはエク
スビボ核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイに
より、疾病または病的状態に特徴的なRNA配列を分析す
ることが含まれる。
発明の背景 核酸プローブ技術における目標は、生物学的試料中に
存在するRNA、DNAまたは両者を含めた多種多様な他の核
酸種として比較して、通常は核酸配列、いわゆるターゲ
ット核酸が少量存在する試料中において、それら種々の
核酸を検出することである。従って、疾病または病的状
態に付随する可能性のあるポリペプチドをコードするRN
A、たとえばヒト免疫不全ウイルスのゲノムのRNAを検出
しうることが望ましい。これらのウイルスに付随するRN
Aを検出するほか、たとえば疾病または病的状態に特徴
的な他のRNA、たとえば血友病または鎌状赤血球貧血の
場合のように欠損遺伝子から転写されたものを検出する
ことも望ましい。特徴的に、これらの疾病または状態に
付随するRNAは、たとえ存在したとしても特定の生物学
的試料、たとえば被験個体の血液試料または体液もしく
は組織試料中の総核酸と比較して、極めて少量存在す
る。
存在するRNA、DNAまたは両者を含めた多種多様な他の核
酸種として比較して、通常は核酸配列、いわゆるターゲ
ット核酸が少量存在する試料中において、それら種々の
核酸を検出することである。従って、疾病または病的状
態に付随する可能性のあるポリペプチドをコードするRN
A、たとえばヒト免疫不全ウイルスのゲノムのRNAを検出
しうることが望ましい。これらのウイルスに付随するRN
Aを検出するほか、たとえば疾病または病的状態に特徴
的な他のRNA、たとえば血友病または鎌状赤血球貧血の
場合のように欠損遺伝子から転写されたものを検出する
ことも望ましい。特徴的に、これらの疾病または状態に
付随するRNAは、たとえ存在したとしても特定の生物学
的試料、たとえば被験個体の血液試料または体液もしく
は組織試料中の総核酸と比較して、極めて少量存在す
る。
これらのRNA種の検出には、そのRNAが存在する場合、
試料中でそれに付随する多種多様な他の核酸種のうちか
ら検出および測定しうることが要求される。これら非タ
ーゲット核酸種は、少なくとも分離されたセグメント中
ではターゲットRNAと密接な相同性をもつ可能性があ
る。さらに上記のように、これらのターゲットRNA種は
試験される生物学的試料中に極めて少量見出されるにす
ぎない場合がしばしばある。それにもかかわらず、内在
する疾病状態の適切な診断のためにはこのように少量の
ターゲットRNAですら、存在する場合には検出可能であ
ることが必要である。
試料中でそれに付随する多種多様な他の核酸種のうちか
ら検出および測定しうることが要求される。これら非タ
ーゲット核酸種は、少なくとも分離されたセグメント中
ではターゲットRNAと密接な相同性をもつ可能性があ
る。さらに上記のように、これらのターゲットRNA種は
試験される生物学的試料中に極めて少量見出されるにす
ぎない場合がしばしばある。それにもかかわらず、内在
する疾病状態の適切な診断のためにはこのように少量の
ターゲットRNAですら、存在する場合には検出可能であ
ることが必要である。
生物学的試料において極めて少量で、総核酸の副次画
分として存在するにすぎないターゲット核酸の信頼性の
ある検出を行うために、幾つかの方法が提示された。１
方法においては、試料中の核酸の量は変化させない。そ
の代わりに、リポーターシステムを採用し、これにより
試料中のターゲット核酸分子それぞれにつき多数の容易
に検出しうる分子が産生され、この検出可能な分子の存
在または量が測定される。このようなリポーターシステ
ムはターゲット核酸に付随するシグナル発生システムで
あり、試料中のターゲット核酸分子数を表す検出可能な
シグナルを発生する。
分として存在するにすぎないターゲット核酸の信頼性の
ある検出を行うために、幾つかの方法が提示された。１
方法においては、試料中の核酸の量は変化させない。そ
の代わりに、リポーターシステムを採用し、これにより
試料中のターゲット核酸分子それぞれにつき多数の容易
に検出しうる分子が産生され、この検出可能な分子の存
在または量が測定される。このようなリポーターシステ
ムはターゲット核酸に付随するシグナル発生システムで
あり、試料中のターゲット核酸分子数を表す検出可能な
シグナルを発生する。
基本的に異なる他の方法の場合、ターゲット核酸の一
部であるがアッセイすべき生物学的試料中の他の核酸の
一部ではないターゲット核酸セグメント、またはそのタ
ーゲットセグメントの相補体（すなわちターゲットセグ
メントと同一サイズであるが、配列が相補的であるセグ
メント）、またはターゲットセグメントおよびその相補
体の双方のコピー数を選択的に増加させる。すなわち試
料中において、ターゲット核酸セグメントもしくはその
相補体のコピー数、またはターゲットセグメントおよび
その相補体の双方のコピー数が、他のいずれかの核酸セ
グメントとコピー数より大幅に増加する。このコピー数
の選択的増加は、当技術分野でセグメントの“増幅”と
呼ばれる。ターゲットセグメント（ここでは、また当技
術分野で、“ターゲット配列”とも呼ばれる）またはタ
ーゲットセグメントの相補体が十分な程度に増幅される
と、これは核酸プローブ技術の分野で核酸セグメントの
検出のために開発された多数の方法のいずれかによって
信頼性をもって検出しうる。これには、ターゲット核酸
分子それぞれにつき多数の容易に検出しうる分子の産生
を伴う上記の第１法による方法も含まれる。
部であるがアッセイすべき生物学的試料中の他の核酸の
一部ではないターゲット核酸セグメント、またはそのタ
ーゲットセグメントの相補体（すなわちターゲットセグ
メントと同一サイズであるが、配列が相補的であるセグ
メント）、またはターゲットセグメントおよびその相補
体の双方のコピー数を選択的に増加させる。すなわち試
料中において、ターゲット核酸セグメントもしくはその
相補体のコピー数、またはターゲットセグメントおよび
その相補体の双方のコピー数が、他のいずれかの核酸セ
グメントとコピー数より大幅に増加する。このコピー数
の選択的増加は、当技術分野でセグメントの“増幅”と
呼ばれる。ターゲットセグメント（ここでは、また当技
術分野で、“ターゲット配列”とも呼ばれる）またはタ
ーゲットセグメントの相補体が十分な程度に増幅される
と、これは核酸プローブ技術の分野で核酸セグメントの
検出のために開発された多数の方法のいずれかによって
信頼性をもって検出しうる。これには、ターゲット核酸
分子それぞれにつき多数の容易に検出しうる分子の産生
を伴う上記の第１法による方法も含まれる。
ターゲットセグメントの増幅のために開発された１方
法は、いわゆる“ポリメラーゼ連鎖反応”（“PCR"）法
である。この方法はサイキ（Saiki）ら,Science230,135
0（1985）、ならびにムリスら，欧州特許出願公開第200
362および201184号明細書（米国特許第4683195および46
83202号明細書も参照されたい）に報告され、特に下記
の反復サイクルを伴う：（１）ターゲット核酸配列３′
−末端に第１プライマーを、ターゲット配列に相補的な
配列の３′−末端に第２プライマーをハイブリダイズ
し、（２）これらのプライマーをポリメラーゼにより延
長し、そして（３）この連鎖延長反応により得られた二
本鎖を一本鎖となす。このPCR法によりターゲット配列
およびその相補体がサイクル数に伴って指数的に増幅さ
れる（たとえば連鎖反応の場合のように）。
法は、いわゆる“ポリメラーゼ連鎖反応”（“PCR"）法
である。この方法はサイキ（Saiki）ら,Science230,135
0（1985）、ならびにムリスら，欧州特許出願公開第200
362および201184号明細書（米国特許第4683195および46
83202号明細書も参照されたい）に報告され、特に下記
の反復サイクルを伴う：（１）ターゲット核酸配列３′
−末端に第１プライマーを、ターゲット配列に相補的な
配列の３′−末端に第２プライマーをハイブリダイズ
し、（２）これらのプライマーをポリメラーゼにより延
長し、そして（３）この連鎖延長反応により得られた二
本鎖を一本鎖となす。このPCR法によりターゲット配列
およびその相補体がサイクル数に伴って指数的に増幅さ
れる（たとえば連鎖反応の場合のように）。
特定のRNAは特定のポリメラーゼ、たとえば細菌ファ
ージRNA依存性RNAポリメラーゼ、たとえばＱβプリカー
ゼによる自触媒複製を受けやすいことが知られている。
これらのRNAをこの場合“鋳型配列”をもつと言う。こ
れはそれらがポリメラーゼによる複製の鋳型となる配列
を含むことを意味する。この方法で鋳型RNA（すなわち
“鋳型配列”を含むRNA）からレプリカーゼにより触媒
された反応において生成したRNAも、複製可能なRNAであ
る（すなわち同様に“鋳型配列”を含む）。こうして自
触媒複製においては、複製可能なRNAの量は指数的に増
加する。ミーレ（Miele）ら,J.Molecular Biology171,
281（1983）に参照されたい。
ージRNA依存性RNAポリメラーゼ、たとえばＱβプリカー
ゼによる自触媒複製を受けやすいことが知られている。
これらのRNAをこの場合“鋳型配列”をもつと言う。こ
れはそれらがポリメラーゼによる複製の鋳型となる配列
を含むことを意味する。この方法で鋳型RNA（すなわち
“鋳型配列”を含むRNA）からレプリカーゼにより触媒
された反応において生成したRNAも、複製可能なRNAであ
る（すなわち同様に“鋳型配列”を含む）。こうして自
触媒複製においては、複製可能なRNAの量は指数的に増
加する。ミーレ（Miele）ら,J.Molecular Biology171,
281（1983）に参照されたい。
最近まで、生物学的試料を特定の核酸配列の存在につ
き分析するための簡便な、利用範囲の広い高感度リポー
ターシステムを得るために自触媒複製を利用しうること
は認識されていなかった。ターゲット配列に対するプロ
ーブがＱβレプリカーゼにより複製されるRNAに結合し
たシステムは国際特許出願公開第87/06270号明細書およ
びチュ（Chu）ら,Nucleic Acids Research14,5591（1
