JP3042864B2 - 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチド、これをコードする核酸断片およびこれらの利用法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、Ａ型でもＢ型でもない血清型肝炎の原因ウ
イルス（非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス）抗原ペプチド、これ
をコードする遺伝子断片およびこれらの利用法に関す
る。

発明の背景および従来技術 ウイルス性肝炎にはＡ型肝炎（伝染性肝炎）とＢ型肝
炎（血清肝炎）の２種類があることは古くから知られて
いた。これは主として感染経路の相違に基づいたもの
で、Ａ型肝炎は経口感染で流行を起こし、Ｂ型肝炎は主
として血液を介して伝播されるものであることが確認さ
れていた。これら二つの肝炎の起因ウイルスは既に分離
同定され、Ａ型肝炎ウイルスは、ピコルナウイルスに属
する、直径27nmのRNAウイルスであり［Fineston,S.M.et
al.,Science 182 p1026（1973）］、一方Ｂ型肝炎ウイ
ルスは、ヘパドナウイルスに属する直径42nmのエンベロ
ープを持つDNAウイルスであることが突き止められた。
［Dane,O.S.,et al.,Lancet,I p695（1970）］また、現
在では、これらの肝炎ウイルスの免疫血清学的診断方法
が確立されるに至っている。

これら２つの肝炎ウイルスの確定診断方法が確立され
るに従い、このいずれにも属さない非Ａ非Ｂ型肝炎の存
在が明らかになってきた［Prince,A.M.,et al.,Lancet.
I p241（1974）］。

輸血後肝炎は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）
のスクリーニング方法の導入により大幅に減少したがゼ
ロにはならず、しかも、発生した肝炎患者からは、Ａ
型、Ｂ型肝炎の感染の証拠は得られなかった。このこと
から、この肝炎は一般に非Ａ非Ｂ型肝炎と呼ばれてい
る。

この肝炎は、我国では散発性肝炎の約50％、輸血後肝
炎の90％以上にのぼり、更に慢性肝炎、肝硬変、肝癌の
50％以上が非Ａ非Ｂ型肝炎に起因すると推定されてお
り、大きな社会問題となっている。

これとは別に、インド、ビルマ、アフガニスタン、ま
たは、北アフリカなどで経口感染で流行する、第二のウ
イルス性非Ａ非Ｂ型肝炎があることが明らかになった
［Khuroo,M.S.Am.J.Med.,68 p818−824,（1980）］。こ
れは、一般には水系、または流行性非Ａ非Ｂ型肝炎と呼
ばれている。我国では、この肝炎の流行は見られていな
いが、渡航者の流行地からの肝炎の輸入は若干見られる
ようである［福原ら、第25回日本肝臓学会総会講演要旨
集151頁（1989）］。

本発明は、上記で言う前者の、主に血液を介して感染
する血清型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに関するものであ
り、本明細書中では、このウイルスを非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
イルスと言う。

この非Ａ非Ｂ型肝炎についてはウイルス本体の分離同
定はされておらず、このため、この肝炎の診断方法、治
療法、予防法は確立されていない。また、この肝炎の診
断は除外診断によるしかなかった。即ち、患者の血清に
ついて、診断方法が確立されているＡ型、Ｂ型肝炎の検
査を行い、これらの肝炎であることを否定し、更に、全
身感染の一部の症状として肝炎症状を示す、ヘルペス、
サイトメガロ、エプスタインバーウイルス感染の可能性
を否定し、薬物性や、アルコール性肝炎、自己免疫性肝
炎を否定して非Ａ非Ｂ型肝炎として診断されていた。

