JP3051411B2 - 新規ｄｎａならびにそれを含有する発現プラスミド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は、生理活性物質の組換えDNA技術を用いた生
産において、有用なプロモーター領域を含有する新規DN
Aおよび該DNAを含有する発現プラスミドに関する。さら
に詳しくは、ヒトポリペプチド鎖延長因子遺伝子のプロ
モーター領域を含有する新規DNAおよび該DNAを含有する
発現プラスミドに関する。

＜従来技術とその問題点＞ 近年、遺伝子工学の研究が進展し、組換えDNA技術に
よる物質生産が実施されている。現在、宿主として大腸
菌を用いた組換え技術による異種蛋白質の生産方法はほ
ぼ完成されたが、糖鎖の付加が必須な物質あるいは異種
細胞による生産ではその生理活性または抗原性に変化の
生じるような物質の生産には、大腸菌の使用は不適当で
ある。

最近では本問題を解決するために、動物細胞を宿主と
して用いた系が各種開発されている。一般に動物細胞で
の遺伝子発現には、３種のシグナルが必要とされてい
る。すなわち、プロモーター、RNAスプライシングシグ
ナルおよびポリＡ付加のシグナルである。このうち、目
的の蛋白質を高発現させるためには、プロモーターの選
択が重要である。現在、よく用いられているプロモータ
ーとしては、パポーバウイルスの一種であるSV40の初期
プロモーター、アデノウイルスのメジャーレイトプロモ
ーター、マウス等のメタロチオネインプロモーター等が
知られている。特に、最も繁用されているのはSV40の初
期プロモーターであるが、これにおいても、発現量およ
び宿主域の点で問題が残されている。すなわちSV40の初
期プロモーターを用いても、発現に組織特異性があり、
細胞種により発現量にばらつきが認められ、例えば、リ
ンパ球系細胞や神経系細胞では他の細胞種に比べ、発現
量が極めて低いのが現状である。

最近、武部等［モレキュラー アンド セルラー バ
イオロジー（Mol.Cell.Biol.）、８巻、466頁、1988
年］は、SV40初期プロモーター下流にヒトＴ細胞白血病
ウイルス−１の末端反復配列の一部を組み込んたSRαプ
ロモーターを構築した。そしてある種のリンパ球細胞を
宿主として用いた結果、SRαプロモーターがSV40初期プ
ロモーターに比べ、その下流の遺伝子の発現効率を10〜
100倍程度高める事を発表した。しかし、SRαプロモー
ターが他の宿主細胞においても高発現率を維持するか否
かは不明である。さらに今後のDNA組換え技術を用いて
生産される有用生理活性物質の多様性を考慮すると、よ
り広い宿主細胞域で使用できかつ高発現率を維持できる
プロモーターの探索および発現プラスミドの開発が望ま
れている。

＜本発明が解決しようとする課題＞ 本発明の目的は、既知のプロモーターおよび該プロモ
ーターを含有する発現プラスミドに比べ、広い宿主細胞
域で使用可能かつ高い発現効率を示すプロモーター領域
を含有する新規DNAおよび該DNAを用いた発現プラスミド
を提供することにある。

＜課題を解決するための手段＞ このような現状に鑑み、本発明者らは、広い宿主細胞
域で高い発現効率を示すプロモーター領域を含有する新
規DNAの探索および該DNAを含有する発現プラスミドの開
発を実施した。この過程において本発明者らは、すべて
の細胞で構成的に強く発現しているヒトポリペプチド鎖
延長因子−１α（Human polypeptide chain elogation
factor−１α、以下ヒトEF−１αと略す）の染色体遺伝
子を単離し、当該遺伝子の塩基配列を初めて決定し、そ
の構造を明らかにした。次いで該遺伝子のプロモーター
領域を含む新規DNAを用い、発現プラスミドを作製し
た。該発現プラスミドは、従来使用されている発現プラ
スミドに比し、広い宿主細胞域で使用可能かつ高発現効
率を示すことを証明し、本発明を完成した。

ポリペプチド鎖延長因子は、遺伝子翻訳におけるポリ
ペプチド鎖延長反応に関与する蛋白質因子であり、機能
的に大別して二種類に分類されている。すなわちmRNAの
暗号に対応したアミノアシル−tRNAをリボソームのＡ部
位へ結合させる因子と、ペプチド転移反応の結果リボソ
ームのＡ部位に結合することになったペプチジル−tRNA
を再びＰ部位へ転位させる因子である。

原核細胞では上記二種類のポリペプチド鎖延長因子
（以下EFと略す）が、各々EF−Ｔ、EF−Ｇと命名され、
EF−ＴはさらにEF−TuとEF−Tsに分別されている。一
方、真核生物においては、細胞質およびミトコンドリア
内にそれぞれ独立したEFが存在している。細胞質内のEF
の一つとして、大腸菌のEF−Tuの機能に対応するEF−１
αが知られており、酵母やブタ肝をはじめ種々の組織か
ら精製されている。

ヒトEF−１α cDNAは、ブランツ等［ヨーロピアン
ジャーナル オブ バイオケミストリー（Eur.J.Bioche
m.）、155巻、167頁、1986年］によりすでに一次構造が
決定されたが、染色体遺伝子のDNA配列は明らかではな
かった。これは後述のごとく染色体遺伝子中にヒトEF−
１α遺伝子の偽遺伝子が存在するため、ヒトEF−１α染
色体遺伝子の単離が困難であったことによる。前述のご
とく本発明者らは、ヒトEF−１αの染色体遺伝子を単離
し、ついで塩基配列を決定し、ヒトEF−１α遺伝子のプ
ロモーター領域を含む新規DNA配列ならびにイントロン
のDNA配列を初めて明らかにした。ついで該プロモータ
ー領域を含有する新規DNAが、下流の遺伝子の発現効率
を高めることを見いだし、該DNAを含有する高発現プラ
スミドを作製した。

すなわち本発明は、図２および図７に示された制限酵
素地図で示される配列を含むヒトEF−１α染色体遺伝子
の開始コドンの上流約2.5kbpの全部あるいはそのTATAボ
ックスを含む一部であって、その下流の遺伝子の発現効
率を高める機能を有する新規DNAを提供する。

