JP3075595B2 - エンドトキシンを含まない薬剤の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、エンドトキシンを含ま
ない注射液等の溶液の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】エンドトキシンは、リポ多糖であり、大
腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌、緑膿菌等のグラム陰性細
菌の細胞壁外膜の構成成分であることはよく知られてい
る。このリポ多糖を酸分解したときに生ずるリピドＡも
エンドトキシンに含まれる。

【０００３】エンドトキシンは、タンパク、ペプチド、
ホルモン、酵素、抗体、アミノ酸、糖、抗生物質、ビタ
ミン、リンゲル液、生理食塩水などを製造する際に、原
料、水、試薬類、器具類の汚染により混入したり、操作
中の細菌汚染により混入するが、エンドトキシンに汚染
されたこれらの薬剤を注射剤として使用した場合には、
発赤、高熱、悪寒、戦慄などの不快な症状を呈したり、
組織の壊死を生じたり、時には、ショック死することも
知られており、注射液の製造において、エンドトキシン
の除去は必須である。

【０００４】注射剤溶液中のエンドトキシンを除去する
方法としては、ａ）これら溶液の限外ろ過による分離除
去、ｂ）活性炭やイオン交換樹脂による吸着除去、ｃ）
加熱処理、ｄ）γ線または超音波照射による処理、ｅ）
酸またはアルカリ処理、あるいは、ｆ）カブトガニ血球
由来の抗菌性ペプタイド（例えばタキプレシン）をリガ
ンドとする水不溶性担体による吸着除去（特開平２−２
０４５００号）等が知られている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の方法は操作が複雑であり、簡単な処理方法によりエン
ドトキシンを除去する方法の開発が望まれている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、グリシジルメ
タクリレートとエチレングリコールジメタクリレートと
の多孔性共重合体のゲルに、エンドトキシン含有溶液を
塩の存在下に接触させることにより、エンドトキシンを
含まない薬剤を製造する方法である。

【０００７】グリシジルメタクリレートとエチレングリ
コールジメタクリレートとの多孔性共重合体を製造する
には、エチレングリコールジメタクリレートの必要量と
グリシジルメタクリレートの必要量とを、適当な触媒及
び多孔性剤の存在下に水性懸濁重合させる、一般に知ら
れた方法により製造することができる。エチレングリコ
ールジメタクリレートに対するグリシジルメタクリレー
トの割合は、エチレングリコールジメタクリレート１０
０重量部に対しグリシジルメタクリレート５〜６０重量
部、好ましくは１０〜４０重量部の範囲であり、グリシ
ジルメタクリレートの量が少ないと得られる共重合体が
軟らかく、多すぎるとエンドトキシンを除去する能力が
低下する。

【０００８】適当な触媒としては、例えばラジカル発生
触媒として一般的に使用されている、ベンゾイルパーオ
キサイド等の有機過酸化物等を用いることができる。多
孔性剤としては、エチレングリコールジメタクリレート
とグリシジルメタクリレートは溶解するが、生成する共
重合体は溶解しない、例えばトルエンのような有機溶媒
を用いることができる。

【０００９】本発明に使用する多孔性共重合体のゲルは
親水性であり、タンパク分画分子量で、１００〜１０，
０００、５００〜８０，０００、１，０００〜７００，
０００、５，０００〜１，０００，０００、５０，００
０〜５，０００，０００、５００，０００〜５０，００
０，０００の範囲を有するものが使用される。このよう
な多孔性共重合体は、市販されており、ＴＳＫ−ＧＥＬ
トヨパールＨＷ−４０、同ＨＷ−５０、同ＨＷ−５５、
同ＨＷ−６０、同ＨＷ−６５、同ＨＷ−７５（いずれも
東ソー株式会社販売）等を挙げることができる。

【００１０】エンドトキシン含有溶液としては、各種タ
ンパク質、ペプチド、ホルモン、酵素、抗体、アミノ
酸、糖、抗生物質、ビタミン等の溶液、リンゲル液、生
理食塩水等を挙げることができる。

【００１１】本発明は、エンドトキシン含有溶液を、塩
の存在下に、前記多孔性共重合体のゲルと接触させるこ
とにより、該溶液中のエンドトキシンが吸着除去された
薬剤の製造方法であるが、塩としては、その水溶液が弱
酸性〜弱アルカリ性の範囲（ｐＨ５〜９）のものであれ
ば何れも使用することができ、例えば塩化ナトリウム、
塩化カリウム、塩化リチウム、酢酸ナトリウム、硫酸ナ
トリウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウム、塩化マ
グネシウム、硫酸マグネシウム等を挙げることができ
る。塩濃度は、０．１〜３．０モルの範囲を挙げること
ができる。

【００１２】エンドトキシン含有溶液を前記多孔性共重
合体のゲルと接触させる方法としては、バッチ法、カラ
ムクロマトグラフィー法等何れの方法をも採用すること
ができる。バッチ法を採用する場合に、タンパク質等の
溶液によっては、エンドトキシンを完全に除去できない
場合があるが、その場合はカラムクロマトグラフィー法
を採用すればよい。