986）に記載されている。たとえばこの国際特許出願公
開明細書に記載された発明は、RNA複製技術とオリゴヌ
クレオチドハイブリダイゼーションプローブ技術とを、
ターゲットセグメントに会合する（プローブを通して）
複製可能なRNAの複製増幅によりターゲット核酸を検出
することによって結びつけたものである。
き分析するための簡便な、利用範囲の広い高感度リポー
ターシステムを得るために自触媒複製を利用しうること
は認識されていなかった。ターゲット配列に対するプロ
ーブがＱβレプリカーゼにより複製されるRNAに結合し
たシステムは国際特許出願公開第87/06270号明細書およ
びチュ（Chu）ら,Nucleic Acids Research14,5591（1
986）に記載されている。たとえばこの国際特許出願公
開明細書に記載された発明は、RNA複製技術とオリゴヌ
クレオチドハイブリダイゼーションプローブ技術とを、
ターゲットセグメントに会合する（プローブを通して）
複製可能なRNAの複製増幅によりターゲット核酸を検出
することによって結びつけたものである。
選ばれた形態としての本発明の目的は、ターゲットRN
A配列の検出を容易にするために増幅のための基本的RNA
複製法をさらに利用し、これにより必ずしも温度サイク
ルを必要とすることなく指数的なコピー産生を達成する
ことである。ターゲットは試料中に存在する場合、増幅
されたのちに初めて検出されるのであるから、本発明の
他の目的は、増幅された生成物中にターゲット配列が保
持されるのを保証するために、偽陽性の存在を避けるか
または少なくとも実質的に減少させる方法を用いたRNA
検出法を利用することである。本発明の他の目的は、対
応するターゲットRNAを検出および測定するための手段
として、複製法および延長生成物法の利点を組み合わせ
ることである。
A配列の検出を容易にするために増幅のための基本的RNA
複製法をさらに利用し、これにより必ずしも温度サイク
ルを必要とすることなく指数的なコピー産生を達成する
ことである。ターゲットは試料中に存在する場合、増幅
されたのちに初めて検出されるのであるから、本発明の
他の目的は、増幅された生成物中にターゲット配列が保
持されるのを保証するために、偽陽性の存在を避けるか
または少なくとも実質的に減少させる方法を用いたRNA
検出法を利用することである。本発明の他の目的は、対
応するターゲットRNAを検出および測定するための手段
として、複製法および延長生成物法の利点を組み合わせ
ることである。
本発明の基本的目的は、プローブ配列、およびRNA鋳
型指令によるプライマー開始−RNA鎖合成（ならびに自
触媒複製の開始）に関してRNA依存性RNAポリメラーゼ
（レプリカーゼ）により操作的に（operatively）認識
されるものである配列を保有する第１ヌクレオチド配列
を、第２プローブ配列、および同様にRNA鋳型指令によ
るプライマー開始−RNA鎖合成（ならびに自触媒複製の
開始）に関してRNA依存性ポリメラーゼにより操作的に
認識されるものである配列を保有する第２の会合ヌクレ
オチド配列と組み合わせて使用し、これにより第１配列
の延長生成物が第２配列の延長生成物の産生のための鋳
型として用いられ、後者の延長生成物はそのままで、ま
たは鎖が脱会合した形で、上記RNA依存性RNAポリメラー
ゼの適宜な影響に際して複製されうるものである。従っ
て本発明は、RNAターゲット配列が被験試料中に存在し
た場合にのみ報告し、その増幅成分が温度サイクルの必
要なしに指数的に作動する増幅／検出システムに関す
る。従って本発明の好ましい目的は、意図する現存ター
ゲットRNA配列への最初のハイブリダイゼーションの実
施により、存在するターゲット核酸配列に対応する特定
の延長生成物が産生され、これが後続生成物を誘導し、
これは複製により増幅されて複数のRNAセグメントを生
じやすく、これをたとえば真性ターゲット配列とのハイ
ブリダイゼーションにより、および／または所望により
それらの検出、測定に寄与しうるシグナルグループ（す
なわちそれ自体検出可能な、または適切な化学反応によ
り検出可能な分子になりうるリポーターグループ）との
会合により検出および測定することである。
型指令によるプライマー開始−RNA鎖合成（ならびに自
触媒複製の開始）に関してRNA依存性RNAポリメラーゼ
（レプリカーゼ）により操作的に（operatively）認識
されるものである配列を保有する第１ヌクレオチド配列
を、第２プローブ配列、および同様にRNA鋳型指令によ
るプライマー開始−RNA鎖合成（ならびに自触媒複製の
開始）に関してRNA依存性ポリメラーゼにより操作的に
認識されるものである配列を保有する第２の会合ヌクレ
オチド配列と組み合わせて使用し、これにより第１配列
の延長生成物が第２配列の延長生成物の産生のための鋳
型として用いられ、後者の延長生成物はそのままで、ま
たは鎖が脱会合した形で、上記RNA依存性RNAポリメラー
ゼの適宜な影響に際して複製されうるものである。従っ
て本発明は、RNAターゲット配列が被験試料中に存在し
た場合にのみ報告し、その増幅成分が温度サイクルの必
要なしに指数的に作動する増幅／検出システムに関す
る。従って本発明の好ましい目的は、意図する現存ター
ゲットRNA配列への最初のハイブリダイゼーションの実
施により、存在するターゲット核酸配列に対応する特定
の延長生成物が産生され、これが後続生成物を誘導し、
これは複製により増幅されて複数のRNAセグメントを生
じやすく、これをたとえば真性ターゲット配列とのハイ
ブリダイゼーションにより、および／または所望により
それらの検出、測定に寄与しうるシグナルグループ（す
なわちそれ自体検出可能な、または適切な化学反応によ
り検出可能な分子になりうるリポーターグループ）との
会合により検出および測定することである。
従って本発明の全体的な目的は、当技術分野で枚挙さ
れている目標に対処し、先行技術者の試みが遭遇する欠
点および問題に対処する選択的手段を提供することであ
る。本発明は、複製による増幅ののち、必要なターゲッ
ト核酸配列が被験試料中に存在する場合にのみ存在する
リポーター分子を用いる。本発明は、核酸配列を用い、
これはハイブリダイゼーションポテンシャル、レプリカ
ーゼにより触媒される連鎖延長、最終的には自触媒複製
による増幅に対して感受性である配列のみを含み、それ
以上含まないことが必要である。従って本発明は、ター
ゲットRNA配列自体の存在にのみ応答するターゲット核
酸配列検出法を提供する。本発明はさらに、受容しうる
程度の短期間で再現性をもって用いることができ、既知
試薬の簡便さを利用し、かつ一貫した科学的結果に到達
するのに必要な精度を備えた直接的手法；再現性のある
アッセイセッティングに用いることができ、実験室／臨
床分析キット用に調整しうる手法を提供する。従って本
発明の目的は、インビトロまたはエクスビボシステムに
おけるターゲット配列の存在に付随する配列を増幅させ
ることにより特定のRNA配列（ターゲットセグメント）
の検出性を高めることであり、その好ましい形態はレプ
リカーゼによる天然の連鎖延長および複製プロセスを利
用し、ターゲット核酸配列が存在した場合にのみ測定可
能であるという独自の特色をそなえている。
れている目標に対処し、先行技術者の試みが遭遇する欠
点および問題に対処する選択的手段を提供することであ
る。本発明は、複製による増幅ののち、必要なターゲッ
ト核酸配列が被験試料中に存在する場合にのみ存在する
リポーター分子を用いる。本発明は、核酸配列を用い、
これはハイブリダイゼーションポテンシャル、レプリカ
ーゼにより触媒される連鎖延長、最終的には自触媒複製
による増幅に対して感受性である配列のみを含み、それ
以上含まないことが必要である。従って本発明は、ター
ゲットRNA配列自体の存在にのみ応答するターゲット核
酸配列検出法を提供する。本発明はさらに、受容しうる
程度の短期間で再現性をもって用いることができ、既知
試薬の簡便さを利用し、かつ一貫した科学的結果に到達
するのに必要な精度を備えた直接的手法；再現性のある
アッセイセッティングに用いることができ、実験室／臨
床分析キット用に調整しうる手法を提供する。従って本
発明の目的は、インビトロまたはエクスビボシステムに
おけるターゲット配列の存在に付随する配列を増幅させ
ることにより特定のRNA配列（ターゲットセグメント）
の検出性を高めることであり、その好ましい形態はレプ
リカーゼによる天然の連鎖延長および複製プロセスを利
用し、ターゲット核酸配列が存在した場合にのみ測定可
能であるという独自の特色をそなえている。
発明の要約 本発明は、下記よりなる第１ヌクレオチド配列を新規
な様式で使用することに基づく：（１）ターゲットRNA
配列のセグメントとのハイブリダイゼーションに適した
プローブ配列、および（ii）該プローブ配列の５′−末
端から５′−方向に伸びた、レプリカーゼにより自触媒
複製プロセスを開始しうるが、かつこれによりRNA鋳型
指令−RNAプライマー開始−連鎖延長反応をも開始しう
る配列である第１配列。この第１配列はここでは第２ヌ
クレオチド配列との組み合わせにおいて作動し、この第
２ヌクレオチド配列は下記よりなる：（ｉ）第１ヌクレ
オチド配列のストランド分離した（strand−separate
d）延長生成物に第１ヌクレオチド配列からの延長生成
物の“反対側末端”（より厳密には、これはこの延長生
成物のセグメントにおいて、第１ヌクレオチド配列の
３′−末端から３′−側を意味し、これは延長生成物の
５′−末端にある）においてハイブリダイズするのに適
した第２プローブ配列、および（ii）第２プローブ配列
の５′−末端から５′−方向に伸びた、同様にレプリカ
ーゼにより自触媒複製プロセスを開始しうる、かつこれ
によりRNA鋳型指令−RNAプライマー開始連鎖延長反応を
も開始しうる配列である第２配列。ターゲット配列につ
きアッセイすべき試料中にターゲット配列が存在した場
合、第１配列がこれにハイブリダイズしたのち、第１配
列はレプリカーゼにより触媒された連鎖延長反応におい
て延長される。次いで延長生成物はターゲット配列を含
むターゲット核酸から分離され、このストランド分離さ
れた延長生成物に第２配列がハイブリダイズし、レプリ
