JP3109599B2 - １６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域から誘導される非ウイルス微生物検出用ハイブリダイゼーションプローブ - Google Patents
１６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域から誘導される非ウイルス微生物検出用ハイブリダイゼーションプローブInfo
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ハイブリダイゼーション手順により生物学
的サンプル中で非ウイルス微生物の特異的検出に使用す
るための、リボソームリボ核酸（rRNA）遺伝子、特に16
S及び23SrRNA遺伝子間のスペーサー領域から誘導される
核酸プローブに係る。
的サンプル中で非ウイルス微生物の特異的検出に使用す
るための、リボソームリボ核酸（rRNA）遺伝子、特に16
S及び23SrRNA遺伝子間のスペーサー領域から誘導される
核酸プローブに係る。
ここ10年間に多数の微生物で目覚ましい進歩が遂げら
れているが、現在使用されている診断手順はまだ手間が
かかり、非感受性であり、非特異的である。これらの欠
点の多くは核酸プローブを使用することにより解決する
ことができる。これらの核酸プローブの例としては、全
ゲノムデオキシリボ核酸（DNA）、プラスミド、リボプ
ローブ又は合成オリゴヌクレオチドを挙げることがで
き、これらのプローブは生物学的サンプル中に存在する
ゲノムDNA、メッセンジャーRNA又は安定RNA種を標的に
することができる。必ずしもそうでなくてもよいが、合
成オリゴヌクレオチドを使用すると好適である。オリゴ
ヌクレオチドは化学的方法を使用して迅速に大量に合成
することができ、貯蔵寿命が長く、容易に精製及び標識
できる。
れているが、現在使用されている診断手順はまだ手間が
かかり、非感受性であり、非特異的である。これらの欠
点の多くは核酸プローブを使用することにより解決する
ことができる。これらの核酸プローブの例としては、全
ゲノムデオキシリボ核酸（DNA）、プラスミド、リボプ
ローブ又は合成オリゴヌクレオチドを挙げることがで
き、これらのプローブは生物学的サンプル中に存在する
ゲノムDNA、メッセンジャーRNA又は安定RNA種を標的に
することができる。必ずしもそうでなくてもよいが、合
成オリゴヌクレオチドを使用すると好適である。オリゴ
ヌクレオチドは化学的方法を使用して迅速に大量に合成
することができ、貯蔵寿命が長く、容易に精製及び標識
できる。
DNAプローブ技術を使用して微生物を確実に診断にす
るためには、使用されるプローブは高特異生（即ち他の
生物に由来する核酸と交差反応すべきでない）且つ高感
度（即ち検出しようとする生物の全部ではないとしても
ほとんどの株がプローブと反応すべきである）であるべ
きである。従って、好適標的配列は以下の特徴を有する
べきである。
るためには、使用されるプローブは高特異生（即ち他の
生物に由来する核酸と交差反応すべきでない）且つ高感
度（即ち検出しようとする生物の全部ではないとしても
ほとんどの株がプローブと反応すべきである）であるべ
きである。従って、好適標的配列は以下の特徴を有する
べきである。
（ｉ）配列は該当生物の各株のゲノム中に存在すべきで
ある。
ある。
（ii）進化による配列の相違は、一方では該当種を他の
密接に関連する種から区別できるようにするために十分
な配列相違があり、他方では使用されるプローブで該当
種の全株を検出できるようにするために十分な配列保存
があるように構成されるべきである。
密接に関連する種から区別できるようにするために十分
な配列相違があり、他方では使用されるプローブで該当
種の全株を検出できるようにするために十分な配列保存
があるように構成されるべきである。
種特異的プローブは多数の生物について記載されてい
る。最近の文献ではTenover,Clin.Microbiol.Rev.１:82
−101,1988を参照されたい。
る。最近の文献ではTenover,Clin.Microbiol.Rev.１:82
−101,1988を参照されたい。
しかしながら、ゲノム中のどの遺伝子から特異的プロ
ーブ配列を誘導できるのかについては不明である。プロ
ーブ開発にあたっては、最終的に対象生物に対して特異
的になるようなフラグメントを得るために大規模な選択
手順に従わなければならないことが多かった（Korolik
et al.,J.Gen.Microbiol.134:521−529,1988;Grimon
t et al.,J.Clin.Microbiol.21:431−437,1985;Welch
er et al.,Nucl.Acids Res.14:10027−10044,1986;D
onegan et al.,Mol.Cell.Probes ３:13−26,1989;Be
aulieu and ROY,Abstract nr D249,Abstracts of
the Annual Meeting of the American Society
for Microbiology,1989）。ほとんどの場合、特異的
フラグメントが誘導される遺伝子の機能又は実態は解明
されておらず、別の特異的プローブが所望される毎にス
クリーニング手順を手探りで繰り返さなければならな
い。上記基準を満たし且つ偏在する遺伝子が厳密に同定
されるならば、時間と手間のかかる選択が不要になる。
ーブ配列を誘導できるのかについては不明である。プロ
ーブ開発にあたっては、最終的に対象生物に対して特異
的になるようなフラグメントを得るために大規模な選択
手順に従わなければならないことが多かった（Korolik
et al.,J.Gen.Microbiol.134:521−529,1988;Grimon
t et al.,J.Clin.Microbiol.21:431−437,1985;Welch
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onegan et al.,Mol.Cell.Probes ３:13−26,1989;Be
aulieu and ROY,Abstract nr D249,Abstracts of
the Annual Meeting of the American Society
for Microbiology,1989）。ほとんどの場合、特異的
フラグメントが誘導される遺伝子の機能又は実態は解明
されておらず、別の特異的プローブが所望される毎にス
クリーニング手順を手探りで繰り返さなければならな
い。上記基準を満たし且つ偏在する遺伝子が厳密に同定
されるならば、時間と手間のかかる選択が不要になる。
16S又は23SrRNA遺伝子は、既に記載されている方法を
使用して配列を容易に得ることができ、種特異的検出に
使用可能なこれらの高保存性遺伝子内に種々の領域が存
在することが知られているので、プローブ開発に頻用さ
れている。しかしながら、生物によっては進化による核
酸配列保存性が非常に高いため、例えば16S及び23SrRNA
遺伝子から高特異性で高感度のプローブを誘導できない
場合がある。更に、これらの遺伝子の保存性の結果、標
的配列のみで１又は少数のミスマッチに基づいて２種の
生物を区別しなければならないことが多くなり、ハイブ
リダイゼーションのストリンジェンシーが必要になる。
これらの条件から少しでも外れると、誤認の恐れがあ
る。
使用して配列を容易に得ることができ、種特異的検出に
使用可能なこれらの高保存性遺伝子内に種々の領域が存
在することが知られているので、プローブ開発に頻用さ
れている。しかしながら、生物によっては進化による核
酸配列保存性が非常に高いため、例えば16S及び23SrRNA
遺伝子から高特異性で高感度のプローブを誘導できない
場合がある。更に、これらの遺伝子の保存性の結果、標
的配列のみで１又は少数のミスマッチに基づいて２種の
生物を区別しなければならないことが多くなり、ハイブ
リダイゼーションのストリンジェンシーが必要になる。
これらの条件から少しでも外れると、誤認の恐れがあ
る。
従って、16S及び23SrRNA遺伝子から特異的プローブを
誘導することができなかった種を含むほとんどの生物に
種特異的なプローブを開発することができ、好ましくは
より広いストリンジェンシー範囲を有する偏在遺伝子を
特徴付けることができるならば、非常に有利である。
誘導することができなかった種を含むほとんどの生物に
種特異的なプローブを開発することができ、好ましくは
より広いストリンジェンシー範囲を有する偏在遺伝子を
特徴付けることができるならば、非常に有利である。
各細胞生物は、その転写物がリボソームの機能とタン
パク質の合成とに不可欠であるため、リボソームRNAシ
ストロンを有する。一般に、遺伝子はゲノム中に多重コ
ピー存在する。真正細菌では16SrRNA遺伝子［小サブユ
ニットrRNA（srRNA）に同じ］はrRNAシストロンの５′
未満に位置し、23SrRNA［大サブユニットrRNA（1rRNA）
に同じ］が後続する。5SrRNA遺伝子はシストロンの３′
末端に位置する。16S、23S及び5S遺伝子はスペーサー領
域により分離され、これらのスペーサー領域には転写後
プロセッシングに関与する転移RNA（tRNA）遺伝子及び
シグナル配列が位置し得る。まず最初にrRNAシストロン
は前駆物質RNA分子として転写される。この一次転写物
はエンドリボヌクレアーゼ及びエキソリボヌクレアーゼ
により更にプロセッシングされ、成熟産物を生成する。
従って、スペーサー領域配列は生物のゲノム中のみに存
在するのではなく、前駆体RNA分子及びプロセッシング
産物中にも存在する。真正細菌rRNAシストロンの構造及
びプロセッシングは、Gegenheimer and Apirion,Micr
obiol.Rev.45:502−541,1981に詳細に記載されている。
パク質の合成とに不可欠であるため、リボソームRNAシ
ストロンを有する。一般に、遺伝子はゲノム中に多重コ
ピー存在する。真正細菌では16SrRNA遺伝子［小サブユ
ニットrRNA（srRNA）に同じ］はrRNAシストロンの５′
未満に位置し、23SrRNA［大サブユニットrRNA（1rRNA）
に同じ］が後続する。5SrRNA遺伝子はシストロンの３′
末端に位置する。16S、23S及び5S遺伝子はスペーサー領
域により分離され、これらのスペーサー領域には転写後
プロセッシングに関与する転移RNA（tRNA）遺伝子及び
シグナル配列が位置し得る。まず最初にrRNAシストロン
は前駆物質RNA分子として転写される。この一次転写物
はエンドリボヌクレアーゼ及びエキソリボヌクレアーゼ
により更にプロセッシングされ、成熟産物を生成する。
従って、スペーサー領域配列は生物のゲノム中のみに存
在するのではなく、前駆体RNA分子及びプロセッシング
産物中にも存在する。真正細菌rRNAシストロンの構造及
びプロセッシングは、Gegenheimer and Apirion,Micr
obiol.Rev.45:502−541,1981に詳細に記載されている。
真核生物の核ゲノム中の状況は多少異なり、srRNA及
び1rRNA間に5.8SRNA遺伝子が位置しており、5SrRNA遺伝
子は別個の長いタンデムアレー中に配置されている（Pe
rry,Annu.Rev.Biochem.45:605−629,1976;Long and D
awid,Annu.Rev.Biochem.49:727−764,1980）。しかしな
がら、真核生物のミトコンドリア又はクロロプラスト中
のrRNAシストロンは実際に原核生物である（Borst and
Grivell,Nature 290:443−444,1981）。
び1rRNA間に5.8SRNA遺伝子が位置しており、5SrRNA遺伝
子は別個の長いタンデムアレー中に配置されている（Pe
rry,Annu.Rev.Biochem.45:605−629,1976;Long and D
awid,Annu.Rev.Biochem.49:727−764,1980）。しかしな
がら、真核生物のミトコンドリア又はクロロプラスト中
のrRNAシストロンは実際に原核生物である（Borst and
Grivell,Nature 290:443−444,1981）。
文献には非常に少数の真核又は原核生物のスペーサー
領域の核酸配列しか記載されていない（例えばYoung e
t al.,J.Biol.Chem.254:3264−3271,1979;及びMartens
et al.,System.Appl.Microbiol.９:224−230,198
7）。これらのデータから核酸配列保存を確実に予想す
ることはできず、従って、特異的プローブの選択のため
のスペーサー領域の適応については全く推定することが
できない。
領域の核酸配列しか記載されていない（例えばYoung e
t al.,J.Biol.Chem.254:3264−3271,1979;及びMartens
et al.,System.Appl.Microbiol.９:224−230,198
7）。これらのデータから核酸配列保存を確実に予想す
ることはできず、従って、特異的プローブの選択のため
のスペーサー領域の適応については全く推定することが
できない。
より詳細には、真核生物に関して、生物学的サンプル
中で微生物の検出に使用され、16S及び23SrRNA遺伝子間
のスペーサー領域から誘導されるハイブリダイゼーショ
ンプローブは未だに報告されていない。真核生物の大小
サブユニットrRNA遺伝子間の対応するスペーサー領域に
ついても何ら解明されていない。
中で微生物の検出に使用され、16S及び23SrRNA遺伝子間
のスペーサー領域から誘導されるハイブリダイゼーショ
ンプローブは未だに報告されていない。真核生物の大小
サブユニットrRNA遺伝子間の対応するスペーサー領域に
ついても何ら解明されていない。
真核生物に関する限り、リボソーム遺伝子スペーサー
からクローニングされたフラグメントの使用がLeishman
iaに関する分類学的研究に記載されている（Ramirez a
nd Guevara,Mol.Bioch.Parasitol.22:177−183,198
7）。しかしながら、使用された領域及び研究のアプロ
ーチは、特に以下に述べる理由により、小rRNA及び大rR
NA遺伝子間のスペーサー領域から誘導されるプローブを
使用するために当業者には無益である。
からクローニングされたフラグメントの使用がLeishman
iaに関する分類学的研究に記載されている（Ramirez a
nd Guevara,Mol.Bioch.Parasitol.22:177−183,198
7）。しかしながら、使用された領域及び研究のアプロ
ーチは、特に以下に述べる理由により、小rRNA及び大rR
NA遺伝子間のスペーサー領域から誘導されるプローブを
使用するために当業者には無益である。
（ｉ）Ramirez及びGuevaraにより使用されたリボソーム
遺伝子スペーサーはsrRNA及び1rRNA間のスペーサー領域
ではなく、２つの隣接するrRNAシストロン間に存在する
配列であり、このようなスペーサーは真核生物ではrRNA
シストロンの反復単位間にしか見いだされず、srRNA及
び1rRNA遺伝子間の内部スペーサーには無関係である。
遺伝子スペーサーはsrRNA及び1rRNA間のスペーサー領域
ではなく、２つの隣接するrRNAシストロン間に存在する
配列であり、このようなスペーサーは真核生物ではrRNA
シストロンの反復単位間にしか見いだされず、srRNA及
び1rRNA遺伝子間の内部スペーサーには無関係である。
（ii）遺伝子スペーサーフラグメントを使用するLeishm
ania分類群間の区別は、制御フラグメントパターンを比
較することにより得られ、使用されるフラグメントは非
特異的である。
ania分類群間の区別は、制御フラグメントパターンを比
較することにより得られ、使用されるフラグメントは非
特異的である。
従って、サザンブロット分析を用いずに簡単なハイブ
リダイゼーションプロトコルを使用してフラグメントで
区別することは不可能である。
リダイゼーションプロトコルを使用してフラグメントで
区別することは不可能である。
リボソーム遺伝子スペーサー中に高特異的プローブが
存在し得るということも立証されていない。
存在し得るということも立証されていない。
従って、本発明の目的は、細菌種のような特定生物の
rRNA遺伝子間のスペーサー領域から誘導される種特異的
プローブを提供することである。
rRNA遺伝子間のスペーサー領域から誘導される種特異的
プローブを提供することである。
本発明の別の目的は、Neisseria gonorrhoeae,Neiss
eria meningitidis,Branhamella catarrhalis,Haemop
hilus ducreyi,Haemophilus influenzae,Bordetella
pertussis,Streptococcus agalactiae,Streptococcu
s pneumoniae,Campylobacter jejuni及びCampylobact
er coli株を検出するための、16S−23SrRNAスペーサー
領域から誘導されるDNAプローブを提供することであ
る。
eria meningitidis,Branhamella catarrhalis,Haemop
hilus ducreyi,Haemophilus influenzae,Bordetella
pertussis,Streptococcus agalactiae,Streptococcu
s pneumoniae,Campylobacter jejuni及びCampylobact
er coli株を検出するための、16S−23SrRNAスペーサー
領域から誘導されるDNAプローブを提供することであ
る。
本発明の更に別の目的は、ドットスポット、鎖置換、
コンペティション、サンドイッチ又は逆ハイブリダイゼ
ーション試験のようなハイブリダイゼーション試験によ
り生物学的サンプル中でNeisseria gonorrhoeae,Neiss
eria meningitidis,Branhamella catarrhalis,Haemop
hilus ducreyi,Haemophilus influenzae,Bordetella
pertussis,Streptococcus agalactiae,Streptococcu
s pneumoniae,Campylobacter jejuni及びCampylobact
er coli株を検出するための、16S−23SrRNA遺伝子スペ
ーサー領域から誘導されるDNAプローブを提供すること
である。本発明の更に別の目的は、Neisseria gonorrh
oeae,Neisseria meningitidis,Branhamella catarrha
lis,Haemophilus ducreyi,Haemophilus influenzae,B
ordetella pertussis,Streptococcus agalactiae,Str
eptococcus pneumoniae,Campylobacter jejuni及びCa
mpylobacter coli株のin vitro診断用プローブ及び簡
