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JP3095391B2 - クラスター状生合成遺伝子を用いた二次代謝産物生産増加法 - Google Patents
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JP3095391B2 - クラスター状生合成遺伝子を用いた二次代謝産物生産増加法 - Google Patents

クラスター状生合成遺伝子を用いた二次代謝産物生産増加法

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Description

【発明の詳細な説明】 本分野は、二次代謝産物生産に係るクラスター状生合
成遺伝子の単離及びその用途に関する。
この40年間、従来の株改良法によりペニシリン生産量
は非常に増加してきている。この従来の株改良法は、基
本的にペニシリウム クリソゲナム（Penicillium chry
sogenum）のランダム突然変異処理及びよりペニシリン
を生産する突然変異体の選択に基づいている。しかし、
クローニング技術の発達が新しい有力な手段を提供し、
さらにこの菌類におけるペニシリン生産を改良した。
ペニシリンはP.クリソゲナム（chrysogenum）によ
り、いくつかの酵素ステップを通して生産される（例え
ば、E.アルバレズ（Alvarez）等、アンチマイクロービ
アル エイジェント ケモセラピー（Antimicrob.Agent
s Chemother.）、31（1987）1675−1682）。これらのス
テップを第１図に示す。この説明の中では生合成経路に
直接関係する遺伝子が重要であり、二次代謝産物の生産
に至る数ステップで活性を示す酵素コードする遺伝子、
すなわちペニシリンＧ又はＶの生産の場合には、第１図
で示されている酵素をコードする遺伝子が意味を持って
いる。第１の反応は、αアミノアシピン酸、システイン
及びバリンからのトリペプチドδ−（Ｌ−α−アミノア
ジピル）−Ｌ−システィニル−Ｄ−バリンの生成であ
る。この反応を担う酵素は、巨大な多機能酵素であるAC
Vシンセターゼ（以後ACVSと呼ぶ）である。このトリペ
プチドは、イソペニシリンＮシンセターゼ（以後IPNSと
呼ぶ）又はシクラーゼの作用により環状化する。この反
応産物はイソペニシリンＮであり、この化合物は典型的
なβ−ラクタム環構造を含み、抗菌性を有する。ぺニシ
リン生成の最終ステップはイソペニシリンＮのα−アミ
ノアジピン酸側鎖の疎水性側鎖による交換である。工業
生産で通常用いられる疎水性側鎖にはペニシリンＧを生
ずるフェニル酢酸及びペニシリンＶを生ずるフェノキシ
酢酸がある。この側鎖交換は単一の酵素により触媒され
る反応であると提唱されている（A.L.デマイン（Demai
n）、1983年、A.L.デマイン（Demain）及びN.A.ソロモ
ン（Solomon）編、β−ラクタム構造を含む抗生物質
Ｉ、スプリング−バーラグ版、ベルリン、189−228
頁）。しかし、中間体として６−APAを含む２ステップ
反応も可能である（E.アルバレス（Alvarez）等、上
述）。最終反応に関すると同定された酵素はアシルCo
A:6−APAアシルトランスフェラーゼである（以後ATと呼
ぶ）。この酵素は均一にまで精製された（E.アルバレス
（Alvarez）等、上述）。
IPNから６−APAまでの反応を触媒する第２の酵素の関
与は未だ確証がつかめていない。
１個以上の酵素反応がペニシリン生合成経路の律速と
なっているかどうかは明らかではなく、また、もしそう
であるとしてもどの酵素ステップが関与しているか明ら
かではない。
ペニシリン生合成経路は、互いに代謝経路の一部を成
している３個のアミノ酸で始まるので、各々の経路にお
ける制御ステップもペニシリンの生合成に影響するであ
ろう。一方、ペニシリンの生成は、炭素代謝抑制及び窒
素源制御に関係している（J.F.マーチン（Martin）等、 H.クレインカーフ（Kleinkanf）、 H.フォンデレン（von Dhren）、 H.ドナウア（Donnauer）及びG.ネセマン（Nesemann）
編、“二次代謝産物生成の制御"VCHバーラゲルシャフト
（Verlaggesellschaft）、ウェインヘイム（Weinhei
m）、1985年、41〜75頁）。また制御タンパク質がこれ
らのタイプの制御にも関係し得る。これらの制御タンパ
ク質及びそれらにより制御されるタンパク質が、二次代
謝産物、この場合のペニシリンの生合成経路に間接的に
関係することは明らかである。
最近になってペニシリンＧ、イソペニシリンＮシンセ
ターゼ（IPNS）又はシクラーゼへの生合成経路において
活性を有する唯一つの酵素の遺伝子が、相当するアクレ
モニウム クリソゲナム（Acremonium Chrysogenum）遺
伝子（S.M.サムソン（Samson）等、ネイチャー（Natur
e）、318（1985）191〜194頁）を用いてクローン化さ
れ、かつ配列決定された。後者の遺伝子がクローン化さ
れ、かつ、IPNSタンパク質を精製し、アミノ末端アミノ
酸配列を決定し、この配列に従がう一群の合成オリゴデ
コキシリボヌクレオチドを合成し、及びこれら混合した
オリゴデオキシヌクレオチドでオスミドゲノムライブラ
リーを探ることにより同定した（S.M.サムソン（Samso
n）、上述）。
ペニシリウム クリソゲナム（Penicillium chrysog
enum）及びアクレモニウム クリソゲナム（Acremonium
chrysogenum）の両方に由来する、IPNSをコードする
単離遺伝子を菌株改良法に用いた。ペニシリウム クリ
ソゲナム（Penicillum chrysogenum）の場合、酵素活性
の増加が示されたが、ペニシリン生合成の増加は検出さ
れなかった（P.L.スカトラド（Skatrud）等、工業微生
物学学会年会ポスターセッション1987、バルチモア、19
87年８月、SIMニュース発刊アブストラクト、37（198
7）77頁）。アクレモニウム クリソゲナム（Acremoniu
m chrysogenum）の場合も同様の結果が得られた（J.L.
チャップマン（Chapman）等（1987）；工業微生物学の
発展、S.W.クイナー（Queener）、第４回工業微生物の
遺伝学及び分子生物学に関するASM会議、ブルーミント
ン（Bloomington）、1988年10月、会議録は1989年発行
予定）。
従って、今日までIPNS遺伝子が、遺伝子増巾によるペ
ニシリン又はセファロスポリンの生産増加に用い得る証
拠は得られていない。
β−ラクタム抗生物質の生合成がグルコース抑制を受
けていることが照明された（J.F.マーチン（Martin）及
びP.ライラス（Liras）、TIBS３（1985）39−44）。こ
のグルコースによる抑制はACVSによるトリペプチドの生
成及びIPNSの活性に対して明確に示された（レビラ（Re
villa）等、ジャーナル・オブ・バくテリオロジー（J.B
act.）168（1986）947−952）。一方、アシルトランス
フェラーゼに対するデータは明確ではない。ATがグルコ
ース抑制を受けていない事をレビラ（Revilla）等（上
述）は報告したが、他のデータはAT活性が無いか又は少
なくとも減少していることを示した（B.スペンサー（Sp
encer）及びT.マング（Maung）、プロシーディング・イ
ン・バイオケミカル・ソサイアティー（Proc,Biochem,S
oc.）1970、29−30）。
グルコースによる抑制がとのステップで行なわれてい
るかは分っていない。すなわちこの事は転写レベルかも
しくは翻訳レベルで起こり得る。もし前者の制御が適用
されているなら、生産及び非生産培養物におけるmRNAレ
ベルの差がペニシリン生合成に関与する遺伝子の単離に
使用し得る。二次代謝産物の生合成に関与する遺伝子の
単離のためのこの方法は、本出願と同日に出願され、か
つここで参考として引用している“二次代謝産物の生産
増加を目的とする生合成又は制御遺伝子の同定法及び使
用法”と題する我々の特許出願の課題である。
抗生物質生合成遺伝子のクラスター化はストレプトミ
セテス（Streptomycetes）について説明されている。例
としてはS,コエリカラー（Coelicolor）によるアクチノ
ロジン（Actinorhodin）の生合成（F.マルパルチダ（Ma
lpartida）及びD.A.ポプウッド（Hopwood）、1984、ネ
イチャー（Nature）309,462−464）又は、S.グラウセセ
ンス（Glaucescens）によるテトラセノマイシンＣの生
合成（H.モタメジ（Motamedi）及びC.R.ハッチンソン
（Hutchinson）、1987、プロシーディング・イン・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc,Natl.Ac
ad.Sci.）USA84、4445−4449）に関する遺伝子のクラス
ター化がある。
菌類におけるβ−ラクタム生合成遺伝子の遺伝子編成
はペニシリン生合成に欠換をもつ突然変異体の遺伝子解
析により研究されてきている。アスペルギラスニドゥラ
ンス（Aspergillus nidulans）の場合には、ペニシリン
生合成に関する４個の部位（npe A,B,C及びＤ）が同定
された。すなわちこれらの部位は各々４種の結合群（す
なわち染色体）、VI、IV、III及びIIに位置している
（J.F.メイキンス（Makins）等、1983、ジャーナル・オ
ブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Journal of G
enral Microbiology）、129、3027−3033）、ペニシリ
ウム クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）の場
合、５個の部位が同定され（npe V、Ｗ、Ｘ、Ｙ及び
Ｚ）、これらの部位は各々３個の結合群、すなわちＩ
（npe W、Ｙ、Ｚ）及びnpe V及びnpe Xを含む２個に位