この肝炎の原因ウイルスが感染性を持つことは、1978
年アメリカの研究グループにより、チンパンジーを用い
た感染実験で証明された［Tabor,E.,et al.,Lancet.I p
463（1978）］。しかし世界中の多くの努力にもかかわ
らず、10年以上経た今も、原因ウイルスの実態はわかっ
ていない。患者感染チンパンジーの血液や肝組織を材料
として、寒天ゲル内沈降反応、免疫電気向流法、ラジオ
イムノアッセイ、蛍光抗体法、電顕法などのＡ型および
Ｂ型肝炎の研究で用いられたほとんどすべてのアプロー
チにより、ウイルスや関連抗原抗体系捜しが行われたき
たが、いまだ確実といわれるものは得られていない。

非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス究明の歴史は、期待と失望の
歴史であったともいえる。数多くのウイルスあるいは抗
原抗体系の候補が浮かび上がってきたが、それらは次々
に否定されていった［Prince,A.M.,Ann.Rev.Microbio
l.,37,p217,（1983）］。

最近の例では、Setoらのレトロウイルス説があり［Se
to,B.et al.:Lancet.I p941−943（1984）］、彼等によ
ると、チンパンジーに非Ａ非Ｂ型肝炎を起こすことが証
明されている血清や血液製剤に逆転写酵素活性が検出さ
れ、ショ糖密度勾配遠心ではこの酵素は、1.14g/mlの部
分にくる、すなわちレトロウイルスと似た浮上密度を持
つというものであった。続いて、Princeらは、チンパン
ジー肝初代培養細胞に患者血清を接種して、レトロウイ
ルス様粒子が見られたと報告した［Prince,A.M.et al.L
ancet.I:p1071−1075（1984）］。しかしながら、逆転
写酵素活性はHollingerらの追試により否定された［Hol
linger et al.,Lancet,I p41（1986）］。更に、Prince
らの観察したウイルス粒子はミクソウイルスの混入とし
て否定された。

非Ａ非Ｂ型肝炎の研究を困難にしている問題点は、血
清中のウイルス濃度が10²〜10³と低いこと、同じ接種材
料で再感染を起こしたチンパンジーがあるなど、抗体の
存在が疑がわしいこと、感染実験モデルがチンパンジ
ー、マーモセットしかいないことなどである。

最近になって米国のカイロン社が、非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
イルスのcDNAを捕らえたという報告があり、［Choo,Q e
t al.,Science,244,p359−362（1989）,Kuo,G.et al.,S
cience,244,p362−364（1989）］、その塩基配列の一部
が公開されているが［欧州特許EP 318216 A］、ウイル
スそのものの性状、ウイルス構成蛋白の性状などはまだ
明らかにされていない。

一般に、ウイルスの違いは、その免疫血清学的性状の
違い、分子遺伝学的性状の違いより診断方法がまったく
異なってくる。また、株の違いは、免疫血清学的性状が
一部異なるため同一の診断方法では株間の違いにより検
出感度の違い、ワクチンでは免疫原性、感染防御能の違
いが出てくる。分子遺伝学的診断方法、たとえばDNAプ
ローブ診断においては、プローブとウイルス核酸の間の
ハイブリダイゼーションは核酸レベルでのホモロジーが
非常に高くないと実用的ではないことが一般に知られて
いる。すなわち、株間での核酸レベルでの差異により、
DNAのハイブリダイゼーションが起こらず、DNAプローブ
診断が効果的にできないケースが考えられる。

血清型の肝炎として、よく知られ、既によく解析され
ているＢ型肝炎においては、欧米、東南アジア等の地域
ごとにメジャーなＢ型肝炎ウイルスのサブタイプ、すな
わちその地域に特徴的な流行株（サブタイプ）が存在す
ることが知られていることから、本発明の対象となる非
Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスにおいても地域に特有なウイルス
種、もしくはウイルス株等が存在することが考えられ
る。

したがって、特定の地域、例えば特に日本で流行して
いる非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの診断方法、予防方法を確
立するには、日本でメジャーな非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
株を捕らえる必要がある。

発明の目的 このような状況のもとに、本発明者らは、非Ａ非Ｂ型
肝炎の原因ウイルスもしくはそのウイルス遺伝子のクロ
ーニングを目的として研究を重ねた結果、肝炎患者血清
より非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの抗原ペプチド配列をコー
ドしている遺伝子をクローニングし、これにコードされ
るペプチドが非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清と特異的に反応す
ることを確認した。