上記DNAが下記式（Ｉ）で表される塩基配列の全部あ
るいはそのTATAボックスを含む一部である新規DNAを提
供する。

式（Ｉ）： ここで、上記下流の遺伝子の発現効率を高める機能に
負の影響を及ぼさない範囲で、上記DNAが、前記式
（Ｉ）から１つ以上の塩基が欠失しているか、置換して
いるか、および／または前記式（Ｉ）に１つ以上の塩基
が挿入されている配列である新規DNAである。

さらに、上記DNAが、図２および図７に示された制限
酵素地図で示される配列を含むヒトEF−１α染色体遺伝
子の開始コドンの上流約2.5kbpのDNAフラグメントを１
種以上の制限酵素で切断して得られた断片、もしくはそ
れらをライゲーションさせた断片である新規DNAであ
る。

また本発明は、新規DNAを用いた発現プラスミドを提
供する。

ここで新規DNAは、本発明のDNAの全部または一部を含
有することが好ましい。

なお、現在の染色体DNA配列に関する常識として、構
造遺伝子以外のDNA配列は、細胞の種類により、また突
然変異等により主たる活性に変化を与えることなく微妙
に異なっている。従って本発明の新規DNAおよび式
（Ｉ）で示される新規DNAにおいても、その作用が同一
である限り、人工的に変異せしめることも含め塩基配列
に多少の差異が認められても本発明のDNAに含まれる。

以下、本発明を詳細に説明する。

ヒトEF−１αの染色体遺伝子は、ヒト遺伝子ライブラ
リーを適当なプローブを使用して核酸ハイブリダイゼ−
ション法にて得ることが可能である。ヒト遺伝子ライブ
ラリーは、ヒト胎児肝より構築された遺伝子ライブラリ
ー［ローン等（R.M.Lawn et al.）、セル（cell）、1
5巻、1157頁、1978年］やヒト胎盤より構築された遺伝
子ライブラリー［松七五三等（H.Matsushimeet a
l.）、モレキュラー アンド セルラー バイオロジー
（Mol.Cell.Biol.）、６巻、3000頁、1986年］等が、使
用可能である。

一方、スクリーニングに使用するプローブにはEF−１
αの遺伝子配列または相補的な配列を有するDNAあるい
はRNAであれば可能であり、このDNAあるいはRNAはいか
なる真核生物由来のものであってもよいが、ヒト由来で
あることが好ましい。さらに好ましくはヒトEF−１α
cDNA、またはcDNAと相補的な塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドが適当である。ヒトEF−１α cDNAの放射標
識は、市販のニックトランスレーションキット等を用い
ることにより実施される。また、cDNAあるいはcDNAと相
補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドはDNA合成
機等で合成したものを、［γ−³²P］で標識してプロー
ブとして用いることができる。ヒト染色体遺伝子上に
は、ある特定の遺伝子と共通のDNA配列を持つが、実際
には機能していない偽遺伝子の存在が知られている。こ
の偽遺伝子のクローニングを避けるために、ヒトEF−１
α cDNAとEF−１αの偽遺伝子との間で相同性のないDN
A配列を使用することが好ましく、ヒトEF−１α cDNA
の３′側のノンコーディング領域の塩基配列を用いるこ
とが適当である。

この場合、得られた陽性クローンが、ヒトEF−１α
cDNAのコ−ディング領域をプローブとしたサザンハイブ
リダイゼ−ション法等により、コーディング領域を含有
することを確認する必要がある。さらにシークエンシン
グにより塩基配列を確認し、これがヒトEF−１α cDNA
と同一の塩基配列を有し、欠失、挿入または変異等を有
する偽遺伝子とは異なり目的の染色体遺伝子であること
を確認する必要がある。

次に、得られたヒトEF−１α染色体遺伝子を既知のプ
ラスミドへサブクローニングする。プラスミドはいかな
る種類のものでもよいが、好ましくはpUC系プラスミド
がよい。作製したプラスミドを適当な制限酵素で消化す
ることにより制限酵素地図を作製することができる。さ
らにヒトEF−１α染色体遺伝子を制限酵素地図に従い適
当な大きさのDNAフラグメントとし、これらDNAフラグメ
ントをファ−ジベクターM13mp8またはM13mp9へサブクロ
ーニングする。１本鎖DNAを単離し、ジデオキシチェー
ンターミネ−ション法により塩基配列を決定する。各DN
Aフラグメントの塩基配列より、ヒトEF−１α染色体遺
伝子の全DNA配列を決定することができる。さらにヒトE
F−１α cDNAの配列と、ヒトEF−１α染色体遺伝子のD
NA配列を比較することにより、エクソンならびにイント
ロンの位置を決定する。また、転写開始部位は、細胞よ
り抽出したmRNAと、ヒトEF−１α cDNAと相補的な合成
オリゴヌクレオチドを用いたプライマ−エクステンショ
ン法により決定することができる。ヒトEF−１α遺伝子
のプロモーター領域に見いだされるTATAボックスは、転
写開始部位［式（Ｉ）に示した＊位置］より上流約30塩
基付近［式（Ｉ）に示した下線の位置］に確認される。

本発明の新規DNAは、図２および図７に示された制限
酵素地図で示される配列を含むヒトポリペプチド鎖延長
因子−１α遺伝子の開始コドンの上流約2.5kbpの全部あ
るいはそのTATAボックスを含む一部であって、その下流
の遺伝子の発現効率を高める機能を有するもの、また
は、上記DNAが前記式（Ｉ）で表される塩基配列の全部
あるいはそのTATAボックスを含む一部であるもの、ある
いは主たる活性に変化を与えることなく、これらで示さ
れるDNAの少なくとも１つが、変異、欠失、挿入された
ものであってもよい。

