JP3100058B2

JP3100058B2 - 線維芽細胞成長因子を含む安定な医薬組成物

Info

Publication number: JP3100058B2
Application number: JP03511862A
Authority: JP
Inventors: アダミ，マルコ; ダラ・カサ，ロザンナ; ガンビニ，ルシアーノ; マグリーニ，ロベルト; マリアーニ，ロザリア; ペローネ，ジオバンニ
Original assignee: フアルミタリア・カルロ・エルバ・エツセ・エルレ・エルレ
Priority date: 1990-07-18
Filing date: 1991-07-16
Publication date: 2000-10-16
Anticipated expiration: 2015-10-16
Also published as: AU8109491A; AU659997B2; ES2055607T3; GB9015824D0; DE69101784D1; DE69101784T2; CA2087430A1; EP0539408A1; JPH05508640A; WO1992001442A1; EP0539408B1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ヒトマイトジェン活性を有する線維芽細胞
成長因子（FGF）、特にヒト塩基性線維芽細胞成長因子
（bFGF）を含む凍結乾燥組成物に係わる。bFGFは天然の
ものまたは組換え手段によって製造されるものとし得
る。

タンパク質は難しい安定性の問題を与える固有の化学
的及び物理的特性を有するので、タンパク質薬剤を安全
に取り扱ったり投与することが、医薬製剤製造業者に強
く求められている。タンパク質には、化学的及び物理的
の両方の不安定性に関与する種々の分解経路が存在す
る。かかる巨大分子は、精製または保存の間のその溶液
の偶発的な汚染に起因する微生物分解の危険性にもさら
されている。これら全てに配慮することは、経済的に好
ましい保存寿命の期待のもとにかかる薬物を調製及びパ
ッケージングする医薬製造業者にとっては特に重要であ
る。起こり得る製剤の問題を解決するために、完璧な前
調製プログラムはタンパク質薬剤に不可欠なステップで
ある。更に、保存寿命が維持されることを保証するため
に、一連の安定性指標試験法が必要である。

凍結液中でさえ迅速に分解するタンパク質を含む多く
の生物学的材料は、材料を凍結乾燥することにより長期
間にわたって生存可能な状態に維持し得る。凍結乾燥
（フリーズドライとしても公知である）は、凍結後に水
分を組成物から昇華させる、組成物を乾燥する方法であ
る。この方法の特に有利な点は、液体を処理することは
比較的容易であることを利用して、水溶液中で比較的不
安定な材料を液体の状態で処理して該材料を含有させる
容器中に充填し、温度を常温以上に高めずに乾燥し、従
って、熱の悪影響を排除し、安定性の問題が比較的少な
い乾燥状態で保存し得ることである。こうすると、生成
物は生物学的活性の損失に対して安定化され、長い保存
寿命が与えられる。

単に薬物塊を凍結乾燥することだけを考えて製剤を設
計することは非実用的なことが多い。これは、製剤に使
用される薬剤の量は通常は極めて少ないからである。こ
れは、凍結乾燥過程で、薬剤が、該過程に使用される真
空によって凍結乾燥容器から吸引除去され得るので問題
である。更に、多くのポリペプチドは、低濃度で凍結乾
燥すると比較的不安定である。それらは、生成物のパッ
ケージ材料に吸収され、活性を失い得る。多くの凍結乾
燥医薬組成物は、凍結乾燥過程に存在する固体の量を増
大し、それによって少量の薬剤塊を凍結乾燥することに
関係する問題を解消するために、希釈剤または増量剤の
使用に頼っている。

欧州特許出願公開第0 308 238号は、ヒトマイトジェ
ン活性を有するポリペプチド成長因子と、該組成物の再
構成溶液に粘性を与え得る、水溶性または水膨潤性の医
薬的に容認可能なポリマーとを含む安定な凍結乾燥組成
物を記載している。成長因子として、上皮成長因子（EG
F）が特に述べられている。

本発明は、線維芽細胞成長因子（FGF）と、医薬的に
容認可能な増量剤（bulking agent）と、（ａ）カルボキシアルキルセルロースのアルカリ金属
塩、または（ｂ）ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及
びシステインのいずれかとを含む凍結乾燥組成物を提供する。