カーゼによる第２の連鎖延長反応において延長される。
次いで第２延長の生成物は（そのまま、または必要に応
じてストランド分離された形で）本発明の増幅プロセス
においてレプリカーゼの存在下に自触媒複製される。次
いでこの増幅された複製物が、それ自体当業者に知られ
ている多数の方法のいずれかによって検出および測定さ
れる（たとえば国際特許出願公開第87/06270号明細書、
参照）。
な様式で使用することに基づく：（１）ターゲットRNA
配列のセグメントとのハイブリダイゼーションに適した
プローブ配列、および（ii）該プローブ配列の５′−末
端から５′−方向に伸びた、レプリカーゼにより自触媒
複製プロセスを開始しうるが、かつこれによりRNA鋳型
指令−RNAプライマー開始−連鎖延長反応をも開始しう
る配列である第１配列。この第１配列はここでは第２ヌ
クレオチド配列との組み合わせにおいて作動し、この第
２ヌクレオチド配列は下記よりなる：（ｉ）第１ヌクレ
オチド配列のストランド分離した（strand−separate
d）延長生成物に第１ヌクレオチド配列からの延長生成
物の“反対側末端”（より厳密には、これはこの延長生
成物のセグメントにおいて、第１ヌクレオチド配列の
３′−末端から３′−側を意味し、これは延長生成物の
５′−末端にある）においてハイブリダイズするのに適
した第２プローブ配列、および（ii）第２プローブ配列
の５′−末端から５′−方向に伸びた、同様にレプリカ
ーゼにより自触媒複製プロセスを開始しうる、かつこれ
によりRNA鋳型指令−RNAプライマー開始連鎖延長反応を
も開始しうる配列である第２配列。ターゲット配列につ
きアッセイすべき試料中にターゲット配列が存在した場
合、第１配列がこれにハイブリダイズしたのち、第１配
列はレプリカーゼにより触媒された連鎖延長反応におい
て延長される。次いで延長生成物はターゲット配列を含
むターゲット核酸から分離され、このストランド分離さ
れた延長生成物に第２配列がハイブリダイズし、レプリ
カーゼによる第２の連鎖延長反応において延長される。
次いで第２延長の生成物は（そのまま、または必要に応
じてストランド分離された形で）本発明の増幅プロセス
においてレプリカーゼの存在下に自触媒複製される。次
いでこの増幅された複製物が、それ自体当業者に知られ
ている多数の方法のいずれかによって検出および測定さ
れる（たとえば国際特許出願公開第87/06270号明細書、
参照）。
本発明のターゲット配列認識／増幅プロセス観点の実
施に関する代表例について、本明細書の第１図を参照さ
れたい。
施に関する代表例について、本明細書の第１図を参照さ
れたい。
１形態においては、本発明な新規な共同機能性（cofu
nctioning）ヌクレオチド配列、よれらの調製および使
用、すなわち上記に述べた、かつ下記に述べる第１およ
び第２ヌクレオチド配列を目的とする。
nctioning）ヌクレオチド配列、よれらの調製および使
用、すなわち上記に述べた、かつ下記に述べる第１およ
び第２ヌクレオチド配列を目的とする。
他の形態においては、本発明は第１ヌクレオチド配列
とターゲットまたは第２ヌクレオチド配列延長生成物と
のハイブリダイゼーションののち、このターゲットまた
は第２ヌクレオチド配列延長生成物を鋳型として形成さ
れた第１ヌクレオチド配列延長生成物、および第２ヌク
レオチド配列とストランド分離された第１延長生成物の
１本のストランド（第２ヌクレオチド配列がこれに第２
プローブ配列によってハイブリダイズしうる）とのハイ
ブリダイゼーションののち形成された第２ヌクレオチド
配列延長生成物を目的とする。
とターゲットまたは第２ヌクレオチド配列延長生成物と
のハイブリダイゼーションののち、このターゲットまた
は第２ヌクレオチド配列延長生成物を鋳型として形成さ
れた第１ヌクレオチド配列延長生成物、および第２ヌク
レオチド配列とストランド分離された第１延長生成物の
１本のストランド（第２ヌクレオチド配列がこれに第２
プローブ配列によってハイブリダイズしうる）とのハイ
ブリダイゼーションののち形成された第２ヌクレオチド
配列延長生成物を目的とする。
ここで言う延長生成物は、適宜なRNA依存性RNAポリメ
ラーゼにより触媒され、NTPの存在下に行われる連鎖延
長反応において形成される。好ましい形態においては、
これらの延長反応および自触媒複製プロセスは同一レプ
リカーゼ、すなわちＱ−ベータレプリカーゼにより行わ
れ、その場合この酵素により認識される配列は第１ヌク
レオチド配列の延長生成物にハイブリダイズした（たと
えばターゲット配列にハイブリダイズした）第２ヌクレ
オチド配列の延長生成物の一部である。
ラーゼにより触媒され、NTPの存在下に行われる連鎖延
長反応において形成される。好ましい形態においては、
これらの延長反応および自触媒複製プロセスは同一レプ
リカーゼ、すなわちＱ−ベータレプリカーゼにより行わ
れ、その場合この酵素により認識される配列は第１ヌク
レオチド配列の延長生成物にハイブリダイズした（たと
えばターゲット配列にハイブリダイズした）第２ヌクレ
オチド配列の延長生成物の一部である。
レプリカーゼ認識配列を含む自触媒複製物はそれ自体
既知の方法で、たとえば自触媒複製の過程で取り込まれ
た、または検出可能な状態に標識された少なくともター
ゲット配列のサブ配列もしくはそのサブ配列の相補体を
含むオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼー
ションにより取り込まれた、発色団部分または放射性部
分によって検出および測定される。
既知の方法で、たとえば自触媒複製の過程で取り込まれ
た、または検出可能な状態に標識された少なくともター
ゲット配列のサブ配列もしくはそのサブ配列の相補体を
含むオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼー
ションにより取り込まれた、発色団部分または放射性部
分によって検出および測定される。
あらゆる観点において本発明は、相補的RNA配列のハ
イブリダイゼーション、レプリカーゼにより触媒された
RNA鋳型上におけるRNAプライマーの連鎖延長（たとえば
ブルナキス（Vournakis）ら,Biochem.Biophys.Res.Comm
un.70.774（1976）、参照）、組み換えRNAを含めた多数
のRNAの、レプリカーゼによる自触媒複製（たとえばミ
ーレら，前掲；米国特許第4,786,600号明細書、参照）
という自然の原理を、核酸混合物を含有する生物学的試
料中に存在する可能性のあるターゲットRNA配列または
ターゲットRNAを増幅して検出および測定可能なものに
するために新規に利用することを目的とする。
イブリダイゼーション、レプリカーゼにより触媒された
RNA鋳型上におけるRNAプライマーの連鎖延長（たとえば
ブルナキス（Vournakis）ら,Biochem.Biophys.Res.Comm
un.70.774（1976）、参照）、組み換えRNAを含めた多数
のRNAの、レプリカーゼによる自触媒複製（たとえばミ
ーレら，前掲；米国特許第4,786,600号明細書、参照）
という自然の原理を、核酸混合物を含有する生物学的試
料中に存在する可能性のあるターゲットRNA配列または
ターゲットRNAを増幅して検出および測定可能なものに
するために新規に利用することを目的とする。
さらに本発明は、これらの原理に基づくアッセイシス
テムのための方法および手段、ならびにターゲットRNA
配列を検出または測定するためのアッセイ法に必要な成
分を含む、実験室用および臨床用セッティングを含めた
キットを目的とする。
テムのための方法および手段、ならびにターゲットRNA
配列を検出または測定するためのアッセイ法に必要な成
分を含む、実験室用および臨床用セッティングを含めた
キットを目的とする。
従って本発明は、核酸を含有する試料中の少なくとも
１種類の特異的RNAターゲットを検出するための方法を
提供するものであって、該RNAターゲットはターゲット
配列を含み、本方法は複製可能な延長生成物（またはそ
の相補体）を検出することよりなり、該生成物はターゲ
ットRNAからストランド分離された第1RNA延長生成物と
ハイブリダイズした第２リボヌクレオチド（すなわちRN
A）配列からの延長生成物であり、これはターゲット配
列の３′−末端とハイブリダイズした第１リボヌクレオ
チド配列からの第１延長生成物の合成のための鋳型とな
る。本方法において第１リボヌクレオチド配列は下記よ
りなる：ターゲット配列の３′−末端のサブ配列に相補
的な第１プローブ配列、およびプローブ配列の５′−末
端リボヌクレオチドから５′側にあり、これと連続した
（すなわち１個のホスフェートを通して結合している）
第１複製開始配列であって（ａ）ターゲットRNA配列を
鋳型として用いてプローブ配列の３′−末端からRNA合
成（すなわち連鎖延長）するプロセスの開始のためにレ
プリカーゼにより認識され、かつ（ｂ）レプリカーゼに
より自触媒複製されうるRNAの５′−末端を含む部分で
あるもの。さらに第２リボヌクレオチド配列は下記より
なる：（１）ターゲット配列の５′−末端におけるサブ
配列（この５′−サブ配列は、第１プローブ配列がその
相補体である３′−サブ配列とオーバーラップしない）
と同一の配列であり、従ってターゲットRNAにハイブリ
ダイズした第１リボヌクレオチド配列からの延長生成物
のサブ配列のものに対する相補体である配列であって、
このサブ配列の５′−末端は該延長生成物中の第１ヌク
レオチド配列の３′−末端から３′側にある；および
（２）第２プローブ配列から５′側にあり、これと連続
した第２複製開始配列であって（ａ）ターゲットRNA配
列の相補体を鋳型として用いて第２プローブ配列の３′
−末端からRNA合成（すなわち連鎖延長）するプロセス
の開始のためにレプリカーゼにより認識され、かつ
（ｂ）レプリカーゼにより自触媒複製されうるRNAの
５′−末端を含む部分であり、ただしその３′−末端に
おいて１個のホスフェートを通して第１複製開始配列の
相補体の５′−末端に結合している第２複製開始配列か
らなるRNAはレプリカーゼにより自触媒複製可能であ
り、さらにこの自触媒複製可能なRNAから、第２複製開
始配列の３′−末端と第１複製開始配列の相補体の５′