これらの本発明の新規DNAは、有機化学合成してもよ
いし、上述の方法で得られるものでもよい。

ヒトEF−１α遺伝子のプロモーター領域を含有する新
規DNAを用いた発現プラスミドの構築の１例は、以下の
ように実施することが可能である。

まず、クローニングされたヒトEF−１α染色体遺伝子
をEcoR Iで消化後、アガロースゲル電気泳動等で単離す
る。このDNAフラグメントを、ヒトEF−１α遺伝子の単
一の切断部位をイントロン１中に持つ制限酵素Sac Iで
切断し、プロモーター領域を含みイントロン１の途中ま
でを含むDNAフラグメントと、エクソン２以降のすべて
のエクソンを含むDNAフラグメントに分離し、これら２
種のDNAフラグメントを単離する。各々のDNAフラグメン
トを、EcoR IおよびSac Iの制限酵素認識部位を一箇所
ずつ有する適当なプラスミド、好ましくはpUC119にサブ
クローニングする。得られた２種のプラスミドのうち、
プロモーター領域を含むプラスミドを制限酵素Pst Iで
切断し、Bal31ヌクレアーゼで処理する。ついでHind II
Iリンカーを結合して環状プラスミドを構築する。Bal31
ヌクレアーゼの作用の程度によりHind IIIの挿入位置の
異なるプラスミド、すなわちエクソン１までを含むプラ
スミドならびにエクソン１をまったく含まないプラスミ
ドが得られる。

またエクソン２に存在するヒトEF−１α遺伝子の開始
コドンATGの直前までを含むプラスミドは、以下のよう
にして構築できる。すなわち、エクソン２以降のすべて
のエクソンを含む上述のプラスミドを制限酵素Bgl IIで
切断し、Bal31ヌクレアーゼで処理する。ついでEcoR I
リンカ−を結合させ環状プラスミドを構築することによ
り、イントロン１のSac I部位から開始コドンの直前ま
でを含むプラスミドを得ることができる。次にEcoR Iで
消化し、その末端をT4DNAポリメラーゼで平滑化後Hind
IIIリンカ−を連結し、ヒトEF−１α染色体遺伝子由来
のSac I−Hind IIIフラグメントを単離し、pUC119にサ
ブクローニングする。さらにSac IおよびHind IIIで消
化することで得られたDNAフラグメントをさきに作製し
たヒトEF−１α遺伝子のプロモーター領域を含みイント
ロン１のSca I部位までを含有するプラスミドのSac I−
Hind III間に挿入することで、ヒトEF−１α遺伝子のプ
ロモーター領域を含みエクソン２の開始コドンの直前ま
でを含むプラスミドが構築できる。

発現効率の測定には種々の方法を用い得るが、たとえ
ばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（以下CATと略す）遺伝子等を用いるのが測定の容易さ
から好ましい。すなわち発現されたCAT量を、クロラム
フェニコールのアセチル化体の生成率として薄層プレ−
ト等で測定することが可能である。またCAT以外の遺伝
子を用いる場合には蛍光抗体法等によって測定可能であ
る。

発現プラスミドの構築は具体的には以下の操作によっ
て実施できる。ヒトEF−１α遺伝子のプロモーター領域
を含むDNAフラグメントは、上述の各種プラスミドをSca
IおよびHind IIIで消化することで得られる。CAT遺伝
子をコードするDNAフラグメントは、それを含有するプ
ラスミド等から適当な制限酵素で切り出すことにより得
られる。例えばプラスミドpSV2−CATからHind IIIおよ
びBamH Iで切り出すことができる。そのDNAフラグメン
トをBamH IおよびHinc II等で開環させた適当なプラス
ミドに、ヒトEF−１α遺伝子のプロモーター領域を含有
するDNAフラグメントとともに挿入することで目的の発
現プラスミドを構築できる。

例えば、本発明者等はヒトEF−１α染色体遺伝子のプ
ロモーター領域を含むDNAフラグメントが式（Ｉ）に示
した５′末端より、220↑、223↑、204↑または321↑の
位置までを含有する発現プラスミドpEF220−CAT、pEF22
3−CAT、pEF204−CATおよびpEF321−CATを構築した。こ
れら４種類のプラスミドは本発明者らにより平成１年３
月２日に、微工研菌寄第10595号（FERM Ｐ−10595）識
別表示E.coli DH5（pEF220−CAT）、微工研菌寄第1059
6号（FERM Ｐ−10596）識別表示E.coli DH5（pEF223
−CAT）、微工研菌寄第10594号（FERM Ｐ−10594）識
別表示E.coli DH5（pEF204−CAT）および微工研菌寄第
10597号（FERM Ｐ−10597）識別表示E.coli DH5（pEF
321−CAT）として寄託されている。

さらにこの発現プラスミド中のCAT遺伝子を、他の生
理活性物質をコードする遺伝子に置換することにより、
本発明の発現プラスミドを用い所望の生理活性物質を生
産することができる。置換には、当該分野で通常行われ
ている必要な処理を行うことができ、これらの処理の１
例としては、あらかじめプラスミド由来のHind III認識
部位を消去しておくことが好ましい。またポリＡ付加が
可能となるように、ポリＡ付加シグナル領域を残してお
くことが好ましい。

＜実施例＞ 本発明を以下の実施例により一層具体的に説明する
が、本発明は、これらの例により何等限定されるもので
はない。

なお、以下の実施例で細胞培養に用いた培地を以下に
示したが、調製方法はそれぞれの指示書に従い、イーグ
ルMEM以下はさらにカナマイシンを終濃度60mg/L添加し
て使用した。

DM−160AU培地 （極東製薬工業） イーグルMEM培地（MEM） （日本水産） ダルベッコ変法イーグル培地 （日本水産） （DMEM） ハムF12培地 （日本水産） （Ham'sF12） RPMI 1640培地 （日本水産） また、以下の記載において用いる略号は、特に断わら
ない限り当該分野における慣用略号に基づくものであ
る。

さらに以下の実施例における操作は、いずれも一般的
な遺伝子操作法であり、モレキュラークローニング ア
ラボラトリーマニュアル（マニアティスら、コールド
スプリング ハーバー ラボラトリー 1982年）、ラ
ボマニュアル遺伝子工学（村松正窯實編、丸善 1988
年）等の、一般に使用されている実験書に記載されてお
り、その指示に従って実施できる。