本明細書において、FGFは、天然ヒトFGFポリペプチド
が示すのと類似の生物学的活性を有する種類のポリペプ
チドを含む。即ちFGFは、組換えDNA技術によって産生さ
れるまたは天然資源から誘導されるヒトFGF、及び例え
ばウシ、ネズミまたは齧歯動物のような近縁哺乳動物FG
Fのような酸性及び塩基性FGFを含む。FGFは更に、４つ
のシステインアミノ酸残基のうち少なくとも１つが誘導
体化されているFGFのような化学的に修飾されたFGFをも
含む。従って本発明に使用されるFGFは、１つ以上のシ
ステイン残基の−SH基が−Ｓ−CH₂−COOH基に変換され
ているカルボキシメチル化FGFであり得る。例えば国際
公開WO 86/07595号;WO 87/01728号；欧州特許出願公開
第0226181号;Abraham et al.,EMBO J.５,2523−2528,1
986;またはLobb,Eur.J.Clin.Invest.18,321−336,1988
に記載のごとき任意のbFGF分子を本発明に有効に使用し
得る。

bFGFの混合物を使用することもできる。これは、 −Abraham et al.によって報告されている配列番号１
に示された155個のアミノ酸のうち、Ｎ末端Met残基を除
いた154個のアミノ酸配列を有するヒトbFGF;及び −配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち、Ｎ末端Me
t及びAla残基を除いた153個のアミノ酸配列を有するヒ
トbFGF のおおよそ50:50の混合物とし得る。

例えば組換えDNA技術によって生産されるヒト塩基性F
GFが、本発明に使用するのに好ましい。特に本発明に使
用し得るカルボキシメチル化FGFは、国際公開WO 87/01
728号に記載のごとき、位置69及び87にある２つのシス
テイン残基がカルボキシメチル基、即ち−Ｓ−CH₂−COO
H基によって個々にブロックされている146アミノ酸形の
bFGFである。以降、この特定のカルボキシメチル化FGF
をCM−FGFと表記する。即ちCM−FGFは、配列番号１に示
した位置10から位置155までのアミノ酸配列のうち、位
置78及び96にあるCys残基がカルボキシメチル化されて
いる配列を有するbFGFである。

本発明の１つの実施態様においては、組成物は更に、
本発明の組成物が例えば１〜３カ月の長期間にわたって
保存されたときにFGFの酸化を十分に防ぐように選択さ
れる抗酸化剤を含む。抗酸化剤はジチオトレイトール
（DTT）であるのが好ましい。存在させるならば、抗酸
化剤は典型的には増量剤の0.01〜100重量％、好ましく
は0.1〜25重量％の量で存在させる。

増量剤は、凍結乾燥に使用するのに適した任意の増量
剤である。増量剤は通常は、凍結乾燥の間の製品の再溶
解または圧潰を防ぐために、硬化剤（rigidizer）とし
て優れた特性を有する。適当な医薬的に容認可能な増量
剤としては、マンニトール、ラクトース、ポリビニルピ
ロリドン、ガラクチトール及びトレハロースを挙げるこ
とができる。このうち、マンニトールが好ましい。本発
明の組成物におけるFGFの量は典型的には増量剤の0.01
〜５重量％、好ましくは0.1〜１重量％である。

驚くべきことには、医薬的に容認可能な増量剤との混
合物中のFGFは、カルボキシアルキルセルロース、例え
ばカルボキシC_1-4アルキルセルロースのアルカリ金属塩
の存在下で安定化され得ることが判明した。アルカリ金
属塩は例えばナトリウム塩またはカリウム塩とし得る。
この成分は通常は増量剤の0.1〜50重量％、好ましくは
2.5〜10重量％の量で存在させる。好ましいのはナトリ
ウムカルボキシメチルセルロースである。驚くべきこと
には、セルロース塩を使用すると、天然アルキルセルロ
ース、例えばメチルセルロースからは得ることができな
い安定性が本発明の組成物に付与される。