置していた（P.J.M.ノーマンセル（Normansell）等、19
79、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロ
ジー（Journal of General Microbiol.）、112、113−1
26;J.F.メイキンス（Makins）等、1980、上述）。閉環
酵素（IPNS又はシクラーゼ;npe W）及び側鎖交換酵素
（アシルトランスフェラーゼ、npe V）に影響する突然
変異は別々の結合群中に存在すると報告されている。従
って遺伝子データは、少なくともいくつかのペニシリン
生合成遺伝子は菌類ゲノムに広く分布しており、かつ例
えばシクラーゼやアシルトランスフェラーゼ遺伝子等の
クラスター化はこれらのデータに基づいて明確に予想し
得ないことを示している。
クラスター状抗生物質生合成遺伝子が開示され、かつ
微生物における抗生物質の生産増加及び抗生物質合成に
関するその他の遺伝子の単離に有効に使用される。本発
明では、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillum chr
ysogenum）におけるペニシリンの生産増加、その他のク
ラスター状生合成遺伝子の単離及びアクレモニウム・ク
リソゲナム（Acremonium chrysogenum）におけるクラ
スター状ペニシリン生合成遺伝子の発現が例示されてい
る。
本発明に従がい、モノー又はポリシストロニックな配
列を含むDNAフラグメントが同定される。この配列によ
ってコードされる遺伝子は、商品価値のある二次代謝産
物又は生成物の生産に関する酵素に翻訳される。目的と
するこれらの配列は、目的遺伝子が活発に発現され、そ
の二次代謝産物を生産し得る生物及び発現し得ない微生
物に由来するDNA配列の比較により同定した。それゆ
え、特定発現し、かつ商品価値のある生産物の生成に関
する１個以上の遺伝子をコードするDNAフラグメントが
提供される。この出願を通して“特定発現する”という
語句は、ある特定の条件下のみで特異的に活性を示し、
かつそれとほぼ等しい他の条件では活性を示さない（本
発明においては低いレベルでしか存在しない、すなわち
活性段階と比較して５％以下のレベル）目的遺伝子の発
明に対して使用される。
発現の欠除は、遺伝子発現の抑制又は誘導の欠除、突
然変異、又は目的遺伝子の転写不能を起こすその他の事
象の結果である。単離DNAは、例えばラムダ又はコスミ
ドクローニングベクター、又は発現ベクター中に含まれ
るゲノム又はcDNAライブラリー等の遺伝子ライブラリー
のスクリーニングに由来する。二次代謝産物の生合成の
際に発現される配列を濃縮したcDNAプローブを用いて、
次の操作のため、陽性のハイブリッドをライブラリー中
から同定し、その二次代謝産物の生産に関する酵素の発
現構築物を提供する。それゆえ、微生物の遺伝子ライブ
ラリーは、２つのcDNAプローブ（１つは転写活性状態由
来の配列を濃縮したもの、及びもう１つは転写不活性状
態に由来する配列を有するもの）を用いてスクリーニン
グする。この比較及び差から、特定の活性条件のみで活
発に発現する遺伝子を含むクローンを単離し得る。
本方法は、二次代謝物、より特定すると、ラクトース
生育（生産性）及びグルコース生育（非生産性）菌糸体
に由来する２つのcDNAプローブをもちいたペニシリン生
合成に関する遺伝子の単離で例示される。
上記方法の適用により、驚くべきことにシクラーゼ及
びアシルトランスフェラーゼをコードするクラスター状
ペニシリン生合成遺伝子は、P.クリソゲナム（chrysoge
num）より単離された（上述の同日出願参照）。この情
報は、当分野で知られている染色体歩行技術を適用する
ことにより、前記抗生物質生合成経路から、他の遺伝子
を単離するのにうまく使用し得る。この後者の方法は、
目的遺伝子が特定発現しない場合、その遺伝子がコード
する酵素が“逆遺伝学”的方法により、その遺伝子を単
離するのに必要な程度の精製が行なえない場合又は遺伝
子単離のための当分野で知られている他の方法が目的の
遺伝子を収穫し得ない場合において特別の使用法を提供
する。
本出願を通して、クラスター化とは、コスミドクロー
ニングベクター中にクローニングし得る１個のDNAフラ
グメントに、他の非関連遺伝子を間に含まない２個以上
の関連機能を有する遺伝子の存在に対して用いられる。
上記クラスターは、天然状態又は本発明の別の特徴で
もある、当分野に知られている技術を用いた１個のDNA
フラグメントへの２個以上の関連遺伝子の結合による人
工的に導入された状態をも示し得る。
ここでは他のペニシリン生合成遺伝子の単離のための
ペニシリン生合成遺伝子のクラスター化のうまい使用法
が、ACVシンセターゼをコードする遺伝子の染色体歩行
による単離により例示されている。
さらに、ペニシリン生合成遺伝子のクラスター化は、
P.クリソゲナム（chrysogenum）におけるシクラーゼ及
びアシルトランスフェラーゼ両遺伝子の増巾にうまく使
用されており、このことはペニシリン生産を増加させ
る。
この同定されたDNA配列は、抗生物質生合成酵素及
び、又はその全生合成経路由来の制御タンパク質、又よ
り一般的には、上記抗生物質生合成にポジティブであれ
ネガティブであれ、どのような形でも関係するタンパク
質をコードする少なくとも１個の遺伝子、好ましくは２
個以上の遺伝子を含む。適当な宿主微生物中にうまく導
入された時、ポジティブに作用する構築物は遺伝子投入
量の増加又はより高い遺伝子発現によりβ−ラクタム生
産微生物中で機能する生合成経路の効率を高める。一
方、抗生物質生産にネガティブな効果を示す構築物（例
えば副産物の生産）も単離し得る。これらの構築物は遺
伝子置換又は同様の効果をもつ他の方法によりネガティ
ブに作用する遺伝子を不活性化するのに使用される。結
局両方法とも工業生産における目的抗生物質をより高い
収率で提供する。本方法は抗生物質、特にペニシリンの
生産に対するβ−ラクタム生産微生物により例示され、
かつ、その特定の応用例を提供する。その発現カセット
は、律速段階を触媒する酵素をコードする遺伝子又は転
写の誘導のための制御タンパク質をコードする遺伝子等
を含むことが望ましい。
さらに本方法は、コードされている生産物が未知の配
列を提供するが、その配列は目的産物の生産増加を提供
する。これらの配列は“潜在的遺伝子”と呼ばれ、機能
が不明の遺伝子を含み、本単離法で入手し得る配列を意
味する。これらの遺伝子は非形質転換宿主と比較して、
形質転換宿主微生物においてはより高い量投入及び、又
は発現することが特徴である。この“潜在的遺伝子”及
び我々の別の特別出願（上述）に由来するIPNS及びアシ
ルトランスフェラーゼに加え、本発明はペニシリン、セ
ファロスポリン及びセファマイシンへの生合成経路の第
１番目の酵素、すなわちここでACVSと呼ばれているδ−
（Ｌ−α−アミノアジピル）−Ｌ−システィニル−Ｄ−
バリンシンセターゼをコードする遺伝子を提供する。
上記出願において、“Y"と命名された潜在的遺伝子は
ペニシリン生合成を増加することが示された。本発明は
IPNS及びAT遺伝子クラスターの増巾によりペニシリン生
産を増加する。
本発明で用いる微生物には、アクチノミセテス（Acti
nomycetes）又はフラボバクテリウム（Flavobacteriu
m）の系統に属するような細菌、又はアスペルギラス（A
spergillus）、アクレモニウム（Acremonium）又はペニ
シリウム（Penicillium）属に属する菌類（イーストを
含む）を含む、原核生物及び真核生物両方を含む。
原核性又は真核性、ゲノム又はcDNA等、フラグメント
の由来に依存して種々の発現カセットを構築し得る。細
菌由来のゲノムDNAの場合、モノー又はポリシストロニ
ックコーディング領域を含むフラグメントはそれ自身の
転写開始制御領域の他に転写終止領域及び例えばシャイ
ンダルガルノ配列及び終止コドン等の適当な翻訳シグナ
ルを含む。ゲノムDNAが菌類由来の場合通常唯一の遺伝
子が転写開始制御領域が会合しており、その結果各遺伝
子は、それ自身独立した転写開始制御領域を有する。cD
NAを用いる場合、ひき続く発現に用いられる宿主m.o.に
依存して適当な転写開始制御領域を提供する必要があ
る。
目的遺伝子はβ−ラクタム高生産株又はその野生型祖
先の遺伝子ライブラリー（例えばゲノム又はcDNAライブ
ラリー）からランダムに入手できるし、また抗生物質生
合成において律速となる遺伝子を含む一群のライブラリ
ーから選択し得る。特に価値ある遺伝子とは当分野で知
られているβ−ラクタム生合成酵素（例えばトリペプチ
ドシンセターゼ（ACVS）、シクラーゼ（IPNS）、アシル
トランスフェラーゼ（AT）、エピメラーゼ、エキスパン
ターゼ、ヒドロキシラーゼ、トランスアセチラーゼ、ト
ランスカルバモイラーゼ、メトキシラーゼ）をコードす
る遺伝子を含む、抗生物質生合成の際に特別的に発現さ
れるものが含まれる。イソペニシリンＮシンセターゼ及
びアシルトランスフェラーゼの両方をコードする遺伝子
が大量に投与されるか、又は発現され、結果としてその
形質転換した菌類において高収率で目的抗生物質が生成
することが望ましい。
β−ラクタム生産宿主において発現される遺伝子が、
その宿主細胞のRNAポリメラーゼにより認識される自分
自身の本来のプロモーター配列を有しているか、又は他
の適当なプロモーター、例えば種々のβ−ラクタム生合
成遺伝子のプロモーター、又はホスホグリセレートキナ
ーゼ、グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼなど解糖遺伝
子のプロモーター又は翻訳延長因子、Ef−Tuのプロモー
ター等に連結し得ることは当業者には当然の事であろ
う。
このようなプロモーターの使用は、上記酵素をコード
する１個以上の遺伝子の発現制御に影響し得る。ペニシ
リン生産が、非形質転換宿主株ではペニシリン生産を誘
導しない条件、例えば解糖酵素はグルコース存在下で発
現されるが、一方ペニシリン生産はグルコース存在下で
抑制されるというような条件下で可能であるので（J.F.