実施例１ ヒトEF−１α染色体遺伝子の単離および同定 （１）ヒトEF−１α cDNAの単離 長島等［ジーン（Gene）、45巻、265頁、1986年］に
よって構築された酵母EF−１α染色体遺伝子を含むプラ
スミドpNK1を、Cla IおよびHind IIIで消化し、約1Kbp
のCla I−Hind IIIフラグメントをアガロ−スゲル電気
泳動で単離した。このDNAフラグメントを［α−³²P］dC
TPを用いたニックトランスレーション法により［³²P］
標識しプローブを作製した。

岡山およびバーグ［モレキュラー アンド セルラー
バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）、３巻、280頁、198
3年］により構築されたヒト線維芽細胞GM637のcDNAライ
ブラリー［ナショナル インスティテュート オブ ヘ
ルス（National Institute of Health）の岡山博士より
供与］の約40,000コロニーを上述のプローブを用いてコ
ロニーハイブリダイゼーション法によりスクリーニング
した。条件は長田等の方法［プロシーディグス オブ
ザ ナショナルアカデミー オブ サイエンス オブ
U.S.A.（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、80巻、6192頁、19
83年］に従って実施した。

すなわちコロニーのレプリカフィルターを作製し、各
ニトロセルロースフィルターと95℃で５分間加熱後急冷
したプローブを、28℃でハイブリダイゼーションさせ
た。洗浄後、オートラジオグラフィーにより目的のクロ
ーンを探索した。

得られた陽性クローン中のヒトEF−１α cDNAの長さ
をアガロースゲル電気泳動で解析し、最長のcDNA（約1.
8Kbp）を含むプラスミドのpAN7と命名した。ついでヒト
EF−１α cDNAの全塩基配列をジデオキシチェーンター
ミネーション法で決定した。得られたヒトEF−１α cD
NAの全塩基配列を第１図に示した。

その結果、ヒトEF−１α cDNA遺伝子のコーディング
部位は1386bpからなり、ブランツ等［ヨーロピアン ジ
ャーナル オブ バイオケミストリー（Eur.J.Bioche
m.）、155巻、167頁、1986年］によって発表されたヒト
EF−１α cDNAのコーディング領域の塩基配列と同一で
あった。

（２）ヒトEF−１α染色体遺伝子のクローニング ヒトEF−１αの染色体遺伝子を単離するために、まず
（１）で調製したヒトEF−１α cDNAをプローブとして
ヒト遺伝子ライブラリーをスクリーニングした。用いた
ヒト遺伝子ライブラリーは、ハーバード大学のマニアテ
ィス（T.Maniatis）博士より供与されたヒト胎児肝より
構築された遺伝子ライブラリー［ローン等（R.M.Lawn e
t al.）、セル（Cell）、15巻、1157頁、1978年］およ
び東京大学医科学研究所の渋谷博士より供与されたヒト
胎盤より構築された遺伝子ライブラリー［松七五三等
（H.Matsushime et al.）、モレキュラー アンド セ
ルラー バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）、６巻、3000
頁、1986年］である。前述のpAN7のヒトEF−１α cDNA
のBamH Iフラグメント約2Kbpを（１）と同様にニックト
ランスレーション法により［³²P］標識し、プローブを
作製した。

両ヒト遺伝子ライブラリーの総計約1,500,000個のプ
ラークをプラークハイブリダイゼーション法によりスク
リーニングし、その結果218個の陽性クローンが得られ
た。任意の５個のプラークを選定し、クローニングされ
ている染色体DNAフラグメントを単離した。これら５個
のクロ−ンに含まれる染色体DNAフラグメントはヒトEF
−１α cDNAプロ−ブと強くハイブリダイズするが、そ
の制限酵素地図およびジデオキシチェーンターミネーシ
ョン法を用いたシークエンスの結果より、まったくイン
トロンを含まずかつ一部変異、欠失または挿入が認めら
れた。以上の結果からこれらの染色体DNAはヒトEF−１
αの偽遺伝子と判断された。

ついで真のヒトEF−１α染色体遺伝子を単離、同定す
る目的で、ヒトEF−１α cDNAの３′側ノンコ−ディン
グ領域に存在する18塩基（終止コドンより約120塩基下
流に存在するDNA配列、５′−GATAACAATGCATCGTAA−
３′）をDNA合成装置（アプライトバイオシステム社、
モデル380A）を用いて合成した。このオリゴヌクレオチ
ドをT4−ポリヌクレオチドカイネースおよび［γ−
³²P］ATPを用いて標識し、プローブを作製した。このプ
ローブを用いて上述の陽性クローン70個をプラークハイ
ブリダイゼーションにより再スクリーニングした。その
結果５個のクローンが陽性と判明し、そのうちのλEFg5
8が約7KbpのEcoR Iフラグメントを含有し、かつこのDNA
フラグメントがヒトEF−１α cDNAプローブとハイブリ
ダイズすることによりヒトEF−１α染色体遺伝子を含有
することを確認した。

（３）ヒトEF−１α染色体遺伝子のシークエンシング （２）で得られたλEFg58にクローニングされている
ヒトEF−１α染色体DNAを、EcoR Iにより切り出しアガ
ロ−スゲル電気泳動により単離した。この7KbpのEcoR I
フラグメントをプラスミドpUC119のEcoR I部位にサブク
ローニングし、得られたプラスミドをpEFg1と命名し
た。

ついでプラスミドpEFg1を各種制限酵素で処理し、ア
ガロースゲル電気泳動によるバンド数と移動度により制
限酵素部位を確認し、制限酵素地図を作製した。さらに
塩基配列を決定するために、各種制限酵素を切断単離し
たDNAフラグメントをM13mp8またはM13mp9へサブクロー
ニングした。常法に従い１本鎖DNAを単離し、ジデオキ
シチェーンターミネーション法により塩基配列を決定し
た。その結果、プラスミドpEFg1中のDNAフラグメントは
ヒトEF−１α cDNAとまったく同一の塩基配列を含有
し、目的のヒトEF−１α染色体遺伝子であることが確認
された。ヒトEF−１α染色体遺伝子の制限酵素地図とシ
ークエンシングの方向を第２図に、またシークエンシン
グの結果得られたSma I部位から約4.7Kbの塩基配列を第
３図に示した。