本発明の組成物は更に、ポリオキシエチレンソルビタ
ン脂肪酸エステル及びシステインを使用することによっ
ても安定化され得る。驚くべきことには、これら２つの
成分が相乗作用して安定性を高めることが判明した。ポ
リオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの例として
は、エチレンオキシドと共重合されたソルビトール並び
にその一及び二無水物のC_12-20部分飽和または不飽和脂
肪酸エステルを挙げることができる。典型的には、ソル
ビトール及びその無水物各々１モルに対して10〜40モ
ル、例えば約20モルのエチレンオキシドを存在させる。
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルは一般に
ポリソルベート（Polysorbate）として知られている。
ポリソルベートの例としては、ソルビトール及びその無
水物各々１モル当たり約20モルのエチレンオキシドと共
重合されたソルビトール並びにその一及び二無水物の部
分ラウリン酸エステルの混合物であるポリソルベート20
（ポリオキシエチレン20ソルビタンモノラウレート,Che
mical Abstracts整理番号9005−64−５）、ポリソルベ
ート40（ポリオキシエチレン20ソルビタンモノパルミテ
ート,CAS整理番号9005−66−７）、ポリソルベート60
（ポリオキシエチレン20ソルビタンモノステアレート,C
AS整理番号9005−67−８）、ポリソルベート65（ポリオ
キシエチレン20ソルビタントリステアレート,CAS整理番
号9005−71−４）、ポリソルベート80（ポリオキシエチ
レン20ソルビタンモノオレエート,CAS整理番号9005−65
−６）及びポリソルベート85（ポリオキシエチレン20ソ
ルビタントリオレエート,CAS整理番号9005−70−３）を
挙げることができる。ポリオキシエチレンソルビタン脂
肪酸エステルの量は好ましくは増量剤の0.01〜25重量
％、最も好ましくは0.1〜１重量％である。本発明の組
成物中のシステインの量は好ましくは増量剤の0.001〜
１重量％、最も好ましくは0.01〜0.1重量％である。

本発明の組成物は通常は、凍結乾燥前にバルク溶液中
で調製する。バルク溶液は任意の量で凍結乾燥すること
ができるが、５〜500、例えば10〜100、好ましくは50μ
ｇのFGFを含むアリコートに分割されるのが好ましい。
アリコートは別個に、例えば別個のガラスバイアル中で
凍結乾燥する。溶液を凍結乾燥する前に、例えば過す
ることで殺菌することができる。このために、0.2μｍ
ナイロン膜フィルターを使用することができる。このよ
うな過の後にHPLC分析を行なって、本発明者らは、FG
Fが一貫して定量的に回収されることを見い出した。

凍結乾燥は実質的に以下のステップからなる。まず、
凍結乾燥すべき溶液を、排気チャンバ内で共融点以下の
温度で凍結する。次いでチャンバを通常は13.3Pa（0.1T
orr）以下に排気する。生成物の温度以下の温度で冷た
い凝結表面上で氷を昇華させるが、凝結表面は前記チャ
ンバ内または結合チャンバ内にある。次いで、制御条件
下に生成物に熱を導入し、それによって生成物をその共
融温度以下に維持するように計画された速度で昇華する
ようなエネルギーを与える。典型的な凍結乾燥サイクル
は次の通りである：（ａ）−45℃で凍結し、この温度に４時間維持する。

（ｂ）13.3Pa（0.1Torr）以下の真空レベル及び−60℃
の凝縮機温度で、−45℃〜＋25℃で約12時間一時乾燥す
る。

（ｃ）上記（ｂ）と同じ真空及び凝縮機温度で、＋25℃
で約11時間二次乾燥する。本発明者らは、上記凍結乾燥
サイクルが、本発明に従って製造されたFGFバッチの調
製に適していることを見い出した。しかしながら、FGF
の安定性を実質的に変えない上記方法の変形もあり得る
ことは当業者には明らかであろう。

本発明の組成物のアリコートは、無菌バイアル中に分
配することができる。無菌ガラスバイアルが適当であ
る。タンパク質はガラス表面に付着することが知られて
おり、本発明者らは、本発明の凍結乾燥組成物をガラス
バイアル内で再構成する場合、付着により幾分かのタン
パク質が失われることを見い出した。しかしながら本発
明者らは、付着を最小化するためにガラスバイアルをシ
リコーンエマルジョン（医薬用）で被覆すると、この問
題がうまく解消されることを見い出した。