−末端との間にRNAセグメントを挿入することにより形
成されたRNAもレプリカーゼにより自触媒複製可能であ
る。第２ヌクレオチドの複製可能な延長生成物は、レプ
リカーゼにより触媒された自触媒複製によって、ターゲ
ット配列を増幅する機能をもつ。第２ヌクレオチド配列
の複製可能な延長生成物および該延長生成物の相補体
は、自触媒複製可能であることにより、ターゲット配列
および付随するターゲットRNAに対するリポーター分子
としても作用する。
１種類の特異的RNAターゲットを検出するための方法を
提供するものであって、該RNAターゲットはターゲット
配列を含み、本方法は複製可能な延長生成物（またはそ
の相補体）を検出することよりなり、該生成物はターゲ
ットRNAからストランド分離された第1RNA延長生成物と
ハイブリダイズした第２リボヌクレオチド（すなわちRN
A）配列からの延長生成物であり、これはターゲット配
列の３′−末端とハイブリダイズした第１リボヌクレオ
チド配列からの第１延長生成物の合成のための鋳型とな
る。本方法において第１リボヌクレオチド配列は下記よ
りなる：ターゲット配列の３′−末端のサブ配列に相補
的な第１プローブ配列、およびプローブ配列の５′−末
端リボヌクレオチドから５′側にあり、これと連続した
（すなわち１個のホスフェートを通して結合している）
第１複製開始配列であって（ａ）ターゲットRNA配列を
鋳型として用いてプローブ配列の３′−末端からRNA合
成（すなわち連鎖延長）するプロセスの開始のためにレ
プリカーゼにより認識され、かつ（ｂ）レプリカーゼに
より自触媒複製されうるRNAの５′−末端を含む部分で
あるもの。さらに第２リボヌクレオチド配列は下記より
なる：（１）ターゲット配列の５′−末端におけるサブ
配列（この５′−サブ配列は、第１プローブ配列がその
相補体である３′−サブ配列とオーバーラップしない）
と同一の配列であり、従ってターゲットRNAにハイブリ
ダイズした第１リボヌクレオチド配列からの延長生成物
のサブ配列のものに対する相補体である配列であって、
このサブ配列の５′−末端は該延長生成物中の第１ヌク
レオチド配列の３′−末端から３′側にある；および
（２）第２プローブ配列から５′側にあり、これと連続
した第２複製開始配列であって（ａ）ターゲットRNA配
列の相補体を鋳型として用いて第２プローブ配列の３′
−末端からRNA合成（すなわち連鎖延長）するプロセス
の開始のためにレプリカーゼにより認識され、かつ
（ｂ）レプリカーゼにより自触媒複製されうるRNAの
５′−末端を含む部分であり、ただしその３′−末端に
おいて１個のホスフェートを通して第１複製開始配列の
相補体の５′−末端に結合している第２複製開始配列か
らなるRNAはレプリカーゼにより自触媒複製可能であ
り、さらにこの自触媒複製可能なRNAから、第２複製開
始配列の３′−末端と第１複製開始配列の相補体の５′
−末端との間にRNAセグメントを挿入することにより形
成されたRNAもレプリカーゼにより自触媒複製可能であ
る。第２ヌクレオチドの複製可能な延長生成物は、レプ
リカーゼにより触媒された自触媒複製によって、ターゲ
ット配列を増幅する機能をもつ。第２ヌクレオチド配列
の複製可能な延長生成物および該延長生成物の相補体
は、自触媒複製可能であることにより、ターゲット配列
および付随するターゲットRNAに対するリポーター分子
としても作用する。
本発明は複製（すなわち自触媒複製）の使用を有利に
組み合わせたものであり、従ってPCRなどの方法に必要
な温度サイクル無しで、複製核酸を選択的かつ指数的に
成長させることができ、この複製可能な生成物中にター
ゲットRNA配列が含まれ、これによりターゲット分子そ
れぞれに対するリポーター分子数のみでなく、ターゲッ
ト配列も増幅される。また本発明は、RNA依存性RNAポリ
メラーゼ、たとえばＱ−ベータレプリカーゼが、RNAを
鋳型として用いてプライマーからRNAを合成しかつRNAを
自触媒複製する両方の機能をもつことを有利に利用し、
これにより単一の酵素を用いてターゲットの増幅および
リポーター分子の生成を行うものである。
組み合わせたものであり、従ってPCRなどの方法に必要
な温度サイクル無しで、複製核酸を選択的かつ指数的に
成長させることができ、この複製可能な生成物中にター
ゲットRNA配列が含まれ、これによりターゲット分子そ
れぞれに対するリポーター分子数のみでなく、ターゲッ
ト配列も増幅される。また本発明は、RNA依存性RNAポリ
メラーゼ、たとえばＱ−ベータレプリカーゼが、RNAを
鋳型として用いてプライマーからRNAを合成しかつRNAを
自触媒複製する両方の機能をもつことを有利に利用し、
これにより単一の酵素を用いてターゲットの増幅および
リポーター分子の生成を行うものである。
本発明の形態はさらに、自触媒複製による生成物を検
出し、その量を測定し、これにより分析される試料中に
存在するターゲットRNAの量をも判定するための手段で
ある。
出し、その量を測定し、これにより分析される試料中に
存在するターゲットRNAの量をも判定するための手段で
ある。
１観点において本発明は、核酸を含有する試料中の少
なくとも１種類の特異的RNAターゲット配列を検出する
ために有用な、下記を含む方法を目的とする： 該ターゲットRNA配列と、プローブ配列（配列が該タ
ーゲット配列のセグメントに対応する）および機能的長
さの配列（これは適宜なRNA依存性RNAポリメラーゼと会
合した際に複製されうるものの相補体である）からなる
ヌクレオチド配列とを、適切な条件下でハイブリダイズ
し、 このハイブリダイズしたヌクレオチド配列を連鎖延長
し、 延長生成物をストランド分離し、 前工程で分離された複製可能なものの相補体である配
列を含むストランドと、第２ヌクレオチド配列（上記の
分離されたストランドとターゲット配列の相補体である
配列の反対側末端においてハイブリダイズしうる配列、
および適宜なRNA依存性RNAポリメラーゼと会合した際に
複製されうるものの相補体である機能的長さの配列から
なる）とをハイブリダイズし、 このハイブリダイズした第２ヌクレオチド配列を連鎖
延長し、 前工程の第２延長生成物を、所望によりストランド分
離後に、適宜なRNA依存性RNAポリメラーゼとの接触によ
り操作的に複製させ、そして 複製物を検出する。
なくとも１種類の特異的RNAターゲット配列を検出する
ために有用な、下記を含む方法を目的とする： 該ターゲットRNA配列と、プローブ配列（配列が該タ
ーゲット配列のセグメントに対応する）および機能的長
さの配列（これは適宜なRNA依存性RNAポリメラーゼと会
合した際に複製されうるものの相補体である）からなる
ヌクレオチド配列とを、適切な条件下でハイブリダイズ
し、 このハイブリダイズしたヌクレオチド配列を連鎖延長
し、 延長生成物をストランド分離し、 前工程で分離された複製可能なものの相補体である配
列を含むストランドと、第２ヌクレオチド配列（上記の
分離されたストランドとターゲット配列の相補体である
配列の反対側末端においてハイブリダイズしうる配列、
および適宜なRNA依存性RNAポリメラーゼと会合した際に
複製されうるものの相補体である機能的長さの配列から
なる）とをハイブリダイズし、 このハイブリダイズした第２ヌクレオチド配列を連鎖
延長し、 前工程の第２延長生成物を、所望によりストランド分
離後に、適宜なRNA依存性RNAポリメラーゼとの接触によ
り操作的に複製させ、そして 複製物を検出する。
本発明の使用形態は、上記の複製物をたとえばそれ自
体既知の放射性もしくは発色団標識またはハイブリダイ
ゼーション技術により検出することである。
体既知の放射性もしくは発色団標識またはハイブリダイ
ゼーション技術により検出することである。
本発明は、ターゲット配列が遺伝性または病原性の疾
病または状態の特性を伴うものである試料、特にターゲ
ットRNA配列がヒトウイルスRNAのセグメントまたは欠損
遺伝子の転写体もしくは正常な遺伝子の欠損転写体であ
るものにおけるRNAターゲット配列の検出を包含する。
病または状態の特性を伴うものである試料、特にターゲ
ットRNA配列がヒトウイルスRNAのセグメントまたは欠損
遺伝子の転写体もしくは正常な遺伝子の欠損転写体であ
るものにおけるRNAターゲット配列の検出を包含する。
遺伝子欠損の直接的結果であるか、または特定の対立
遺伝子の存在と相関するヒトの疾病は多数である。たと
えば本明細書に記載する方法は、ごく少量の核酸試料中
に特定のターゲットが存在するか否かを判定するために
用いることができる。これは、対応するmRNAの検出によ
り遺伝的障害を診断する際、またはウイルス感染、たと
えばHIV−１の存在を検査する際に有用であろう。
遺伝子の存在と相関するヒトの疾病は多数である。たと
えば本明細書に記載する方法は、ごく少量の核酸試料中
に特定のターゲットが存在するか否かを判定するために
用いることができる。これは、対応するmRNAの検出によ
り遺伝的障害を診断する際、またはウイルス感染、たと
えばHIV−１の存在を検査する際に有用であろう。
本発明は、連鎖延長および複製の両方を行いうる適宜
なRNA依存性RNAポリメラーゼ（レプリカーゼ）酵素の使
用を包含する。好ましい形態においては、Ｑ−ベータレ
プリカーゼ酵素を用いて好都合な、いわゆるシングルポ
ット反応において両機能を達成する。
なRNA依存性RNAポリメラーゼ（レプリカーゼ）酵素の使
用を包含する。好ましい形態においては、Ｑ−ベータレ
プリカーゼ酵素を用いて好都合な、いわゆるシングルポ
ット反応において両機能を達成する。
本発明は、核酸を含有する試料中の少なくとも１種類
の特異的RNAターゲット配列を本発明に従うターゲットR
NA配列増幅ののち検出するのに有用なアッセイシステ
ム、およびそれを実施するキットをも目的とする。キッ
トはレプリカーゼ、前記に従って増幅を行うための第１
ヌクレオチド配列、前記に従って増幅を行うための第２
ヌクレオチド配列、および増幅された生成物を検出する
ために、またはそれに検出性を付与するために必要な組
成物を含む。
の特異的RNAターゲット配列を本発明に従うターゲットR
NA配列増幅ののち検出するのに有用なアッセイシステ
ム、およびそれを実施するキットをも目的とする。キッ