単な診断方法を提供することである。
コンペティション、サンドイッチ又は逆ハイブリダイゼ
ーション試験のようなハイブリダイゼーション試験によ
り生物学的サンプル中でNeisseria gonorrhoeae,Neiss
eria meningitidis,Branhamella catarrhalis,Haemop
hilus ducreyi,Haemophilus influenzae,Bordetella
pertussis,Streptococcus agalactiae,Streptococcu
s pneumoniae,Campylobacter jejuni及びCampylobact
er coli株を検出するための、16S−23SrRNA遺伝子スペ
ーサー領域から誘導されるDNAプローブを提供すること
である。本発明の更に別の目的は、Neisseria gonorrh
oeae,Neisseria meningitidis,Branhamella catarrha
lis,Haemophilus ducreyi,Haemophilus influenzae,B
ordetella pertussis,Streptococcus agalactiae,Str
eptococcus pneumoniae,Campylobacter jejuni及びCa
mpylobacter coli株のin vitro診断用プローブ及び簡
単な診断方法を提供することである。
本発明は、非ウイルス生物、特に原核生物、より特定
的には細菌のrRNA遺伝子間のスペーサー領域の少なくと
も約15ヌクレオチドから構成されるプローブに係る。
的には細菌のrRNA遺伝子間のスペーサー領域の少なくと
も約15ヌクレオチドから構成されるプローブに係る。
本発明はより詳細には、非ウイルス生物、特に原核生
物、より特定的には細菌のrRNA遺伝子間、特に16S及び2
3SrRNA遺伝子間のスペーサー領域の約15ヌクレオチド〜
ほぼ最大数のヌクレオチド、より好ましくはスペーサー
領域の約15〜約100ヌクレオチドから構成されるプロー
ブに係る。
物、より特定的には細菌のrRNA遺伝子間、特に16S及び2
3SrRNA遺伝子間のスペーサー領域の約15ヌクレオチド〜
ほぼ最大数のヌクレオチド、より好ましくはスペーサー
領域の約15〜約100ヌクレオチドから構成されるプロー
ブに係る。
以下の文中で「スペーサー領域」なる用語は、rRNA遺
伝子間、より特定的には16S及び23SrRNA遺伝子間のスペ
ーサー領域を意味する。
伝子間、より特定的には16S及び23SrRNA遺伝子間のスペ
ーサー領域を意味する。
本発明は、検出すべき非ウイルス生物、特に原核生
物、より特定的には細菌に固有であるように選択された
rRNA遺伝子間のスペーサー領域の配列にハイブリダイズ
するために十分相補的なオリゴヌクレオチドを構築する
段階を含む方法で得られるようなハイブリダイゼーショ
ンアッセイ用プローブに係り、rRNA遺伝子間のスペーサ
ー領域の前記配列は、 −＊目的生物のrRNA遺伝子間のスペーサー領域のヌクレ
オチド配列を、最近隣種のrBNA遺伝子間のスペーサー領
域のヌクレオチド配列と比較し、 ＊最近隣種のうちの少なくとも１種のrRNA遺伝子間のス
ペーサー領域との間に少なくとも１つのミスマッチを有
する目的生物のrRNA遺伝子間のスペーサー領域の少なく
とも約15ヌクレオチド、好ましくはスペーサー領域の約
15〜ほぼ最大数のヌクレオチド、より好ましくは約15〜
約100ヌクレオチドの配列を選択することにより、又は −＊短縮スペーサー領域を得るように、目的生物のスペ
ーサー領域からtRNA遺伝子及び場合によりシグナル配列
を欠失させ、 ＊少なくとも約15ヌクレオチド、好ましくは約15〜スペ
ーサー領域のほぼ最大数のヌクレオチド、より好ましく
は約15〜約100ヌクレオチドから構成され且つ目的生物
の核酸（DNA及び／又はRNA）と特異的にハイブリダイズ
することが可能な特異的ヌクレオチド配列を試験錯誤に
より決定することにより選択される。
物、より特定的には細菌に固有であるように選択された
rRNA遺伝子間のスペーサー領域の配列にハイブリダイズ
するために十分相補的なオリゴヌクレオチドを構築する
段階を含む方法で得られるようなハイブリダイゼーショ
ンアッセイ用プローブに係り、rRNA遺伝子間のスペーサ
ー領域の前記配列は、 −＊目的生物のrRNA遺伝子間のスペーサー領域のヌクレ
オチド配列を、最近隣種のrBNA遺伝子間のスペーサー領
域のヌクレオチド配列と比較し、 ＊最近隣種のうちの少なくとも１種のrRNA遺伝子間のス
ペーサー領域との間に少なくとも１つのミスマッチを有
する目的生物のrRNA遺伝子間のスペーサー領域の少なく
とも約15ヌクレオチド、好ましくはスペーサー領域の約
15〜ほぼ最大数のヌクレオチド、より好ましくは約15〜
約100ヌクレオチドの配列を選択することにより、又は −＊短縮スペーサー領域を得るように、目的生物のスペ
ーサー領域からtRNA遺伝子及び場合によりシグナル配列
を欠失させ、 ＊少なくとも約15ヌクレオチド、好ましくは約15〜スペ
ーサー領域のほぼ最大数のヌクレオチド、より好ましく
は約15〜約100ヌクレオチドから構成され且つ目的生物
の核酸（DNA及び／又はRNA）と特異的にハイブリダイズ
することが可能な特異的ヌクレオチド配列を試験錯誤に
より決定することにより選択される。
本発明は特に、rRNA遺伝子間のスペーサー領域が16Sr
RNA遺伝子及び23SrRNA遺伝子間の転写スペーサー領域で
あるようなプローブに係る。
RNA遺伝子及び23SrRNA遺伝子間の転写スペーサー領域で
あるようなプローブに係る。
追って概説するように、数種の微生物のスペーサー領
域をクローニングし、配列決定及び比較した。比較の結
果、スペーサー領域の核酸配列は高保存性のrRNA遺伝子
に比較して半保存性（semi−conserved nature）である
ことが判明した。従って、スペーサー領域はrRNA遺伝子
それ自体よりもプローブの開発に好適である。図１、２
及び10は、高度に関連する生物（例えば同一遺伝種から
の高度に関連する株）間に高度の配列相同性があること
を示す。図３及び７に示すように、並の関連性を有する
生物間では多少大きい配列相違が認められた。図４〜６
に示すように、関連性の低い種間では顕著な配列相同性
は（tRNA配列を除き）全くないことが判明した。
域をクローニングし、配列決定及び比較した。比較の結
果、スペーサー領域の核酸配列は高保存性のrRNA遺伝子
に比較して半保存性（semi−conserved nature）である
ことが判明した。従って、スペーサー領域はrRNA遺伝子
それ自体よりもプローブの開発に好適である。図１、２
及び10は、高度に関連する生物（例えば同一遺伝種から
の高度に関連する株）間に高度の配列相同性があること
を示す。図３及び７に示すように、並の関連性を有する
生物間では多少大きい配列相違が認められた。図４〜６
に示すように、関連性の低い種間では顕著な配列相同性
は（tRNA配列を除き）全くないことが判明した。
下記表では、異なる株の16SrRNA配列の相同値（16S
hom）（配列相同％）を、スペーサー領域の対応する相
同値（スペーサーhom）に比較した。相同値（16S hom
及びスペーサーhom）は、Intelligentics Inc.及びGen
ofit SA製PC Geneソフトウェア（1989年４月20日リリ
ース6.01）を使用して計算した。比較したヌクレオチド
の総数を括弧内に示す。この結果から明らかなように、
スペーサー領域は16SrRNA分子よりも低保存性である。
hom）（配列相同％）を、スペーサー領域の対応する相
同値（スペーサーhom）に比較した。相同値（16S hom
及びスペーサーhom）は、Intelligentics Inc.及びGen
ofit SA製PC Geneソフトウェア（1989年４月20日リリ
ース6.01）を使用して計算した。比較したヌクレオチド
の総数を括弧内に示す。この結果から明らかなように、
スペーサー領域は16SrRNA分子よりも低保存性である。
この結果、関連する対象病原種（即ちNeisseria gon
orrhoeae,Neisseria meningitidis,Branhamella cata
rrhalis,Haemophilus ducreyi,Haemophilus influenz
ae,Bordetella pertussis,Streptococcus agalactia
e,Streptococcus pneumoniae,Campylobacter jejuni
及びCampylobacter coli株）のスペーサー領域配列か
ら種特異性及び感度の高いプローブを誘導することがで
きた。16S及び／又は23SrRNA分子中で高特異性プローブ
を見いだすことができなかったNeisseria meningitidi
s及びBordetella pertussis種のスペーサー領域からも
有用なプローブを誘導することができた。本明細書に記
載する以外の種（例えば他のCampylobacter種、他のHae
mophilus種、Actinobacillus種、Bacteroides種、chlam
ydia種等）の特異的プローブも同様にスペーサー領域配
列から誘導できる。
orrhoeae,Neisseria meningitidis,Branhamella cata
rrhalis,Haemophilus ducreyi,Haemophilus influenz
ae,Bordetella pertussis,Streptococcus agalactia
e,Streptococcus pneumoniae,Campylobacter jejuni
及びCampylobacter coli株）のスペーサー領域配列か
ら種特異性及び感度の高いプローブを誘導することがで
きた。16S及び／又は23SrRNA分子中で高特異性プローブ
を見いだすことができなかったNeisseria meningitidi
s及びBordetella pertussis種のスペーサー領域からも
有用なプローブを誘導することができた。本明細書に記
載する以外の種（例えば他のCampylobacter種、他のHae
mophilus種、Actinobacillus種、Bacteroides種、chlam
ydia種等）の特異的プローブも同様にスペーサー領域配
列から誘導できる。
16S及び23SrRNA遺伝子間の転写スペーサー領域から誘
導されるプローブの標的は、検出すべき細胞中に存在す
るゲノムDNA及び前駆体RNA分子である。前駆体RNA分子
は一本鎖であり、多重コピー存在し得るので、前駆体RN
A分子を検出すると有利である。他方、DNA分子はRNA分
子よりも酵素分解を非常に受けにくい。従って、ハイブ
リダイゼーション前にRNA分解を生じないように十分に
生物学的サンプルを処理及び／又は保存できない場合に
は、DNAターゲッティングが好適である。
導されるプローブの標的は、検出すべき細胞中に存在す
るゲノムDNA及び前駆体RNA分子である。前駆体RNA分子
は一本鎖であり、多重コピー存在し得るので、前駆体RN
A分子を検出すると有利である。他方、DNA分子はRNA分
子よりも酵素分解を非常に受けにくい。従って、ハイブ
リダイゼーション前にRNA分解を生じないように十分に
生物学的サンプルを処理及び／又は保存できない場合に
は、DNAターゲッティングが好適である。
16S−23SrRNA転写スペーサー領域から誘導されるプロ
ーブの別の利点は、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）を使用
する酵素増幅後に標的検出する点にある。多くの微生物
のスペーサー領域は例えば、夫々16S及び23SrRNA遺伝子
の３′末端及び５′末端の保存領域に割り当てられた同
一プライマーを使用して酵素的に増幅され得る。rRNA遺
伝子の高保存性を利用すると、同一試薬及びプロトコル
を使用して好適には同時に多数の生物のスペーサー領域
を増幅し、その後、該当生物のスペーサー領域に特異的
にターゲッティングするプローブを使用して増幅フラグ
メントを検出することができる。同時に増幅されたフラ
グメントの同時且つ特異的検出のために有利な方法は、
逆ハイブリダイゼーションである。
ーブの別の利点は、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）を使用
する酵素増幅後に標的検出する点にある。多くの微生物
のスペーサー領域は例えば、夫々16S及び23SrRNA遺伝子
の３′末端及び５′末端の保存領域に割り当てられた同
一プライマーを使用して酵素的に増幅され得る。rRNA遺
伝子の高保存性を利用すると、同一試薬及びプロトコル
を使用して好適には同時に多数の生物のスペーサー領域
を増幅し、その後、該当生物のスペーサー領域に特異的
にターゲッティングするプローブを使用して増幅フラグ
メントを検出することができる。同時に増幅されたフラ
グメントの同時且つ特異的検出のために有利な方法は、
逆ハイブリダイゼーションである。
スペーサー領域は保存配列により夾叉されているの
で、この領域をPCR技術によりクローニング及び配列決
定するのは簡単であり、同一プロトコルを多種の生物に
適用することができる。従ってスペーサー領域の配列
は、16S又は23SrRNAに割り当てられた保存プライマーを
使用するrRNA遺伝子の酵素的増幅により得られる。スペ
ーサー領域を占めるフラグメントの増幅に使用可能な塩
基プライマー対の例を以下に挙げる。
で、この領域をPCR技術によりクローニング及び配列決
定するのは簡単であり、同一プロトコルを多種の生物に
適用することができる。従ってスペーサー領域の配列
は、16S又は23SrRNAに割り当てられた保存プライマーを
使用するrRNA遺伝子の酵素的増幅により得られる。スペ
ーサー領域を占めるフラグメントの増幅に使用可能な塩
基プライマー対の例を以下に挙げる。
増幅したフラグメントをそのまま、又は固有制限部位
を認識する制限酵素で消化後に２つのサブフラグメント
としてクローニングすることができる。M13でPCR産物を
クローニングするためのストラテジーは、Medlin et
al.（Gene 71:491−499,1988）に記載されている。
を認識する制限酵素で消化後に２つのサブフラグメント
としてクローニングすることができる。M13でPCR産物を
クローニングするためのストラテジーは、Medlin et
al.（Gene 71:491−499,1988）に記載されている。
同一ストラテジーを使用してプラスミドベクターでク
ローニングすることができる。このアプローチによる
と、塩基プライマーの５′末端から固有制限部位を含む
ヌクレオチド配列を伸長させ、フラグメントを順方向に
クローニングする。プラスミドベクターにクローニング
後、ジデオキシチェーンターミネーション法を使用して
スペーサー領域を配列決定することができる。
ローニングすることができる。このアプローチによる
と、塩基プライマーの５′末端から固有制限部位を含む
ヌクレオチド配列を伸長させ、フラグメントを順方向に
クローニングする。プラスミドベクターにクローニング
後、ジデオキシチェーンターミネーション法を使用して
スペーサー領域を配列決定することができる。
このアプローチはゲノムバンク又は選択された制限エ
ンドヌクレアーゼフラグメントを使用する従来のクロー
ニング手順に比較して著しく簡単で時間がかからない。
ンドヌクレアーゼフラグメントを使用する従来のクロー
ニング手順に比較して著しく簡単で時間がかからない。
クローニングせずにPCRフラグメントで配列決定反応
を直接実施すると、より迅速に配列情報が得られるが、
クローン化フラグメントから生成された配列情報のほう
がより正確且つ完全である。PCRフラグメントに比較し
て、クローン化遺伝子フラグメントは容易に大量精製で
きるので、配列決定段階を明瞭に読み取ることができ
る。プローブ配列中に１つでもミスマッチがあるとプロ
ーブは無効になるので、配列を得る際には速度よりも精
度のほうが著しく優先される。
を直接実施すると、より迅速に配列情報が得られるが、
クローン化フラグメントから生成された配列情報のほう
がより正確且つ完全である。PCRフラグメントに比較し
て、クローン化遺伝子フラグメントは容易に大量精製で
きるので、配列決定段階を明瞭に読み取ることができ
る。プローブ配列中に１つでもミスマッチがあるとプロ
ーブは無効になるので、配列を得る際には速度よりも精
度のほうが著しく優先される。
上記に要約したアプローチによりスペーサー配列を得
る容易さを考慮すると、プローブが所望される生物のス
ペーサー領域のヌクレオチド配列を最近隣種のスペーサ
ー領域のヌクレオチド配列と比較するのが、特異的プロ
ーブ配列を誘導するために好適な方法である。
る容易さを考慮すると、プローブが所望される生物のス
ペーサー領域のヌクレオチド配列を最近隣種のスペーサ
ー領域のヌクレオチド配列と比較するのが、特異的プロ
ーブ配列を誘導するために好適な方法である。
最近隣種とは、DNA相同の点で最も密接に関連するこ
とが知られており且つ該当生物と区別されなければなら
ない分類群を意味する。
とが知られており且つ該当生物と区別されなければなら
ない分類群を意味する。
該当成分の分類学的位置に依存して、最近隣種は該当
生物に非常に高度の関連し、結合度が75％以上であって
もよいし、関連度が低く、有効なDNA相同百分率を示さ
なくてもよい。初期再生レート法では結合度の値は約30
％以下であり、固相DNA:DNAハイブリダイゼーション法
ではDNA相同は更に低く、10〜20％の結合度になる。
生物に非常に高度の関連し、結合度が75％以上であって
もよいし、関連度が低く、有効なDNA相同百分率を示さ
なくてもよい。初期再生レート法では結合度の値は約30
％以下であり、固相DNA:DNAハイブリダイゼーション法
ではDNA相同は更に低く、10〜20％の結合度になる。
一方、該当生物を区別すべき最近隣種のヌクレオチド
配列を入手できない場合には、試行錯誤により特異的プ
ローブを選択することができる。その場合、スペーサー
領域の任意の場所に位置し得る特異的プローブ領域を各
生物毎に実験的に定義しなければならない。tRNA遺伝子
やシグナル配列のようなスペーサー領域中のほんのわず
かの領域しかプローブ領域として先験的に除外できない
場合もある。しかしながら、16S−23SrRNAスペーサー領
域は一般に小さく、通常900bp以下であるので、大規模
にスクリーニングしなくても良好なプローブ配列を容易
に見いだすことができる。
配列を入手できない場合には、試行錯誤により特異的プ
ローブを選択することができる。その場合、スペーサー
領域の任意の場所に位置し得る特異的プローブ領域を各
生物毎に実験的に定義しなければならない。tRNA遺伝子
やシグナル配列のようなスペーサー領域中のほんのわず
かの領域しかプローブ領域として先験的に除外できない
場合もある。しかしながら、16S−23SrRNAスペーサー領
域は一般に小さく、通常900bp以下であるので、大規模
にスクリーニングしなくても良好なプローブ配列を容易
に見いだすことができる。