すなわち、本発明者らは、献血者のGPT高値血漿を用
いて、従来の免疫血清学的方法とは違った新しい分子遺
伝学的手法を取り入れたイムノスクリーニング法により
得られた非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに特有なペプチドおよ
びこれをコードしている遺伝子断片並びにこれらの利用
法を提供するものである。

発明の構成および効果 本発明の目的とするような核酸断片をクローニングす
るに際しては、研究材料として非Ａ非Ｂ型肝炎に感染し
た日本人の肝臓、並びに非Ａ非Ｂ型肝炎を感染させたチ
ンパンジーの肝臓を用い、mRNAを抽出しcDNAを合成し
て、その中から、染色体DNAとのサブトラクションによ
りウイルス特異的cDNAを選択してくることが考えられ
る。しかしながら、これに必要な良い実験材料を十分な
量確保することはきわめて困難である。

もう一つの研究材料として非Ａ非Ｂ型肝炎感染者ある
いは感染チンパンジーの血漿が考えられる。ヒトでは非
Ａ非Ｂ型肝炎のキャリアーの存在が確認されており、輸
血において供血者のGPT値が高い程輸血後非Ａ非Ｂ型肝
炎の発生頻度が高いことからGPT高値の血漿はキャリア
ーの頻度が高いと推定されている。そこで我々は比較的
多量に入手可能である、日本の献血者のGPT高値血漿を
プールし、研究材料とした。このほか、日本人の非Ａ非
Ｂ型肝炎患者の血清を接種し非Ａ非Ｂ型肝炎を発症させ
たチンパンジーの血漿も用いることができるが、現在で
はチンパンジーの入手性から多少問題が残る。

血漿中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス濃度は先に述べたよ
うに10²〜10³程度しかないと推定されていることから、
ウイルス核酸の抽出およびcDNAの合成には1000倍程度ウ
イルスを濃縮する必要がある。しかしながら、ヒト血漿
は７％前後の蛋白溶液であり、ただ単に濃縮することは
不可能であり、除蛋白をしながらウイルスを濃縮する必
要がある。我々が用いたポリエチレングリコール（PE
G）などの沈澱剤による沈澱形成は、比較的簡便に行う
ことができ、大量の血漿の処理にも適しており、ウイル
スの失活も少ないマイルドな方法である。このほかに
は、超遠心によるペレッティング、硫安などの塩類の添
加による塩析、限外瀘過、ゲルクロマトグラフィーなど
が用いられうる。

このように1000倍程度に濃縮した血漿をグアニジウム
チオシアネートで処理し、フェノール／クロロホルムで
抽出をおこない、エタノール沈澱により濃縮血漿中の全
核酸を精製する。次にDNA分解酵素で混入しているヒト
由来のDNAを分解し、フェノール／クロロホルム抽出と
エタノール沈澱によりRNAを精製する。

精製したRNAよりcDNAを合成し、λgt11ベクターに挿
入しcDNAライブラリーを作成する。

λファージを大腸菌に感染させ、細菌培養プレートに
まき、42℃で数時間培養する。この後ニトロセルロース
フィルター（NCフィルター）をかぶせ数時間培養し、NC
フィルターをはがしレプリカをとる。

このレプリカをブロッキング液で処理し、PBSなどで
洗浄した後イムノスクリーニングを行う。すなわち、レ
プリカを非Ａ非Ｂ型肝炎回復期あるいは急性期のヒトま
たはチンパンジー血清と反応させ、PBSなどで洗浄後、
酵素標識抗ヒトIgGまたはIgMと反応させ、洗浄後、基質
溶液と反応させて発色させる。発色したプラークに対応
するファージを選び二次スクリーニングを行い、再現性
のあるクローンを得た。