トはレプリカーゼ、前記に従って増幅を行うための第１
ヌクレオチド配列、前記に従って増幅を行うための第２
ヌクレオチド配列、および増幅された生成物を検出する
ために、またはそれに検出性を付与するために必要な組
成物を含む。
発明の詳細な説明 1.図面の簡単な説明 第１図は本発明の１観点、すなわちそれの一本鎖また
は二本鎖RNAを増幅用鋳型として用いたターゲット増幅
における工程を模式的に表す。延長および増幅は、たと
えばＱ−ベータポリメラーゼ（レプリカーゼ）を用いて
行われる。Ｔ（ターゲット）はセグメント状でTLTMTRと
再表示される。配列QLTLおよびTR′QR′は分子クローニ
ングおよび後続のインビトロ転写により得られる。自触
媒複製による増幅に必要な鋳型は図示されるようにハイ
ブリダイゼーション、延長、再ハイブリダイゼーション
および再延長により得られる。Ｑ−配列が連鎖延長およ
び複製の開始のためのＱ−ベータ配列である場合、Ｑ−
ベータレプリカーゼが連鎖延長し、次いで複製する。
は二本鎖RNAを増幅用鋳型として用いたターゲット増幅
における工程を模式的に表す。延長および増幅は、たと
えばＱ−ベータポリメラーゼ（レプリカーゼ）を用いて
行われる。Ｔ（ターゲット）はセグメント状でTLTMTRと
再表示される。配列QLTLおよびTR′QR′は分子クローニ
ングおよび後続のインビトロ転写により得られる。自触
媒複製による増幅に必要な鋳型は図示されるようにハイ
ブリダイゼーション、延長、再ハイブリダイゼーション
および再延長により得られる。Ｑ−配列が連鎖延長およ
び複製の開始のためのＱ−ベータ配列である場合、Ｑ−
ベータレプリカーゼが連鎖延長し、次いで複製する。
2.一般法および定義 本発明の基本技術、たとえば下記を実施するための定
義および方法ならびに手段を含む標準的な分子生物学の
テキストブックが参照される： RNAプローブまたはプライマーの調製、これは発現ベ
クターにおけるコーディングDNAの転写、およびそのま
まで、もしくは他のRNAに結合した状態で本発明におけ
るプローブ用として適切なものにそれらを適合させるこ
と（tailoring）を含む； ハイブリダイゼーションに用いるための異なる機能性
配列を含むヌクレオチドの調製； ハイブリダイゼーションの方法、これはターゲットRN
A配列に対するプライマーの相同性の程度に応じてハイ
ブリダイゼーションの確実性を増減させるためにストリ
ンジェンシー条件を変化させることを含む； 連鎖延長反応を行うことができ、かつ前記の複製可能
な配列を認識しうるRNAポリメラーゼの同定、分離また
は調製； RNA依存性RNAポリメラーゼおよびNTPの使用を含め
た、延長反応の開始および維持を助成する条件； 自触媒（ここでは時に“誘導された”と称する）複製
の機構および方法；その他。
義および方法ならびに手段を含む標準的な分子生物学の
テキストブックが参照される： RNAプローブまたはプライマーの調製、これは発現ベ
クターにおけるコーディングDNAの転写、およびそのま
まで、もしくは他のRNAに結合した状態で本発明におけ
るプローブ用として適切なものにそれらを適合させるこ
と（tailoring）を含む； ハイブリダイゼーションに用いるための異なる機能性
配列を含むヌクレオチドの調製； ハイブリダイゼーションの方法、これはターゲットRN
A配列に対するプライマーの相同性の程度に応じてハイ
ブリダイゼーションの確実性を増減させるためにストリ
ンジェンシー条件を変化させることを含む； 連鎖延長反応を行うことができ、かつ前記の複製可能
な配列を認識しうるRNAポリメラーゼの同定、分離また
は調製； RNA依存性RNAポリメラーゼおよびNTPの使用を含め
た、延長反応の開始および維持を助成する条件； 自触媒（ここでは時に“誘導された”と称する）複製
の機構および方法；その他。
たとえばマニアチス（Maniatis）ら,Molecular Clon
ing:A Laboratory Manual,コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー、ニューヨーク（1982）、および
コロウィック（Colowick）ら,Methods in Enzymology
Volume152、アカデミック・プレス社（1987）、なら
びにそこに引用される各種文献を参照されたい。
ing:A Laboratory Manual,コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー、ニューヨーク（1982）、および
コロウィック（Colowick）ら,Methods in Enzymology
Volume152、アカデミック・プレス社（1987）、なら
びにそこに引用される各種文献を参照されたい。
上記刊行物はすべてこの参照によりここに正確に引用
される。
される。
本明細書において“プローブ”という語は、ターゲッ
ト配列と十分な相同性をもち、従って適切なハイブリダ
イゼーション条件下でターゲット配列とハイブリダイズ
しうる、すなわち結合しうるRNA配列を意味する。一般
的なプローブは少なくとも約10ヌクレオチドの長さであ
り、極めて好ましくは25ヌクレオチド塩基以上の長さで
あり、その極めて好ましい形態においてはそれはターゲ
ット配列との同一性または極めて高い相同性を有する。
たとえば欧州特許出願公開第128042号明細書（1984年12
月12日公開）を参照されたい。
ト配列と十分な相同性をもち、従って適切なハイブリダ
イゼーション条件下でターゲット配列とハイブリダイズ
しうる、すなわち結合しうるRNA配列を意味する。一般
的なプローブは少なくとも約10ヌクレオチドの長さであ
り、極めて好ましくは25ヌクレオチド塩基以上の長さで
あり、その極めて好ましい形態においてはそれはターゲ
ット配列との同一性または極めて高い相同性を有する。
たとえば欧州特許出願公開第128042号明細書（1984年12
月12日公開）を参照されたい。
検出シグナル、たとえば放射性標識または色原感受性
酵素を用いた色原性手段によるものを形成する方法も、
当技術分野で周知であり、立証されている。
酵素を用いた色原性手段によるものを形成する方法も、
当技術分野で周知であり、立証されている。
本発明のアッセイ法を実施する試料は、生物学的材料
の原検体、たとえば血清その他の体液、組織培養用培地
または食料材料であってもよい。より一般的には本方法
は、たとえばアフィニティー分子の非特異的結合を生じ
ることによりターゲットの検出を妨害すると思われる物
質を除去するための各種処理によって原検体から誘導さ
れた処理検体である試料について実施される。本発明の
アッセイ法にいっそう適した試料を得るために原試料を
処理する方法は、当技術分野において周知である。
の原検体、たとえば血清その他の体液、組織培養用培地
または食料材料であってもよい。より一般的には本方法
は、たとえばアフィニティー分子の非特異的結合を生じ
ることによりターゲットの検出を妨害すると思われる物
質を除去するための各種処理によって原検体から誘導さ
れた処理検体である試料について実施される。本発明の
アッセイ法にいっそう適した試料を得るために原試料を
処理する方法は、当技術分野において周知である。
ここでバクテリオファージＱβという表現は、その特
定の変位体もしくは突然変異体または集団に限定されな
い。この表現は特に限定しない限り、バクテリオファー
ジＱβ感染に対し感受性の大腸菌（E.coli）がそれに感
染した際に、RNA依存性RNAポリメラーゼ、またはレプリ
カーゼとして作用するいずれかのポリメラーゼ、および
それに付随する核酸基質を産生させうる、いずれかの変
異体もしくは突然変異体または集団に対するものであ
る。
定の変位体もしくは突然変異体または集団に限定されな
い。この表現は特に限定しない限り、バクテリオファー
ジＱβ感染に対し感受性の大腸菌（E.coli）がそれに感
染した際に、RNA依存性RNAポリメラーゼ、またはレプリ
カーゼとして作用するいずれかのポリメラーゼ、および
それに付随する核酸基質を産生させうる、いずれかの変
異体もしくは突然変異体または集団に対するものであ
る。
その感染に対し感受性の細菌がそれに感染した際に、
RNA依存性RNAポリメラーゼ、およびそれに付随する、イ
ンビトロで自触媒複製されうる複製可能なRNAを産生す
る他のファージであって、本発明に使用しうるものにつ
いては、たとえばミヤケ（Miyake）ら,Proc.Natl.Acad.
Sci.（U.S.A.）68,2022（1971）を参照されたい。
RNA依存性RNAポリメラーゼ、およびそれに付随する、イ
ンビトロで自触媒複製されうる複製可能なRNAを産生す
る他のファージであって、本発明に使用しうるものにつ
いては、たとえばミヤケ（Miyake）ら,Proc.Natl.Acad.
Sci.（U.S.A.）68,2022（1971）を参照されたい。
複製プロセスから得られたRNAを、複製可能なRNAの
３′−末端が蛍光性となるように修飾されたヌクレオチ
ドを付加するT4 RNAリガーゼ触媒反応により、蛍光性
となすことができる。クロスティック（Crosstick）ら,
Nucl.Acids Res.12,1791（1984）を参照されたい。得
られたRNAの蛍光を利用して、数種の標準法のいずれか
によりRNAを検出することができる。
３′−末端が蛍光性となるように修飾されたヌクレオチ
ドを付加するT4 RNAリガーゼ触媒反応により、蛍光性
となすことができる。クロスティック（Crosstick）ら,
Nucl.Acids Res.12,1791（1984）を参照されたい。得
られたRNAの蛍光を利用して、数種の標準法のいずれか
によりRNAを検出することができる。
複製RNAを検出するために採用しうるさらに他の方法
には、複製が行われる系に、または複製RNAがその上に
分離している媒体（たとえば正に帯電した支持体、たと
えばエクテオーラ（ECTEOLA）紙）に、核酸の特異的に
結合するリポーター物質を添加し、このリポーター物質
からのシグナルを測定する方法が含まれる。これらの物
質には下記のものが含まれる：色原性色素、たとえば
“ステインズオール”（ダールバーグ（Dahberg）ら,J.