更に本発明者らは、ガラスバイアルを慣用のゴム栓で
密封すると、FGFがゴム表面に吸収されることによりタ
ンパク質が損失し得ることも見い出した。フッ素樹脂積
層ブチルゴム栓を使用するとこの吸収は防止される。

本発明の凍結乾燥組成物は空気中または真空下に保存
することができる。しかしながら、不活性ガス下、例え
ば窒素下に保存することが好ましい。

本発明の凍結乾燥組成物は実質的に、FGFと、医薬的
に容認可能な増量剤と、（ａ）カルボキシアルキルセル
ロースのアルカリ金属塩または（ｂ）ポリオキシエチレ
ンソルビタン脂肪酸エステル及びシステインのいずれか
とからなる。

本発明の凍結乾燥組成物は、任意の医薬的に容認可能
な溶剤を使用して再構成（reconstitute）することがで
きる。使用する溶剤は、pHが5.0〜7.0の再構成溶液を与
えるのが好ましい。再構成溶剤は0.9％塩化ナトリウム
溶液（即ち生理食塩水）であるのが好ましい。必要によ
っては、溶液は有効量の抗菌性保存剤を含む。塩化ベン
ザルコニウムの効力は十分に報告されており、例えば眼
科用保存剤として医薬製剤に一般に使用されているが故
に、塩化ベンザルコニウムを約0.005重量％の濃度で含
むことは特に適している。本発明者らは、0.005重量％
の塩化ベンザルコニウムは、本発明の再構成溶液におい
て微生物活性を有効に阻害することを見い出した。

FGFは、正常ヒト細胞の成長の調節において役割を果
たす成長因子である。FGFは、創傷治癒及び線維芽細胞
の成長を刺激することにおいて有用である。従って本発
明は更に、無菌バイアルに入った上記凍結乾燥組成物
と、凍結乾燥組成物を再構成するための無菌希釈液とを
含むキットをも提供する。本発明は更に、本発明の凍結
乾燥組成物を水性希釈液、例えば上述の医薬的に容認可
能な溶剤を用いて再構成することからなる、FGF水溶液
を調製する方法をも含む。本発明の組成物またはキット
は、人体または動物体の治療、例えば創傷治療の方法に
おいて有効である。

以下の実施例によって本発明の態様を説明する。

以下の実施例において、使用したFGFは、Farmitalia
Carlo Erba Biotechnology Development Departm
entから入手可能な組換えタンパク質薬剤である塩基性F
GF FCE 26184、及びbFGFから得られる化学的修飾タンパ
ク質であるCM−FGF（146アミノ酸形）である。これらの
調製は調製例において後述する。bFGF及びCM−FGFは、b
FGFについては約2.0mg/ml、またCM−FGFについては約1.
1mg/mlの活性物質濃度（この濃度は、ビウレット反応
（biruet reaction）によって測定されたタンパク質濃
度として表され、溶液は、10μＭリン酸緩衝液を用いて
pH6.0で得られる）の凍結バルク溶液として入手可能で
ある。

本発明者らは、上記バルク溶液を溶かし、２％マンニ
トール溶液を使用して濃度約50μg/mlに希釈してもタン
パク質の安定性に影響しないことを見い出した。希釈溶
液のHPLC分析は、活性薬物（bFGFまたはCM−FGF）が定
量的に回収されることを示した。

調製例1:bFGF（FCE 26184）の調製 bFGFに対する合成DNA配列及びかかる配列を保有する
発現プラスミドを、欧州特許出願公開第363675号に記載
の方法に従って構築した。発酵及び精製プロセスは以下
のごとく実施した。

（ａ）発酵プロセス Institute Pasteur collectionからのE.coli B型細
菌株を、bFGFをコードするヒト遺伝子及びテトラサイク
リン耐性遺伝子の両方を保有するプラスミドで形質転換
した。この形質転換株を、組換え非グリコシル化ｈ−bF
GF（ヒトbFGF）の製造に使用した。この株のMaster Ce
ll Bank（15個の凍結乾燥バイアル）及びWorking Cel
l Bank（W.C.B.）（−190℃の液体窒素中に保存した70
個のバイアル）を調製した。W.C.B.のバイアルの１つの
内容物を、発酵段階の接種物として使用した。