例えば16S及び23SrRNA遺伝子間の700bpのスペーサー
領域の場合、tRNA及びシグナル配列を欠失させることに
より得られる「短縮」スペーサー領域は約500bpであり
得る。
領域の場合、tRNA及びシグナル配列を欠失させることに
より得られる「短縮」スペーサー領域は約500bpであり
得る。
本明細書中に使用する「生物学的サンプル」なる用語
は、該当標的配列が探査される臨床サンプル（膿、痰、
血液、尿等）、環境サンプル、細菌コロニー、汚染又は
純粋培養物、精製核酸等のような試料を意味する。
は、該当標的配列が探査される臨床サンプル（膿、痰、
血液、尿等）、環境サンプル、細菌コロニー、汚染又は
純粋培養物、精製核酸等のような試料を意味する。
本明細書中に使用する「rRNA遺伝子スペーサー領域か
ら誘導」なる用語は、該当プローブがDNAフラグメント
から形成されるかRNAフラグメントから形成されるかに
関係なく、又はクローン化フラグメント（DNAの場合）
から構成されるか又は合成オリゴヌクレオチドから構成
されるかに関係なく、該当プローブがゲノム又は転写RN
A分子中に通常存在するリボソームRNA遺伝子間のスペー
サー領域に配置された配列とハイブリダイズすることを
意味する。
ら誘導」なる用語は、該当プローブがDNAフラグメント
から形成されるかRNAフラグメントから形成されるかに
関係なく、又はクローン化フラグメント（DNAの場合）
から構成されるか又は合成オリゴヌクレオチドから構成
されるかに関係なく、該当プローブがゲノム又は転写RN
A分子中に通常存在するリボソームRNA遺伝子間のスペー
サー領域に配置された配列とハイブリダイズすることを
意味する。
Neisseria gonorrhoeae株を検出するための本発明の
ハイブリダイゼーションプローブは、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は 下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修
飾配列と同一のRNA又はDNA標的とハイブリダイズすると
いう条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチド
が付加もしくは除去されているか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換
されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列
を含む。
ハイブリダイゼーションプローブは、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は 下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修
飾配列と同一のRNA又はDNA標的とハイブリダイズすると
いう条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチド
が付加もしくは除去されているか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換
されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列
を含む。
Neisseria meningitidis株を検出するための本発明
のハイブリダイゼーションプローブは、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は 下記の場合のいずれかにおいてもプローブが対応する非
修飾配列と同一のRNA又はDNA標的とハイブリダイズする
という条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチド
が付加もしくは除去されているか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換
されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列
を含む。
のハイブリダイゼーションプローブは、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は 下記の場合のいずれかにおいてもプローブが対応する非
修飾配列と同一のRNA又はDNA標的とハイブリダイズする
という条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチド
が付加もしくは除去されているか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換
されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列
を含む。
Branhamella catarrhalis株を検出するための本発明
のハイブリダイゼーションプローブは、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は 下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修
飾配列と同一のRNA又はDNA標的とハイブリダイズすると
いう条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチド
が付加もしくは除去されているか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換
されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列
を含む。
のハイブリダイゼーションプローブは、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は 下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修
飾配列と同一のRNA又はDNA標的とハイブリダイズすると
いう条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチド
が付加もしくは除去されているか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換
されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列
を含む。
Haemophilus ducreyi株を検出するための本発明のハ
イブリダイゼーションプローブは、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は 下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修
飾配列と同一のRNA又はDNA標的とハイブリダイズすると
いう条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチド
が付加もしくは除去されているか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換
されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列
を含む。
イブリダイゼーションプローブは、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は 下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修
飾配列と同一のRNA又はDNA標的とハイブリダイズすると
いう条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチド
が付加もしくは除去されているか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換
されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列
を含む。
Haemophilus influenzae株を検出するための本発明
のハイブリダイゼーションプローブは、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は 下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修
飾配列と同一のRNA又はDNA標的とハイブリダイズすると
いう条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチド
が付加もしくは除去されているか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換
されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列
を含む。
のハイブリダイゼーションプローブは、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は 下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修
飾配列と同一のRNA又はDNA標的とハイブリダイズすると
いう条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチド
が付加もしくは除去されているか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換
されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列
を含む。
Bordetella pertussis株を検出するための本発明の
ハイブリダイゼーションプローブは、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は 下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修
飾配列と同一のRNA又はDNA標的とハイブリダイズすると
いう条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチド
が付加もしくは除去されているか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換
されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列
を含む。
ハイブリダイゼーションプローブは、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は 下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修
飾配列と同一のRNA又はDNA標的とハイブリダイズすると
いう条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチド
が付加もしくは除去されているか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換
されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列
を含む。
Streptococcus pneumoniae株を検出するための本発
明のハイブリダイゼーションプローブは、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は 下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修
飾配列と同一のRNA又はDNA標的とハイブリダイズすると
いう条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチド
が付加もしくは除去されているか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換
されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列
を含む。
明のハイブリダイゼーションプローブは、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は 下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修
飾配列と同一のRNA又はDNA標的とハイブリダイズすると
いう条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチド
が付加もしくは除去されているか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換
されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列
を含む。
Streptococcus agalactiae株を検出するための本発
明のハイブリダイゼーションプローブは、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は 下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修
飾配列と同一のRNA又はDNA標的とハイブリダイズすると
いう条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチド
が付加もしくは除去されているか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換
されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列
を含む。
明のハイブリダイゼーションプローブは、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は 下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修
飾配列と同一のRNA又はDNA標的とハイブリダイズすると
いう条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチド
が付加もしくは除去されているか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換
されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列
を含む。
本発明は更に、適切な条件でプローブがCampylobacte
r jejuni及びCampylobacter coli由来のDNA及び／又
はRNAと特異的にハイブリダイズするという条件下で、
図10に示し16S−23SrRNAスペーサー配列から誘導される
15〜最大数のヌクレオチドの配列、又はＴがＵで置換さ
れた対応配列、又はその相補配列、又はＴがＵで置換さ
れた対応する相補配列を含むCampylobacter jejuni及
びCampylobacter coli株を検出するためのハイブリダ
イゼーションプローブに係る。
r jejuni及びCampylobacter coli由来のDNA及び／又
はRNAと特異的にハイブリダイズするという条件下で、
図10に示し16S−23SrRNAスペーサー配列から誘導される
15〜最大数のヌクレオチドの配列、又はＴがＵで置換さ
れた対応配列、又はその相補配列、又はＴがＵで置換さ
れた対応する相補配列を含むCampylobacter jejuni及
びCampylobacter coli株を検出するためのハイブリダ
イゼーションプローブに係る。
グループNGI1,NGI2,NMI1,NMI2,NMI3,NMI4,NMI5,NMI6,
BCI1,BCI2,HDI1,HII1,HII2,BPI1,SPI1,SPI2,SPI3,SAI1,
SAI2,SAI3及びSAI4に示した配列中、アルファベットは
以下のヌクレオチドを表す。
BCI1,BCI2,HDI1,HII1,HII2,BPI1,SPI1,SPI2,SPI3,SAI1,
SAI2,SAI3及びSAI4に示した配列中、アルファベットは
以下のヌクレオチドを表す。
A:アデニル残基 C:シチジル残基 G:グアニジル残基 T:チミジル残基 U:ウラシル残基。
「標的」なる用語は、上記に定義したグループNGI1,N
GI2,NMI1,NMI2,NMI3,NMI4,NMI5,NMI6,BCI1,BCI2,HDI1,H
II1,HII2,BPI1,SPI1,SPI2,SPI3,SAI1,SAI2,SAI3及びSAI
4の配列のいずれかに相補的な配列を意味する。
GI2,NMI1,NMI2,NMI3,NMI4,NMI5,NMI6,BCI1,BCI2,HDI1,H
II1,HII2,BPI1,SPI1,SPI2,SPI3,SAI1,SAI2,SAI3及びSAI
4の配列のいずれかに相補的な配列を意味する。
本発明のプローブが上記配列の片側又は両側に核酸延
長部（例えばクローニングベクターの核酸フラグメント
又は該クローニングベクターから前記プローブを切断す
ることにより得られるリンカーフラグメント）を含む場
合、このような延長部は、追って定義するような本発明
の方法により試験され得る微生物のDNA中で上記標的以
外の任意の対応する相補的核酸配列とハイブリダイズし
ないように選択されるべきである。このようなハイブリ
ダイゼーションは寄生性であり、プローブの特異性を低
下させる。好適プローブは、上記グループの配列のいず
れかから形成される核酸フラグメントから構成され、該
フラグメントは15〜該当核酸配列の最大数のヌクレオチ
ドを含む。
長部（例えばクローニングベクターの核酸フラグメント
又は該クローニングベクターから前記プローブを切断す
ることにより得られるリンカーフラグメント）を含む場
合、このような延長部は、追って定義するような本発明
の方法により試験され得る微生物のDNA中で上記標的以
外の任意の対応する相補的核酸配列とハイブリダイズし
ないように選択されるべきである。このようなハイブリ
ダイゼーションは寄生性であり、プローブの特異性を低
下させる。好適プローブは、上記グループの配列のいず
れかから形成される核酸フラグメントから構成され、該
フラグメントは15〜該当核酸配列の最大数のヌクレオチ
ドを含む。
上記ヌクレオチド配列（及び以下に記載する他の配
列）において、式の左端は常に該当配列の５′未満に対
応し、右端は３′末端に対応する。
列）において、式の左端は常に該当配列の５′未満に対
応し、右端は３′末端に対応する。
更に「グループＸのプローブ」（ＸはNGI1,NGI2,NMI
1,NMI2,NMI3,NMI4,NMI5,NMI6,BCI1,BCI2,HDI1,HII1,HII
2,BPI1,SPI1,SPI2,SPI3,SAI1,SAI2,SAI3及びSAI4から選
択される）と称するとき、このようなプローブは上記又
は下記に定義するグループに属する核酸の１種に含まれ