Mol.Biol.41,139（1969）；メチレンブルー（ディング
マン（Dingman）ら,Biochemistry７,659（1968）、およ
び銀染色（サモンズ（Sammons）ら,Electrophoresis
２,135（1981）；イグロイ（Lgloi）,Anal.Biochem.13
4,184（1983））;RNAに結合する蛍光原化合物−−たと
えば臭化エチジウム（シャープ（Sharp）ら,Biochemist
ry 12,3055（1973）；ベイリー（Bailey）ら,Anal.Bio
chem.70,75（1976）:Qβレプリカーゼによる複製のため
の鋳型であるRNAに特異的に結合する蛍光原化合物−−
たとえばＱβレプリカーゼのウイルス系サブユニットに
結合したフィコビリプロテイン（オイ（Oi）ら,J.CellB
iol.93,981（1982）；ストライエルら，米国特許第4,52
0,110号明細書）。
には、複製が行われる系に、または複製RNAがその上に
分離している媒体（たとえば正に帯電した支持体、たと
えばエクテオーラ（ECTEOLA）紙）に、核酸の特異的に
結合するリポーター物質を添加し、このリポーター物質
からのシグナルを測定する方法が含まれる。これらの物
質には下記のものが含まれる：色原性色素、たとえば
“ステインズオール”（ダールバーグ（Dahberg）ら,J.
Mol.Biol.41,139（1969）；メチレンブルー（ディング
マン（Dingman）ら,Biochemistry７,659（1968）、およ
び銀染色（サモンズ（Sammons）ら,Electrophoresis
２,135（1981）；イグロイ（Lgloi）,Anal.Biochem.13
4,184（1983））;RNAに結合する蛍光原化合物−−たと
えば臭化エチジウム（シャープ（Sharp）ら,Biochemist
ry 12,3055（1973）；ベイリー（Bailey）ら,Anal.Bio
chem.70,75（1976）:Qβレプリカーゼによる複製のため
の鋳型であるRNAに特異的に結合する蛍光原化合物−−
たとえばＱβレプリカーゼのウイルス系サブユニットに
結合したフィコビリプロテイン（オイ（Oi）ら,J.CellB
iol.93,981（1982）；ストライエルら，米国特許第4,52
0,110号明細書）。
レプリカーゼの濃度が鋳型RNAの濃度より高い状態に
維持され、リボヌクレオシド−５′−トリホスフェート
濃度が制限とならない限り、鋳型RNAの濃度はレプリカ
ーゼ触媒によるRNA複製に際して時間と共に指数的に上
昇するであろう。鋳型RNA濃度がレプリカーゼ濃度と等
しくなるか、またはそれを越えたのちは、リボヌクレオ
シド−５′−トリホスフェート濃度が制限とならない限
り、鋳型RNAの濃度は時間と共に直線的に上昇するであ
ろう。たとえばクレイマーら（（1974），前掲）を参照
されたい。
維持され、リボヌクレオシド−５′−トリホスフェート
濃度が制限とならない限り、鋳型RNAの濃度はレプリカ
ーゼ触媒によるRNA複製に際して時間と共に指数的に上
昇するであろう。鋳型RNA濃度がレプリカーゼ濃度と等
しくなるか、またはそれを越えたのちは、リボヌクレオ
シド−５′−トリホスフェート濃度が制限とならない限
り、鋳型RNAの濃度は時間と共に直線的に上昇するであ
ろう。たとえばクレイマーら（（1974），前掲）を参照
されたい。
レプリカーゼ触媒による複製の条件下で、そこに例示
されたMDV−１は鋳型濃度が酵素濃度を越えるまで36秒
毎に２倍濃度となることが見出された。
されたMDV−１は鋳型濃度が酵素濃度を越えるまで36秒
毎に２倍濃度となることが見出された。
レプリカーゼ触媒による複製反応系において一定の反
応時間後の鋳型RNAの濃度は、鋳型RNAの初期濃度に関係
があるであろう。複製反応に際して常にレプリカーゼの
濃度が鋳型濃度を越える（かつリボヌクレオシド−５′
−トリホスフェート濃度が制限とならない場合、反応終
結時の鋳型RNAの濃度のlogは鋳型の初期濃度（反応開始
時）のlogに正比例するであろう。レプリカーゼ濃度が
鋳型濃度を下回ったのちは、リボヌクレオシド−５′−
トリホスフェート濃度が制限とならない限り、反応終結
時の鋳型の濃度は鋳型の初期濃度のlogに正比例する。
さらに、鋳型濃度がレプリカーゼ濃度と等しくなる時点
に反応が達するのに必要な時間は、鋳型の初期濃度のマ
イナスlogに正比例する。
応時間後の鋳型RNAの濃度は、鋳型RNAの初期濃度に関係
があるであろう。複製反応に際して常にレプリカーゼの
濃度が鋳型濃度を越える（かつリボヌクレオシド−５′
−トリホスフェート濃度が制限とならない場合、反応終
結時の鋳型RNAの濃度のlogは鋳型の初期濃度（反応開始
時）のlogに正比例するであろう。レプリカーゼ濃度が
鋳型濃度を下回ったのちは、リボヌクレオシド−５′−
トリホスフェート濃度が制限とならない限り、反応終結
時の鋳型の濃度は鋳型の初期濃度のlogに正比例する。
さらに、鋳型濃度がレプリカーゼ濃度と等しくなる時点
に反応が達するのに必要な時間は、鋳型の初期濃度のマ
イナスlogに正比例する。
複製反応を長時間進行させるほど、より高い感度が達
成される。
成される。
本発明によるアッセイに際しては、ターゲットにつき
検査される試料および対照試料の両試料について、可能
な限り同じ条件下で同時にアッセイを行う。当技術分野
で理解されているように、対照試料は被験試料と同様で
あるが、ターゲットを含有しないかまたは既知量のター
ゲットを含有することが知られている。ターゲットを含
有しない対照は“バックグラウンド”を確立し、これよ
り下ではターゲットを含有する試料を含有しない試料と
区別することは不可能である。被験試料のアッセイに際
して産生される複製された複製可能なRNAの量または濃
度を、同時にアッセイされた対照試料につき産生された
量または濃度と比較することにより、被験試料中のバッ
クグラウンドを越える水準のターゲットの存在を判定す
ることができる。既知濃度範囲のターゲットを含有する
対照試料を用いる場合、被験試料中のターゲットの濃度
を推定することができる。
検査される試料および対照試料の両試料について、可能
な限り同じ条件下で同時にアッセイを行う。当技術分野
で理解されているように、対照試料は被験試料と同様で
あるが、ターゲットを含有しないかまたは既知量のター
ゲットを含有することが知られている。ターゲットを含
有しない対照は“バックグラウンド”を確立し、これよ
り下ではターゲットを含有する試料を含有しない試料と
区別することは不可能である。被験試料のアッセイに際
して産生される複製された複製可能なRNAの量または濃
度を、同時にアッセイされた対照試料につき産生された
量または濃度と比較することにより、被験試料中のバッ
クグラウンドを越える水準のターゲットの存在を判定す
ることができる。既知濃度範囲のターゲットを含有する
対照試料を用いる場合、被験試料中のターゲットの濃度
を推定することができる。
同様に、本発明のRNA生成物の複製の（自触媒）誘導
のために“レプリカーゼ”を用いることは当技術分野で
知られている。本発明に有用なこれらのレプリカーゼの
適切な例には、特定のRNA転写体の３′−末端における
特定の核酸配列部位を認識する、いわゆるＱβウイルス
系レプリカーゼが含まれる。これらのレプリカーゼはRN
A転写体および相補体を複製し（replicate,reproduc
e）、これによりそれらのコピーを増加させる作用をも
つ。これらの酵素が転写過程で反応座に存在すると、転
写体に産生された多数の転写体自身が複製され、従って
RNA転写体生成物の量が指数的に増加することが予測さ
れる。
のために“レプリカーゼ”を用いることは当技術分野で
知られている。本発明に有用なこれらのレプリカーゼの
適切な例には、特定のRNA転写体の３′−末端における
特定の核酸配列部位を認識する、いわゆるＱβウイルス
系レプリカーゼが含まれる。これらのレプリカーゼはRN
A転写体および相補体を複製し（replicate,reproduc
e）、これによりそれらのコピーを増加させる作用をも
つ。これらの酵素が転写過程で反応座に存在すると、転
写体に産生された多数の転写体自身が複製され、従って
RNA転写体生成物の量が指数的に増加することが予測さ
れる。
以下の実施例は本発明のモデルシステムを説明するも
のである： 4.実施例 例示したのは、Ｑ−ベータポリメラーゼ、およびこの
ポリメラーゼにより複製可能なRNA基質をこのRNA基質に
含まれるターゲットRNA配列の増幅のために使用するこ
とである。Ｑ−ベータレプリカーゼは、RNA基質の３′
−末端の特徴的構造要素を認識し、次いでこの基質の相
補的コピーを産生するRNA依存性RNAポリメラーゼであ
る。相補的コピーをその３′−末端に必要な構造要素を
含む場合、Ｑ−ベータレプリカーゼにより認識およびコ
ピーされ、基質配列を指数的に増幅する自触媒反応サイ
クルを生じる。
のである： 4.実施例 例示したのは、Ｑ−ベータポリメラーゼ、およびこの
ポリメラーゼにより複製可能なRNA基質をこのRNA基質に
含まれるターゲットRNA配列の増幅のために使用するこ
とである。Ｑ−ベータレプリカーゼは、RNA基質の３′
−末端の特徴的構造要素を認識し、次いでこの基質の相
補的コピーを産生するRNA依存性RNAポリメラーゼであ
る。相補的コピーをその３′−末端に必要な構造要素を
含む場合、Ｑ−ベータレプリカーゼにより認識およびコ
ピーされ、基質配列を指数的に増幅する自触媒反応サイ
クルを生じる。
Ｑ−ベータレプリカーゼはその正常な開始特異性を避
けて、適切なオリゴヌクレオチドプライマーの３′−末
端から相補的合成を延長しうる（フェリックス（Felix,
G.）およびヘイク（Heke,H.）,Biochem.Biophys.Res.Co
mm.65,503−509,1975）。この反応により主として部分
長さのcRNA、およびかなりの量の非特異的RNAが生成し
（ブルナキス（Vournakis）ら,Biochem.Biophys.Res.Co
mm.70,774−782,1976）、従って複製に不適当である。
しかしこれは約20−100ヌクレオチドの短いターゲット
領域を通してRNAプライマーを延長するためには使用し
うる。
けて、適切なオリゴヌクレオチドプライマーの３′−末
端から相補的合成を延長しうる（フェリックス（Felix,
G.）およびヘイク（Heke,H.）,Biochem.Biophys.Res.Co
mm.65,503−509,1975）。この反応により主として部分
長さのcRNA、およびかなりの量の非特異的RNAが生成し
（ブルナキス（Vournakis）ら,Biochem.Biophys.Res.Co
mm.70,774−782,1976）、従って複製に不適当である。
しかしこれは約20−100ヌクレオチドの短いターゲット
領域を通してRNAプライマーを延長するためには使用し
うる。
プライマーの調製 ２種類のRNAプライマーは、適切に構成された組み換