発酵プロセスは、４の培養培地を満たした10発酵
器内で実施した。株選択条件を維持するために、テトラ
サイクリン塩酸塩を培地に加えた。37℃で20時間増殖さ
せると、最終バイオマスは42±2g/乾燥重量であり、b
FGFの産生は、比較ゲル電気泳動によって測定したとこ
ろ2500±500mg/であった。

細菌を大量に増殖させるためには、発酵段階で純粋酸
素に富むことが必要であった。

（ｂ）初回精製細胞（微生物）を遠心することにより全発酵ブロスか
ら分離した。得られたペレットを、塩化ナトリウムを含
むリン酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁させた。細胞を十
分に破壊するために、高圧ホモジナイザーに少なくとも
３回通すことが必要であった。得られた細胞溶解物を遠
心することにより清澄化し、更に処理するために上清を
回収した。

（ｃ）精製清澄化した上清をSepharose（商標）S Fast Flow（カ
チオン交換体）カラムに入れ、リン酸緩衝液中の塩化ナ
トリウム濃度増加勾配を使用してこのカラムから生成物
を溶出した。生成物を、Heparin Sepharose（商標）6B
カラム上でリン酸緩衝液中の塩化ナトリウム濃度増加勾
配によって溶出することにより更に精製した。最後に、
Sephadex（商標）G25樹脂上で緩衝液交換して、大量の
生成物緩衝液（リン酸ナトリウム−EDTA）中に生成物を
得た。

（ｄ）カラム清澄化（column sanitization） Sepharose S Fast Flowカラム及びSephadex G25カラ
ムは水酸化ナトリウム溶液で洗浄することにより清浄化
した。Heparin Sepharoseは、3M塩化ナトリウムを含むp
H＝8.5及びpH5.5いずれかの溶液を用いて洗浄した。

このようにして、FCE26184と命名されたbFGFを得た。
これは、Abraham et al.によって報告されている配列
番号１に示された155個のアミノ酸のうち、Ｎ末端のMet
残基を除く154個のアミノ酸配列を有するヒトbFGFと、配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち、Ｎ末端の
Met及びAla残基を除く153個のアミノ酸配列を有するヒ
トbFGF とのおおよそ50:50の混合物である。

調製例2:CM−FGFの調製 110mlの25mMリン酸緩衝液pH8.0/5mMEDTA中に、国際公
開WO 87/01728号に記載のごとく得られる組換えヒトbFG
F（146アミノ酸形）100mgを含む溶液に、110mlの同じ緩
衝液中のヨード酢酸400mgを加えた。反応混合物を暗所
において室温で２時間放置した。次いで反応混合物を、
25mMリン酸緩衝液pH7.5で平衡化しておいたMonoSカラム
（HR10/10,Pharmacia）に直接入れた。過剰な試薬を除
去するために、カラムを平衡化緩衝液で十分に洗浄し、
25mMリン酸緩衝液pH7.5中の０〜1M NaCl直線濃度勾配を
用いてカルボキシメチル化bFGF（CM−FGF）を溶出し
た。CM−FGF含有フラクションを、10nMリン酸緩衝液pH
6.0/0.1mMEDTAで平衡化しておいたSephadex G−25カラ
ム（Pharmacia）上で脱塩した。

実施例１本発明者らは、溶液中のタンパク質を酸化から保護す
る上で、抗酸化剤、例えば1,4−ジチオトレイトール（D
TT）の存在が有効であることを見い出した。

しかしながら、溶液中でのその優れた保護作用にもか
かわらず、凍結乾燥状態のタンパク質を長期間にわたっ
て保存する場合、DTTはその分解を阻害しない。実際、
増量剤としてマンニトールを、抗酸化剤としてDTTを含
む50μｇのbFGF凍結乾燥製剤は、容認可能な安定性を示
さない。35℃及び25℃で１週間保存した後、約10％の効
力損失（HPLC法）が検出された。従って、保護剤を製剤
中に配合する必要性がある。