このクローンについて非Ａ非Ｂ型肝炎特異性を調べ
た。

非Ａ非Ｂ型肝炎回復期、キャリアー期、および正常期
のチンパンジーのIgGを用いてプラークイムノアッセイ
を行った結果非Ａ非Ｂ型肝炎キャリアー期に特異性の高
いクローンを得ることができた。このクローンをサブク
ローニングし、アガロースゲル電気泳動で約380bpの挿
入断片（CH−15）を確認した。

チンパンジーの正常及び非Ａ非Ｂ型肝炎急性期の肝
臓、並びに正常人の白血球より染色体DNAを精製し、ア
ガロース電気泳動を行った後、³²P標識したCH−15クロ
ーンを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。
CH−15はいずれのDNAとも反応せず、したがってCH−15
は染色体由来のDNAでないと判明した。

本発明のCH−15クローンのDNA配列は、ジデオキシ法
により決定された。その結果CH−15クローンは非Ａ非Ｂ
型肝炎ウイルス遺伝子由来の計372bpのcDNA断片であ
り、その塩基配列は第３図の中に示される通りであっ
た。この塩基配列とこれから推定されるアミノ酸配列を
データベース（Genetyx−CDソフトウェア開発 1989）
で検索したところ、現在まで知られているウイルス、細
菌、その他ホモロジーを示すものはなかった。さらに、
米国カイロン社によって発表された非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルス（HCV）の塩基配列およびアミノ酸配列と比較した
結果、CH−15の塩基配列と83.1％、アミノ酸配列と89.5
％のホモロジーを持つ領域がカイロン社の発表した配列
中の存在した。この結果からも、このクローンはカイロ
ン社によってクローニングされたものと同種で、株の異
なる非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスと推定された。

さらに、CH−15がコードするアミノ酸配列の中から、
長さの異なる下記の２種のペプチド（29merおよび37me
r）を合成し、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清と反応させたと
ころ、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清と極めて特異的に反応す
ることが確認された。

すなわち、本発明はCH−15にコードされるアミノ酸配
列の中でも特に特異性の高い抗原エピトープを開示する
ものである。

上記ペプチドのうち、特に37merを用いた非Ａ非Ｂ型
肝炎ウイルス抗体測定においては、29merを用いた同様
の測定方法と比較しても、特異性および感度のいずれの
面において極めて優れた結果を示した。

本発明の遺伝子配列は、これを公知の適当な発現系を
用いて発現させるか、または公知の化学的な合成方法を
用いて本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチドを
得ることができる。公知の適当な発現系としては、原核
細胞または真核細胞のいずれの発現系を利用することも
可能であり、必要であれば、適当なペプチドとの融合蛋
白質とすることもできる。また、一方、化学的な合成方
法は、特定のエピトープからなる比較的短いペプチドを
調製する場合に便利である。このような本発明のペプチ
ドは、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの抗体検査に使用するこ
とができるし、またペプチドを動物に免疫して、このペ
プチドに特異的な抗体を作らせ、これを用いて非Ａ非Ｂ
型肝炎感染患者の肝組織中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスを
検出することも可能である。

さらに、本発明で得られた非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
は、感染予防のためのワクチンの作製に極めて有用であ
ると考えられる。

また、遺伝子配列そのものは、非Ａ非Ｂ型肝炎のDNA
プローブ診断キットの開発に極めて有用である。

このような、本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ペ
プチド、これをコードする核酸断片およびこれらを利用
した非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに関する各種検出方法は、
特に日本における非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの検出におい
て極めて有用であると考えられる。