えDNAのインビトロ転写により調製される。第１プライ
マーはＱ−ベータMDV−１ RNAのマイナス鎖の最初の15
7ヌクレオチド（５′−末端に）、続いて目的部位（す
なわちターゲット配列）の３′−末端から５′−側に
（すなわちその“すぐ下流に”）伸びる領域にわたっ
て、ターゲットRNAに相補的な10−50ヌクレオチドを含
む。第２プライマーはＱ−ベータMDV−１ RNAのプラス
鎖の最初の61ヌクレオチド（５′−末端に）、続いて目
的部位（すなわちターゲット配列）の５′−末端から
３′−側に（すなわちその“すぐ下流に”）の伸びる領
域にわたってターゲットRNAに等しい10−50ヌクレオチ
ドを含む。
えDNAのインビトロ転写により調製される。第１プライ
マーはＱ−ベータMDV−１ RNAのマイナス鎖の最初の15
7ヌクレオチド（５′−末端に）、続いて目的部位（す
なわちターゲット配列）の３′−末端から５′−側に
（すなわちその“すぐ下流に”）伸びる領域にわたっ
て、ターゲットRNAに相補的な10−50ヌクレオチドを含
む。第２プライマーはＱ−ベータMDV−１ RNAのプラス
鎖の最初の61ヌクレオチド（５′−末端に）、続いて目
的部位（すなわちターゲット配列）の５′−末端から
３′−側に（すなわちその“すぐ下流に”）の伸びる領
域にわたってターゲットRNAに等しい10−50ヌクレオチ
ドを含む。
ハイブリダイゼーションおよびプライマーの延長 検出のためのターゲットとなりうる適切なRNA転写体
を調製するために、対照鋳型DNA、たとえばpT7−０（ユ
ー・エス・バイオケミカル）を使用する。1fg、10fg、1
00fg、1pg、10pgまたは100pgのRNA転写体（10-5fmol−1
0-3pmol）を50μｌ容量に希釈して、100mMトリスHCl（p
H7.5）、22mM MgCl2、2mM Na2EDTA、４種類のNTP（そ
れぞれ）1mMを含有する最終溶液を得る。この溶液に２
種類のRNAプライマーそれぞれ2ng（約1nM）を含有する2
5μｌ容量を添加する。混合物を70℃に１分間加熱し、
次いで氷で急冷する。Ｑ−ベータレプリカーゼ２μｇを
含有する25μｌ容量を添加し、混合物を37℃で10分間イ
ンキュベートする。混合物を再び70℃に１分間加熱し、
次いで氷で急冷する。Ｑ−ベータレプリカーゼ２μｇを
含有する第２の25μｌ容量を添加し、混合物を再び37℃
で10分間インキュベートする。
を調製するために、対照鋳型DNA、たとえばpT7−０（ユ
ー・エス・バイオケミカル）を使用する。1fg、10fg、1
00fg、1pg、10pgまたは100pgのRNA転写体（10-5fmol−1
0-3pmol）を50μｌ容量に希釈して、100mMトリスHCl（p
H7.5）、22mM MgCl2、2mM Na2EDTA、４種類のNTP（そ
れぞれ）1mMを含有する最終溶液を得る。この溶液に２
種類のRNAプライマーそれぞれ2ng（約1nM）を含有する2
5μｌ容量を添加する。混合物を70℃に１分間加熱し、
次いで氷で急冷する。Ｑ−ベータレプリカーゼ２μｇを
含有する25μｌ容量を添加し、混合物を37℃で10分間イ
ンキュベートする。混合物を再び70℃に１分間加熱し、
次いで氷で急冷する。Ｑ−ベータレプリカーゼ２μｇを
含有する第２の25μｌ容量を添加し、混合物を再び37℃
で10分間インキュベートする。
ターゲットRNAの増幅 第２プライマー−延長生成物を所望により70℃に１分
間加熱し、次いで氷で急冷することにより鋳型から解放
する。この工程を含める場合、50mMトリスHCl（pH7.
5）、11mM MgCl2、1mM Na2EDTA、４種類のNTP（それ
ぞれ）0.5mMを含有する溶液中にＱ−ベータレプリカー
ゼ２μｇを含有する第３の25μｌ容量を添加しなければ
ならない。いずれの場合も、次いで37℃で20分間インキ
ュベートすることによりターゲットの増幅が自触媒的に
進行する。次いで得られた混合物を、目的のターゲット
配列の対応する挿入配列を含むMDV−１ RNAの産生につ
きアッセイすることができる。
間加熱し、次いで氷で急冷することにより鋳型から解放
する。この工程を含める場合、50mMトリスHCl（pH7.
5）、11mM MgCl2、1mM Na2EDTA、４種類のNTP（それ
ぞれ）0.5mMを含有する溶液中にＱ−ベータレプリカー
ゼ２μｇを含有する第３の25μｌ容量を添加しなければ
ならない。いずれの場合も、次いで37℃で20分間インキ
ュベートすることによりターゲットの増幅が自触媒的に
進行する。次いで得られた混合物を、目的のターゲット
配列の対応する挿入配列を含むMDV−１ RNAの産生につ
きアッセイすることができる。
複製されたRNAの検出 RNAの量はその固有UV吸収により測定される（たとえ
ばクタテラズ（Kutateladze）ら,Anal.Biochem.100,129
（1979）の触媒フォトプリンティング法による）。ある
いはRNAをエテオラ紙上で視覚化する。アリコート（等
容量）の複製反応物を13、48または96−フィンガーアリ
コッター（aliquotter）によりジエチルジアミノエチル
セルロース紙のシートに移す。次いでこれらのシートを
室温で200mM NaCl、300mM酢酸アンモニウム、pH6の溶
液中において洗浄し、RNAに取り込まれなかったリボヌ
クレオシドトリホスフェートを除去する。次いでシート
を0.3μg/mlの臭化エチジウムで染色する（シャープ（S
harp）ら,Biochemistry 12,3055（1973））；ベイリー
（Bailey）ら,Anal.Biochem.70,75（1976）。
ばクタテラズ（Kutateladze）ら,Anal.Biochem.100,129
（1979）の触媒フォトプリンティング法による）。ある
いはRNAをエテオラ紙上で視覚化する。アリコート（等
容量）の複製反応物を13、48または96−フィンガーアリ
コッター（aliquotter）によりジエチルジアミノエチル
セルロース紙のシートに移す。次いでこれらのシートを
室温で200mM NaCl、300mM酢酸アンモニウム、pH6の溶
液中において洗浄し、RNAに取り込まれなかったリボヌ
クレオシドトリホスフェートを除去する。次いでシート
を0.3μg/mlの臭化エチジウムで染色する（シャープ（S
harp）ら,Biochemistry 12,3055（1973））；ベイリー
（Bailey）ら,Anal.Biochem.70,75（1976）。
最後に個々のブロットからの蛍光を数種の既知方法の
いずれかにより測定する。対照ブロットを上回る染色ブ
ロットからの蛍光強度はターゲットの存在を指示する。
臭化エチジウムの代わりに他の染色用物質を用いること
もできる。これらにはメチレンブルー（ディングマンお
よびピーコック（Dingman,Peacock）,Biochemistry
７,659（1968）、銀染色（サモンズ（Sammons）ら,Elec
trophoresis ２,135（1981）フィコビリプロテイン−
Ｑβレプリカーゼ−コンジュゲート（オイ（Oi）ら,J.C
ell Biol.93,981（1982）が含まれる。
いずれかにより測定する。対照ブロットを上回る染色ブ
ロットからの蛍光強度はターゲットの存在を指示する。
臭化エチジウムの代わりに他の染色用物質を用いること
もできる。これらにはメチレンブルー（ディングマンお
よびピーコック（Dingman,Peacock）,Biochemistry
７,659（1968）、銀染色（サモンズ（Sammons）ら,Elec
trophoresis ２,135（1981）フィコビリプロテイン−
Ｑβレプリカーゼ−コンジュゲート（オイ（Oi）ら,J.C
ell Biol.93,981（1982）が含まれる。
以上の記載は本発明を実施するために用いられる方法
をより詳細に説明するものであり、考慮される最良の形
態を示す。本文において詳述したが、これは本発明の全
体的範囲を限定するものではなく；むしろ本発明の範囲
は適切な請求の範囲の記載のみによって支配されると解
すべきである。
をより詳細に説明するものであり、考慮される最良の形
態を示す。本文において詳述したが、これは本発明の全
体的範囲を限定するものではなく；むしろ本発明の範囲
は適切な請求の範囲の記載のみによって支配されると解
すべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョイス，ジェラルド・フランシス アメリカ合衆国カリフォルニア州92024, エンシニタス，フォース・ストリート 337 (72)発明者 オーゲル，レスリー・エレザー アメリカ合衆国カリフォルニア州92037, ラ・ホーラ，テリーヒル・ドライブ 6102
Claims (21)
- 【請求項１】ターゲットRNA配列を含む自触媒複製可能
なRNAを形成するために有用な共同機能性核酸プライマ
ーにおいて、 （１）下記よりなる第１核酸プライマー：（ａ）その
５′−末端における第１の複製開始性相補配列であっ
て、その配列の相補体が上記の複製可能なRNAの３′−
末端を構成する、複製可能なRNAのセグメントであり、R
NA依存性−RNAポリメラーゼにより指令される自触媒複
製を開始しうるもの、および（ｂ）その３′−末端にお
ける第１プローブ配列であって、ターゲットRNA配列を
含有する試料中のターゲットRNA配列のセグメントにハ
イブリダイズし、ターゲットRNA配列を鋳型として用い
て延長反応を開始し、第１プライマー延長生成物（これ
はターゲットRNA配列に相補的なRNA配列を含む）を産生
しうるもの；ならびに （２）下記よりなる第２核酸プライマー：（ａ）その
５′−末端における第２の複製開始性相補配列であっ
て、その配列の相補体がRNA依存性−RNAポリメラーゼに
より指令される自触媒複製を開始しうるもの、および
（ｂ）その３′−末端における第２プローブ配列であっ
て、第１プライマー延長生成物の相補的ターゲット配列
のセグメントにハイブリダイズし、第１延長生成物を鋳
型として用いて延長反応を開始し、第２プライマー延長
生成物（これが、ターゲット配列を含む自触媒複製可能
なRNAである）を産生しうるもの からなる共同機能性プライマー。 - 【請求項２】RNA依存性−RNAポリメラーゼがＱ−ベータ
レプリカーゼである、請求の範囲第１項に記載のヌクレ
オチド配列。 - 【請求項３】ターゲット配列がヒト免疫不全ウイルスの
RNAセグメントに対応する、請求の範囲第１項または第
２項に記載のヌクレオチド配列。 - 【請求項４】ターゲット配列が欠損遺伝子の転写体また
は正常遺伝子の欠損転写体である、請求の範囲第１項ま
たは第２項に記載のヌクレオチド配列。 - 【請求項５】ターゲット配列とハイブリダイズしたのち
の、請求の範囲第１項に記載の第１ヌクレオチド配列の
延長生成物。 - 【請求項６】第１延長生成物の分離したストランド（第
１ヌクレオチド配列に対応する配列を保有する）とハイ