る配列を有するものと理解されたい。
1,NMI2,NMI3,NMI4,NMI5,NMI6,BCI1,BCI2,HDI1,HII1,HII
2,BPI1,SPI1,SPI2,SPI3,SAI1,SAI2,SAI3及びSAI4から選
択される）と称するとき、このようなプローブは上記又
は下記に定義するグループに属する核酸の１種に含まれ
る配列を有するものと理解されたい。
また、本明細書中で使用する「ヌクレオチド」なる用
語は、特に明記しない限りリボヌクレオチド及びデオキ
シヌクレオチド及び修飾ヌクレオチド（例えばイノシ
ン）を無差別に意味するものと理解されたい。「ヌクレ
オチド」なる用語は更に、修飾基（例えばハイブリダイ
ゼーション能に根本的に影響しない化学的修飾基）を含
むヌクレオチドも包含する。このような修飾基の目的
は、例えば特に該当RNA又はDNA鎖（例えば他のDNA及び
／又はRNAと共に生物学的サンプル中に最初に含まれて
いるRNA又はDNA鎖）とのハイブリダイゼーション産物中
から標識又はラベルされたプローブを後で検出するため
に適切なマーカー又はラベルと直接又は間接的に結合し
易くすることである。
語は、特に明記しない限りリボヌクレオチド及びデオキ
シヌクレオチド及び修飾ヌクレオチド（例えばイノシ
ン）を無差別に意味するものと理解されたい。「ヌクレ
オチド」なる用語は更に、修飾基（例えばハイブリダイ
ゼーション能に根本的に影響しない化学的修飾基）を含
むヌクレオチドも包含する。このような修飾基の目的
は、例えば特に該当RNA又はDNA鎖（例えば他のDNA及び
／又はRNAと共に生物学的サンプル中に最初に含まれて
いるRNA又はDNA鎖）とのハイブリダイゼーション産物中
から標識又はラベルされたプローブを後で検出するため
に適切なマーカー又はラベルと直接又は間接的に結合し
易くすることである。
例えば、このような修飾基は、適切な酵素又は蛍光又
は化学発光ラベルを担持する他の抗体により特異的に認
識され得る抗体により認識可能である。可能な標識手順
については追って詳細に説明する。
は化学発光ラベルを担持する他の抗体により特異的に認
識され得る抗体により認識可能である。可能な標識手順
については追って詳細に説明する。
本発明は更に、上記配列のいずれかを有しており且つ
上記プローブの特異性を変更しないように一部のヌクレ
オチドが置換したプローブにも係る。プローブは、上記
グループのいずれかに属する核酸の１種又はその一部か
ら構成される場合もあるが、その場合、プローブはNeis
seria gonorrhoeae,Neisseria meningitidis,Branham
ella catarrhalis,Haemophilus ducreyi,Haemophilus
influenzae,Bordetella pertussis,Streptococcus
agalactiae,Streptococcus pneumoniae又はCampylobac
ter jejuni及びCampylobacter coli株の遺伝材料に対
する該プローブとの特異性を変えない程度までその両側
にヌクレオチド延長部を含む。
上記プローブの特異性を変更しないように一部のヌクレ
オチドが置換したプローブにも係る。プローブは、上記
グループのいずれかに属する核酸の１種又はその一部か
ら構成される場合もあるが、その場合、プローブはNeis
seria gonorrhoeae,Neisseria meningitidis,Branham
ella catarrhalis,Haemophilus ducreyi,Haemophilus
influenzae,Bordetella pertussis,Streptococcus
agalactiae,Streptococcus pneumoniae又はCampylobac
ter jejuni及びCampylobacter coli株の遺伝材料に対
する該プローブとの特異性を変えない程度までその両側
にヌクレオチド延長部を含む。
従って本発明は、場合によりヌクレオチド配列に少数
の些少の変異を有するほとんどのNeisseria gonorrhoe
ae,Neisseria meningitidis,Branhamella catarrhali
s,Haemophilus ducreyi,Haemophilus influenzae,Bor
detella pertussis,Streptococcus agalactiae,Strep
tococcus pneumoniaeもしくはCampylobacter jejuni
及びCampylobacter coliのRNA又はDNAに含まれる配列
のヌクレオチド配列からなるレプリカ（数字の数にIC又
はICRと記述することにより表す）、又はNeisseria go
norrhoeae,Neisseria meningitidis,Branhamella cat
arrhalis,Haemophilus ducreyi,Haemophilus influen
zae,Bordetella pertussis,Streptococcus agalactia
e,Streptococcus pneumoniaeもしくはCampylobacter
jejuni及びCampylobacter coliの天然RNA又はDNAに含
まれる配列に相補的な配列（数字のみ又は数字の後にＲ
を記述することにより表す）から形成されるプローブを
提供する。
の些少の変異を有するほとんどのNeisseria gonorrhoe
ae,Neisseria meningitidis,Branhamella catarrhali
s,Haemophilus ducreyi,Haemophilus influenzae,Bor
detella pertussis,Streptococcus agalactiae,Strep
tococcus pneumoniaeもしくはCampylobacter jejuni
及びCampylobacter coliのRNA又はDNAに含まれる配列
のヌクレオチド配列からなるレプリカ（数字の数にIC又
はICRと記述することにより表す）、又はNeisseria go
norrhoeae,Neisseria meningitidis,Branhamella cat
arrhalis,Haemophilus ducreyi,Haemophilus influen
zae,Bordetella pertussis,Streptococcus agalactia
e,Streptococcus pneumoniaeもしくはCampylobacter
jejuni及びCampylobacter coliの天然RNA又はDNAに含
まれる配列に相補的な配列（数字のみ又は数字の後にＲ
を記述することにより表す）から形成されるプローブを
提供する。
より詳細には、該当DNA中の標的配列は、このような
標的に対する本発明のプローブのハイブリダイゼーショ
ン特異性に影響しないように、場合により株間に些少な
天然の変異を有するNeisseria gonorrhoeae,Neisseria
meningitidis,Branhamella catarrhalis,Haemophilu
s ducreyi,Haemophilus influenzae,Bordetella per
tussis,Streptococcus agalactiae,Streptococcus pn
eumoniae又はCampylobacter jejuni及びCampylobacter
coli株の全部ではないとしても大部分に存在する以下
の連続配列のいずれかから構成される。
標的に対する本発明のプローブのハイブリダイゼーショ
ン特異性に影響しないように、場合により株間に些少な
天然の変異を有するNeisseria gonorrhoeae,Neisseria
meningitidis,Branhamella catarrhalis,Haemophilu
s ducreyi,Haemophilus influenzae,Bordetella per
tussis,Streptococcus agalactiae,Streptococcus pn
eumoniae又はCampylobacter jejuni及びCampylobacter
coli株の全部ではないとしても大部分に存在する以下
の連続配列のいずれかから構成される。
Neisseria gonorrhoeaeの場合、 Neisseria meningitidisの場合、 Branhamella catarrhalisの場合、 Haemophilus ducreyiの場合、 Bordetella pertussisの場合、 Haemophilus influenzaeの場合、 Streptococcus pneumoniaeの場合、 Streptococcus agalactiaeの場合、 本発明のプローブは、対応するヌクレオチド配列を含
むインサートを含む組換プラスミドをクローニングし、
必要に応じて適切なヌクレアーゼを使用してクローン化
プラスミドから対応するヌクレアーゼ配列を切断し、例
えば分子量に従う分画により回収することにより形成さ
れ得る。本発明のプローブは、例えば従来のホスホ−ト
リエステル法により化学的に合成することもできる。
むインサートを含む組換プラスミドをクローニングし、
必要に応じて適切なヌクレアーゼを使用してクローン化
プラスミドから対応するヌクレアーゼ配列を切断し、例
えば分子量に従う分画により回収することにより形成さ
れ得る。本発明のプローブは、例えば従来のホスホ−ト
リエステル法により化学的に合成することもできる。
本発明は更に、生物学的サンプル中でNeisseria gon
orrhoeae,Neisseria meningitidis,Branhamella cata
rrhalis,Haemophilus ducreyi,Haemophilus influenz
ae,Bordetella pertussis,Streptococcus agalactia
e,Streptococcus pneumoniae又はCampylobacter jeju
ni及びCampylobacter coli株を検出するための方法に
も係り、該方法は、必要に応じて適切な変性条件下で核
酸（DNA又はRNA）をハイブリダイゼーションできるよう
にしておいた前記生物学的サンプルを、プローブととサ
ンプル中に存在し得る株の相補的核酸との間のハイブリ
ダイゼーションを可能にする条件下で本発明のプローブ
と接触させる段階と、ハイブリッドが形成された場合に
はこれを検出する段階とを含む。
orrhoeae,Neisseria meningitidis,Branhamella cata
rrhalis,Haemophilus ducreyi,Haemophilus influenz
ae,Bordetella pertussis,Streptococcus agalactia
e,Streptococcus pneumoniae又はCampylobacter jeju
ni及びCampylobacter coli株を検出するための方法に
も係り、該方法は、必要に応じて適切な変性条件下で核
酸（DNA又はRNA）をハイブリダイゼーションできるよう
にしておいた前記生物学的サンプルを、プローブととサ
ンプル中に存在し得る株の相補的核酸との間のハイブリ
ダイゼーションを可能にする条件下で本発明のプローブ
と接触させる段階と、ハイブリッドが形成された場合に
はこれを検出する段階とを含む。
本発明の方法は、該当生物を探査するサンプル中に存
在する可能性のある酵母、真菌、原生動物、他の細菌株
及び／又はヒト細胞から、Neisseria gonorrhoeae,Nei
sseria meningitidis,Branhamella catarrhalis,Haem
ophilus ducreyi,Haemophilus influenzae,Bordetell
a pertussis,Streptococcus agalactiae,Streptococc
us pneumoniae又はCampylobacter jejuni及びCampylo
bacter coliを、区別することができる。本発明の方法
は、Neisseria gonorrhoeae,Neisseria meningitidi
s,Branhamella catarrhalis,Haemophilus ducreyi,Ha
emophilus influenzae,Bordetella pertussis,Strept
ococcus agalactiae,Streptococcus pneumoniae又はC
ampylobacter jejuni及びCampylobacter coli株をサ
ンプル中で直接又は株を培養後に検出する方法に係る。
在する可能性のある酵母、真菌、原生動物、他の細菌株
及び／又はヒト細胞から、Neisseria gonorrhoeae,Nei
sseria meningitidis,Branhamella catarrhalis,Haem
ophilus ducreyi,Haemophilus influenzae,Bordetell
a pertussis,Streptococcus agalactiae,Streptococc
us pneumoniae又はCampylobacter jejuni及びCampylo
bacter coliを、区別することができる。本発明の方法
は、Neisseria gonorrhoeae,Neisseria meningitidi
s,Branhamella catarrhalis,Haemophilus ducreyi,Ha
emophilus influenzae,Bordetella pertussis,Strept
ococcus agalactiae,Streptococcus pneumoniae又はC
ampylobacter jejuni及びCampylobacter coli株をサ
ンプル中で直接又は株を培養後に検出する方法に係る。
ハイブリッドが検出された場合、グループNGI1,NGI2,
NMI1,NMI2,NMI3,NMI4,NMI5,NMI6,BCI1,BCI2,HDI1,HII1,
HII2,BPI1,SPI1,SPI2,SPI3,SAI1,SAI2,SAI3及びSAI4の
プローブのいずれかの使用中に夫々Neisseria gonorrh
oeae,Neisseria meningitidis,Branhamella catarrha
lis,Haemophilus ducreyi,Haemophilus influenzae,B
ordetella pertussis,Streptococcus agalactiae及び
Streptococcus pneumoniaeによる感染が生物学的サン
プル中に存在していたと判断することができる。
NMI1,NMI2,NMI3,NMI4,NMI5,NMI6,BCI1,BCI2,HDI1,HII1,
HII2,BPI1,SPI1,SPI2,SPI3,SAI1,SAI2,SAI3及びSAI4の
プローブのいずれかの使用中に夫々Neisseria gonorrh
oeae,Neisseria meningitidis,Branhamella catarrha
lis,Haemophilus ducreyi,Haemophilus influenzae,B
ordetella pertussis,Streptococcus agalactiae及び
Streptococcus pneumoniaeによる感染が生物学的サン
プル中に存在していたと判断することができる。
本発明の有利な実施態様によると、Neisseria gonor
rhoeae,Neisseria meningitidis,Branhamella catarr
halis,Haemophilus ducreyi,Haemophilus influenza
e,Bordetella pertussis,Streptococcus agalactiae,
Streptococcus pneumoniae又はCampylobacter jejuni
及びCampylobacter coli株を検出するための方法にお
いて、使用されるプローブは、生物学的サンプル中に存
在し得るNeisseria gonorrhoeae,Neisseria meningit
idis,Branhamella catarrhalis,Haemophilus ducrey
i,Haemophilus influenzae,Bordetella pertussis,St
reptococcus agalactiae,Streptococcus pneumoniae
又はCampylobacter jejuni及びCampylobacter coli株
のDNA全体及びRNAとハイブリダイズするプローブであ
る。
rhoeae,Neisseria meningitidis,Branhamella catarr
halis,Haemophilus ducreyi,Haemophilus influenza
e,Bordetella pertussis,Streptococcus agalactiae,
Streptococcus pneumoniae又はCampylobacter jejuni
及びCampylobacter coli株を検出するための方法にお
いて、使用されるプローブは、生物学的サンプル中に存
在し得るNeisseria gonorrhoeae,Neisseria meningit
idis,Branhamella catarrhalis,Haemophilus ducrey
i,Haemophilus influenzae,Bordetella pertussis,St
reptococcus agalactiae,Streptococcus pneumoniae
又はCampylobacter jejuni及びCampylobacter coli株
のDNA全体及びRNAとハイブリダイズするプローブであ
る。
ハイブリダイゼーション条件は、例えばハイブリダイ
ゼーション温度、媒体の成分の性質及び濃度、並びに形
成されるハイブリッドの洗浄温度等の数個のパラメータ
ーに依存して監視され得る。
ゼーション温度、媒体の成分の性質及び濃度、並びに形
成されるハイブリッドの洗浄温度等の数個のパラメータ
ーに依存して監視され得る。
ハイブリダイゼーション及び洗浄温度はプローブ（そ
の核酸組成、種類及び長さ）に応じて上限を制限され、
本発明のプローブの最高ハイブリダイゼーション又は洗
浄温度は約30〜58℃である。温度がこれ以上になると、
デュプレクシングはプローブと標的との間に形成される
ハイブリッドの解離（又は変性）に競合する。
の核酸組成、種類及び長さ）に応じて上限を制限され、
本発明のプローブの最高ハイブリダイゼーション又は洗
浄温度は約30〜58℃である。温度がこれ以上になると、
デュプレクシングはプローブと標的との間に形成される
ハイブリッドの解離（又は変性）に競合する。
好適ハイブリダイゼーション媒体は約３×SSC（１×S
SC＝0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.