以下、実施例に沿って本発明を更に詳細に説明する。

実施例 （１）GOT、GPT高値ヒトプール血漿の濃縮 日本赤十字社より供与された、HBs抗原陰性でGPT値10
0以上のヒトプール血漿（8.5）を以下の方法で1000倍
に濃縮した。まず、ヒトプール血漿を粗遠心し、不溶物
を除去した。これに1/10量の5M塩化ナトリウム液、次い
で1/10量の40％（W/W）ポリエチレングリコール液（PEG
6000、和光純薬社製、平均分子量7500）を４℃にて攪拌
しながら添加した。一時間静置したのち、7000回転、20
分間遠心分離して上清を除き、沈渣に元の血漿の約1/20
量のTNE液（10mM Tris−HCl、pH7.4、1mM EDTA、140mM
NaCl）を加え、再溶解した。この溶液を、庶糖の20％、
15％、10％および５％TNE液を段階的に重層した遠心管
の頂部に重層し、４℃、80000×Ｇで、12時間超遠心分
離した。分離後、上清を除去し、沈渣を8mlのPBSに溶解
してGOT、GPT高値ヒトプール血漿の1000倍濃縮物とし
た。

（２）GOT、GPT高値ヒトプール血漿濃縮物からのRNAの
精製 まず、前記の1000倍濃縮血漿8mlに５倍量のグアニジ
ウムチオシアネート溶液（4Mグアニジウムチオシアネー
ト、50mM Tris−HCl pH7.6、10mM EDTA、0.1M 2−メル
カプトエタノール、２％ザルコシル）を加え、攪拌した
後フェノール／クロロホルム抽出し、グリコーゲンをキ
ャリアーとしてエタノール沈澱により濃縮血漿中の全核
酸を精製した。次に、この全核酸中に存在するヒト由来
のDNAを分解するために、2mMバナジルリボヌクレオチッ
ドコンプレックス存在下、RNaseフリーDNase 1.15KU/ml
（ベーリンガー／マンハイム社製）、50mM Tris−HCl p
H7.4、1mM EDTA、10mM MgCl₂の混液400μ中にて、37
℃、30分間処理した。その後、250mM EDTA液16μ、10
％SDS液８μを加え反応を停止し、フェノール／クロ
ロホルム抽出とエタノール沈澱によりRNAを精製した。
さらに、このRNA中に存在する多量のグルコーゲン及び
微量に存在すると思われる不純物を除くために、QIAGEN
pack−100（DIAGEN社製）を用いて精製操作を行った。

（３）cDNAライブラリーの構築 前記までの方法で精製したRNAすべてを、cDNA合成シ
ステムプラス（アマシャム社製）を用いてcDNA合成を行
った。次に、合成したcDNAをcDNAクローニングλgt11
（アマシャム社製）によりλgt11ベクターにクローニン
グした。in vitroパッケージングの結果、1.8×10⁶プラ
ークフォーミングユニット（PFU）のライブラリーを得
た。

（４）非Ａ非Ｂ型肝炎（NANBH）回復期及びキャリアー
期のチンパンジー血清によるNANBHウイルス関連クロー
ンのスクリーニング （Ａ）大腸菌ライゼートの調製 cDNAライブラリーのスクリーニングを用いる一次抗体
はNANBH回復期及びキャリアー期のチンパンジー血漿で
あることから、高い非特異反応が予想された。そこで、
この非特異反応を抑えるためにスクリーニング用チンパ
ンジー血漿の吸収操作に用いる大腸菌Y1090のライゼー
トを調製した。即ち、単一コロニーからアンピシリン50
μg/mlを含むLB培地［１％Bacto−trytone（ジフコ社
製）、0.5％Bacto−yeast extract（ジフコ社製）、１
％NaCl、pH7.5］中で37℃、一夜培養した大腸菌Y1090培
養液20mlを２のLB培地に加え、さらに37℃で一夜培養
した。この培養液を遠心管に移し、9000回転、10分間、
４℃で遠心分離し、上清を除去して沈渣を得た。この沈
渣1g当り4mlのRIPA液（１％デオキシコール酸ナトリウ
ム、１％Triton X−100、0.3M NaCl、0.1％SDS、0.1M T
ris−HCl pH7.5、1mM PMSF）を加えて可溶化し、これを
さらに9000回転、10分間、４℃で遠心分離してその上清
を大腸菌ライゼートした。