ブリダイズしたのちの、請求の範囲第１項に記載の第２
ヌクレオチド配列の延長生成物。 - 【請求項７】核酸を含有する試料中の少なくとも１種類
の特異的RNAターゲット配列を検出するために有用な方
法において、複製可能な延長生成物を検出することを含
み、該生成物は第１延長生成物から分離したストランド
（これはターゲットRNA配列とハイブリダイズしうる第
１ヌクレオチド配列の配列を含む）とハイブリダイズし
た第２ヌクレオチド配列からの延長生成物であり、この
複製可能な延長生成物は該ターゲットに対するリポータ
ー分子として機能し、上記の第１ヌクレオチド配列は、
該ターゲット配列に相補的なプローブ配列、および複製
プロセスを開始しうる配列の相補体である配列からな
り、上記の第２ヌクレオチド配列は、第１延長生成物か
ら分離したストランド（第１ヌクレオチド配列の配列を
保有する）の反対側末端に相補的なプローブ配列を含
み、従って第２ヌクレオチド配列の延長生成物は複製に
際して鋳型として作用するものである方法。 - 【請求項８】複製可能な生成物の検出に際して、該生成
物を多数複製させることによる工程をさらに含む、請求
の範囲第７項に記載の方法。 - 【請求項９】複製が、複製可能な生成物をレプリカーゼ
酵素と接触させることにより行われる、請求の範囲第８
項に記載の方法。 - 【請求項１０】レプリカーゼ酵素がＱ−ベータレプリカ
ーゼである、請求の範囲第９項に記載の方法。 - 【請求項１１】核酸を含有する試料中の少なくとも１種
類の特異的RNAターゲット配列を検出するために有用
な、下記を含む方法： 該ターゲットRNA配列と、プローブ配列（これは該ター
ゲット配列のセグメントの配列に相補的である）および
機能的長さの配列（これは適宜なRNA依存性RNAポリメラ
ーゼと会合した際に複製されうるものの相補体である）
からなる第１ヌクレオチドプライマーとを、適切な条件
下でハイブリダイズし、 このハイブリダイズしたヌクレオチド配列を連鎖延長
し、 延長生成物をストランド分離し、 前工程で分離された複製可能なものの相補体である配列
を含むストランドと、第２ヌクレオチド配列（上記の分
離されたストランドとターゲット配列の相補体である配
列の反対側末端においてハイブリダイズしうる配列、お
よび適宜なRNA依存性RNAポリメラーゼと会合した際に複
製されうるものの相補体である機能的長さの配列からな
る）とをハイブリダイズし、 このハイブリダイズした第２ヌクレオチド配列を連鎖延
長し、 前工程の第２延長生成物を、所望によりストランド分離
後に、適宜なRNA依存性RNAポリメラーゼとの接触により
操作的に複製させ、そして 複製物を検出する。 - 【請求項１２】レプリカーゼ酵素がＱ−ベータレプリカ
ーゼである、請求の範囲第11項に記載の方法。 - 【請求項１３】検出された生成物が、核酸試料中に含有
されるターゲット配列の量を測定するために標準化され
た様式で測定される、請求の範囲第11項または第12項に
記載の方法。 - 【請求項１４】ターゲット配列が、遺伝性または病原性
の疾病または状態の特性に付随する核酸配列内に位置す
る、請求の範囲第11項、第12項または第13項に記載の方
法。 - 【請求項１５】核酸配列がヒト免疫不全ウイルスに対応
するRNAセグメントである、請求の範囲第14項に記載の
方法。 - 【請求項１６】核酸配列が欠損遺伝子の転写体または正
常遺伝子の欠損転写体である、請求の範囲第14項に記載
の方法。 - 【請求項１７】検出される生成物が検出前に標識され
る、請求の範囲第11項または第12項に記載の方法。 - 【請求項１８】生成物が放射性標識される、請求の範囲
第17項に記載の方法。 - 【請求項１９】生成物が発色団標識される、請求の範囲
第17項に記載の方法。 - 【請求項２０】複製物と、ターゲット配列の真正な、所
望により標識された配列とのハイブリダイゼーションに
より検出が行われる、請求の範囲第11項ないし第16項の
いずれかに記載の方法。 - 【請求項２１】核酸を含有する試料中の少なくとも１種
類の特異的RNAターゲット配列を検出するために有用な
キットにおいて、複製可能な延長生成物を検出すること
を含み、該生成物は第１延長生成物から分離したストラ
ンド（これはターゲットRNA配列とハイブリダイズしう
る第１ヌクレオチド配列の配列を含む）とハイブリダイ
ズした第２ヌクレオチド配列からの延長生成物であり、
この複製可能な延長生成物は該ターゲットに対するリポ
ーター分子として機能し、上記の第１ヌクレオチド配列
は、該ターゲット配列に相補的なプローブ配列、および
複製プロセスを開始しうる配列の相補体である配列から
なり、上記の第２ヌクレオチド配列は、第１延長生成物
から分離したストランド（第１ヌクレオチド配列の配列
を保有する）の反対側末端に相補的なプローブ配列を含
み、従って第２ヌクレオチド配列の延長生成物は複製に
際して鋳型として作用するものであり、かつ上記ヌクレ
オチド配列をハイブリダイズする手段、ならびにこれら
のハイブリダイズしたヌクレオチド配列を連鎖延長する
手段、ならびにこれらの延長生成物を複製により増幅す
る手段、ならびにこれによる複製物および推理により該
ターゲット配列を検出し、所望により測定する手段を含
むキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US27981788A | 1988-12-05 | 1988-12-05 | |
| US279817 | 1988-12-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04503302A JPH04503302A (ja) | 1992-06-18 |
| JP3020602B2 true JP3020602B2 (ja) | 2000-03-15 |
Family
ID=23070530
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2502221A Expired - Fee Related JP3020602B2 (ja) | 1988-12-05 | 1989-12-05 | ターゲット核酸増幅／検出システム |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP3020602B2 (ja) |
| AT (1) | ATE137807T1 (ja) |
| CA (1) | CA2004574A1 (ja) |
| DE (1) | DE68926460T2 (ja) |
| WO (1) | WO1990006376A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| FR2663949A1 (fr) * | 1990-06-29 | 1992-01-03 | Genset Sa | Perfectionnements a un procede d'amplification enzymatique in vitro. |
| US6083689A (en) * | 1990-10-16 | 2000-07-04 | Bayer Corporation | Sensitive immunoassays utilizing antibody conjugates with replicable DNA templates |
| CA2046713A1 (en) * | 1990-10-16 | 1992-04-17 | Richard M. Martinelli | Amplification of midivariant dna templates |
| WO1992020820A1 (en) * | 1991-05-15 | 1992-11-26 | Vanderbilt University | Method to determine metastatic potential of tumor cells |
| USH1985H1 (en) | 1992-01-09 | 2001-08-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Method for detecting biological toxins |
| FR2761695B1 (fr) * | 1997-04-04 | 1999-09-24 | Bio Merieux | Arn polymerase fonctionnant preferentiellement sur matrice d'arn, sa preparation et son utilisation |
| DE19904285A1 (de) * | 1999-02-03 | 2000-08-10 | Max Planck Gesellschaft | Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von Analyten in Proben mit Hilfe von RNA-Replikons |
| CN109642231A (zh) * | 2016-06-17 | 2019-04-16 | 博德研究所 | Vi型crispr直向同源物和系统 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| IL86724A (en) * | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
| US5112734A (en) * | 1989-05-26 | 1992-05-12 | Gene-Trak Systems | Target-dependent synthesis of an artificial gene for the synthesis of a replicatable rna |
-
1989
- 1989-12-05 AT AT90901336T patent/ATE137807T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1989-12-05 EP EP90901336A patent/EP0446305B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-05 WO PCT/US1989/005533 patent/WO1990006376A1/en not_active Ceased
- 1989-12-05 DE DE68926460T patent/DE68926460T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-05 JP JP2502221A patent/JP3020602B2/ja not_active Expired - Fee Related
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