（４）ヒトEF−１α染色体遺伝子の構造 （１）で得られたヒトEF−１α cDNAと（３）で得ら
れたヒトEF−１α染色体遺伝子を比較し、エクソンおよ
びイントロンの位置を決定した。その結果、染色体遺伝
子は８個のエクソンと７個のイントロンからなることが
判明した（第２図）。

さらに転写開始部位はプライマーエクステンション法
により決定した。すなわちヒトHL−60細胞より得られた
mRNA5μｇ、［³²P］標識したオリゴヌクレオチド５′−
TGTGTTCTGGCGGCAAACCCGTTG−３′5pmol（第３図の584−
607の位置に示されるDNAと相補的な塩基配列）、AMV逆
転写酵素25単位およびRNase阻害剤40単位を用いて１本
鎖cDNAを合成した。得られたDNAを7M尿素を含む８％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で解析し、転写開始位置
を決定した（第３図の＊印の位置）。

以上の結果、エクソン１は33塩基で構成されているこ
とが、また開始コドンATGはエクソン２に存在し、エク
ソン１とエクソン２の間のイントロン１は943塩基の長
さから成ることが判明した。

実施例２ ヒトEF−１α遺伝子のプロモーター領域を含
むCAT遺伝子発現プラスミドの構築 （１）プラスミドpEF−２およびpEF−３の構築（第４図
参照） プラスミドpEFg1のヒトEF−１α遺伝子を含むEcoR I
フラグメント（約7Kbp）をSac Iで消化し、アガロース
ゲル電気泳動で２種のDNAフラグメント（約2.5Kbpおよ
び約4.5Kbp）に分離した。単離した両DNAフラグメント
を各々プラスミドpUC119のEcoR I−Sac I間にサブクロ
ーニングした。ヒトEF−１α遺伝子のプロモーター領域
とエクソン１を含むプラスミドをpEF−２と、またエク
ソン２からエクソン８を含むプラスミドをpEF−３と命
名した。

（２）プラスミドpEF−220、pEF−223およびpEF−204の
構築（第５図参照） （１）で作製したプラスミドpEF−２（10μｇ）をPst
Iで消化後、Bal31−Ｓヌクレアーゼ３単位を用い、30
℃、10分間反応させた。ついで５′端がリン酸化された
Hind IIIリンカーpCAAGCTTG（宝酒造社）１μｇをT4DNA
リカーゼで結合させた。さらにHind IIIで消化後、T4DN
Aリカーゼで環状化させ、プラスミド中にHind III認識
部位を導入した。Hind III認識部位の導入位置は得られ
たプラスミドにより差異が認められたが、プラスミドDN
Aを鋳型としてジデオキシチェーンターミネーション法
により塩基配列を決定（Hind III部位より上流に向かっ
てシークエンシング）することにより、各プラスミド中
に含まれるヒトEF−１α染色体DNA部分を正確に決定し
た。このうちヒトEF−１α染色体遺伝子上流のEcoR I部
位からエクソン１の21塩基上流［式（Ｉ）の220↑の位
置］までを含むプラスミドpEF−220、EcoR I部位からエ
クソン１の８塩基［式（Ｉ）の223↑の位置］までを含
むプラスミドpEF−223およびEcoR I部位からエクソン１
の24塩基［式（Ｉ）の204↑の位置］までを含むプラス
ミドpEF−204の３種のプラスミドを選定し、発現プラス
ミドの構築に使用した。

（３）プラスミドpEF−321の構築（第６図参照） （１）で作製したプラスミドpEF−３（５μｇ）をBal
IIで消化後、Bal31−Ｆヌクレアーゼ1.3単位を用い30
℃、８分間反応させた。次いで５′末端がリン酸化され
たEcoR IリンカーpGGAATTCC（宝酒造社）１μｇをT4DNA
リガーゼで結合させた。さらにEcoR Iで消化後、T4DNA
リカーゼで環状化させ、Sac I部位よりエクソン２の一
部を含むプラスミドを作製した。EcoR I認識部位の導入
位置は、（２）と同様シークエンシングにより決定し、
Sac I部位よりエクソン２の５′部分10塩基［式（Ｉ）
の321↑の位置］までを含むプラスミドを選定した。

得られたプラスミドをさらにEcoR Iで消化し、T4DNA
ポリメラ−ゼにより平滑化した。ついで（２）と同様に
Hind IIIリンカーを連結した。このDNAよりエクソン２
の一部（10塩基）を含むSac I−Hind IIIフラグメント
（396bp）を単離し、pUC119のSac I−Hind III間にT4DN
Aリガーゼで連結した。得られたプラスミドより再度Sac
I−Hind IIIフラグメントを単離し、（１）で作製した
プラスミドpEF−２のSac I−Hind III間にT4DNAリカー
ゼで連結し、プラスミドpEF−321を作製した。プラスミ
ドpEF−321は、ヒトEF−１α染色体遺伝子上流のEcoR I
部位よりエクソン２の10塩基まで（開始コドンATGの上
流21塩基まで）を含有するプラスミドである。

（４）プラスミドpEF204−CAT、pEF223−CAT、pEF220−
CATおよびpEF321−CATの構築（第７図参照） （２）または（３）で得られたプラスミドpEF−220、
pEF−223、pEF−240またはpEF−321をSca IおよびHind
IIIで消化し、ヒトEF−１α遺伝子のプロモーター領域
を含むSca I−Hind IIIフラグメントを単離した。CAT遺
伝子は、バーク博士（P.Berg、スタンフォード大学）よ
り供与されたプラスミドpSV2−CAT［ゴーマン等（C.M.G
orman et al.）、モレキュラー アンド セルラー バ
イオロジー（Mol.Cell.Biol.）、２巻、1044頁、1982
年］をHind IIIおよびBamH Iで消化し、約1.6KbpのDNA
フラグメントとして単離した。