マーチン（Martin）、上述）、このことは形質転換後の
抗生物質生産増加に導く。解糖遺伝子のプロモーターの
制御下、ペニシリン生合成遺伝子を発現させることによ
り、この遺伝子はグルコース存在下でも発現し得、それ
により十分な量の菌糸体の発生に高濃度のグルコースが
必要である時、発酵の初期にペニシリンが生成し得る。
またこのようなプロモーターの制御下に選択マーカーも
含め得る。
ペニシリウム（Penicillium）の形質転換に対して形
質転換細胞の選択用の少なくとも１つのマーカー及び好
ましくは組込みDNAの保持を高める領域を含む構築物が
用いられる。それゆえベクターには形質転換効率を増加
することが知られているDNA配列が含まれることが望ま
しい。このようなDNA配列の例としてはアスペルギラス
・ニドウランス（Aspergillus nidulans）から単離され
る“ans"要素がある（バランス（Ballance）及びターナ
ー（Turner）、ジーン（Gene）、36（1985）321−331参
照）。上述の特許出願は、“ans"配列の効果に似た効果
を有する配列と同定された、P.クリソゲナム（chrysoge
num）のゲノムから単離されるDNA配列を提供している。
この配列はP.クリソゲナム（chrysogenum）由来のもの
であるので、P.クリソゲナム（chrysogenum）における
形質転換効率を増加するのに使用し得る。このDNA配列
はP.クリソゲナム（chrysogenum）pyr G遺伝子を含み、
かつ単独、上記DNA配列がトランスホーマントの選択及
び形質転換増加効果の両方を提供する、pys G−宿主と
組合せて（EP−Ａ−260762参照）、又は他の選択マーカ
ー、例えばフレオマイシン（phleomycin）などの殺菌剤
耐性をコードする遺伝子と組合せて使用し得る。後者の
場合、トランスホーマントの選択及び形質転換増加効果
は２個の別々のDNA配列により提供され、またpyr G要素
の単一の機能は形質転換効率の増加である。
トランスホーマントクローンの有用な選択マーカー
は、例えばアルギニン等のアミノ酸、例えばウラシル等
のヌクレオチド前駆体等への代謝経路の欠陥のより引き
起こされる宿主細胞の栄養要求を相補し得る同種又は異
種の生合成遺伝子である。
選択マーカーを提供する構造遺伝子は野生型ペニシリ
ウム（Penicillium）宿主本来のものでもよいし、又宿
主内で機能し得る異種の構造遺伝子でもよい。例えば代
謝経路の酵素をコードする構造遺伝子はペニシリウム
（Penicillium）由来のものでもよいし、又は例えばア
スペルギラス（Aspergillus）、ニューロスポラ（Neuro
spora）、ポドスポラ（Podospora）又はイースト等、そ
の構造遺伝子がペニシリウム（Penicillium）宿主中で
機能し、かつ栄養要求株を原栄養株へと相補する、他の
繊維状菌類由来のものでもよい。
この相補構造遺伝子は、プリン又はピリミジン（ヌク
レオシド）又はアミノ酸の合成などの代謝経路に由来す
るものである。例えば酵素オロチジン−５′−ホスフェ
ートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子（pyr G又
はpyr 4）などのピリミジン経路の酵素をコードする構
造遺伝子が特に興味深い。その他の遺伝子には、例えば
オルニチン・カルバモイル・トランスフェラーゼ（arg
B）及びアルギニノーサアクシネート・リアーゼ（arg
4）などのアミノ酸生合成遺伝子がある。上記の選択マ
ーカーの使用法は、EP−Ａ−260762に提供されている。
栄養要求マーカーに代って、唯一の炭素源又は窒素源
としてのアミドの使用能力又は例えばガラクトースなど
の種々の糖での生育能力等の発酵マーカーも使用し得
る。
さらに、例えばヒグロマイシン、ゲンタマイシン、フ
レオマイシン、グリホセート、バイアラホス等の殺菌剤
耐性をコードする遺伝子も使用し得る。
目的配列を含む構築物が提供され、かつこれは例えば
クローニング宿主及び、又は二次代謝産物の発現を目的
とする標的宿主等１種以上の宿主における複製システム
のような他の機能、すなわち上記の１種以上の宿主にお
ける１個以上の選択マーカー、形質転換効率を高める遺
伝子又は他の特定の機能を含み得る。
この構築物は少なくとも１個の遺伝子、好ましくは２
個以上の遺伝子を含む。この構築物は適当な宿主由来の
他の望ましい遺伝子の単離、その遺伝子の全部又は一部
の合成、又はこれらの組合せによる従来法により合成さ
れる。同様に、制御シグナル、すなわち転写及び翻訳開
始及び終止領域は、天然のものから単離されるか、又は
合成されるか、もしくはそれらを組合せて得られる。種
々のフラグメントについてエンドヌクレアーゼ消化（制
限処理）、ライゲーション、配列決定、インビトロ突然
変異誘発、プライマー修復等が行なわれる。これらの種
々の操作は、文献によく示されており、かつ特定の目的
を達成するのに使用される。
種々のフラグメントは従来法に従がい、結合、クロー
ン化、単離及び配列決定を行ない得る。各操作の後、DN
Aフラグメント又はそれらフラグメントの組合せをクロ
ーニングベクターに挿入し、そのベクターにより、例え
ば大腸菌等のクローニング宿主を形質転換し、このクロ
ーニング宿主を生育させ、溶菌した後、プラスミドを単
離してからそのフラグメントを制限分析、配列決定又は
それらを組合せて分析する。また大腸菌は大量のタンパ
ク質を生産する目的で、目的とする遺伝子を発現する宿
主として用いる。
構築物の開発及び宿主細胞の形質転換の際には種々の
ベクターが用いられる。これらのベクターにはクローニ
ングベクター、発現ベクター及び宿主への組込みを提供
するベクター又は形質転換及び組込みのための裸のDNA
の使用が含まれる。
ほとんどの場合、クローニングベクターは、クローニ
ングベクターを含む宿主の選択マーカー及び形質転換促
進配列による特徴を有しているが、場合によっては、１
個以上のポリリンカー、又は挿入、選択、操作、配列決
定、切断等に適する付加的配列を含む。
発現ベクターは通常転写及び翻訳開始及び終止領域を
含む構築物の挿入を提供する。すなわち構築物はそれら
制御領域の１つ又は両方を欠いており、そのタンパク質
産物をコードする配列の挿入した発現ベクターにより提
供される。
目的の酵素をコードするDNAは、EP−Ａ−260762に記
述されている操作に従がいペニシリウム（Penicilliu
m）宿主に導入される。
ペニシリウム（Penicillium）の効率的形質転換は、
特に宿主ゲノムに組込まれた（インテグラント）発現し
得る１個以上の構造遺伝子を有するトランスホーマント
を提供する。形質転換宿主細胞の選択を可能とするDNA
構築物を調製する。高頻度の形質転換が可能となる形質
転換条件を適用し、目的とする構造遺伝子を発現する形
質転換宿主の選択及び単離を保証する。生成したトラン
スホーマントは、組込みDNAの安定的保持及び発現を提
供する。本発明に従う形質転換宿主は、他のDNA仲介形
質転換、例えば原形質融合、交配及び突然変異等の株改
良法における出発株として用い得る。生成した株は本発
明の一部を形成すると考える。
形質転換により導入した目的遺伝子は、その形質転換
ベクターの組込み部分を形成しているが、しばしばその
形質転換混合物中の別のベクター上にこれらの遺伝子を
乗せておき、繊維状菌類の場合には非常に効率的プロセ
スである、選択ベクターとのコトランスホーメーション
により該遺伝子を導入する方がより簡便である（例え
ば、P.J.プント（Punt）等、ジーン（Gene）56（1987）
117−124;K.ワーナース（Wernars）等、モレキュラー・
アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Mol.Gen,Gene
t,）209（1987）71−77;I.E.マターン（Mattern）等、
モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス
（Mol.Gen,Genet,）210（1987）460−461）。
形質転換の結果、目的遺伝子の少なくとも１コピー、
しばしば２個以上で通常約100個以下、より普通には約1
0個以下のコピーが存在する。その数は組込み又は安定
なエピソーム的維持が行なわれるかどうか、組込まれた
コピー数、該構築物が増巾を受けているかどうか等に依
存する。
選択種のゲノムライブラリーからの目的遺伝子の単離
には、当分野でいくつかの方法が知られている（例え
ば、マニアチス（Maniatis）等、モレキュラー・クロー
ニング、1982、ラボラトリーマニュアル）。我々はペニ
シリンの生合成に関する遺伝子の単離に特定のスクリー
ニング法を採用した。
ラクトース生育菌糸体（生産性）及びグルコース生育
菌糸体（非生産性）からmRNAを単離した。両mRNA群から
ラベル化cDNAプローブを合成し、生成したcDNAプローブ
濃縮後（非生産性mRNAにハイブリダィズする全てのcDNA
の除去による）、生産性cDNAプローブにのみハイブリダ
ィズするゲノムクローンを単離した。操作の詳細は例２
に示す。このように単離した大量のクローンはペニシリ
ン生合成酵素インペニシリンＮシンセターゼ（IPNS又は
シクラーゼ）をコードしている様である。
さらに、これらのクローンの中に、側鎖交換酵素（ア
シルトランスフェラーゼ）をコードする数コピーの遺伝
子が存在することが分った。このことは精製した酵素の
アミノ末端ペプチド配列に基づくDNAプローブを採用し
た実験で証明された。これらのクローンの同一性は生化
学的及び生物学的に証明された。アシルトランスフェラ
ーゼ遺伝子のヌクレオチド及び推定されるアミノ酸配列
を第３図に示す。驚くべきことに、イソペニシリンＮシ
ンセターゼ及びアシルトランスフェラーゼ酵素をコード
する遺伝子が１つのDNAフラグメント上に一緒に存在し
ている。このことはラムダベクターEMBL3におけるP.ク
リソゲナム（chrysogenum）のゲノムライブラリーの、
各々の遺伝子に特異的なプローブによるハイブリダイゼ
ーションで示された。同一のクローンが両方のプローブ
と別々にハイブリダィズした。
さらに、１つのゲノムラムダクローンの物理マップ構
築、及びそのラムダクローン制限断片の、両遺伝子に対
する別個のプローブによるハイブリダイゼーション後、
そのゲノム構成は第２図に示したものであることが示さ
れた（クローンB21及びG2）。１個の大きいDNAフラグメ
ント上における両遺伝子の存在が両遺伝子の相対的構成
又は均衡のとれた発現を乱すことなく、両イソペニシリ
ンＮシンセターゼ及びアシルトランスフェラーゼ遺伝子
を高い密度で含むP.クリソゲナム（chrysogenum）の構
築を可能にした。さらに、多数のその大きいDNAフラグ