0）、約25mMのリン酸緩衝液pH7.1、20％脱イオン化ホル
ムアミド、0.02％Ficoll、0.02％ウシ血清アルブミン、
0.02％ポリビニルピロリドン及び約0.1mg/mlの剪断変性
サケ精子DNAを含有する。
SC＝0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.
0）、約25mMのリン酸緩衝液pH7.1、20％脱イオン化ホル
ムアミド、0.02％Ficoll、0.02％ウシ血清アルブミン、
0.02％ポリビニルピロリドン及び約0.1mg/mlの剪断変性
サケ精子DNAを含有する。
好適洗浄媒体は、約３×SSC、25mMリン酸緩衝液pH7.1
及び20％脱イオンホルムアミドを含有する。他のハイブ
リダイゼーション又は洗浄媒体も使用できる。
及び20％脱イオンホルムアミドを含有する。他のハイブ
リダイゼーション又は洗浄媒体も使用できる。
しかしながら、プローブ又は媒体に変更を導入する場
合、必要な特異性を得るためにプローブを使用可能な温
度は、B.D.HAMES and S.J.HIGGINS,（eds.）,Nucleic
acid kydridization.A practical approach,IRL
Press,Oxford,U.K.,1985に記載されているような既知の
関係に応じて変更すべきである。
合、必要な特異性を得るためにプローブを使用可能な温
度は、B.D.HAMES and S.J.HIGGINS,（eds.）,Nucleic
acid kydridization.A practical approach,IRL
Press,Oxford,U.K.,1985に記載されているような既知の
関係に応じて変更すべきである。
この点では、一般にDNA:DNAハイブリッドはRNA:DNA又
はRNA:RNAハイブリッドよりも安定性が低いことにも留
意すべきである。従って、検出すべきハイブリッドの性
質に依存して、特異的検出を実施できるようにハイブリ
ダイゼーション条件を適応させるべきである。
はRNA:RNAハイブリッドよりも安定性が低いことにも留
意すべきである。従って、検出すべきハイブリッドの性
質に依存して、特異的検出を実施できるようにハイブリ
ダイゼーション条件を適応させるべきである。
本発明に従って、一般にNeisseria gonorrhoeae,Nei
sseria meningitidis,Branhamella catarrhalis,Haem
ophilus ducreyi,Haemophilus influenzae,Bordetell
a pertussis,Streptococcus agalactiae,Streptococc
us pneumoniae又はCampylobacter jejuni及びCampylo
bacter coli株を検出するための方法は、ハイブリダイ
ゼーションが特異的となるような値にハイブリダイゼー
ション温度を適宜調節することにより実施され得る。こ
のような場合、より厳密な条件で洗浄する必要はない。
sseria meningitidis,Branhamella catarrhalis,Haem
ophilus ducreyi,Haemophilus influenzae,Bordetell
a pertussis,Streptococcus agalactiae,Streptococc
us pneumoniae又はCampylobacter jejuni及びCampylo
bacter coli株を検出するための方法は、ハイブリダイ
ゼーションが特異的となるような値にハイブリダイゼー
ション温度を適宜調節することにより実施され得る。こ
のような場合、より厳密な条件で洗浄する必要はない。
本発明の別の実施態様によると、ハイブリダイゼーシ
ョン温度を必ずしもハイブリダイゼーションが特異的と
なるような値に調節する必要はなく、特に、ハイブリダ
イゼーションが特異的となるような値に対応する温度で
洗浄を実施するのであるならば、ハイブリダイゼーショ
ンが特異的となるような温度よりも低い温度でハイブリ
ダイゼーションを行ってもよい。
ョン温度を必ずしもハイブリダイゼーションが特異的と
なるような値に調節する必要はなく、特に、ハイブリダ
イゼーションが特異的となるような値に対応する温度で
洗浄を実施するのであるならば、ハイブリダイゼーショ
ンが特異的となるような温度よりも低い温度でハイブリ
ダイゼーションを行ってもよい。
グループNGI1のプローブでNeisseria gonorrhoeae株
を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法
の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／又
は洗浄温度は約50℃に調節すると適切であり、媒体は上
記に定義した類である。
を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法
の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／又
は洗浄温度は約50℃に調節すると適切であり、媒体は上
記に定義した類である。
グループNGI2のプローブでNeisseria gonorrhoeae株
を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法
の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／又
は洗浄温度は約50℃に調節すると適切であり、媒体は上
記に定義した類である。
を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法
の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／又
は洗浄温度は約50℃に調節すると適切であり、媒体は上
記に定義した類である。
グループNMI1のプローブでNeisseria meningitidis
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約45℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約45℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
グループNMI2のプローブでNeisseria meningitidis
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約45℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約45℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
グループNMI3のプローブでNeisseria meningitidis
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約40℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約40℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
グループNMI4のプローブでNeisseria meningitidis
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約48℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約48℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
グループNMI5のプローブでNeisseria meningitidis
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約58℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約58℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
グループNMI6のプローブでNeisseria meningitidis
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約50℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約50℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
グループBCI1のプローブでBranhamella catarrhalis
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約30℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約30℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
グループBCI2のプローブでBranhamella catarrhalis
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約42℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約42℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
グループBPI1のプローブでBordetella pertussis株
を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法
の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／又
は洗浄温度は約55℃に調節すると適切であり、媒体は上
記に定義した類である。
を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法
の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／又
は洗浄温度は約55℃に調節すると適切であり、媒体は上
記に定義した類である。
グループHDI1のプローブでHaemophilus ducreyi株を
検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法の
実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／又は
洗浄温度は約40℃に調節すると適切であり、媒体は上記
に定義した類である。
検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法の
実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／又は
洗浄温度は約40℃に調節すると適切であり、媒体は上記
に定義した類である。
グループHII1のプローブでHaemophilus influenzae
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約55℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約55℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
グループHII2のプローブでHaemophilus influenzae
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約35℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方
法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び／
又は洗浄温度は約35℃に調節すると適切であり、媒体は
上記に定義した類である。
グループSAI1のプローブでStreptococcus agalactia
e株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための
方法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び
／又は洗浄温度は約35℃に調節すると適切であり、媒体
は上記に定義した類である。
e株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための
方法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び
／又は洗浄温度は約35℃に調節すると適切であり、媒体
は上記に定義した類である。
グループSAI2のプローブでStreptococcus agalactia
e株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための
方法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び
／又は洗浄温度は約45℃に調節すると適切であり、媒体
は上記に定義した類である。
e株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための
方法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び
／又は洗浄温度は約45℃に調節すると適切であり、媒体
は上記に定義した類である。
グループSAI3のプローブでStreptococcus agalactia
e株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための
方法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び
／又は洗浄温度は約45℃に調節すると適切であり、媒体
は上記に定義した類である。
e株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための
方法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び
／又は洗浄温度は約45℃に調節すると適切であり、媒体
は上記に定義した類である。
グループSAI4のプローブでStreptococcus agalactia
e株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための
方法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び
／又は洗浄温度は約37℃に調節すると適切であり、媒体
は上記に定義した類である。
e株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための
方法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び
／又は洗浄温度は約37℃に調節すると適切であり、媒体
は上記に定義した類である。
グループSPI1のプローブでStreptococcus pneumonia
e株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための
方法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び
／又は洗浄温度は約45℃に調節すると適切であり、媒体
は上記に定義した類である。
e株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための
方法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び
／又は洗浄温度は約45℃に調節すると適切であり、媒体
は上記に定義した類である。
グループSPI2のプローブでStreptococcus pneumonia
e株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための
方法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び
／又は洗浄温度は約45℃に調節すると適切であり、媒体
は上記に定義した類である。
e株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための
方法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び
／又は洗浄温度は約45℃に調節すると適切であり、媒体
は上記に定義した類である。
グループSPI3のプローブでStreptococcus pneumonia
e株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための
方法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び
／又は洗浄温度は約45℃に調節すると適切であり、媒体
は上記に定義した類である。
e株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための
方法の実施態様によると、ハイブリダイゼーション及び
／又は洗浄温度は約45℃に調節すると適切であり、媒体
は上記に定義した類である。
本発明は更にNeisseria meningitidis株を特異的に
検出するためのキットに係り、該キットは、 −Neisseria meningitidisに特異的なプローブ、即ち
グループNMI1,NMI12,NMI3,NMI4,NMI5又はNMI6のプロー
ブと、 −これらのプローブとNeisseria meningitidis株のDNA
及び／又はRNAのみとの間にハイブリダイゼーション反
応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成
するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
検出するためのキットに係り、該キットは、 −Neisseria meningitidisに特異的なプローブ、即ち
グループNMI1,NMI12,NMI3,NMI4,NMI5又はNMI6のプロー
ブと、 −これらのプローブとNeisseria meningitidis株のDNA
及び／又はRNAのみとの間にハイブリダイゼーション反
応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成
するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更にNeisseria gonorrhoeae株を特異的に検
出するためのキットに係り、該キットは、 −Neisseria gonorrhoeaeに特異的なプローブ、即ちグ
ループNGI1又はNGI2のプローブと、 −これらのプローブとNeisseria gonorrhoeae株のDNA
及び／又はRNAのみとの間にハイブリダイゼーション反
応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成
するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
出するためのキットに係り、該キットは、 −Neisseria gonorrhoeaeに特異的なプローブ、即ちグ
ループNGI1又はNGI2のプローブと、 −これらのプローブとNeisseria gonorrhoeae株のDNA
及び／又はRNAのみとの間にハイブリダイゼーション反
応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成
するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更にBranhamella catarrhalis株を特異的に
検出するためのキットに係り、該キットは、 −上記Branhamella catarrhalisに特異的なプローブか
ら選択された少なくとも１種のプローブ、即ちグループ
BCI1又はBCI2のプローブと、 −これらのプローブとBranhamella catarrhalis株のDN
A及び／又はRNAのみとの間にハイブリダイゼーション反
応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成
するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
検出するためのキットに係り、該キットは、 −上記Branhamella catarrhalisに特異的なプローブか
ら選択された少なくとも１種のプローブ、即ちグループ
BCI1又はBCI2のプローブと、 −これらのプローブとBranhamella catarrhalis株のDN
A及び／又はRNAのみとの間にハイブリダイゼーション反
応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成
するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更にHaemophilus ducreyi株を特異的に検出
するためのキットに係り、該キットは、 −上記Haemophilus ducreyiに特異的なプローブから選
択された少なくとも１種のプローブ、即ちグループHDI1
のプローブと、 −これらのプローブとHaemophilus ducreyi株のDNA及
び／又はRNAのみとの間にハイブリダイゼーション反応
を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成す
るために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
するためのキットに係り、該キットは、 −上記Haemophilus ducreyiに特異的なプローブから選
択された少なくとも１種のプローブ、即ちグループHDI1
のプローブと、 −これらのプローブとHaemophilus ducreyi株のDNA及
び／又はRNAのみとの間にハイブリダイゼーション反応
を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成す
るために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更にBordetella pertussis株を特異的に検