これら両DNAフラグメントと、プラスミドpUC119のHin
c II−BamH Iラージフラグメント（3.2kbp）の３種DNA
フラグメントをT4DNAリガーゼを用いて連結し、プラス
ミドpEF220−CAT、pEF223−CAT、pEF204−CATおよびpEF
321−CATを作製した（ただし、各々のSca I−Hind III
フラグメントは式（Ｉ）で示される５′末端よりさらに
約950bpのDNAを含んでいる）。

実施例３ ヒトEF−１α遺伝子のプロモーター領域を含
むSV40T抗原発現プラスミドの構築（第８図参照） （１）プラスミドpEF204α−CATおよびpEF321α−CATの
構築 pUC119由来のHind III認識部位のみを消去するため、
プラスミドpEF204−CATまたはpEF321−CAT4μｇをHind
III6単位を用いて37℃、10、15、25または40分間反応さ
せ不完全切断をおこなった。１カ所のみ切断されている
DNAフラグメントを、アガロースゲル電気泳動で単離精
製した。このDNAフラグメントをT4DNAポリメラーゼで平
滑化後T4DNAリガーゼで連結した。各々のプラスミドをH
ind IIIおよびBamH Iで消化した時、CAT遺伝子由来の1.
6KbpのDNAフラグメントが切り出されるプラスミドを選
定し、各々プラスミドpEF204α−CAT、pEF321α−CATと
命名した。

（２）プラスミドpEF204α−ＴおよびpEF321α−Ｔの構
築 SV40T抗原のコ−ディング領域を含有するプラスミドp
MT1［菅野等（S Sugano et al.）、ジャーナル オブ
バイロロジー（J.Virol.）、52巻、884頁、1984年］をH
ind IIIおよびTaq Iで消化しSV40T抗原のコーディング
領域の上流部分432bpを単離した。またこれとは別にプ
ラスミドpMT1をTaq IおよびBamH Iで消化し、初期ポリ
Ａ付加シグナル配列を含むSV40T抗原のコーディング領
域の下流部分2.2Kbpを単離した。

（１）で作製したプラスミドpEF204α−CATまたはpEF
321α−CATを各々Hind IIIおよびBamH Iで消化してCAT
遺伝子を除去した。このHind III−BamH I部位間に、上
述のHind III−Taq IフラグメントおよびTaq I−BamH I
フラグメントを挿入してSV40T抗原の全コーディング領
域を含むプラスミドpEF204α−ＴおよびpEF321α−Ｔを
作製した。

実施例４ ヒトEF−１α遺伝子のプロモーター領域を含
むヒトCD4cDNA発現プラスミドの構築（第９図参照） ヒトCD4cDNAを含有するプラスミドT4−pMV7［マドン
等（P.J.Maddon et at.）、セル（Cell）、47巻、333
頁、1986年］からヒトCD4cDNA（約1.7Kbp）をEcoR I−B
amH Iフラグメントとして切り出し、プラスミドpCU8に
挿入した。ことプラスミドをHind IIIで消化しT4DNAポ
リメラーゼで平滑化後、さらにEcoR Iで消化しヒトCD4c
DNAフラグメントを単離した。

実施例３で作製したプラスミドpEF321α−Ｔを実施例
３の（１）と同様に、pUC119由来のEcoR I認識部位を消
去し、プラスミドpEF321β−Ｔを得た。次いでプラスミ
ドpEF321β−ＴをEcoR IおよびHpa Iで消化して得られ
たラ−ジフラグメントに、上述のヒトCD4cDNAフラグメ
ントをT4DNAリガーゼで結合させ、プラスミドpEF321β
−CD4を作製した。

実施例５ CAT遺伝子の発現 ４種のヒトEF−１α遺伝子のプロモーター領域を含有
する発現プラスミドpEF220−CAT、pEF223−CAT、pEF204
−CATおよびpEF321−CATの発現効率を他の発現プラスミ
ドpSV−CATおよびpSRα−CAT（国立予防衛生研究所の武
部博士より供与）と比較した。

（１）発現プラスミドの各種細胞株へのトランスフェク
ション 用いた細胞株、培地、プレートに植え込む時の細胞密
度（細胞数/10cm²プレート）および培養時間を以下に示
す。

CHO−K1（チャイニーズハムスター卵巣細胞 ATCC C
CL61） 10％FCS含有Ham'sF12培地 1.2×10⁶個、48時間 IMR−32（ヒト神経芽細胞 ATCC CCL127） 10％FCS含有MEM培地 2.0×10⁶個、48時間 3Y1（ラット線維芽細胞） ８％FCS含有DMEM培地 2.0×10⁶個、24時間 CV−１（サル腎臓細胞 ATCC CCL70） ８％FCS含有DMEM培地 2.0×10⁶個、24時間 COS−１（SV40による形質転換サル腎臓細胞 ATCC C
RL1650） ８％FCS含有DMEM培地 2.0×10⁶個、24時間 T22（SV40による形質転換サル腎臓細胞） ８％FCS含有DMEM培地 2.0×10⁶個、24時間 BrA2−227（SV40変異株Ｔ抗原A2によって不朽化した
ラット脳細胞） ８％FCS含有DMEM培地 2.0×10⁶個、24時間 BrA2−SS（SV40変異株Ｔ抗原A2によって不朽化したラ
ット脳細胞） ８％FCS含有DMEM培地 2.0×10⁶個、24時間 JTC−16・P3（ラット肝癌細胞 JCRB 0714） １％FCS含有DM−160AU培地 約50％コンフルエント、48時間 NY（ヒト骨肉腫細胞 JCRB 0614） ８％FCS含有DMEM培地 2.0×10⁶個、72時間 MT−１（ヒトＴ細胞白血病細胞 JCRB 0063） 10％FCS含有RPMI 1640培地 浮遊細胞を2.0×10⁶個に調製して使用 各細胞は上記の条件でプラスミドDNA添加前に植え込
み、添加約１時間前に培養液を交換した。

一方、各々のプラスミドDNA10−20μｇを含む水溶液
0.45mlに50μｌの2.5MCaCl₂を加え、さらに溶液を攪拌
しつつ、0.5mlの２×HBS［280mM NaCl/50mM HEPES/2.
8mM Na₂hPO₄（pH 7.05）］を滴下後、10分間室温で放
置した。ついで上記細胞を含む培地中にこれを加え６時
間培養した。約10mlのPBS−で洗浄後、20％DMSO/培地で
３分間処理してトランスフェクタントを得た。得られた
トランスフェクタントはPBS−で洗浄後、培地を添加
し、５％CO₂存在下37℃で維持した。