メントの導入は、正常な状態と同様の上流及び下流の配
列を含む自然な環境で、そのDNAフラグメント上の両遺
伝子を発現させる。
均衡のとれた発現及び自然環境の維持の両方が以後
〔IPNS＋AT〕遺伝子クラスターと呼ぶ両AT及びIPNS遺伝
子を含むDNA構築物を含むトランスホーマントにおける
ペニシリンの増産（40％まで）により例示されるよう
に、遺伝子発現、従ってペニシリン生産の効率増加に有
利であることが分った。従って、AT及びIPNSをコードす
る遺伝子のクラスター化がペニシリウム（Penicilliu
m）の株改良にうまく適用された。IPNS遺伝子のみを含
むDNA構築物の導入はペニシリンの増産をもたらさなか
った（スカトラド（Skatrud）等、上述）。
さらに本発明は染色体歩行（すなわち１つの組換えク
ローンから出発して、その出発クローンに近く、かつそ
のゲノム由来の重複する情報を含む他の組換えクローン
を単離する技術）により、β−ラクタム抗生物質生合成
に関する別の遺伝子の単離における、本〔IPNS＋AT〕遺
伝子クラスター単離の有効な応用法を提供する。このこ
とは、IPNS遺伝子との相同性に基づくコスミドクローン
の単離、及び〔IPNS＋AT〕遺伝子クラスターによりコー
ドされる酵素活性を含むことが知られている非生産突然
変異体の上記コスミドクローンを用いた相補性により例
示される。それゆえ、IPNS及びAT遺伝子のクラスター化
はペニシリン生合成に関する別の遺伝子、すなわちACVS
遺伝子の単離にうまく応用された。また、このACVS遺伝
子も〔IPNS＋AT〕遺伝子クラスターにクラスター化さ
れ、コスミドHM193上に存在する。本発明を明確に定義
するため、第８図に上記コスミドの物理マップを示し
た。さらにこのコスミドクローンはCBS179、89として登
録した。第８図にはアガロースゲル電気泳動を用いたサ
イズ測定実験で測定した制限酵素切断部位のおよその位
置が示してあり、かつ必しも示されているDNA上の全て
の制限部位を示す意図はないことを理解すべきである。
コスミドHM193中、例えば制限タンパク質をコードする
ような他の遺伝子の存在はまだ排除し得ない。ACVSをコ
ードする遺伝子は単離されているので、ペニシリン生合
成経路（第１図参照）はクローン化されており、かつイ
ースト等の微生物の中に導入し得る。
さらに、本発明は抗生物質が合成される条件下で特異
的に発現し、かつその抗生物質生成への生合成反応を触
媒する遺伝子産物をコードする遺伝子を有する形質転換
したペニシリウムクリソゲナム（Penicillium chrysoge
num）で例示される。
このような１つの酵素アシルトランスフェラーゼ（以
後ATと呼ぶ）は、ペニシリン生合成の最終ステップ、す
なわちイソペニシリンＮのアミノアピジル部分の、例え
ばフェニル酢酸又はフェノキシ酢酸等の疎水性側鎖前躯
体による交換を触媒し、各々ペニシリンＧ又はＶを生成
する。
P.クリソゲナム（chrysogenum）のアシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子で、その配列が同じアミノ酸配列をコー
ドするが、30％もの異なる塩基、より普通には多くとも
約10％の異なる塩基を有する保存的突然変異、又は、約
10％以下、より普通には約５％以下、好ましくは多くと
も約１％のアミノ酸が天然のアミノ酸と比較して置換又
は欠失しており、かつ５％以下の挿入アミノ酸を有する
非保存的突然変異をもつものが提供されている。さら
に、通常約９個のコドン、より普通には少なくとも約15
個のコドンからなる、その酵素をコードする両核酸のフ
ラグメントが、それらの発現産物と同様、抗体生産のた
めのプローブ等として用いられる。このプローブはハイ
ブリダイゼーション用の核酸又は交叉反応タンパク質同
定用の抗体を用いることによる、異種生物中の酵素の同
定に用いる。
その他の酵素ACVSは、β−ラクタム抗生物質ペニシリ
ン、セファロスポリン及びセファマイシンの生合成の第
１ステップ、すなわち三個のアミノ酸、Ｌ−α−アミノ
アジピン酸、Ｌ−システィン及びＬ−バリンのトリペプ
チドδ−（Ｌ−α−アミノアジピル）−Ｌ−システイニ
ル−Ｄ−バリンへの縮合を触媒する。ACVS遺伝子はコス
ミドHM193の形で提供される。このコスミドの一部又は
全部は、ACVS酵素をもコードする、他種生物のDNAフラ
グメントを同定するためのハイブリダイゼーションプロ
ーブとして用いる。またこのクローンはハイブリッド捕
捉インビトロ翻訳実験でも用いられ、そこでは第１ステ
ップとして、これにハイブリダィズするのに十分な、こ
のクローンに対する相同性を有するmRNA群が単離され
る。第２ステップは、該mRNA群の単離及び当分野で知ら
れているインビトロ翻訳システムを用いた機能タンパク
質への翻訳である。このようにして単離したタンパク質
は例えば活性テスト又は抗体の生産に用い得る。
AT−、ACVS−、Ｔ−及びその他のペニシリン生合成遺
伝子の単離は、プロモーター、上流活性化配列（UA
S）、ターミネーター等の個々の遺伝子の制御要素の同
定を可能とする。このことはそれら自身の中の遺伝子配
列比較及びイソペニシリンＮシンセターゼ生合成遺伝子
及びその他の関連遺伝子から得られた配列との比較によ
って行ない得る。さらに後者の比較は、ペニシリン生合
成遺伝子群の遺伝子発現制御の特異的性質を明らかにし
得る。
このような“ペニシリン生合成制御要素”の同定は、
ゲル遅延法、クロスリンク法、DNAフットプリティング
法等の標準技術により、特定の制御タンパク質の同定を
誘導する。アフィニティークロマトグラフィーによる特
定の制御タンパク質の単離は該タンパク質をコードする
遺伝子のクローニング及び適当な宿主における操作を可
能とする。
クローン化したAT遺伝子、ACVS遺伝子、Ｙ遺伝子及び
その他のペニシリン生合成遺伝子を用いることにより、
修正した酵素の設計及び合成が行ない得る。これらの修
正は至適pH又は至適温度の変化、安定性の変化又は基質
特異性の変化などの酵素の特性を変化させる。これら修
正した酵素をコードする遺伝子で形質転換した宿主株は
異なる条件下での抗生物質の合成、又は、例えばペニシ
リンの代わりにアンピシリンなど、別の抗生物質の合成
を行なうよう計画し得る。
本発明のもう１つの特徴には、このクローン化遺伝子
を、これら酵素を天然には有しない宿主株の形質転換に
用いることがあげられる。ストレプトマイセス（Strept
omyces）及びアクレモニウム（Acremonium）はAT酵素を
有さず、一方ペニシリウム（Penicillium）は、セファ
ロスポリン及びセファマイシン生合成遺伝子を欠いてい
ることが知られている。
これら宿主への上記遺伝子の導入は、ペニシリウム
（Penicillium）によるセファロスポリン又はセファマ
イシンの生合成又は、アクレモニウム（Acremonium）に
よる疎水性側鎖を有するペニシリン又はセファロスポリ
ンの生合成を誘導する。さらに、このことは、アクレモ
ニウムクリソゲナム（Acremonium chrysogenum）にお
けるペニシリウム クリソゲナム（Penicillum chrysog
enum）〔IPNS＋AT〕遺伝子クラスターの発現により例示
される。
次に示す結果から、二次代謝産物生産は、二次代謝産
物生産と関連するDNA配列の同定を可能とするスクリー
ニング操作を用いることにより大巾に増加し得ることは
明白である。二次代謝産物と関連する特異的配列の同定
においてい消去法（Subtraction method）を用いること
により、プローブとして使用するためmRNA及びcDNAを単
離及び同定する。従ってまだ機能が分っていない潜在的
遺伝子を含むフラグメントが二次代謝産物の生産を非常
に増加することが分り、かつこの二次代謝産物の生産の
ため宿主の形質転換に用いられる。この操作は特にペニ
シリンについて例示される。
さらに、β−ラクタム化合物を修飾する酵素として、
ラベルとして、アシルトランスフェラーゼに対する抗体
生産のための抗原源として、プロモーター配列源とし
て、結晶化のための大量のタンパク質発現源として、修
正された特性を有する酵素を得るためのインビトロ突然
変異誘発のテンプレートとして等、巾広い用途があるこ
とが分ったアシルトランスフェラーゼ遺伝子が提供され
た。〔IPNS＋AT〕遺伝子クラスターへのAT遺伝子の導入
はトランスホーマントにおけるペニシリン生産を大巾に
増加させる。さらにこのクラスター化遺伝子型は、ペニ
シリン生合成に関する他の遺伝子、すなわちACVSをコー
ドする遺伝子の単離に使用された。アクレモニウムクリ
ソゲナム（Acremonium chrysogenum）への、この遺伝子
クラスターの導入は、アクレモニウムクリソゲナム（Ac
remonium chrysogenum）によりこの遺伝子クラスターの
発現及びペニシリンの生産を誘導する。
さらに、ACVSをコードする遺伝子を含むコスミドクロ
ーンも提供される。ATをコードする遺伝子同様の、この
遺伝子は先に述べた用途に使用し得ることが分る。別の
（制御）遺伝子がコスミドHM193上に存在することも可
能である。
この明細書に記述されている全ての出版物及び特許出
願を、各々個別の出版物又は特許出願を具体的かつ個別
に参考として引用した場合と同様に、参考として引用す
る。
本発明は、より明確な理解を目的として説明及び例に
より詳細に記述されているけれども当業者にとって本発
明が特許請求の範囲の精神又はその範囲を逸脱すること
なしに、ある変化及び修正が可能であることは明らかで
あろう。
次に示す例は説明を目的とするもので、本発明を制限
するものではない。
（例 １） ペニシリウムクリソゲナムのゲノムライブラリーの構築 ペニシリウムクリソゲナム（Penicillium chrysogen
um）（ATCC28089）のゲノムライブラリーは、実質的に
当分野でよく知られている方法に従がい構築した（T.マ
ニアチス（Maniatis）等（1982）モレキュラークローニ
ング、ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハ
ーバーラボラトリー、N.Y.）。先にEP−Ａ−260762で説
明されているように、菌糸体から原形質体を生成するこ
とにより、染色体DNAをペニシリウムクリソゲナム（Pen
icillium chrysogenum）から抽出した。
その後、４倍容のTESバッファ（0.05Mトリス−塩酸pH
8.0、0.1M EDTA、0.15M NaCl）で登張（0.7M KCl）サ
スベンジョンを希釈することにより、この原形質体を溶
解した。この溶解物に１％ラウリル硫酸ナトリウムを加
え、この混合物を55℃で30分間インキュベーションし
た。フェノールで１回及びクロロホルムで２回抽出した