【００１３】エンドトキシン含有量を測定するには、市
販されているエンドトキシン測定試薬、例えば、エンド
スペシー（生化学工業株式会社製造販売）、リムルス−
ＥＳテストワコー（和光純薬工業株式会社販売）等を使
用することができる。

【００１４】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに説明する
が、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。

【００１５】実施例１ 撹拌機、温度計、滴下ロート及び冷却器を装備した１０
００ml容量のセパラブルフラスコに、４重量％のポリビ
ニルアルコール水溶液４００ml、エチレングリコールジ
メタクリレート８０ｇ、グリシジルメタクリレート２０
ｇ及びベンゾイルパーオキサイド１．５ｇよりなる混合
液を入れ、更に、トルエン１００ｇを添加したのち、４
００r.p.m で撹拌しながら８０℃に昇温し、１０時間反
応させた。反応液を冷却後、重合生成物を分離し、これ
を熱水及びアセトンで洗浄し、次いで乾燥した後、分球
操作を行い、粒子径５０〜１００μｍの多孔性共重合体
を得た。

【００１６】この多孔性共重合体担体を０．２Ｎ水酸化
ナトリウム−９５％エタノール溶液に２４時間浸したの
ち、２５０℃で２時間乾熱滅菌したガラスフィルター上
に移し、エンドトキシンを含まない蒸留水で洗浄して予
め脱エンドトキシン処理をした。この濾過物を水流ポン
プで吸引しながら水切りして湿潤状担体を得た。この担
体を、乾熱滅菌した２個のビーカーに各２ｇずつ秤取し
た。それぞれのビーカーにセラチア・マルセスセンス
（Serra tia marcesce ns)由来のエンドトキシン（シグマ
社販売）２０ngとグルコース０．１ｇとを含む０．５Ｍ
塩化ナトリウム溶液２０mlを加えて、室温で各３０分間
又は３時間撹拌してエンドトキシンを吸着させた。次い
で、その上澄液を採取してエンドトキシン測定用試料溶
液とした。

【００１７】比較として、上記の湿潤状担体を２個のビ
ーカーに各２ｇ秤取し、それぞれに上記エンドトキシン
２０ngとグルコース０．１ｇとを含む蒸留水溶液２０ml
を加え、同様に処理して、エンドトキシン測定用試料溶
液とした。

【００１８】上記担体に対するエンドトキシン吸着量
は、上記で得られた塩化ナトリウム添加系又は比較とし
て塩類無添加の蒸留水系上澄液０・１ｍｌとエンドスペ
シー（生化学工業株式会社、商品名）溶解液０．１ｍｌ
とを混合し、３７℃に３０分間保持した後、得られた溶
液に０．０４％亜硝酸ナトリウムの０．４８Ｎ塩酸溶
液、０．３％スルファミン酸アンモニウム水溶液及び
０．０７％Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミンニ塩酸塩
水溶液を順次０．５ｍｌずつ加え、赤色に呈色した溶液
を波長５４５ｎｍで吸光度を測定し、別に既知濃度のエ
ンドトキシン水溶液０．１ｍｌとエンドスペシー溶解液
０．１ｍｌとを同様に反応させて作成した検量線より求
めた。その結果を表１に示した。

【００１９】

【表１】

【００２０】グルコース溶液中の総エンドトキシン量
は、０．５Ｍ塩化ナトリウム添加系の開始時２０ngであ
ったのに対して、撹拌吸着処理３０分及び３時間後で
は、それぞれ３．３ng及び０．４ngに減少した。

【００２１】一方、塩化ナトリウム無添加の蒸留水の系
では、エンドトキシンは吸着されなかった。なお、いず
れの系でも、グルコースは吸着されず、ほぼ１００％回
収された。

【００２２】実施例２ 実施例１で用いた多孔性共重合体と同様の構造を有する
市販の多孔性共重合体であるトヨパールＨＷ−４０Ｃ
（東ソー株式会社販売、商品名）を担体として使用し
た。

【００２３】実施例１と同様にして、脱エンドトキシン
処理した上記湿潤状担体を、乾熱滅菌した２個のビーカ
ーに各２ｇずつ秤取し、それぞれにセラチア・マルセス
センス（Serratia marcescens)由来のエンドトキシン２
０ngとグルコース０．１ｇとを含む０．５Ｍ塩化ナトリ
ウム溶液２０mlを加えて、室温で３０分間又は３時間撹
拌して吸着させた。次いで、その上澄液を採取して、エ
ンドトキシン測定用試料溶液とした。

【００２４】比較として、上記湿潤状担体を２個のビー
カーに各２ｇずつ秤取し、それぞれに上記エンドトキシ
ン２０ngとグルコース０．１ｇとを含む蒸留水溶液２０
mlを加え、同様に処理して、エンドトキシン測定用試料
溶液とした。