P.P.De Luca及びM.W.Townsend（Journal of Paren
teral Science and Technology.vol.42,No.6,Nov.−
Dec.1988,p190）によれば、リオプロテクタント（lyopr
otectant）またはクリオプロテクタント（cryoprotecta
nt）を使用することにより、凍結、乾燥または長期保存
に起因するタンパク質の構造的変性を防止及び低減し得
る。リオプロテクタントは、凍結乾燥の間及びその後の
保存の間タンパク質を安定化しその分解を防止する化合
物と定義され、一方、クリオプロテクタントは凍結の際
の損傷からのみ保護する。

上記理論的考察を踏まえ、リオプロテクタントとして
作用し得る多数の化合物のFCE26184及びCM−FGF保護能
力を測定する実験を行なった。

ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、ナト
リウムカルボキシメチルセルロース（NaCMC）、メチル
セルロース（MC）、ヒドロキシエチルセルロース（HE
C）、ポリビニルアルコール（PVA）、塩化ナトリウム、
グリシン、システイン及びアルブミンを、使用し得る保
護剤として選択した。bFGF（50μg/ml）と、増量剤とし
てのマンニトール（20mg/ml）と、抗酸化剤としてのDTT
（0.5または0.1mg/mlのいずれか）と、適当な濃度の使
用可能な各安定剤とを含む溶液を無菌状態で調製し、バ
イアル（公称容積:1.0ml）に入れ、凍結乾燥した。最終
的な凍結乾燥製剤におけるタンパク質効力に及ぼす保存
の影響を、加速安定性試験（accelerated stability
studies）（35℃）によって検査した。

基本的な実験結果を表１にまとめて示す。既に述べた
ように、マンニトール及びDTTを含む凍結乾燥製剤は、
１週間保存すると10％の効力損失が認められる。

DTTとの相乗硬化を調査する目的でシステインを加え
ても、同程度の損失が認められた。

NaCMCのようなリオプロテクタントを存在させると、
タンパク質の安定性は著しく向上する。他のセルロース
誘導体（HPMC、HEC、MC）は、安定剤として無効である
ことが判明した（表１にはMCに対するデータのみ表され
ているが、他の誘導体も同様の挙動を示した）。

PVA、塩化ナトリウム、グリシン及びアルブミンは、b
FGFと極度に相入れないことが判明した。ポリソルベー
ト80またはシステインは、単独で使用した場合には無効
であることが判明した。しかしながら、ポリソルベート
80とシステインを併用すると安定剤として驚異的によく
作用した。更に、ポリソルベート80またはシステインの
いずれもNaCMCと相乗作用した。

表１に示したデータは、凍結乾燥状態のタンパク質の
ための安定剤としてリオプロテクタントが果たす重要な
役割を立証している。かかる化合物の保護能力における
機構は、凍結乾燥調製物において水をタンパク質から分
離するのを防ぐ能力にあると考え得る。試験した各凍結
乾燥製剤において、薬物の水分を超え、タンパク質を水
和形態に維持するのに十分な程度の水分が（残留湿分と
して）存在する。タンパク質構造体によって緩やかに配
位されている水の殻（shell）を破壊しようとするいか
なる要因（高温または低温、溶剤）も、変性または凝集
によるタンパク質の不活性化の原因となる。NaCMCのよ
うな安定剤は、疎水構造または極性カルボキシル基のい
ずれかによって水分子にしっかりと配位し得る。その結
果、安定剤はタンパク質の微小環境を水和状態に維持す
る。

保護剤として試験したHPMC、MC及びHECような他のセ
ルロース誘導体は、最も考えられるところではカルボキ
シル基がないために、無効であることが判明した。

ポリソルベート80の安定化活性は、水分子に対する配
位力が弱いために、低いことが推定され得る。これとは
対照的に、ポリソルベート80とシステイン及びNaCMCと
の相乗効果は全く予想外であった。

CM−FGFにおける実験結果を表２にまとめて示す。表
２において、n.d.は未測定であることを意味する。CM−
FGF（50μg/ml）と、増量剤としてのマンニトール（20m
g/ml）と、DTT（0.1mg）と、適当な濃度の使用し得る各
安定剤とを含む溶液を無菌条件下に調製し、バイアル
（公称容積1.0ml）に入れ、凍結乾燥した。最終的な凍
結乾燥製剤におけるタンパク質効力（protein potenc
y）に及ぼす保存の影響を、加速安定性試験（35℃/45
℃）によって検査した。既にbFGFにおいて見られたよう
に、Na−CMCはCM−FGFの安定性を著しく向上する。