後、DNAをエタノール沈殿し、乾燥後TEバッファ（10mM
トリス、1mM EDTApH8.0）に溶解した。さらにこのDNA
溶液を100μg/mlのRNaseを用い、37℃で１時間処理した
後、さらに200μg/mlのプロティナーゼＫを用い、42℃
で１時間処理した。この溶液をフェノールで１回及びク
ロロホルムで２回抽出した。等容量のイソプロパノール
を水層の上に重層し、これをガラス棒でかき回しながら
その界面に析出するDNAを回収した乾燥後このDNAをTEバ
ッファに溶解した。このようにして得たDNA調製物の分
子量は約108であった。このDNAをSan 3Aで部分消化し、
Bam H Iで切断した脱リン酸化EMBL3（プロメガバイオテ
ク、マジソンWI、USA）にライゲーションした後、プロ
メガバイオテク製のパッケージーンシステム（Packagen
e System）を用いてパクテリオファージラムダカプシド
中に包み込んだ。パッケージ反応を22℃、２〜３時間行
ったこと以外は、全ての反応は業者の説明に従って行っ
た。パッケージ化ファージをプレーティングし、37℃で
７〜８時間インキュベーション後ペトリ皿当り4mlのSM
バッファ（0.1M NaCl、0.01M MgSO4、0.05Mトリス・
塩酸pH7.5、0.01％ゼラチン）を用いてファージを溶出
することによりライブラリーを増巾した。
（例 ２） 分画スクリーニング法を用いたペニシリン生合成中に特
別に発現する遺伝子の単離 ペニシリン生合成の際に特別に、又は著しく発現する
遺伝子を生産性（ラクトース生育）及び非生産性（グル
コース生育）菌糸体から抽出したmRNAテンプレート上で
合成したラベル化cDNAプローブを用いて、例１のゲノム
ライブラリーを検索し、かつ先の（＋）プローブで著し
くポジティブシグナルを与えるクローンを選択すること
により同定した。
メッセンジャRNAは生産培地中（例３参照）（＋調
製）又はラクトースをグルコースで置換えた同培地（−
調製）中３日又は６日間増殖した培養物から単離した。
その菌糸体を濾過で回収し、液体窒素中で凍結してから
ホモジナイズ後、mRNAをT.マニアチス（Maniatis）等の
グアニジンイソチオシアネート法（上述）を用いて単離
した。
12.5 mM MgCl2 50 mM トリス−HCl pH8.3 100 mM KCl 125 mM DTT 2 u/μ アールエヌエイシン 500 μＭ dGTP 500 μＭ dCTP 500 μＭ dTTP 25 μＭ dATP 0.1 μg/ml BSA 100−200 μg/ml ポリA+RNA 50−60 μg/ml オリゴdT12-18 1.2 u/μ 逆転写酵素 1.67 μCi/μ 〔α−32P〕dATP を含む30μの反応混合物中（ポリA+RNA及びオリゴdT
は別に混合し、反応混合物に添加する前に１分間100℃
に加熱し、ついで氷水で冷却する）、両mRNAに対してcD
NAを合成し、かつ〔α−32P〕dATPを用いて高比活性の
ラベル化を行った。42℃、１時間のインキュベーション
の後、５μの1mM dATPを加え、さらに30分間インキ
ュベーションを続けた。つづいて、この反応混合物を20
mM EDTA、40mM NaOH（最終体積100μ）としてから6
5℃に加熱した。１時間のイキュベーション後、５μ
の1Mトリス・塩酸（pH8.3）、40μの0.1N HCl、７μ
ｇ仔牛胸腺DNA、100μTESバッファ（10mMトリス、1mM
EDTA、１％SDSpH7.5）及び200μの5M酢酸アンモニ
ウムを加えてから800μのエタノールを用い、−20
℃、16時間でDNAを沈殿した。
沈殿を遠心で回収し、70％エタノールで洗浄後乾燥し
てから32μのTEバッファ（10mMトリス、1mMEDTApH8.
0）に溶解した。その後、（＋）cDNA調製物について、 32.5μ （＋）cDNA 10 μ （−）mRNA（１μg/μ） 30 μ 1M NaPO4pH6.8 1.5μ 10％ SDS 1 μ 0.5M EDTA を含む75μの反応混合物中、（−）mRNA調製物に対す
る連続する２回のハイブリダイゼーションにより、ペニ
シリン生合成の際に特に発現される配列の濃縮を行っ
た。
68℃16時間のインキュベーション後、102μの水を
添加し（最終リン酸濃度170mM）、68℃でこの混合物を1
70mMリン酸で平衡化したハイドロキシアパタイトカラム
に通した。これらの条件下、二本鎖核酸はカラムに結合
するが、一本鎖核酸は溶出する。この溶出物を回収し、
TEバッファに対して1.5時間透析した後、４μｇのキャ
リヤー（仔牛胸腺）DNAを添加してエタノール沈殿を行
った。この操作を繰り返し、最終的に未結合のcDNAを以
下に示すようにペニシリウム（Penicillium）株のゲノ
ムライブラリーのスクリーニングプローブとして直接使
用した。
例１の増巾ライブラリーのサンプルを、ペトリ皿当り
約1500個のプラークを含めるように５枚のペトリ皿に添
加した。このプレートの複製を業者の説明に従がいジー
ン・スクリーンプラスフィルターに作った（ニューイン
グラントニュークリア）。１組のフィルターをラベル化
濃縮（＋）cDNA調製物で探った。コントロールとして複
製をラベル化（−）cDNAで探った。
ポジティブプラークを精製し、第２のスクリーニング
を行った。このようにして（＋）cDNAプラークに対し著
しくポジティブシグナルを与える96個のプラークを選択
した。
最初のスクリーニングにおいて強又は中のシグナルを
与える組換えファージのDNAを32Pでラベル化し、生産及
び非生産菌糸体での発現レベルを測定するための、両菌
糸体由来のペニシリウム（Penicillium）RNAのノーザン
ブロットを探るプローブとして用いた。このことから組
換えクローンは３つのグループに分けられる。
クラス１はペニシリン生合成の際に非常に発現される
遺伝子を含み、そしてクローン ＊G2 and B21 ＊B9,L5and G5 ＊L12 ＊K9 で例示される。
クラス２は中程度に発現し、 ＊C12 ＊P3and K11 ＊B13 ＊B20 で例示される。
クラス３は発現は低く、 ＊G3 ＊G1 ＊K16 ＊L10 ＊B23 で例示される。
組換えファージG2及びB21の物理マップを第２図に示
す。クローンG2及びB21をイソペニシリンＮシンセター
ゼ特異的プローブで探るとポジティブのハイブリダィゼ
ーションシグナルを与える（S.M.サムソン（Samson）
等、上述）。驚くべきことに同クローンはアシルトラン
スフェラーゼ特異的プローブともハイブリダィズするよ
うである（例５参照）。
例 ３ アシルトランスフェラーゼの精製 ペニシリウムクリソゲナム（Penicillium chrysogen
um）株（ATCC28089）を、コーンひたし液（20g/）、
酒造溶質物（20g/）、スクロース（20g/）、CaCO3
（5g/）（滅菌前pH5.7）を含む複合接種培地に接種す
る（２×106コニジア/ml）。36時間、25℃、250rpmのイ
ンキュベーション後、得られた培養物を、コーンひたし
液固形物（35g/）、ラクトース（25g/）、フェニル
酢酸カリウム（2.5g/）、MgSO4・7H2O（3g/）、KH2
PO4（7g/）、コーン油（2.5g/）、CaCO3（10g/）
を含む20倍容の複合生産倍地の接種に用いた。48時間の
インキュベーション後、濾過により菌糸体を回収し、そ
の濾過固形物を冷0.15M NaClで４回洗浄した。
菌糸体200g（湿重量）を5mMのジチオスレイトールを
含む0.05Mトリス−塩酸（pH8）（以後TDバッファと呼
ぶ）700mlに懸濁し、エタノール／ドライアイス浴で冷
やしながら、バロチニガラスビーズ（シグマ社Ｖ型、径
450〜500μｍ）を用い、ブラウン製デスインテグレータ
ー（ブラウン社、メルサンゲン・F.R.G.）中、15秒の間
隔を置いた30秒間の処理で破壊した。その後、この抽出
物を20,000×g30分間で遠心した。この操作及び以後の
操作は４℃で行った。抽出物640mlに、0.05Mトリス−塩
酸（pH8）中10％w/vの硫酸プロタミン溶液27mlを緩やか
に加えた。45分間の撹拌後、沈殿する核酸を20,000×ｇ
の遠心で除去し、その上清を、溶液pH8.0を維持しなが
ら硫酸アンモニウムを添加することによる沈殿化で分画
した。40％及び55％飽和の間に沈殿するフラクションを
1M硫酸アンモニウムを含むTDバッファに溶解し、同バッ
ファで平衡化したフェニルセファロースCL−4Bカラム
（1.8×16cm）にかけた。5ml/minの流速でTDバッファを
流すことにより未結合タンパク質の放出がなくなるまで
カラムを洗浄した。
その後、0.05Mトリス・塩酸（pH8.0）中40％のエチレ
ングリコール溶液を用い、カラムからアシルトランスフ
ェラーゼを溶出した。
この溶出フラクションについて、最終容積200μ
中、0.2mMフェニルアセチル補酵素Ａ、0.2mM6−アミノ
ペニシラン酸、5mMジチオスレイトール、0.1Mトリス−H
Cl（pH8.0）及び酵素抽出物を含む反応混合物中25℃で
インキュベーションすることにより、アシルトランスフ
ェラーゼ活性の検定を行った。10分後、200μのメタ
ノールを加えることにより反応を停止した。このサンプ
ルを5000×ｇで遠心し、従来の微生物学的又はクロマト
グラフ的方法により、その上清におけるペニシリンＧを
検定した。
フェニルセファロースカラムからの活性フラクション
を集めて、TDバッファで平衡化したDEAE−セファロース
カラム（1.5×20cm）にかけ、0.25ml/minの流速でTDバ
ッファ中０−0.25M NaClの直線濃度勾配を用いてアシ
ルトランスフェラーゼ活性を溶出した。集めた活性フラ
クションを70％硫酸アンモニウムで沈殿させ、そのペレ
ットを3mlのTDバッファに溶解した後、TDバッファで平
衡化したセファデックスＧ−75（粗）カラム（2.6×70c
m）にかけた。
9ml/hの流速のTDバッファを用いてアシルトランスフ
ェラーゼを溶出し、アシルトランスフェラーゼ活性をも
つタンパク質の対称ピークとして得られたフラクション
の後半の部分を回収した。最終精製度は258倍であっ
た。
例 ４ アシルトランスフェラーゼのアミノ末端アミノ酸配列決
定及びそれに対応するオリゴヌクレオチドプローブ混合
物の設計 例３で得られた酵素調製物をSDS−PAGEゲルにかけた
（U.K.レムリ（Laemmli）、ネイチャー（Nature）、227
（1970）680ff）（13％アクリルアミド、50mA）。29kD
バンド（タンパク質約10μｇ）をSDSゲルから切り出
し、そのタンパク質をマルチフォーII/バブロットユニ
ット（LKB、0.8mA/cm2、90分、電極バッファ5mMホウ酸
ナトリウムpH8.0）を用い、PCGM−２メンブレン（ポリ