【００２５】上記担体に対するエンドトキシン吸着量
は、上記で得られた溶液中に残存するエンドトキシン量
を実施例１と同様にしてエンドスペシーで測定すること
によって求め、その結果を表２に示した。

【００２６】

【表２】

【００２７】グルコース溶液中のエンドトキシン量は、
０．５Ｍ塩化ナトリウム添加系の開始時２０ngであった
のに対して、撹拌吸着処理３０分及び３時間後では、そ
れぞれ５．２ng及び１．２ngに減少した。

【００２８】一方、塩化ナトリウム無添加の蒸留水の系
では、エンドトキシンは吸着されなかった。なお、どち
らの系でも、グルコースは吸着されず、ほぼ１００％回
収された。

【００２９】実施例３ 実施例１の担体と同様の基本構造を有する市販の多孔性
共重合体であるトヨパールＨＷ−５５Ｆ（東ソー株式会
社販売、商品名）を担体として使用した。実施例１と同
様にして、脱エンドトキシン処理した上記湿潤状担体
を、乾熱滅菌した２個のビーカーに各２ｇずつ秤取し、
それぞれに大腸菌（Escherichia coli O111:B4) 由来の
エンドトキシン（シグマ社販売）２０ngとヒト血清アル
ブミン（ＨＳＡ）０．０２ｇとを含む０．５Ｍ塩化マグ
ネシウム溶液２０mlを加えて、室温で３０分間又は３時
間撹拌して吸着させた。

【００３０】比較として、上記湿潤状担体を２個のビー
カーに各２ｇずつ秤取し、それぞれに上記エンドトキシ
ン２０ngとＨＳＡ０．０２ｇとを含む蒸留水溶液２０ml
を加えて同様に処理した。

【００３１】上記担体に対するエンドトキシン吸着量
は、溶液中に残存するエンドトキシン量を実施例１と同
様にしてエンドスペシーで測定することによって求め、
その結果を表３に示した。

【００３２】

【表３】

【００３３】ＨＳＡ溶液中のエンドトキシン量は、０．
５Ｍ塩化マグネシウム添加系の開始時２０ngであったの
に対して、撹拌吸着処理３０分及び３時間後では、それ
ぞれ１３．５ng及び８．７ngに減少した。

【００３４】一方、塩化マグネシウム無添加の蒸留水の
系では、エンドトキシンは吸着されなかった。なお、ど
ちらの系でも、ＨＳＡは吸着されず、ほぼ１００％回収
された。

【００３５】実施例４ 実施例１の担体と同様の基本構造を有する市販の多孔性
共重合体であるトヨパールＨＷ−６５Ｃ（東ソー株式会
社販売、商品名）を実施例１と同様にして脱エンドトキ
シン処理し、同じく脱エンドトキシン処理したガラス製
カラム（直径２．２cm×長さ９４．０cm）に充填した。
次に、エンドトキシンを含まない蒸留水３０００mlで洗
浄した後、エンドトキシンを含まない０．５Ｍ塩化ナト
リウム溶液１０００mlで平衡化した。

【００３６】このカラムにサルモネラ・チフィムリウム
（Sal monella typh imurium) 由来のエンドトキシン（シ
グマ社販売）８１ngとラミナラン０．０７ｇとを含む
０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液３mlを負荷し、０．５Ｍ塩
化ナトリウム溶液５４０mlで溶出したのち、エンドトキ
シンを含まない蒸留水で再び溶出した。溶出液は、乾熱
滅菌した試験管に各３mlずつ採取し、分析に供した。

【００３７】上記画分中のエンドトキシン量は、実施例
１と同様にしてエンドスペシーで測定することによって
求めた。また、ラミナラン量は、各画分１mlと５％フェ
ノール溶液１mlとを混合し、これに硫酸５mlを加えて再
び混合してから２０分間放置後、波長４９０nmにおける
吸光度を測定するフェノール硫酸法〔Dubois M. etal,
Anal. Chem. 28, 350-356(1956) 〕を用い、別に作成し
た検量線より求めた。その結果を図１に示した。

【００３８】ラミナランは、画分７９〜９５番目の０．
５Ｍ塩化ナトリウム溶出部分に全量回収されたが、エン
ドトキシンは、全く溶出されなかった。次いで、前述の
カラムにエンドトキシンを含まない蒸留水を通すと画分
２４０番目以降においてエンドトキシンが溶出された
（回収率９８％）。したがって、０．５Ｍ塩化ナトリウ
ムで溶出した時には、エンドトキシンのみが吸着され除
去されたことが明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１】トヨパールＨＷ−６５Ｃカラムクロマトグラフ
ィーによるエンドトキシンの吸着除去パターンを示す。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 グリシジルメタクリレートとエチレング
   リコールジメタクリレートとの多孔性共重合体に、エン
   ドトキシン含有溶液を塩の存在下に接触させ、エンドト
   キシンを当該多孔性共重合体に吸着させることを特徴と
   するエンドトキシンを含まない薬剤の製造法。