（２）CATアッセイ CATアッセイは、ゴーマン等の方法［モレキュラー
アンド セルラー バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）、
２巻、1044頁、1982年］に従った。各々の細胞を５％CO
₂存在下37℃で48時間培養後、２回PBS−で洗浄し、1000
r.p.m.で３分間遠心して細胞を集めた。0.25MTris−HCl
（pH7.8）200μｌに懸濁後凍結−融解を３回繰り返し、
さらに超音波処理により細胞を破壊した。４℃、15,000
r.p.m.で15分間遠心し、得られた上清の一部を用いてブ
ラッドフォード等の方法［アナリティカル バイオケミ
ストリー（Anal.Biochem.）、72巻、248頁、1976年］に
従い上清中の蛋白質量を定量した。

この結果に基づき約150μｇ（ただしCHO−K1は２μ
ｇ、NYは18μｇ、JTC−16・P3は６μｇ、MT−１は41μ
ｇおよびIMR−32は760μｇ）の蛋白質量を含有すると考
えられる上清を分取し、終濃度0.2μCi［¹⁴C］クロラム
フェニコール/1mMアセチルCoA/0.25MTris−HCl（pH7.
8）となるように［¹⁴C］クロラムフェニコール（アマシ
ャム社）およびアセチルCoAを添加した。37℃、２時間
（ただしCHO−K1およびNYは30分間、JTC−16・P3は40分
間）インキュベートした後、反応液を酢酸エチルで抽出
し、次いで酢酸エチルを蒸発乾固させた。再度15μｌの
酢酸エチルに溶解させ、20cmのシリカゲル薄層プレート
（メルク社）上にスポット後、クロロホルムーメタノー
ル（95:5）を展開溶媒としてクロマトグラフィーを行っ
た。上端より13cmまで展開し乾燥後、Ｘ線フィルムを薄
層プレートに重ね、18〜20時間（ただしMT−１は３日
間）放置してオートラジオグラフをとった。

各トランスフェクタントにより発現されたCAT量は、
アセチル化された［¹⁴C］クロラムフェニコールの割合
から推定された。さらに定量的な測定法としてラジオア
ナリティックラベリングシステム（AMBIS System In
c.）を用い薄層プレート上の放射活性を直接カウントし
た。

代表例としてIMR−32細胞におけるCAT遺伝子の発現効
率を、ラジオアナリティックラベリングシステムで測定
した結果を第10図に示した。図中の数字は各々［¹⁴C］
クロラムフェニコールまたはアセチル化［¹⁴C］クロラ
ムフェニコールの放射活性の強さを示している。従って
アセチル化［¹⁴C］クロラムフェニコールの割合は（ア
セチル化体）／（アセチル化体＋未変化体）で示され
る。この結果、SV40プロモーターを含有する発現プラス
ミドでは発現効率の非常に低い神経芽細胞（IMR−32）
においても、ヒトEF−１α遺伝子のプロモーター領域を
含有する４種の発現プラスミドは、いずれも高発現率を
示した。特にエクソン２までを含有するプラスミドpEF3
21−CATはpSV2−CATの約100倍、pSRα−CATの約10倍の
発現効率を示した。

また、各発現プラスミドによるアセチル化体の割合を
表１にまとめた。

CHO−K1およびIMR−32細胞で、４種のヒトEF−１α遺
伝子のプロモーター領域を含有する発現プラスミドの発
現効率を比較すると、pEF321−CAT＞pEF204−CAT、pEF2
23−CAT＞pEF220−CATの順であった。さらに上記２種の
細胞で最大発現効果を示したプラスミドpEF321−CAT
は、作用したいずれの細胞株においても、SV40プロモー
ター含有の２種のプラスミドに比べ同等またはそれ以上
の発現効率を示した。

実施例６ SV40T抗原遺伝子の発現 プラスミドpEF204α−Ｔ、pEF321α−ＴおよびpMT1を
実施例５の（１）に従ってIMR−32細胞にトランスフェ
クションした。48時間後、細胞をエタノール−アセトン
（1:1）溶液で−20℃、18分間固定し免疫蛍光アッセイ
を行った。一次抗体としてハムスターのSV40に対する抗
血清を作製して使用した。すなわち生後３〜４カ月のハ
ムスタ−の皮下にSV40トランスフォーム細胞約２×10⁶
個を接種し腫瘍の形成を待ち（通常２〜６カ月）、１日
の絶食後全採血を実施し、抗血清を得た。上記の固定さ
れた細胞を抗血清とともに37℃、１時間インキュベート
した。PBS−で細胞を洗浄後、FITC結合ウサギ抗ハムス
ターIgG（富士臓器）とともに37℃、１時間インキュベ
ートした。PBS−で細胞を洗浄後、落斜式蛍光顕微鏡BH2
（オリンパス社）で蛍光を観察した。

その結果、Ｔ抗原の発現は、プラスミドpEF204α−Ｔ
およびプラスミドpEF321α−Ｔでは確認できたが（第11
図および第12図）、プラスミドpMT1では確認できなかっ
た。

実施例７ 発現プラスミドの安定性の測定 3Y1細胞に対して実施例６と同様にトランスフェクシ
ョンを行った。24時間培養後、トリプシン溶液（0.05％
トリプシン/PBS−）を用いて細胞をまき直し、その後37
℃、５％CO₂存在下で１カ月間培養した。

その結果プラスミドpEF204α−Ｔ、pEF321α−Ｔまた
はpMT1によってトランスフェクトされた細胞は、すべて
高密度のフォーカスを形成した。しかし、プラスミドpE
F204α−ＴまたはpEF321α−Ｔでトランスフェクトされ
た細胞は、プラスミドpMT1によりトランスフェクトされ
た細胞に比べフォーカスが多数存在していた。