（Ｂ）抗体スクリーニング用レプリカフィルターの作製 GOT、GPT高値ヒトプール血漿濃縮物中のRNAより構築
したcDNAライブラリーから、一枚のLBプレート［1.5％A
gar（日水製薬社製）、１％Bacto−tryptone、0.5％Bac
to−yeast extract、１％NaCl pH7.5、50μg/mlアンピ
シリンの入った細菌培養用プレート（ヌンク社製;23cm
×23cm）］当り10000PFUのファージをとり、大腸菌Y109
0に37℃で15分間感染させて、Top Agar 40ml（0.7％Aga
r、１％Bacto−tryptone、0.5％Bacto−yeast extrac
t、１％NaCl、pH7.5、50μg/mlアンピシリン）と共にま
き、42℃で４〜５時間培養した。その後、10mM IPTG
（シグマ社製）を染みこませたニトロセルロースフィル
ター（NCフィルター:S ＆ S社製、Code BA85、23cm×23
cm）をかぶせ、さらに37℃で培養を続けた。３時間後NC
フィルターをプレートからはがし、PBSで洗い、Blockin
g液（５％スキムミルク、0.05％NaN₃を含むPBS溶液）に
浸し、４℃で一夜振とうした。

（Ｃ）抗体スクリーニング ブロッキング液中で一夜浸したレプリカフィルターを
PBSで洗浄後、PBSで10倍に希釈したNANBH回復期及びキ
ャリアー期のチンパンジープール血漿（スクリーニング
用血漿）［NANBH回復期及びキャリアー期のチンパンジ
ープール血漿をPBSで５倍希釈し、1/20量の大腸菌ライ
ゼートを加えて４℃で一夜非特異反応の吸収操作を行
い、さらにPBSで２倍希釈した。］に浸し、室温で振と
うしながら反応させた。２時間後、PBS−Ｔ（0.05％Twe
en20を含むPBS溶液）で、一回につき15分間、計３回レ
プリカフィルターを洗浄の後、各々1000倍希釈したペル
オキシダーゼ標識抗ヒトIgGとIgMヤギ抗体（MBL社製、F
ab）の入ったインキュベーションバッファー（１％牛血
清アルブミンを含むPBS溶液）に浸し、37℃で振とうし
ながら反応させた。１時間後、PBS−Ｔで一回につき15
分間、計４回、その後PBSで５分間洗浄後、発色液［0.0
2％DAB（シグマ社製）、0.1％NiCl₂・6H₂O、0.005％H₂O
₂］に浸し発色させた。NCフィルター上で発色したプラ
ークに対応するファージを選び、二次スクリーニングを
行った。即ち、一次スクリーニングで選択した各ファー
ジ200PFUを別々に挿入断片のないファージ200PFUと共に
大腸菌Y1090に感染させ、90mmシャーレ（ベクトンディ
ッキンソン社製）のLBプレートにまき直し、レプリカフ
ィルターを作製した。これらを上述の方法で抗体スクリ
ーニングし、NANBH回復期及びキャリアー期のチンパン
ジー血漿と再現性よく反応するファージを１クローン
（CH−15）得た。

（５）チンパンジー血清中の抗体を用いた各クローンの
NANBHに対する特異性の検討 （４）で得たクローンについて、（４）.Cの２次スク
リーニングと同様にレプリカフィルターを作製し、NANB
H回復期、キャリアー期及び正常のチンパンジー血清又
は、硫安沈澱後DEAE−セルフウァインカラム（生化学工
業社製）で精製したIgG分画を用いてプラークアッセイ
を行った。その方法は抗体スクリーニングの場合と同様
であるが、一次抗体反応にチンパンジーのIgG分画を用
いる場合には50μg/mlの濃度にPBSで希釈し、1/20量の
大腸菌ライゼートを加え、４℃で一夜非特異反応の吸収
処理をして使用した。