下記の材料、装置及び溶液を使用し、後述する条件下
に試料のHPLCアッセイを実施した。

材料： bFGF凍結バルク溶液、作業用標準CM−FGF凍結バルク溶
液、作業用標準アセトニトリル、HPLC用水、HPLC用トリ
フルオロ酢酸、分析用1,4−ジチオトレイトール。

装置：・液体クロマトグラフィー装置：以下のものを備えたMi
lton RoyモデルCM4000または等価の装置： ‥Vydac 218TP54 300Åを充填したクロマトグラフィ
ーカラム（長さ250mm,内径4.6mm）または等価の装置 ‥注入バルブ:100mcl試料ループを取り付けたRheodyn
eモデル7125または等価の装置 ‥検出器:Shimadzu モデルSFD 6Aまたは等価の装置 ‥積算レコーダー:SP 4270（Spectra−Physics）また
は等価の装置・膜フィルター:0.22μｍ多孔度,Millipore Durapore
GVWPまたは等価の装置・精密実験用ガラス器具・プラスチックピペットチップ（Gilson）・自動ピペット（Gilson）・使い捨てプラスチックマイクロチューブ，容量2.5ml
（Eppendorf）溶液：・移動相（Ａ）：上記膜フィルターを用いて過し、脱
気した、0.1％のトリフルオロ酢酸（w/v）を含む水溶液・移動相（Ｂ）：上記膜フィルターを用いて過し、脱
気した、0.1％のトリフルオロ酢酸（w/v）を含む95％ア
セトニトリル−５％水からなる溶液・1,4−ジチオトレイトール溶液 HPLC用水中に約1mg/mlを含むよう調製した溶液・標準溶液正確に計量した適量のbFGFまたはCM−FGF作業用標準
バルク溶液を、使い捨てプラスチックマイクロチューブ
に移し、約50mcg/mlのbFGFまたはCM−FGFを含む最終溶
液を得るために、適量の1,4−ジチオトレイトール溶液
で希釈したもの。標準溶液は新しく調製し、作業日中に
使用せねばならない。

・試料溶液少なくとも５つの凍結乾燥バイアルを使用して試料溶
液を調製する。50mcgのbFGFまたはCM−FGFを含む各バイ
アルの内容物を1.0mlのHPLC用水中に溶解し、調製した
全ての溶液を用いてプールを作製する。

クロマトグラフィー（HPLC）条件：下記の実験条件下で、液体クロマトグラフィーに標準
溶液及び試料溶液のいずれかを交互に３回以上注入す
る：カラム温度：室温（22±２℃）移動相流速 :1ml/分分析波長 :210±1nm 濃度勾配条件：時間（分）Ａ％Ｂ％： 0 75 25 ： 20 60 40 ： 25 60 40 ： 30 75 25 検出器感度：検出器“コンピューター”出力を再高感
度で積算器に接続しておく。

注入量 :100mcl 積算レコーダー減衰（attenuation）:256 罫紙速度 :0.5cm/分実施例２ａ）ナトリウムカルボキシメチルセルロースを用いて安
定化したbFGF組成物の調製ｂ）ポリソルベート80及びシステインを用いて安定化し
たbFGF組成物の調製上記両調製物を凍結乾燥し、個々のバイアルを窒素下
に密閉した。

ｃ）ナトリウムカルボキシメチルセルロースを用いて安
定化したCM−FGF組成物の調製ｄ）ポリソルベート80及びシステインを用いて安定化し
たCM−FGF組成物の調製上記両調製物を凍結乾燥し、個々のバイアルを窒素下
に密閉した。

ｅ）ポリソルベート80及びシステインを用いて安定化し
たCM−FGF組成物の調製上記両調製物を凍結乾燥し、個々のバイアルを窒素下
に密閉した。

実施例３本発明の組成物の安定性約50μｇのbFGFを含む本発明の組成物が入った凍結乾
燥バイアルを、種々の温度で種々の期間にわたって保存
したときの長期安定性について調査した。結果は表３〜
22に示す。以下のパラメーターを調査した。容認可能な
標準（値）も以下に示す。