ブレン含浸グラスファイバー、ヤンセン（Jansen）、バ
ース（Beerse）、ベルギー）に電気泳動により転移させ
た。ブロッテイング後、そのPCGMメンブレンを25mM Na
Cl、10mMホウ酸ナトリウム（pH8.0）で４回洗浄し、空
気乾燥した。このようにして得たPCGM吸着タンパク質バ
ンドを気相シークエネーター（アプライドバイオシステ
ム社470a型）を用いてＮ−末端アミノ酸配列を分析し
た。以下の配列 が決定された。このアミノ酸配列の下線部分に従がい以
下に示すオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。
しばしば調製物中に存在する10kDバンドのアミノ末端
アミノ酸配列も決定したが、オリゴデオキシリボヌクレ
オチドプローブの構築には用いなかった。得られた配列
は、 であった。
例 ５ アシルトランスフェラーゼ遺伝子の同定 例２の多数のラムダクローンのDNAを制限エンドヌク
レアーゼSal Iで消化し、そのフラグメントを0.7％アガ
ロースゲルで分画し、ジーンスクリーンプラス（Genesc
reen Plus）に転移後、例４の〔32P〕未満ラベル化オリ
ゴヌクレオチド混合物とハイブリダィズさせた。ポジテ
ィブシグナルを示すクローンを標準法を用いた制限分析
によりマップ化した。組換えファージ、ラムダB21及び
ラムダG2由来の２個の代表的物理マップを第２図に示
す。オリゴデオキシリボヌクレオチド混合物はマップ上
に示されているEcoR I/Hind IIIフラグメントに特異的
にハイブリダィズした。このフラグメント及び隣接する
フラグメントをpTZ18/19（コナイテッドステートバイオ
ケミカルコーポレーション）に再クローン化し、ヌクレ
オチド配列分析を行った。決定された配列及び推定され
るアミノ酸配列を第３図に示す。
調製物中に存在する10kDのアミノ末端アミノ酸配列も
決定し、これが29kD配列の上流のDNA配列に相当するこ
とが分った。それゆえおそらくATは40kDのタンパク質と
して合成されるのであろう。このことは、約1500塩基の
長さを持ち、従って３′及び５′側に100塩基の非翻訳
領域を有するmRNAの長さ（38kDのタンパク質をコードす
るイソペニシリンＮシンセターゼのmRNAと同じ）から確
認される。
29kDのアミノ酸配列（Thr−Thr−Ala−Tyr−Cys−Gln
−Leu−Pro−Asp−Gly−Ala−Leu−Gln−Gly−Gln−Asn
−Trp−Asp−Phe−Phe−Ser−Ala−Thr−Lys−Glu−Al
a）及び10kDのタンパク質は２つのイントロンの存在を
明らかにした。第３のイントロンの存在が、10kDタンパ
ク質全体のアミノ酸組成及びその境界のコンセンサス配
列に基づいて推定される（D.J.バランス（Ballance）、
イースト（Yeast）２（1986）229−236）。この第３の
イントロンは、プライマー伸長及びコード領域及び非コ
ード領域由来のオリゴデヌクレオチドプローブを用いた
ノーザンブロットにより確められた。
例 ６ pPS47の構築 ホスホグリセレートキナーゼ（pgk）遺伝子を、ハイ
ブリダィゼーションプローブとして対応するイースト遺
伝子（ヒッツェマン（Hitzeman）等、上述）を用いた標
準法により、ペニシリウム（Pen−icillium）ゲノムラ
イブラリーより単離した（マニアチス（Maniatis）、例
１）。
P.クリソゲナム（chrysogenum）pgkプロモーターを1.
5kb Hind IIIフラグメントとしてpTZ18Rにクローン化
し、その中から望ましい配向のクローンを選択した。
つづいて、フレオマイシン耐性遺伝子を、pUT702（カ
イラ（Cayla）、トゥールースセデックス（Toulouse Ce
dex）、フランス）から単離した1.0kbのBam H I＋Bgl I
Iフラグメントとして、このクローンのポリリンカーのB
am H I部位にクローン化した。このpgkプロモーターは
以下の配列； をもつオリゴヌクレオチドを用いて、欠失させる配列を
ループアウトさせることにより、フレオマイシン耐性遺
伝子と読み枠が合うように融合した。
さらにこのオリゴヌクレオチドはATG部位（下線）にN
co I部位を導入する。
例 ７ 高い形質転換効率を有する形質転換ベクター（pPS54）
の構築 β−ラクタム生合成に関する非選択性遺伝子を相補又
は増巾する目的で、形質転換又は共形質転換により遺伝
子を導入するのに十分高い形質転換効率を有するP.クリ
ソゲナム（chrysogenum）を得るため、その形質転換ベ
クター中に形質転換促進剤が含まれることが望ましい
（アスペルギラス（Aspergillus）におけるans,D.J,バ
ランス（Ballance）及びG.ターナー（Turner）、ジーン
（Gene）、36（1985）321−331参照）。驚くべきこと
に、P.クリソゲナム（chrysogenum）中で機能する形質
転換促進配列は、P.クリソゲナム（chrysogenum）pyr G
遺伝子を含むDNAフラグメント中に存在する。このDNAフ
ラグメントはプラスミドpUC13のBam H I部位にクローン
化された4kbSan 3A部分フラグメントの一部を形成して
いる（J.メシング（Messing）、メソッド・イン・エン
ザイモロジー（Meth.Enzymol.）101（アカデミックプレ
ス、1983）、p20ff）。このプラスミドを以後pUC13::py
r Gと呼ぶ（EP−Ａ−260762参照）。
2.4kb EcoR Iフラグメントは、P.クリソゲナム（chry
sogenum）由来のホスホグリセレートキナーゼ（pgk）の
遺伝子のプロモーターの制御下、ストレプトアロティカ
ス・ヒンダスタナス（Streptoalloteichus hindustanu
s）のフレオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミド（pPS
47）中に含まれていた。生成した構築物はpPS54であ
る。
形質転換効率に関するpys Gフラグメントの促進効果
を以下の第１表に示す。
例 ８ ATクローン同定の生物学的及び生化学的確認 ATクローンの同定は、P.クリソゲナム（chrysogenu
m）のアシルトランスフェラーゼネガティブ突然変異
体、ATCC28089、npe8の相補性により確認した。
ATCC28089npe8株のウラシル要求誘導体、ATCC28089np
e8pyr G（CBS512.88）の２×107個の原形質体を、５μ
ｇの選択性プラスミドpUC13::pyr G及び15μｇのラムダ
B21DNAの混合物を用い、先に報告されている方法（EP−
Ａ−260762）により共形質転換した。
数百個のトランスホーマントが得られ、その中のコニ
ジアを回収して、ペトリ皿当り１〜10個のコロニーとな
る密度で、例１の複合生産培地にプレーティングした。
25℃、３日間のインキュベーション後、そのプレートに
ペニシリン感受性バチルスサチルス（Bacillus Subtili
s）インジケーター株を重層し、30℃で１晩インキュベ
ーションして、細菌地中に現れる阻害帯の大きさを測定
した。
ほとんど（75％）のトランスホーマントは、ペニシリ
ン非生産受容株npe8pyr Gと同じ大きさの、非常に小さ
い穴を示した。残りの25％は野生株、ATCC28089と同様
の大きな阻害帯を示した。先のクラスは、選択性プラス
ミドpUC13::pyr Gのみしか受け取らなかったが、一方後
者はpUC13::pyr G及びラムダB21の両方を受け取り、ペ
ニシリン生産能を保持していると結論づけられる。
両グルーブに由来するいくつかのトランスホーマント
クローンに対し無細胞抽出物中のAT活性レベルを以下の
方法で測定した。例３で説明したように２日間の培養後
菌糸体を回収し、洗浄後、液体窒素で凍結して破壊し
た。
各検定に対し、2.5gの粉砕菌糸体を5mMジチオスレイ
トール及び5mMEDTAを含む50mMのリン酸カリウムバッフ
ァ（pH8.0）に懸濁し（最終体積12.5ml）、25分間撹拌
した。無細胞抽出物は、このサスペンジョンを遠心（５
分間、1,000×ｇ）とすることにより得た。
AT活性は、2mlの無細胞抽出物を25℃で0.1mlジチオス
レイトール（10mg/ml）、0.2ml6−アミノペニシラン酸
（10mg/ml）及び0.2mlフェニルアセチル補酵素Ａ溶液
（20mg/ml）とともにインキュベーションすることによ
り検定した。
15分又は30分後、等容量のメタノールを加えることに
より反応を停止し、そのサンプルを遠心した（20分間、
5,000×ｇ）。それからこの上清について当分野で知ら
れているクロマトグラフ（HPLC）法により生成したペニ
シリンＧを検定した。典型的実験結果を以下の第２表に
示す。これらのデータは、形質転換株（３）及び（４）
において、AT活性レベルが、増加した遺伝子投入量と一
致して、野生型（５）の２〜３倍増加していることを示
している。
〔IPNS＋AT〕クラスターをpPS54にサブクローン化し
てpGJ0IA及びＢ（第６図参照）を得、また、pPS47にサ
ブクローン化してpGJ02A及びＢ（第７図参照）を得た。
5kbのSan IフラグメントT4DNAポリメラーゼの作用によ
りグラントエンド化し、T4DNAポリメラーゼ処理を行っ
たpPS54又はpPS47の唯一のHind III部位にライゲーショ
ンした。
例 ９ 潜在的遺伝子Ｙで形質転換した宿主株におけるペニシリ
ン生産の増加 ペニシリン生産に関することが同定された遺伝子の効
果を示すため、これら遺伝子の中の１つの遺伝子の、ペ
ニシリウム（Penicillium）宿主株への投入量を増加さ
せた。すなわち、ラムダクローンB9、25及びG5に含まれ
る遺伝子“Y"を3.0kb（bam H I＋Sph I）フラグメント
としてpPS47にサブクローン化した。生成した構築物pRH
05をP.クリソゲナム（chrysogenum）Wis54−1255（ATCC
28089）に形質転換し、フレオマイシン耐性クローンを
単離した。いくつかのクローンについて振盪フラスコ中
ペニシリン生産テストを行った。
単離した１個のトランスホーマントについて得られた
結果を以下の第３表に示す。
非形質転換宿主と比較して、このトランスホーマント
中の遺伝子Ｙの遺伝子投入量の増加は、サウザンブロッ
ト分析により確認した。本発明の方法により単離した潜
在的遺伝子Ｙの投入量の増加は、ペニシリン生産の実質
的増加をもたらした。
遺伝子Ｙの転写物のサイズはノーザンブロットハイブ
リダィゼーションで測定し、約1.0kb長である。
例 10 pGJ102Aで形質転換した宿主によるペニシリン生産の増
加 IPNS遺伝子単独に対し、〔IPNS＋AT〕遺伝子クラスタ
ーの、ペニシリン生産に関する効果を研究するため、AT