プラークアッセイの結果、CH−15はNANBHキャリアー
期のチンパンジー血清あるいはIgG分画と高率に反応
し、正常チンパンジーの血清あるいはIgG分画とは全く
反応しなかった。

この結果から、CH−15は特にNANBHキャリアー期のチ
ンパンジー血清に特異性の高いクローンであるといえ
る。

このCH−15のファージDNAを精製［実験医学臨時増刊
号、遺伝子工学総集編５（11）、P31−32（1987）参
照］し、制限酵素EcoR I（東洋紡社製）切断後pUC118ベ
クターのEcoR I部位に挿入し、サブクローニングを行っ
た［Douglas Hanahan,J.Mol.Biol.166,P557−580（198
3）参照］。このサブクローニングしたプラスミドpCH−
15をEcoR I切断後、電気泳動で1.5％アガロースゲルに
展開したところ、約380bpの挿入断片（CH−15）が確認
できた（第１図）。

（６）CH−15を用いたサザンブロット分析 下記のとうり、CH−15を用いたサザンブロット分析を
行った。チンパンジーの正常及び米国NIH由来Ｆ株感染N
ANBH急性期（NANBHウイルス接種後８週目）の肝臓、さ
らに正常人の白血球より染色体DNAを精製し、各々20μ
ｇをEcoR Iで切断後、電気泳動で２％アガロースゲルに
展開し、NCフィルターに転写した。このフィルターをマ
ルチプライム法で［³²P］標識したCH−15プローブを用
いサザンハイブリダイゼーションを行った（第２図）。
この図からわかるように、CH−15プローブは、一週間オ
ートラジオグラフィーすると、サブクローニング前のCH
−15クローンとは反応するが、正常及びNANBH急性期の
チンパンジーの染色体DNAあるいは正常なヒトの染色体D
NAとは反応しなかった。このことから、CH−15はヒトの
染色体DNA由来のクローンではなく、ウイルス等の外来
性の核酸由来のものであると考えられる。

（７）CH−15の核酸塩基配列とアミノ酸配列 （Ａ）CH−15クローンの塩基配列の決定 CH−15の遺伝子断片を組み込んだプラスミドDNAを鋳
型とし、［α−³²P］dCTP（800Ci/m mol）を反応に用い
た。Klenow fragmentによるポリメラーゼ反応は宝酒造
の7DEAZAシーケンシングキットによって行った。８％の
ポリアクリルアミド−8Mウレアゲルを用いて、４時間18
00Vで電気泳動し16時間感光した。

（Ｂ）得られた塩基配列と予測されるアミノ酸配列 上記の結果得られた塩基配列とそれから予測されるア
ミノ酸配列の解読の結果をそれぞれ第３図および第４図
に示した。

得られた塩基配列及びアミノ酸配列をデータベース
（前述）で検索した結果、ウイルス、細菌その他高いホ
モロジーを示すものはなかった。また、カイロン社によ
って発表された非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの塩基配列及び
アミノ酸配列と比較した結果、CH−15クローンの塩基配
列と83.1％、アミノ酸配列と89.5％のホモロジーを持つ
領域がカイロン社発表配列中に存在した（第５図及び第
６図参照）。

（８）29merおよび37merを用いた抗体測定法における非
Ａ非Ｂ型肝炎患者血清との反応性 CH−15がコードするアミノ酸配列に基づき下記の29ア
ミノ酸からなる合成ペプチド（29mer）および37アミノ
酸からなる合成ペプチド（37mer）を合成した。

合成には、アプライドバイオシステムズ社の430Aペプ
チドシンセサイザーを用い、精製には合成ペプチド精製
用HPLCカラム（Aquapore Prep−10,C−8,300A pore siz
e,20um spherical silica,10mm ID×250mm,アプライド
バイオシステムズ社）を用いた。精製した合成ペプチド
について常法に従い組成分析を行ったところ、所望のペ
プチドが合成されたことを確認できた。