外観：目視検査により評価。圧縮された白色の凍結乾
燥ケーキまたは塊を含む無色のガラスバイアルであるこ
と。

識別：＊Pharmacia LKB Biotechnology,Uppsala,Sw
edenから入手可能なPhast System（登録商標）を使用し
た電気泳動（SDS PAGE）により評価。還元及び変性条件
下に、FCE26184またはCM−FGFの作業用標準溶液と同じ
分子量バンドであること。

RP−HPLCアッセイ：標識量の90〜110％であること。

バイオアッセイ（3T3細胞におけるDNA合成の刺激）:F
CE 26184のFICE内部標準を使用し、BALB/3T3細胞中への
³H−TdR取込みについて測定する平行線アッセイ（paral
lel line assay）によって計算される値。値を調製物
の力価で表わすと、Ｒ＝1.0±0.35であること。

無菌性：無菌水分:3％以下再構成（reconstitution）後の外観＊：清浄な無色透
明溶液であり、肉眼で見える異物粒子を含まないこと。

再構成後のpH＊:5.0〜7.0 ＊バイアルを5mlの所望の溶剤中に溶解した。

同様の安定性が実施例２（ｄ）及び２（ｅ）の組成物
においても認められた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 47/32 Ａ６１Ｋ 47/32 47/38 47/38 (72)発明者ガンビニ，ルシアーノイタリー国、20010・コルナレド（ミラン）、ビア・ピアベ、16 (72)発明者マグリーニ，ロベルトイタリー国、20091・ブレツソ（ミラン）、ビア・ドン・ミンツオーニ、45 (72)発明者マリアーニ，ロザリアイタリー国、20033・デシオ（ミラン）、ビア・カルロ・マルクス、12 (72)発明者ペローネ，ジオバンニイタリー国、20125・ミラン、ビア・メルキオーレ・ジオイア、131 (56)参考文献特表平５−506225（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 38/22 A61K 9/14 A61K 47/14 A61K 47/18 A61K 47/26 A61K 47/32 A61K 47/38 ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】線維芽細胞成長因子（FGF）と、医薬的に
容認可能な増量剤と、（ａ）カルボキシアルキルセルロースのアルカリ金属
塩、または（ｂ）ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及
びシステインのいずれかとを含む凍結乾燥組成物。
【請求項２】更に、抗酸化剤を含む請求項１に記載の組
成物。
【請求項３】前記抗酸化剤がジチオトレイトールである
請求項２に記載の組成物。
【請求項４】前記増量剤が、マンニトール、ラクトー
ス、ポリビニルピロリドン、ガラクチトールまたはトレ
ハロースである請求項１から３のいずれか一項に記載の
組成物。
【請求項５】前記カルボキシアルキルセルロースのアル
カリ金属塩が、ナトリウムカルボキシメチルセルロース
である請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】前記ポリオキシエチレン脂肪酸エステルが
ポリソルベート80である請求項１から４のいずれか一項
に記載の組成物。
【請求項７】無菌ガラスバイアル内に密封されている請
求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】前記線維芽細胞成長因子が塩基性FGFであ
る請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】前記線維芽細胞成長因子が、配列番号１に
示された位置10から位置155のアミノ酸配列で、位置78
及び96にあるCys残基がカルボキシメチル化されている
配列を有する塩基性FGFである請求項１から７のいずれ
か一項に記載の組成物。
【請求項１０】（ａ）請求項１から９のいずれか一項に
記載の組成物、及び（ｂ）前記組成物を再構成するための無菌溶液を含むキット。
【請求項１１】線維芽細胞成長因子（FGF）と、医薬的
に容認可能な増量剤と、（ａ）カルボキシアルキルセルロースのアルカリ金属
塩、または（ｂ）ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及
びシステインのいずれかとを水溶液中で混合し、前記水溶液を凍結乾
燥することからなる、線維芽細胞成長因子（FGF）を含
む凍結乾燥組成物を製造する方法。
【請求項１２】請求項１から９のいずれか一項に記載の
組成物を、無菌水性希釈剤を用いて再構成することから
なる、FGF水溶液を製造する方法。