CC28089株（Wis54−1255）の２×107個の原形質体を、
ヨーロッパ特許出願EP−Ａ−260762で報告されている操
作を用い、pGJ02A（第６図）で形質転換した。トランス
ホーマントを30μg/mlのフレオマイシンで選択した。約
100個のトランスホーマント及び同数のコントロールト
ランスホーマント（ベクターpPS47のみで形質転換した
もの）について、例７で示したバイオアッセイ法を用い
て生産を分析した。コントロールトランスホーマントよ
りも有意に大きい径のハローを作る26個のトランスホー
マントについて振盪フラスコ中での生産を分析した。こ
れらのトランスホーマントのペニシリン生産を、８個の
コントロールトランスホーマントの平均ペニシリン生産
量と比較した。これら26個のトランスホーマントの平均
ペニシリン生産量はコントロールトランスホーマントの
平均値より18％多く、一方２個の選択したトランスホー
マントは平均的コントロールトランスホーマントよりも
約40％多いペニシリンを生産することが分った。それを
グラフ化したものを第９図に示す。従って、〔IPNS＋A
T〕遺伝子クラスターはP.クリソゲナム（chrysogenum）
の株改良を成功させた。
例 11 ペニシリウムクリソゲナムのコスミドライブラリーの構
築 P.クリソゲナム（chrysogenum）の染色体DNAを単離
し、例１で述べたような処理を行った。DNAの部分の消
化の後、20〜35kbのサイズの部分を単離し、標準操作に
従がい（例えばマニアチス（Maniatis）等、上述）、Ba
m H I消化したコスミドベクターpPS07（EP−Ａ−026076
2;第４図参照）にライゲーションした。このライゲーシ
ョン混合物をインビトロでパッケージ化し、ついで従来
法によりこのファージ溶菌液で大腸菌HB101（ATCC3369
4）の形質導入を行った。新鮮な形質導入コロニーをア
ンピシリン選択条件下10mlのＬ培地（１リットル当り10
gNaCl、10gバクトリプトン及び5gイーストエキストラク
ト）中で生育させた。コスミドDNAを単離し、EcoR I消
化により挿入DNAの存在をチェックした。コスミドを含
む挿入物を−20℃でマイクロプレート中に保存した。
例 12 IPNS遺伝子を含むコスミドHM193の単離 IPNS遺伝子及び大量の隣接領域を含むコスミドクロー
ンを単離するため、例12のコスミドライブラリーを、IP
NS遺伝子を含むクローンについてスクリーニングした。
当分野ではコスミドベクターがラムダベクターよりも
（９〜23kb）大きい挿入物を含む（20〜40kb）ことが知
られていることから、例１のファージラムダライブラリ
ーではなく、コスミドベクターを使用した。プローブと
して、P.クリソゲナム（chrysogenum）IPNS遺伝子のＮ
末端アミノ酸配列に基づく２個のオリゴヌクレオチド を使用した。このプローブは、当分野で知られている標
準法に従がいラベル化した（例えば、マニアチス（Mani
atis）等、上述）。
このプローブがハイブリダィズするコスミドを単離
し、IPNS遺伝子の存在を、サブクローニング、配列決定
及びL.カー（Carr）等（上述）による配列とのデータ比
較により確認した。全コスミドHM193の予備的物理マッ
プを第８図に示した。このコスミドクローンは、IPNS遺
伝子の上流のDNA約23kbを含んでいる。すなわちこのク
ローンは部分的ではあるがラムダクローンB21及びG2と
重複している（第２図参照）。
例 13 コスミドHM193による非生産突然変異体の相補 コスミドHM193（CBS179.89）上の、既知のIPNS遺伝子
以外の遺伝子の存在を研究するため、上記コスミドをpG
S02Aと共に、別のnpe株に共形質転換した。npe5株（CBS
178.89）はIPNS及びAT活性の両方を含むことが示され、
かつACVS活性を欠いている。IPNS遺伝子のみの形質導入
による相補を排除するため、構築物pGJ02Aのみを含むト
ランスフォーマントも分析した。形質転換は先に説明し
たように行ない、また（コ）トランスホーマントは先に
説明したバイオアッセイを用いて分析した。その結果を
第４表に示す。
第４表のデータは、コスミドHM194がnpe5の突然変異
を相補し得る一方、プラスミドpGJ02Aはこの突然変異を
相補しないことを示している。IPNS遺伝子から始まり、
ペニシリン生合成に関するその他の遺伝子が同定されて
いる。この遺伝子は、〔IPNS＋AT〕遺伝子クラスターの
一部を含む同コスミド上に存在し、しかも〔IPNS＋AT〕
遺伝子クラスターから23kb以内の場所に存在する。
例 14 コスミド193上に存在するACVS遺伝子の生化学的及び生
物学的確認 コスミドHM193上の遺伝子の１つがACVSをコードする
かどうかを研究するため、npe5株、構築物pGJ02Aのみに
よるこの株のトランスホーマント及びpGJ02A及びコスミ
ドHM193によるnpe5のコトランスホーマントのACVS活性
を測定した。
これらの株をラクトース及び0.75％フェノキシ酢酸を
含む生産培地中40時間生育させる。無細胞抽出物を調製
し、基本的にファンリンプト（Van Liempt）（H.ファン
リンプト（Van Liempt）等、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカルケミストリー（J.Biol.Chem.）264（1989）368
0−3684）による方法で測定した。バッファＡによる抽
出は30分間行った。この検定に使用したラベル化バリン
量は12.5μCiで行ない、反応は30分後に停止した。この
反応混合物を先に説明したように沈殿化し、ついでポラ
パクＱカラムにかけた。このカラムを2mlの平衡バッフ
ァで洗浄した後、２×1mlのメタノールで溶出した。ACD
含量をHPLCで定量した。100μのサンプルをRP18カラ
ムに注入し、室温で0.1mM DTTを含む50mM KH2PO4（pH
6.00）中10％メタノール溶液で溶出した。流速は1.0ml/
minで行ない、検出には200μセルを用いたバーソール
ドLB503ミンチレーション検出器を使用した。還元型の
トリペプチドと同じ保持時間のラベル化ピークを回収
し、そのラベル量を液体シンチレーションアナライザー
（パッカード社製）で計数することにより測定した。結
果を第５表に示す。npe5及びpGJ02A〔IPNS＋AT〕による
そのトランスホーマントから調製した無細胞抽出物には
ACVS活性は検出されなかったが、wis54−1255、及びpGJ
02A及びHM193によるコトランスホーマントから調製した
無細胞抽出物はACVS活性を有していた。我々は、ACVS活
性がコスミドHM193の導入によりnpe5中に保存されると
結論した。無細胞抽出物中に存在するポリペプチドのラ
ウリル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分析は後者株中に存在する250kDaのバンドを確認
し、一方前者株中にはこのバンドが存在しないことを明
らかにした。A.ニドランス（nidulans）のACVS酵素はこ
れと程等しい大きさの分子量を有しており（ファンリン
プト（van Liempt）、上述）、また我々は、ペニシリウ
ムの酵素と同じ分子量であると推定している。従って我
々はコスミドHM193はACVS遺伝子を含んでいると結論し
た。
例 15 アクレモニウムクリソゲナムの形質転換 250mlの邪魔根付振盪フラスコ中50mlのMMC培地（１リ
ットル当り、31.6gスクロース、2.2gグルコース、3g Ca
CO3、0.5gコーンひたし液固形物、7.5gL−アスパラギ
ン、0.22g酢酸アンモニウム、15g KH2PO4、21g K2HP
O4、0.75g NaSO4、0.18g MgSO4・7H2O、0.06g CaCl2、1
ml塩溶液（１リットル当り13g Fe（NH4）２（SO4）２・
6H2O、3g MnSO4・4H2O、3g ZnSO4・7H2O、0.8g CuSO4・
5H2O））に、リページ−キャンプベル（Le Page−Camp
bell）胞子化培地（１リットル当り1gグルコース、1gイ
ーストエキストラクト、0.5g NaCl10gCaCl2、20g寒天、
pH6.8）中で６日間生育させた２プレート分の胞子を接
種した。この培養物を200rpmで振盪しながら、28℃で24
〜30時間インキュベートした。ナイロンフィルター（ポ
アサイズ15μｍ）による濾過で菌糸体を回収し、このフ
ィルターの過剰の水を、濾紙の間で押しつけることによ
り除去した。単離した菌糸体を10mM DTTを含むTPCバッ
ファ（0.8M NaCl、0.02M MgSO4、50mMリン酸カリウムバ
ッファ（pH7））中に50mg/mlとなるよう懸濁し、振盪し
ながら28℃で90分間インキュベートした。遠心によりこ
の菌糸体を回収し（2500rpm、５分間、卓上遠心機）、
再び約25mg/mlとなるように、2mg/mlノボジム（Novozy
m）（TM）を含むTPCに懸濁した。このサフペジョンを振
盪しながら28℃で２〜５時間インキュベーションした。
25μｍポアサイズのナイロンフィルターを用いて原形質
体を濾過し、遠心により（2000rpm、５分間、卓上遠心
機）単離した。この原形質体ペレットを0.8M NaClで３
回洗浄し、再び10mlのNMCバッファ（0.8M NaCl、50mM C
aCl2、10mM MOPS、pH7）懸濁してから、再びペレット
化した後、ペレット体積の５倍容のNMCバッファに再懸
濁した（約108原形質体/ml）。その後、0.1倍容のCCMバ
ッファ（0.8M NaCl、50mM CaCl2、10mMMOPS、pH＝７、1
8％ポリエチレングリコール（PEG）、シグマ）を添加し
た。各々の形質転換に対して、DNA及び100μの原形質
体サスペンジョンを10ml試験管の底に入れ、注意深くサ
スペンジョンを混合して氷上に20分間放置する。各試験
管に500μのCCMバッファを加え、この混合物をもう20
分間室温に放置する。この形質転換混合物を600μのN
MCバッファで希釈し、10μg/mlのフレオマイシンを含む
TSA−スクロース（S.W.クイーナー（Queener）等、198
5、マイクロバイオロジー（ASM）468−472）上にプレー
ティングした。このプレートを28℃で２〜６日間インキ
ュベートした。トランスホーマントをフレオマイシン含
有プレートに接種し、増殖後リページーキャンプベル
（Le Page−Campbell）胞子化培地を用いて胞子を生成
した。
例 16 前記トランスホーマントによるアクレモニウムクリソゲ
ナム非生産突然変異体の相補及びペニシリン生産 アクレモニウムクリソゲナム（Acremonium chrysoge