それぞれの合成ペプチドを、PBS（0.1M PBS）へ溶解
し、１μg/mlとし、イムノプレートの各ウエルへ200μ
ずつ加え、４℃で一夜反応させ、0.01％Tween80を含
むPBS（PBS−Ｔ）で洗浄し、0.1％BSA（牛血清アルブミ
ン）、PBS溶液250μ／ウエルでコーティングを行っ
た。その後、0.1％BSA PBS−Ｔを各ウエルに200μ加
え、これに血漿サンプル20μを入れ、プレートミキサ
ーで軽く攪はんした後、37℃で１時間反応させた。

次に、PBS−Ｔで洗浄後、抗ヒトIgG HRPコンジュゲー
トを200μ／ウエル加え、37℃で１時間反応させた。

PBS−Ｔで洗浄後、TMBZ（３′,3′,5′,5′，−テト
ラメチルベンジジン塩酸塩）基質溶液200μを各ウエ
ルへ加え、37℃で30分反応させた後、2M硫酸を50μ／
ウエル加えて反応を停止した。これをマイクロプレート
リーダーにて、450nm/650nmの２波長で測定を行った。

その結果、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス感染血液と思われ
るヒト血漿165検体を対象に、上記イムノサンドイッチ
アッセイを行ったところ、29merを用いた測定法におい
ては165検体中122検体に対して陽性を示し、39merを用
いた測定法においては165検体中135検体に対して陽性を
示した。すなわち、本発明の39merを用いた非Ａ非Ｂ型
肝炎ウイルス抗体測定法は極めて検出率の高い測定法で
ある。

このような本発明のペプチドを用いた非Ａ非Ｂ型肝炎
ウイルス抗体測定法は、従来の方法に比較して非特異反
応の少ない、極めて優れた測定法である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明においてクローニングしたpCH−15のE
coR I挿入断片の1.5％アガロースゲル電気泳動展開後の
模式図である。 第２図は、本発明においてクローニングしたCH−15とヒ
ト及びチンパンジーの染色体DNAとのサザンハイブリダ
イゼーションの模式図である。 第３図は、本発明でクローニングした非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
イルス抗原をコードする核酸断片の塩基配列を示す。 第４図は、本発明でクローニングした非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
イルス核酸断片がコードするアミノ酸配列を示す。 第５図は、カイロン社発表の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
（HCV）遺伝子の塩基配列とCH−15クローンの塩基配列
とを比較したものである。上段はHCVゲノムの塩基配
列、下段は本発明のCH−15の塩基配列を示し、共通の塩
基を＊で示した。 第６図は、カイロン社発表の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
（HCV）遺伝子がコードするアミノ酸配列とCH−15クロ
ーンのアミノ酸配列とを比較したものである。上段はHC
Vゲノムにコードされるアミノ酸配列、下段は本発明のC
H−15がコードするアミノ酸配列であり、共通のアミノ
酸を＊で示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:92） 審査官 内田 俊生 (56)参考文献 国際公開89／4669（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/11 - 15/62 C07K 14/00 - 14/825 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸
   配列を含む非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチドをコー
   ドする核酸断片。
2. 【請求項２】下記の塩基配列を含む前記第（１）項記載
   の核酸断片。
3. 【請求項３】下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸
   配列からなり、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス特異的エピトー
   プを有するペプチドをコードする核酸断片。
4. 【請求項４】下記の塩基配列からなる前記第（３）項記
   載の核酸断片。
5. 【請求項５】化学合成により得られるペプチドであっ
   て、下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなり、非
   Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス特異的エピトープを有するペプチ
   ド。
6. 【請求項６】上記第（５）項記載のペプチドを用いるこ
   とを特徴とする非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス関連抗体の免疫
   学的検出方法。
7. 【請求項７】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を検出する
   ための核酸プローブであって、下記の塩基配列又は該塩
   基配列に相補的な配列で表される核酸断片からなること
   を特徴とする前記核酸プローブ。