さらにそれらのフォーカスの１つをトリプシン溶液で
処理後、実施例６に従い免疫蛍光アッセイを行った。そ
の結果、プラスミドpEF204α−ＴおよびプラスミドpEF3
21α−Ｔによってトランスフェクトされた細胞は、細胞
核にＴ抗原が検出され（第13図および第14図）、細胞内
のプラスミドDNAが１カ月間安定に存在していることが
示された。

実施例８ ヒトCD4遺伝子の発現 プラスミドpEF321β−CD4を実施例６に従いCHO−K1細
胞にトランスフェクションした。一次抗体としてヒトCD
4特異的マウスモノクローナル抗体（OKT4、オ−ソ
社）、二次抗体としてFITC結合ウサギ抗マウスIgG（医
学生物学研究所）を使用して実施例６に従い免疫蛍光ア
ッセイを実施した。

結果を第15図に示すが、CD4蛋白質がトランスフェク
ションされた細胞表面に検出され、プラスミドpEF321β
−CD4がCHO−K1細胞でCD4を発現していることが証明さ
れた。

＜発明の効果＞ 本発明のヒトEF−１α遺伝子のプロモーター領域を含
有する新規DNA配列を用いた発現プラスミドは、従来繁
用されているSV40初期プロモーターを用いた発現プラス
ミドに比べ、広宿主細胞域でより強力な発現効率を示し
た。さらにこの発現プラスミドは細胞内で約１カ月間安
定に存在した。したがって本発明の発現プラスミドを用
いることにより、より広範囲の哺乳動物細胞を宿主とし
て各種有用生理活性物質をより効率的に、なおかつ長期
間産生させ得ることが期待される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトEF−１αのcDNAの塩基配列を示す図であ
る。 第２図は、ヒトEF−１α染色体遺伝子の構造およびシー
クエンシングの方向を示す線図である。 第３図は、ヒトEF−１α染色体遺伝子の全塩基配列を示
す図である。 第４図は、プラスミドpEF−２およびpEF−３、第５図は
プラスミドpEF−220、pEF−223およびpEF−204、第６図
はプラスミドpEF−321、第７図はプラスミドpEF220−CA
T、pEF223−CAT、pEF204−CATおよびpEF321−CAT、第８
図はプラスミドpEF204α−ＴおよびpEF321α−Ｔ、第９
図はプラスミドpEF321β−CD4の各々の構築図を示す図
である。 第10図は、IMR−32細胞におけるCATアッセイの結果を示
す図である。 第11図、第12図、第13図、第14図および第15図は、生物
の形態を示す図面代用写真である。 すなわち、第11図および第12図は、IMR−32細胞におけ
る、また第13図および第14図は3Y1細胞におけるＴ抗原
の蛍光抗体による検出結果を示す。 第15図はCHO−K1細胞におけるヒトCD4の蛍光抗体による
検出結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 上代 淑人 東京都練馬区石神井町６―22―10 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/00 - 21/08 C12N 5/00 - 5/28 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】図２および図７に示された制限酵素地図で
   示される配列を含むヒトEF−１α染色体遺伝子の開始コ
   ドンの上流約2.5kbpの全部あるいはそのTATAボックスを
   含む一部であって、その下流の遺伝子の発現効率を高め
   る機能を有する新規DNA。
2. 【請求項２】前記DNAが下記式（Ｉ）で表される塩基配
   列の全部あるいはそのTATAボックスを含む一部である請
   求項１に記載の新規DNA。 式（Ｉ）：
3. 【請求項３】前記下流の遺伝子の発現効率を高める機能
   に負の影響を及ぼさない範囲で、前記DNAが、前記式
   （Ｉ）から１つ以上の塩基が欠失しているか、置換して
   いるか、および／または前記式（Ｉ）に１つ以上の塩基
   が挿入されている請求項１または２に記載の新規DNA。
4. 【請求項４】前記DNAが、図２および図７に示された制
   限酵素地図で示される配列を含むヒトEF−１α染色体遺
   伝子の開始コドンの上流約2.5kbpのDNAフラグメント
   を、１種以上の制限酵素で切断して得られた断片、もし
   くはそれらをライゲーションさせた断片である請求項１
   ないし３のいずれかに記載の新規DNA。
5. 【請求項５】請求項１に記載のDNAを含有する発現プラ
   スミド。
6. 【請求項６】請求項２に記載のDNAを含有する発現プラ
   スミド。
7. 【請求項７】請求項３に記載のDNAを含有する発現プラ
   スミド。
8. 【請求項８】前記DNAが、図２および図７に示された制
   限酵素地図で示される配列を含むヒトEF−１α染色体遺
   伝子の開始コドンの上流約2.5kbpのDNAフラグメント
   を、１種以上の制限酵素で切断して得られた断片、もし
   くはそれらをライゲーションさせた断片である請求項５
   ないし７のいずれかに記載の発現プラスミド。
9. 【請求項９】請求項１ないし４のいずれかに記載のDNA
   および、その下流に発現させようとする蛋白質をコード
   する遺伝子を含有する発現プラスミド。
10. 【請求項１０】前記蛋白質をコードする遺伝子が、生理
    活性物質をコードする遺伝子である請求項９に記載の発
    現プラスミド。
11. 【請求項１１】請求項９に記載の発現プラスミドで宿主
    細胞を形質転換することを特徴とする蛋白質の生産方
    法。
12. 【請求項１２】請求項10に記載の発現プラスミドで宿主
    細胞を形質転換することを特徴とする生理活性物質の生
    産方法。
13. 【請求項１３】（ａ）プラスミドpEF204−CAT、pEF220
    −CAT、pEF223−CATまたはpEF321−CATのプラスミド中
    のCAT遺伝子もしくはその一部を除去する、 （ｂ）必要があれば、（ａ）で得られるプラスミド中の
    任意の制限酵素部位を除去する、 （ｃ）（ａ）または（ｂ）のプラスミド中の遺伝子の下
    流に発現させようとする生理活性物質をコードする遺伝
    子を挿入する、 上記工程で得られることを特徴とするプラスミド。
14. 【請求項１４】請求項13で得られるプラスミドで宿主細
    胞を形質転換し、生理活性物質を発現させることを特徴
    とする蛋白質の生産方法。