num）N2株（シラフジ（Shirafuji）等、1979、アグリカ
ルチャル・アンド・バイオロジカルケミストリー（Agri
c.Biol.Chem.）43、155−160;J.L.チャップマン（Chapm
an）等、“工業微生物学の発展"27巻、165頁、G.ピアス
（Pierce）編、1987年、工業微生物学会;F.R.ラモス（R
amos）等、FEMSマイクロバイオロジーレターズ、35（19
86）123頁）を、例15で説明した方法により、P.クリソ
ゲナム（chrysogenum）〔IPNS＋AT〕遺伝子クラスター
を含むラムダファージG2（第２図）で形質転換した。共
形質転換実験における選択性構築物として、フレオマイ
シン耐性遺伝子を含むpPS47を用いた。N2株はIPNS遺伝
子中に突然変異を有しており（シラフジ（Shirafuji）
等、上述）、そのためセファロスポリンＣを生産しな
い。
コトランスホーマントを単離し、生産のテストを行っ
た。抗生物質生産クローンが約25/0の頻で単離され、こ
のことはP.クリソゲナム（chrysogenum）のIPNS遺伝子
がA.クリソゲナム（chrysogenum）中で発現され、かつ
P.クリソゲナム（chrysogenum）の酵素がA.クリソゲナ
ム（chrysogenum）の酵素と機能的に置換し得ることを
示している。このトランスホーマントを、フェニル酢酸
有無の条件下のカルトライダー（Caltrider）及びニス
（Niss）（1966、アプライドマイクロバイオロジー（Ap
pl.Microbiol.）14、746−753）の複合生産固体培地に
接種し、27℃で５日間インキュベートした後、生成した
抗生物質を、ペニシリンＧには高い感受性をもつがセフ
ァロスポリンＣには非感受性（少なくとも10μg/mlま
で）であるマイクロコッカスルテウス（Micrococcus lu
teus）及びセファロスポリンＣに対する超感受性株であ
るがペニシリンＧには感受性の低い大腸菌ESS2231を用
いて検定した。マイクロコッカスルテウス（Micrococcu
s luteus）及び大腸菌ESS2231については、J.M.ルエン
ゴ（Luengo）等、ジャーナル・オブ・アンチビオティク
ス（J.Antibiotics）39、1565（1986）、M.L.ロペス−
ニエト（Lopez−Nieto）等、アプライドマイクロバイオ
ロジー・アンド・バイオテクノロジー（Apll.Microbio
l.Biotechnol.）、22、343（1985）、G.レビラ（Revill
a）等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacte
riol.）168,947（1986）を参照せよ。テストしたいくつ
かのトランスホーマントの結果を第６表に示す。フェニ
ル酢酸（PA）存在下及び非存在下で生産された、M.ルテ
ウス（Luteus）に対して活性のある抗生物質の比較は、
それらの多数のものがPAにより抗生物質が強く促進され
ることを示しており、このことはペニシリンＧが生産さ
れていることを暗示している。おそらくPA非存在下で生
産される抗生物質は、ペニシリンＮ又はイソペニシリン
Ｎである。これら両化合物は強い抗生物質活性を有して
いる。選択したトランスホーマントを、0.8mg/mlのPAを
補った液体生産培地（カルトライダー（Caltrider）及
びニス（Niss）、1966、上述）で生育した。
水層をリン酸を用いてpH2に調整した後、ジエチルエ
ーテル抽出により生成したペニシリンＧを単離した。
ペニシリンＧは、疎水性側鎖（PA）のため有機相に抽
出し得る。セファロスポリンＣ（疎水性側鎖（α−アミ
ノアジピン酸）を有していない）は有機層に抽出されな
い。
有機相分離後、次に0.1Mリン酸カリウム（pH7.0）で
抽出した。この抽出でペニシリンＧは水層に移行する。
この水相は、バイオアッセイで確認されるように抗生
物質活性を含んでいる。この活性に対しては大腸菌より
もM.ルテウス（luteus）の方がより感受性が高い。この
活性は市販ペニシリン特異的ペニシリナーゼ（ディフコ
社）とのインキュベーションにより破壊し得た。これら
の結果は、実際にペニシリンＧがこのトランスホーマン
トにより生成していることを示している。さらに、この
水相サンプルをHPLCで分析した。この検定の結果（保持
時間、溶出曲線）は、抗生物質をペニシリンＧであると
同定した。宿主株の発酵培地を用いた同様の実験は、抗
生物質活性がないことを示し、従ってこの株によっては
ペニシリンＧが生成しないことを示した。それゆえ、P.
クリソゲナム（chrysogenum）AT遺伝子は、A.クリソゲ
ナム（chrysogenum）において発現し、かつ通常ペニシ
リウム（Penicillium）及びアスペルギラス（Aspergill
us）種に限られるペニシリンＧの生産能は、P.クリソゲ
ナム（chrysogenum）〔IPNS＋AT〕遺伝子クラスターの
形質転換によりA.クリソゲナム（chrysogenum）に転移
する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、 P.クリソゲナム（chrysogenum）におけるペニシリンＧ
又はＶの生合成経由を図式で示したものであり、 第２図は、 〔IPNS＋AT〕遺伝子クラスターを含むラムダクローンG2
及びB21の物理マップであり、 第２図中、 を示し、 第３図Ａ、Ｂ、Ｃは P.クリソゲナム（chrysogenum）アシルトランスフェラ
ーゼ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸
配列を示し、 第４図は、 コスミドクローニングベクターpPS07の制限部位及び機
能マップを示し、 第５図は、 pPS47の制限部位及び機能マップを示す図であり、 第６図は、 pGJ01A及びＢの制限部位及び機能マップを示す図であ
り、 第７図は、 pGJ02A及びＢの制限部位及び機能マップを示す図であ
り、 第８図は、 コスミドHM193の制限部位及び機能マップを示す図であ
り、 図中、このマップに存在する全ての部位が示されておら
ず、破線は特性が明確ではない領域を示すものであり、 第９図は、 pPS47 又はpGJ02A で形質転換した宿主によるペニシリン生産のグラフ表示
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:82） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:04） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:82） (72)発明者 アンネマリー エヴェリーン フェーン ストラ オランダ国 2151イックスハー ニウ ヴェンネップ ニーロップ 27 (72)発明者 ピエテル ファン ゾーリンゲン オランダ国 2671ヴェーゼット ナール トウェイク ロッシーニ 16 (72)発明者 ベルテュス ピエテル クークマン オランダ国 2636ベーヘー シップライ デン プリューヌスストラート ８ (72)発明者 ルシア ヘレナ マリア ファン デル フォールト オランダ国 2624ペーエー デルフト ア ファン セルテマプレイン ２ (72)発明者 フアン フランシスコ マルティン スペイン国 24004 レオン アヴダ デ ア ファクルタード 13‐43 (72)発明者 サンチアゴ グッティエルレス スペイン国 レオン セ イルデフォン ソ フィエロ オルドニェース（番地な し) (72)発明者 ブルーノ ディエース スペイン国 20006 サン セバスチャ ン セ エアッソ 25‐４デ (72)発明者 エミリオ アルヴァレース スペイン国 41012 セヴィーラ アヴ ダ レイナ メルシデス 53‐６ (72)発明者 ホセ ルイス バルレド スペイン国 ブルゴス トレスパデルネ セ マイオール 28 (72)発明者 クリスチーナ エスマーン スペイン国 48003 ビルバオ セ テ ノール コンスタンチノ １‐３デ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】イソペニシリンＮシンセターゼ（IPNS）及
    びACVシンセターゼ（ACVS）をコードする遺伝子を含むD
    NA構築物、及びイソペニシリンＮシンセターゼ（IPNS）
    及び下記配列のMetからLeu（No.475〜No.1746）のアミ
    ノ酸配列を有するアシルトランスフェラーゼ（AT）をコ
    ードする遺伝子を含むDNA構築物からなる群から選択さ
    れる、二次代謝産物生産の生合成経路に関する少なくと
    も２個の遺伝子を含有するDNA構築物。
  2. 【請求項２】下記からなる群から選択される、請求項
    （１）記載のDNA構築物。 下記物理的地図を有するpGJ02A; 下記物理的地図を有するpGJ02B;及び 下記物理的地図を有するHM193
  3. 【請求項３】非生産型突然変異体を補うDNAフラグメン
    トを含む、請求項（１）又は（２）記載のDNA構築物。
  4. 【請求項４】前記二次代謝産物を生産する宿主の選択マ
    ーカー及び／又は該宿主における形質転換効率を増加す
    る配列を含む、請求項（１）〜（３）のいずれか１項記
    載のDNA構築物を含むベクター。
  5. 【請求項５】請求項（１）〜（４）のいずれか１項に記
    載のDNA構築物を少なくとも１個含む形質転換宿主細
    胞。
  6. 【請求項６】請求項（１）〜（４）のいずれか１項に記
    載のDNA構築物を含む形質転換宿主細胞を用いた、DNA仲
    介の形質転換以外の株改良操作により得られる宿主細
    胞。
  7. 【請求項７】前記宿主細胞が、ペニシリウム、アスペル
    ギラス、アクレモニウム又はアクチノミセトであり、好
    ましくはペニシリウム クリソゲナムである、請求項
    （６）記載の形質転換宿主細胞。
  8. 【請求項８】微生物宿主における二次代謝産物の生産法
    又はその生産増加法であって、 （ａ）請求項（１）〜（４）のいずれか１項記載のDNA
    構築物の調製、 （ｂ）該DNA構築物による宿主候補の形質転換、 （ｃ）生成したトランスフォーマントのクローニング、
    及び （ｄ）該宿主候補よりも高いレベルの該二次代謝産物を
    生産するクローンの同定 を含む方法。
  9. 【請求項９】抗生物質二次代謝産物の生産収率を増加す
    る改良法であって、 （ａ）請求項５記載の形質転換宿主細胞の増殖、及び （ｂ）生成する抗生物質の単離 を含む方法。
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