出するためのキットに係り、該キットは、 −上記Bordetella pertussisに特異的なプローブから
選択された少なくとも１種のプローブ、即ちグループBP
I1のプローブと、 −これらのプローブとBordetella pertussis株のDNA及
び／又はRNAのみとの間にハイブリダイベーション反応
を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成す
るために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
出するためのキットに係り、該キットは、 −上記Bordetella pertussisに特異的なプローブから
選択された少なくとも１種のプローブ、即ちグループBP
I1のプローブと、 −これらのプローブとBordetella pertussis株のDNA及
び／又はRNAのみとの間にハイブリダイベーション反応
を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成す
るために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更にHaemophilus influenzae株を特異的に
検出するためのキットに係り、該キットは、 −上記Haemophilus influenzaeに特異的なプローブか
ら選択された少なくとも１種のプローブ、即ちグループ
HII1又はHII2のプローブと、 −これらのプローブとHaemophilus influenzae株のDNA
及び／又はRNAのみとの間にハイブリダイゼーション反
応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成
するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
検出するためのキットに係り、該キットは、 −上記Haemophilus influenzaeに特異的なプローブか
ら選択された少なくとも１種のプローブ、即ちグループ
HII1又はHII2のプローブと、 −これらのプローブとHaemophilus influenzae株のDNA
及び／又はRNAのみとの間にハイブリダイゼーション反
応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成
するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更にStreptococcus agalactiae株を特異的
に検出するためのキットに係り、該キットは、 −上記Streptococcus agalactiaeに特異的なプローブ
から選択された少なくとも１種のプローブ、即ちグルー
プSAI1,SAI2,SAI3又はSAI4のプローブと、 −これらのプローブとStreptococcus agalactiae株のD
NA及び／又はRNAのみとの間にハイブリダイゼーション
反応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生
成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
に検出するためのキットに係り、該キットは、 −上記Streptococcus agalactiaeに特異的なプローブ
から選択された少なくとも１種のプローブ、即ちグルー
プSAI1,SAI2,SAI3又はSAI4のプローブと、 −これらのプローブとStreptococcus agalactiae株のD
NA及び／又はRNAのみとの間にハイブリダイゼーション
反応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生
成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更にStreptococcus pneumoniae株を特異的
に検出するためのキットに係り、該キットは、 −上記Streptococcus pneumoniaeに特異的なプローブ
から選択された少なくとも１種のプローブ、即ちグルー
プSPI1,SPI2又はSPI3のプローブと、 −これらのプローブとStreptococcus pneumoniae株のD
NA及び／又はRNAのみとの間にハイブリダイゼーション
反応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生
成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
に検出するためのキットに係り、該キットは、 −上記Streptococcus pneumoniaeに特異的なプローブ
から選択された少なくとも１種のプローブ、即ちグルー
プSPI1,SPI2又はSPI3のプローブと、 −これらのプローブとStreptococcus pneumoniae株のD
NA及び／又はRNAのみとの間にハイブリダイゼーション
反応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生
成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更にCampylobacter jejuni及びCampylobact
er coli株を特異的に検出するためのキットに係り、該
キットは、 −上記Campylobacter jejuni及びCampylobacter coli
に特異的なプローブから選択された少なくとも１種のプ
ローブと、 −これらのプローブとCampylobacter jejuni及びCampy
lobacter coli株のDNA及び／又はRNAのみとの間にハイ
ブリダイゼーション反応を応じさせることが可能な緩衝
液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
er coli株を特異的に検出するためのキットに係り、該
キットは、 −上記Campylobacter jejuni及びCampylobacter coli
に特異的なプローブから選択された少なくとも１種のプ
ローブと、 −これらのプローブとCampylobacter jejuni及びCampy
lobacter coli株のDNA及び／又はRNAのみとの間にハイ
ブリダイゼーション反応を応じさせることが可能な緩衝
液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明のプローブは、核酸プローブを利用するアッセ
イの特異性を増加するサンドイッチハイブリダイゼーシ
ョンシステムで使用することができる。核酸プローブに
基づくアッセイにおけるサンドイッチハイブリダイゼー
ションの原理及び使用は更に記載されている（例えばDU
NN and HASSEL,Cell,12:23−36;1977;RANKI et a
l.,Gene,21:77−85;1983）。直接ハイブリダイゼーショ
ンアッセイは好ましい速度を有するが、サンドイッチハ
イブリダイゼーションは信号対雑音比が高いという点で
有利である。更に、サンドイッチハイブリダイゼーショ
ンは核酸プローブに基づくアッセイの特異性を増加する
ことができる。
イの特異性を増加するサンドイッチハイブリダイゼーシ
ョンシステムで使用することができる。核酸プローブに
基づくアッセイにおけるサンドイッチハイブリダイゼー
ションの原理及び使用は更に記載されている（例えばDU
NN and HASSEL,Cell,12:23−36;1977;RANKI et a
l.,Gene,21:77−85;1983）。直接ハイブリダイゼーショ
ンアッセイは好ましい速度を有するが、サンドイッチハ
イブリダイゼーションは信号対雑音比が高いという点で
有利である。更に、サンドイッチハイブリダイゼーショ
ンは核酸プローブに基づくアッセイの特異性を増加する
ことができる。
適正に設計するならば、サンドイッチハイブリダイゼ
ーションアッセイは実際に、同一生物の２種の異なる核
酸部分を認識する２種のプローブを使用する場合、核酸
プローブに基づく試験の特異性を最大にすることができ
る。満足しなければならない唯一の要件は、２種のプロ
ーブの両方が（ｉ）標的生物の同一核酸分子にハイブリ
ダイズし、且つ（ii）同一の非標的生物にハイブリダイ
ズしないことである。
ーションアッセイは実際に、同一生物の２種の異なる核
酸部分を認識する２種のプローブを使用する場合、核酸
プローブに基づく試験の特異性を最大にすることができ
る。満足しなければならない唯一の要件は、２種のプロ
ーブの両方が（ｉ）標的生物の同一核酸分子にハイブリ
ダイズし、且つ（ii）同一の非標的生物にハイブリダイ
ズしないことである。
２種の所与のプローブＩ及びIIを使用する場合、サン
ドイッチハイブリダイゼーションシステムは次のように
説明することができる。
ドイッチハイブリダイゼーションシステムは次のように
説明することができる。
プローブＩは生物（Ｃでなく）Ａ及びＢ由来の核酸と
ハイブリダイズする。
ハイブリダイズする。
プローブIIは生物（Ｂでなく）Ａ及びＣ由来の核酸と
ハイブリダイズする。
ハイブリダイズする。
両方のプローブが標的核酸にハイブリダイズすること
が絶対的に必要であるので、生物Ａ由来の核酸がサンプ
ル中に存在する場合のみに検出可能なシグナルが発生さ
れる。プローブの一方が検出すべき生物に特異的である
場合には、他方のプローブは第１のプローブよりも同一
標的分子にハイブリダイズするのであれば、特異的配列
から構成しても非特異的配列から構成してもよい。
が絶対的に必要であるので、生物Ａ由来の核酸がサンプ
ル中に存在する場合のみに検出可能なシグナルが発生さ
れる。プローブの一方が検出すべき生物に特異的である
場合には、他方のプローブは第１のプローブよりも同一
標的分子にハイブリダイズするのであれば、特異的配列
から構成しても非特異的配列から構成してもよい。
本発明のプローブは、同一標的分子にハイブリダイズ
する別の非特異的又は特異的プローブと夫々組み合わせ
てNeisseria gonorrhoeae,Neisseria meningitidis,B
ranhamella catarrhalis,Haemophilus ducreyi,Haemo
philus influenzae,Bordetella pertussis,Streptoco
ccus agalactiae,Streptococcus pneumoniae又はCamp
ylobacter jejuni及びCampylobacter coliに特異的な
サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイで使用す
ることができる。サンドイッチハイブリダイゼーション
プロセスでは、標的DNA及はRNAを探査する生物学的サン
プルにプローブを同時に加えてもよいし、別々に加えて
もよい。
する別の非特異的又は特異的プローブと夫々組み合わせ
てNeisseria gonorrhoeae,Neisseria meningitidis,B
ranhamella catarrhalis,Haemophilus ducreyi,Haemo
philus influenzae,Bordetella pertussis,Streptoco
ccus agalactiae,Streptococcus pneumoniae又はCamp
ylobacter jejuni及びCampylobacter coliに特異的な
サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイで使用す
ることができる。サンドイッチハイブリダイゼーション
プロセスでは、標的DNA及はRNAを探査する生物学的サン
プルにプローブを同時に加えてもよいし、別々に加えて
もよい。
本発明は更に生物学的サンプル中でNeisseria gonor
rhoeae株をin vitro検出するためのサンドイッチハイ
ブリダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キット
は、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がNeisse
ria gonorrhoeaeに対して特異的である少なくとも２種
のプローブと、 −これらのプローブとNeisseria gonorrhoeae株のDNA
及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を
生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成する
ために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
rhoeae株をin vitro検出するためのサンドイッチハイ
ブリダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キット
は、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がNeisse
ria gonorrhoeaeに対して特異的である少なくとも２種
のプローブと、 −これらのプローブとNeisseria gonorrhoeae株のDNA
及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を
生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成する
ために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更に生物学的サンプル中でNeisseria menin
gitidis株をin vitro検出するためのサンドイッチハイ
ブリダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キット
は、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がNeisse
ria meningitidisに対して特異的である少なくとも２
種のプローブと、 −これらのプローブとNeisseria meningitidis株のDNA
及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を
生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成する
ために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
gitidis株をin vitro検出するためのサンドイッチハイ
ブリダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キット
は、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がNeisse
ria meningitidisに対して特異的である少なくとも２
種のプローブと、 −これらのプローブとNeisseria meningitidis株のDNA
及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を
生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成する
ために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更に生物学的サンプル中でBranhamella cat
arrhalis株をin vitro検出するためのサンドイッチハ
イブリダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キッ
トは、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がBran
hamella catarrhalisに対して特異的である少なくとも
２種のプローブと、 −これらのプローブとBranhamella catarrhalis株のDN
A及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を
生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成する
ために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
arrhalis株をin vitro検出するためのサンドイッチハ
イブリダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キッ
トは、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がBran
hamella catarrhalisに対して特異的である少なくとも
２種のプローブと、 −これらのプローブとBranhamella catarrhalis株のDN
A及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を
生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成する
ために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更に生物学的サンプル中でHaemophilus duc
reyi株をin vitro検出するためのサンドイッチハイブ
リダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キット
は、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がHaemop
hilus ducreyiに対して特異的である少なくとも２種の
プローブと、 −これらのプローブとHaemophilus ducreyi株のDNA及
び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を生
じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するた
めに必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
reyi株をin vitro検出するためのサンドイッチハイブ
リダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キット
は、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がHaemop
hilus ducreyiに対して特異的である少なくとも２種の
プローブと、 −これらのプローブとHaemophilus ducreyi株のDNA及
び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を生
じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するた
めに必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更に生物学的サンプル中でHaemophilus inf
luenzae株をin vitoro検出するためのサンドイッチハ
イブリダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キッ
トは、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がHaemop
hilus influenzaeに対して特異的である少なくとも２
種のプローブと、 −これらのプローブとHaemophilus influenzae株のDNA
及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を
生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成する
ために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
luenzae株をin vitoro検出するためのサンドイッチハ
イブリダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キッ
トは、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がHaemop
hilus influenzaeに対して特異的である少なくとも２
種のプローブと、 −これらのプローブとHaemophilus influenzae株のDNA
及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を
生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成する
ために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更に生物学的サンプル中でBordetella pert
ussis株をin vitro検出するためのサンドイッチハイブ
リダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キット
は、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がBordet
ella pertussisに対して特異的である少なくとも２種
のプローブと、 −これらのプローブとBordetella pertussis株のDNA及
び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を生
じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するた
めに必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
ussis株をin vitro検出するためのサンドイッチハイブ
リダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キット
は、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がBordet
ella pertussisに対して特異的である少なくとも２種
のプローブと、 −これらのプローブとBordetella pertussis株のDNA及
び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を生
じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するた
めに必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更に生物学的サンプル中でStreptococcus a
galactiae株をin vitro検出するためのサンドイッチハ
イブリダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キッ
トは、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がStrept
ococcus agalactiaeに対して特異的である少なくとも
２種のプローブと、 −これらのプローブとStreptococcus agalactiae株のD
NA及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応
を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成す
るために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
galactiae株をin vitro検出するためのサンドイッチハ
イブリダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キッ
トは、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がStrept
ococcus agalactiaeに対して特異的である少なくとも
２種のプローブと、 −これらのプローブとStreptococcus agalactiae株のD
NA及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応
を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成す
るために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更に生物学的サンプル中でStreptococcus p
neumoniae株をin vitro検出するためのサンドイッチハ
イブリダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キッ
トは、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がStrept
ococcus pneumoniaeに対して特異的である少なくとも
２種のプローブと、 −これらのプローブとStreptococcus pneumoniae株のD
NA及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応
を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成す
るために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
neumoniae株をin vitro検出するためのサンドイッチハ
イブリダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キッ
トは、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がStrept
ococcus pneumoniaeに対して特異的である少なくとも
２種のプローブと、 −これらのプローブとStreptococcus pneumoniae株のD
NA及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応
を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成す
るために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更に生物学的サンプル中でCampylobacter j
ejuni株をin vitro検出するためのサンドイッチハイブ
リダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キット
は、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がCampyl
obacter jejuniに対して特異的である少なくとも２種
のプローブと、 −これらのプローブとCampylobacter jejuni株のDNA及
び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を生
じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するた
めに必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
ejuni株をin vitro検出するためのサンドイッチハイブ
リダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キット
は、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がCampyl
obacter jejuniに対して特異的である少なくとも２種
のプローブと、 −これらのプローブとCampylobacter jejuni株のDNA及
び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を生
じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するた
めに必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更に生物学的サンプル中でCampylobacter c
oli株をin vitro検出するためのサンドイッチハイブリ
ダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キットは、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がCampyl
obacter coliに対して特異的である少なくとも２種の
プローブと、 −これらのプローブとCampylobacter coli株のDNA及び
／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を生じ
させることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するため
に必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
oli株をin vitro検出するためのサンドイッチハイブリ
ダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キットは、 −同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がCampyl
obacter coliに対して特異的である少なくとも２種の
プローブと、 −これらのプローブとCampylobacter coli株のDNA及び
／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を生じ
させることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するため
に必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明のプローブは、コンペティションハイブリダイ
ゼーションプロトコルでも使用することができる。
ゼーションプロトコルでも使用することができる。
コンペティションハイブリダイゼーションでは、標的
分子は特異的プローブとその補体との間に形成されるハ
イブリッドに競合する。標的数が多ければ多いほどプロ
ーブとその補体との間に形成されるハイブリッドの量は
少なくなる。特異的標的が存在していたことを示す陽性
シクナルは、標的を加えなかったシステムに比較してハ
イブリダイゼーション反応が低いことにより確認され
る。特定の実施態様によると、適切に標識した特異的オ
リゴヌクレオチドプローブを標的分子とハイブリダイズ
させる。次に、混合物を受容器（例えばマイクロタイタ
ー皿のウェル）に移し、特異的プローブに相補的なオリ
ゴヌクレオチドを固定し、ハイブリダイゼーションを続
ける。洗浄後、相補的オリゴヌクレオチドとプローブと
の間に形成されたハイブリッドを、使用したラベルに応
じて好ましくは定量的に測定する。
分子は特異的プローブとその補体との間に形成されるハ
イブリッドに競合する。標的数が多ければ多いほどプロ
ーブとその補体との間に形成されるハイブリッドの量は
少なくなる。特異的標的が存在していたことを示す陽性
シクナルは、標的を加えなかったシステムに比較してハ
イブリダイゼーション反応が低いことにより確認され
る。特定の実施態様によると、適切に標識した特異的オ
リゴヌクレオチドプローブを標的分子とハイブリダイズ
させる。次に、混合物を受容器（例えばマイクロタイタ
ー皿のウェル）に移し、特異的プローブに相補的なオリ
ゴヌクレオチドを固定し、ハイブリダイゼーションを続
ける。洗浄後、相補的オリゴヌクレオチドとプローブと
の間に形成されたハイブリッドを、使用したラベルに応
じて好ましくは定量的に測定する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、酵素的に増幅した特
異的フラグメントを生成するためにポリメラーゼ鎖反応
技術（PCR;Mullis and Faloona,Methods in Enzymo
logy 155:335−350,1987）で増幅プライマーとして及
び／又は夾叉オリゴヌクレオチドプライマー間で増幅さ
れたフラグメントを検出するためのプローブとして使用
することができる。
異的フラグメントを生成するためにポリメラーゼ鎖反応
技術（PCR;Mullis and Faloona,Methods in Enzymo
logy 155:335−350,1987）で増幅プライマーとして及
び／又は夾叉オリゴヌクレオチドプライマー間で増幅さ
れたフラグメントを検出するためのプローブとして使用
することができる。
PCRによるハイブリダイゼーションアッセイの特異性
は種々のレベルに調節することができる。
は種々のレベルに調節することができる。
増幅法又は検出法又はその両方は特異的であり得る。
両方が特異的な場合は特異性が最大になるので好適であ
る。このようなPCRを利用する高特異性試験は本発明の
プローブを使用して実施され得る。
両方が特異的な場合は特異性が最大になるので好適であ
る。このようなPCRを利用する高特異性試験は本発明の
プローブを使用して実施され得る。
しかしながら、場合によっては、多様な生物に使用で
きるように増幅法を標準化するために、特異的検出に結
び付けられた本発明の検出プローブを夾叉する保存性プ
ライマーを使用する非特異的増幅法が有利である。
きるように増幅法を標準化するために、特異的検出に結
び付けられた本発明の検出プローブを夾叉する保存性プ
ライマーを使用する非特異的増幅法が有利である。
標準化増幅法で使用される増幅プライマーは、スペー
サー領域の両側の16S及び23SrRNA遺伝子の保存領域に見
いだされる（実施例１参照）。
サー領域の両側の16S及び23SrRNA遺伝子の保存領域に見
いだされる（実施例１参照）。
本発明は更に、検出すべき微生物に特異的な本発明の
プローブのいずれかを使用して生物学的サンプルに含ま
れる１種の微生物又は数種の微生物を同時にin vitro
検出するための方法にも係り、該方法によると、好まし
くはプローブ領域を夾叉する少なくとも１組のプライマ
ーによる酵素的増幅を使用して、生物学的サンプル中に
存在する（標的配列を含む）DNA及び／又はRNAを標識
し、増幅した標的配列と膜上のプローブとの特異的ハイ
ブリダイゼーションを可能にする媒体中で、１種以上の
オリゴヌクレオチドプローブを既知の位置にドットスポ
ットした膜に前記生成物学的サンプルを接触させ、ハイ
ブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適
切な手段により検出する。
プローブのいずれかを使用して生物学的サンプルに含ま
れる１種の微生物又は数種の微生物を同時にin vitro
検出するための方法にも係り、該方法によると、好まし
くはプローブ領域を夾叉する少なくとも１組のプライマ
ーによる酵素的増幅を使用して、生物学的サンプル中に
存在する（標的配列を含む）DNA及び／又はRNAを標識
し、増幅した標的配列と膜上のプローブとの特異的ハイ
ブリダイゼーションを可能にする媒体中で、１種以上の
オリゴヌクレオチドプローブを既知の位置にドットスポ
ットした膜に前記生成物学的サンプルを接触させ、ハイ
ブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適
切な手段により検出する。
増幅が必要な場合、その目的は標的配列を増幅し（そ
れによって標的配列の夾叉領域も増幅させ）、増幅領域
のみを標識することである。
れによって標的配列の夾叉領域も増幅させ）、増幅領域
のみを標識することである。
生物学的サンプル中に十分な標的配列が存在する場
合、増幅は不要である。
合、増幅は不要である。
このような場合、ハイブリダイゼーション前に例えば
化学的手段により又は特異的染料の添加により標識を実
施するべきであり、生物学的サンプル中に存在するDNA
及び／又はRNA全体を標識することに留意すべきであ
る。
化学的手段により又は特異的染料の添加により標識を実
施するべきであり、生物学的サンプル中に存在するDNA
及び／又はRNA全体を標識することに留意すべきであ
る。
本発明は更に、生物学的サンプル中に含まれる１種の
微生物又は数種の微生物を同時にin vitro検出するた
めのキットに係り、該キットは、 −検出すべき微生物に特異的であり、膜にドットスポッ
トした本発明のプローブの少なくとも１種と、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又はこれらのプローブ
と検出すべき微生物のDNA及び／又はRNAとの間にハイブ
リダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝液
又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
微生物又は数種の微生物を同時にin vitro検出するた
めのキットに係り、該キットは、 −検出すべき微生物に特異的であり、膜にドットスポッ
トした本発明のプローブの少なくとも１種と、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又はこれらのプローブ
と検出すべき微生物のDNA及び／又はRNAとの間にハイブ
リダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝液
又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
上記方法及びキットは、Saiki et al.（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,86:6230−6234,1989）により記載されて
いる逆ドットブロットアッセイのような逆ハイブリダイ
ゼーションドットブロットアッセイを含む。
Acad.Sci.USA,86:6230−6234,1989）により記載されて
いる逆ドットブロットアッセイのような逆ハイブリダイ
ゼーションドットブロットアッセイを含む。
この場合、５′ビオチニル化プライマーを用いるPCR
を使用して標的配列をまず酵素的に増幅する。第２段階
では、固体支持体に固定した特異的オリゴヌクレオチド
とのハイブリダイゼーション後、増幅産物を検出する。
この方法は実施例２に記載する変形方法のような数種の
変形が考えられる。例えば、この方法はスペーサー領域
を夾叉する普遍的プライマーを用いるPCR、及び該当生
物の種々の特異的オリゴヌクレオチドプライマーをドッ
トスポットした膜とのハイブリダイゼーション後に特定
の臨床サンプル中に存在し得る種々の微生物の同時且つ
特異的検出に特に有利であり得る。上記のような逆ハイ
ブリダイゼーションアッセイで使用可能な特異的オリゴ
ヌクレオチドプライマーの有利なパネルの例を以下に挙
げる。
を使用して標的配列をまず酵素的に増幅する。第２段階
では、固体支持体に固定した特異的オリゴヌクレオチド
とのハイブリダイゼーション後、増幅産物を検出する。
この方法は実施例２に記載する変形方法のような数種の
変形が考えられる。例えば、この方法はスペーサー領域
を夾叉する普遍的プライマーを用いるPCR、及び該当生
物の種々の特異的オリゴヌクレオチドプライマーをドッ
トスポットした膜とのハイブリダイゼーション後に特定
の臨床サンプル中に存在し得る種々の微生物の同時且つ
特異的検出に特に有利であり得る。上記のような逆ハイ
ブリダイゼーションアッセイで使用可能な特異的オリゴ
ヌクレオチドプライマーの有利なパネルの例を以下に挙
げる。
（ｉ）痰パネル:Moraxella（Branhamella）catarrhalis Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzea （ii）CSF−パネル:Neisseria meningitidis Haemophilus influenzae Streptococcus pneumonoiae （iii）尿生殖−パネル:Neisseria gonorrhoese Haemophilus ducreyi Chelmydia trachomatis Treponema pallidum 当然のことながら、これらのパネルは他の臨床的に関
連する微生物のプローブを加えることにより拡張するこ
とができる。歯周ポケットからのサンプル又は血液サン
プルのような他の臨床サンプルのパネルも利用できる。
連する微生物のプローブを加えることにより拡張するこ
とができる。歯周ポケットからのサンプル又は血液サン
プルのような他の臨床サンプルのパネルも利用できる。
PCRには、非普遍的に保存されたプライマー、例えば
スペーサー領域自体に配置されたプライマーも使用する
ことができ、PCRは１組のプライマー用いて又は同一反
応容器で種々の組のプライマーを用いて実施することが
できる。
スペーサー領域自体に配置されたプライマーも使用する
ことができ、PCRは１組のプライマー用いて又は同一反
応容器で種々の組のプライマーを用いて実施することが
できる。
増幅段階なしに逆ハイルイダイゼーションを実施する
こともできる。この場合、サンプル中に存在する核酸を
ハイブリダイゼーション前に例えば化学的手段又は特異
的染料の添加により特異的又は非特異的に標識又は修飾
すべきである。
こともできる。この場合、サンプル中に存在する核酸を
ハイブリダイゼーション前に例えば化学的手段又は特異
的染料の添加により特異的又は非特異的に標識又は修飾
すべきである。
ほとんどの場合、スペーサー領域から誘導され得る該
当生物の特異的プローブの数は、本明細書に記載するプ
ローブに制限されない。
当生物の特異的プローブの数は、本明細書に記載するプ
ローブに制限されない。
生物によっては、種々の細菌の高特異性且つ高感度の
プローブの開発のためにスペーサー領域を利用できるこ
とが立証されているプローブは１又は２種しか記載され
ていない。Bordetella pertussisのみが例外であり、
スペーサー領域の唯一の特定領域（Bordetella pertus
sis配列中のヌクレオチド271〜299、図２の上段）が特
異的配列を有する。しかしながら、Bordetella pertus
sisのスペーサー領域配列から、高度に関連するBordete
lla種の同時検出に有用であり得るプレーブを設計する
ことができる。Bordetella pertussis以外のBordetell
a種を検出するプレーブも図２の配列から推定すること
ができる。同様に、Moraxella nonliquefaciens及びHa
emophilus influenzaeバイオグループaegyptiusの潜在
的に特異的なプローブも夫々図７及び８に示すスペーサ
ー配列から推定することができる。
プローブの開発のためにスペーサー領域を利用できるこ
とが立証されているプローブは１又は２種しか記載され
ていない。Bordetella pertussisのみが例外であり、
スペーサー領域の唯一の特定領域（Bordetella pertus
sis配列中のヌクレオチド271〜299、図２の上段）が特
異的配列を有する。しかしながら、Bordetella pertus
sisのスペーサー領域配列から、高度に関連するBordete
lla種の同時検出に有用であり得るプレーブを設計する
ことができる。Bordetella pertussis以外のBordetell
a種を検出するプレーブも図２の配列から推定すること
ができる。同様に、Moraxella nonliquefaciens及びHa
emophilus influenzaeバイオグループaegyptiusの潜在
的に特異的なプローブも夫々図７及び８に示すスペーサ
ー配列から推定することができる。
本発明は更に、生物学的サンプル中で１種以上のNeis
seria gonorrhoese株をin vitro検出するためのキッ
トに係り、該キットは、 −固体支持体に固定されたNeisseria gonorrhoeaeに特
異的な本発明のプローブのいずれかから選択された少な
くとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとNe
isseria gonorrhoeae株のDNA及び／又はRNAとの間にハ
イブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩
衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
seria gonorrhoese株をin vitro検出するためのキッ
トに係り、該キットは、 −固体支持体に固定されたNeisseria gonorrhoeaeに特
異的な本発明のプローブのいずれかから選択された少な
くとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとNe
isseria gonorrhoeae株のDNA及び／又はRNAとの間にハ
イブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩
衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更に、生物学的サンプル中で１種以上のNeis
seria meningitidis株をin vitro検出するためのキッ
トの係り、該キットは、 −固体支持体に固定されたNeisseria meningitidisに
特異的な本発明のプローブのいずれかから選択された少
なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとNe
isseria meningitidis株のDNA及び／又はRNAとの間に
ハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な
緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
seria meningitidis株をin vitro検出するためのキッ
トの係り、該キットは、 −固体支持体に固定されたNeisseria meningitidisに
特異的な本発明のプローブのいずれかから選択された少
なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとNe
isseria meningitidis株のDNA及び／又はRNAとの間に
ハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な
緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更に、生物学的サンプル中で１種以上のHaem
ophilus ducreyi株をin vitro検出するためのキット
の係り、該キットは、 −固体支持体に固体されたHaemophilus ducreyiに特異
的な本発明のプローブのいずれかから選択された少なく
とも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとHa
emophilus ducreyi株のDNA及び／又はRNAとの間にハイ
ブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝
液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
ophilus ducreyi株をin vitro検出するためのキット
の係り、該キットは、 −固体支持体に固体されたHaemophilus ducreyiに特異
的な本発明のプローブのいずれかから選択された少なく
とも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとHa
emophilus ducreyi株のDNA及び／又はRNAとの間にハイ
ブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝
液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更に、生物学的サンプル中で１種以上のBran
hamella catarrhalis株をin vitro検出するためのキ
ットに係り、該キットは、 −固体支持体に固定されたBranhamella catarrhalisに
特異的な本発明のプローブのいずれかから選択された少
なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとBr
anhamella catarrhalis株のDNA及び／又はRNAとの間に
ハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な
緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
hamella catarrhalis株をin vitro検出するためのキ
ットに係り、該キットは、 −固体支持体に固定されたBranhamella catarrhalisに
特異的な本発明のプローブのいずれかから選択された少
なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとBr
anhamella catarrhalis株のDNA及び／又はRNAとの間に
ハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な
緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更に、生物学的サンプル中で１種以上のBord
etella pertussis株をin vitro検出するためのキット
に係り、該キットは、 −固体支持体に固定されたBordetella pertussisに特
異的な本発明のプローブのいずれかから選択された少な
くとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとBo
rdetella pertussis株のDNA及び／又はRNAとの間にハ
イブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩
衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
etella pertussis株をin vitro検出するためのキット
に係り、該キットは、 −固体支持体に固定されたBordetella pertussisに特
異的な本発明のプローブのいずれかから選択された少な
くとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとBo
rdetella pertussis株のDNA及び／又はRNAとの間にハ
イブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩
衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更に、生物学的サンプル中で１種以上のHaem
ophilus influenzae株をin vitro検出するためのキッ
トに係り、該キットは、 −固体支持体に固定されたHaemophilus influenzaeに
特異的な本発明のプローブのいずれかから選択された少
なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとHa
emophilus influenzae株のDNA及び／又はRNAとの間に
ハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な
緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
ophilus influenzae株をin vitro検出するためのキッ
トに係り、該キットは、 −固体支持体に固定されたHaemophilus influenzaeに
特異的な本発明のプローブのいずれかから選択された少
なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとHa
emophilus influenzae株のDNA及び／又はRNAとの間に
ハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な
緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更に、生物学的サンプル中で１種以上のStre
ptococcus pneumoniae株をin vitro検出するためのキ
ットに係り、該キットは、 −固体支持体に固定されたStreptococcus pneumoniae
に特異的な本発明のプローブのいずれかから選択された
少なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとSt
reptococcus pneumoniae株のDNA及び／又はRNAとの間
にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能
な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
ptococcus pneumoniae株をin vitro検出するためのキ
ットに係り、該キットは、 −固体支持体に固定されたStreptococcus pneumoniae
に特異的な本発明のプローブのいずれかから選択された
少なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとSt
reptococcus pneumoniae株のDNA及び／又はRNAとの間
にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能
な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更に、生物学的サンプル中で１種以上のStre
ptococcus agalactiae株をin vitro検出するためのキ
ットに係り、該キットは、 −固体支持体に固定されたStreptococcus agalactiae
に特異的な本発明のプローブのいずれかから選択された
少なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとSt
reptococcus agalactiae株のDNA及び／又はRNAとの間
にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能
な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
ptococcus agalactiae株をin vitro検出するためのキ
ットに係り、該キットは、 −固体支持体に固定されたStreptococcus agalactiae
に特異的な本発明のプローブのいずれかから選択された
少なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとSt
reptococcus agalactiae株のDNA及び／又はRNAとの間
にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能
な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
本発明は更に、生物学的サンプル中で１種以上のCamp
ylobacter jejuni及びCampylobacter coli株をin vi
tro検出するためのキットに係り、該キットは、 −固体支持体に固定されたCampylobacter jejuniに特
異的な本発明のプローブのいずれかから選択された少な
くとも１種のプローブと及びCampylobacter coliに特
異的な本発明のプローブのいずれかから選択された少な
くとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとCa
mpylobacter jejuni及びCampylobacter coli株のDNA
及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を
生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成する
ために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
ylobacter jejuni及びCampylobacter coli株をin vi
tro検出するためのキットに係り、該キットは、 −固体支持体に固定されたCampylobacter jejuniに特
異的な本発明のプローブのいずれかから選択された少な
くとも１種のプローブと及びCampylobacter coliに特
異的な本発明のプローブのいずれかから選択された少な
くとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとCa
mpylobacter jejuni及びCampylobacter coli株のDNA
及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を
生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成する
ために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含む。
プローブの使用条件 本発明のプローブは標識すると有利である。任意の従
来のラベルを使用することができる。プローブは、
32P、35S、125I、3H及び14Cのような放射性トレーサー
により標識され得る。
来のラベルを使用することができる。プローブは、
32P、35S、125I、3H及び14Cのような放射性トレーサー
により標識され得る。
放射性標識は、（標識すべき末端に応じて）放射性標
識ヌクレオチド、（ホスファターゼによる脱リン酸化を
伴うか又は伴わない）ポリヌクレオチドキナーゼ、末端
転移酵素又はリガーゼを使用することにより、３′又は
５′位の末端標識のような任意の従来方法に従って実施
され得る。本発明のプローブの１種は、数種の放射性ヌ
クレオチド又は数種の放射性及び非放射性ヌクレオチド
から構成される鎖の合成用マトリックスであり得る。
識ヌクレオチド、（ホスファターゼによる脱リン酸化を
伴うか又は伴わない）ポリヌクレオチドキナーゼ、末端
転移酵素又はリガーゼを使用することにより、３′又は
５′位の末端標識のような任意の従来方法に従って実施
され得る。本発明のプローブの１種は、数種の放射性ヌ
クレオチド又は数種の放射性及び非放射性ヌクレオチド
から構成される鎖の合成用マトリックスであり得る。
本発明のプローブは、１又は数種の放射性ヌクレオチ
ドを使用する化学的合成により製造することもできる。
別の放射性標識方法は本発明のプローブの化学的ヨウ素
化であり、プローブに数個の125I原子を結合させる。
ドを使用する化学的合成により製造することもできる。
別の放射性標識方法は本発明のプローブの化学的ヨウ素
化であり、プローブに数個の125I原子を結合させる。
本発明のプローブの１種が非放射性RNA又はDNAとのハ
イブリダイゼーションに使用するように放射性標識され
る場合、ハイブリダイゼーションの検出方法は、使用さ
れる放射性トレーサーに依存する。一般に、放射性トレ
ーサーにより発生される電離性放射線を検出することが
可能なオートラジオグラフィー、液体シンチレーショ
ン、γ計数又は他の任意の従来方法を使用することがで
きる。
イブリダイゼーションに使用するように放射性標識され
る場合、ハイブリダイゼーションの検出方法は、使用さ
れる放射性トレーサーに依存する。一般に、放射性トレ
ーサーにより発生される電離性放射線を検出することが
可能なオートラジオグラフィー、液体シンチレーショ
ン、γ計数又は他の任意の従来方法を使用することがで
きる。
免疫特性（例えば抗原又はハプテン）、ある種の試薬
に対する特異的親和性（例えばリガンド）、検出可能な
酵素反応を提供する特性（例えば酵素、補酵素、酵素基
質又は酵素反応に関与する基質）、又は物理的特性（例
えば任意の波長の光の蛍光、発光又は吸収）を有する残
基に本発明のプローブを組み合わせることにより非放射
性標識を使用することもできる。プローブと標的とによ
り形成されるハイブリッドを特異的に検出する抗体も使
用できる。
に対する特異的親和性（例えばリガンド）、検出可能な
酵素反応を提供する特性（例えば酵素、補酵素、酵素基
質又は酵素反応に関与する基質）、又は物理的特性（例
えば任意の波長の光の蛍光、発光又は吸収）を有する残
基に本発明のプローブを組み合わせることにより非放射
性標識を使用することもできる。プローブと標的とによ
り形成されるハイブリッドを特異的に検出する抗体も使
用できる。
本発明のプローブを化学的に合成する場合には非放射
性ラベルを使用することができ、アデノシン、グアノシ
ン、シチジン、チミジン及びウラシル残基は、プローブ
又はプローブと相補的DNAもしくはRNAフラグメントとの
間に形成されたハイブリッドを検出することが可能な他
の化学的残基に結合し得る。
性ラベルを使用することができ、アデノシン、グアノシ
ン、シチジン、チミジン及びウラシル残基は、プローブ
又はプローブと相補的DNAもしくはRNAフラグメントとの
間に形成されたハイブリッドを検出することが可能な他
の化学的残基に結合し得る。
一方、１種以上のヌクレオチドを他の化学的残基に結
合することにより修飾した場合、プローブのヌクレオチ
ド配列は本発明のプローブの１種のヌクレオチド配列と
同一である。
合することにより修飾した場合、プローブのヌクレオチ
ド配列は本発明のプローブの１種のヌクレオチド配列と
同一である。
本発明は更に、上記のように標識され且つ検出可能な
本発明のプローブを使用してハイブリダイゼーションに
よりRNA及び／又はDNAを検出するための方法にも係る。
この点では、従来のハイブリダイゼーション方法を使用
することができる。
本発明のプローブを使用してハイブリダイゼーションに
よりRNA及び／又はDNAを検出するための方法にも係る。
この点では、従来のハイブリダイゼーション方法を使用
することができる。
生存生物起源の細胞又はそれ自体生存生物である細胞
を検出するためには、化学的又は物理的方法を使用して
細胞の部分的又は全溶解によりこれらの細胞のRNA及び
／又はDNAに必要に応じてアクセスできるようにし、検
出可能な本発明の１又は数種のプローブと接触させる。
この接触は、液体媒体又は溶液中でニトロセルロース、
セルロース又はナイロンフィルターのような適当な支持
体上で実施され得る。この接触は、次善、最適又は制限
条件（即ち配列が所定の分子長で完全に相同である場合
のみにハイブリッド形成可能な条件）下で実施され得
る。このような条件は、温度、反応物質濃度、最適核酸
対合温度を低下させる物質の存在（例えばホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド及び尿素）、及び反応容量を
外見上低下させるか及び／又はハイブリッド形成を促進
する物質の存在（例えばデキストラン硫酸、ポリエチレ
ングリコール又はフェノール）を含む。
を検出するためには、化学的又は物理的方法を使用して
細胞の部分的又は全溶解によりこれらの細胞のRNA及び
／又はDNAに必要に応じてアクセスできるようにし、検
出可能な本発明の１又は数種のプローブと接触させる。
この接触は、液体媒体又は溶液中でニトロセルロース、
セルロース又はナイロンフィルターのような適当な支持
体上で実施され得る。この接触は、次善、最適又は制限
条件（即ち配列が所定の分子長で完全に相同である場合
のみにハイブリッド形成可能な条件）下で実施され得
る。このような条件は、温度、反応物質濃度、最適核酸
対合温度を低下させる物質の存在（例えばホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド及び尿素）、及び反応容量を
外見上低下させるか及び／又はハイブリッド形成を促進
する物質の存在（例えばデキストラン硫酸、ポリエチレ
ングリコール又はフェノール）を含む。
ハイブリダイズしなかった本発明のプローブを除去す
るには、適切なイオン力価及び適切な温度の緩衝溶液で
洗浄し、場合により、S1ヌルレアーゼ又は一本鎖DNAも
しくはRNAを消化するが、DNA−RNAハイブリッドもしく
は二本鎖DNAを消化しない他の任意の酵素で処理する。
るには、適切なイオン力価及び適切な温度の緩衝溶液で
洗浄し、場合により、S1ヌルレアーゼ又は一本鎖DNAも
しくはRNAを消化するが、DNA−RNAハイブリッドもしく
は二本鎖DNAを消化しない他の任意の酵素で処理する。
液体媒体中で、細胞DNA又はRANフラグメントに対合し
た本発明のプローブのハイブリッドは種々の方法、例え
ばヒドロキシアパタイト上のクロマトグラフィーにより
液体媒体の残余から分離することもできる。
た本発明のプローブのハイブリッドは種々の方法、例え
ばヒドロキシアパタイト上のクロマトグラフィーにより
液体媒体の残余から分離することもできる。
次に、ハイブリダイズしたプローブをプローブ上のラ
ベルにより検出する。
ベルにより検出する。
染色体DNAフラグメントを標的にするためには、RNAを
１又は数種の酵素で処理し、DNAフラグメントを変性
（即ち両鎖を分離）した後、ハイブリダイゼーションを
可能にする条件下で本発明のプローブの１種をDNAフラ
グメントと接触させ、ハイブリダイゼーションの終了に
達するために必要な時間後、ハイブリダイズしなかった
フラグメントをハイブリダイズしたフラグメントから分
離し、細胞検出について上述したようにラベルを検出す
る。
１又は数種の酵素で処理し、DNAフラグメントを変性
（即ち両鎖を分離）した後、ハイブリダイゼーションを
可能にする条件下で本発明のプローブの１種をDNAフラ
グメントと接触させ、ハイブリダイゼーションの終了に
達するために必要な時間後、ハイブリダイズしなかった
フラグメントをハイブリダイズしたフラグメントから分
離し、細胞検出について上述したようにラベルを検出す
る。
一般に、異種DNAの存在が該当用途でプローブの特異
性を損なわないならば、クローニングを可能にする組換
DNA中に本発明の種々のプローブを含むこともできる。
性を損なわないならば、クローニングを可能にする組換
DNA中に本発明の種々のプローブを含むこともできる。
図１〜図10には、種々の微生物中で発見されたスペー
サー領域のアライメント（全部または一部を配列したも
の）が例として示されている。対（match）及び空所（g
ap）は各々、“:"及び“−”で表されている。総ての配
列に関して、非−コードストランドは、その５′−３′
配列で示されている。
サー領域のアライメント（全部または一部を配列したも
の）が例として示されている。対（match）及び空所（g
ap）は各々、“:"及び“−”で表されている。総ての配
列に関して、非−コードストランドは、その５′−３′
配列で示されている。
５′末端は、16S rRNA遺伝子の近位であり、３′末端
は、23S rRNA遺伝子の近位である。
は、23S rRNA遺伝子の近位である。
図１〜図10に参照される各生体（E.coliの１種を除
く）の16Sと23S rRNA遺伝子との間のスペーサー領域の
各核酸配列は、新規であることは指摘されねばならな
い。
く）の16Sと23S rRNA遺伝子との間のスペーサー領域の
各核酸配列は、新規であることは指摘されねばならな
い。
図１には、Neisseria gonorrhoeae組NCTC 8375（上
列）及びITM 4367（下列）の16Sと23S rRNA遺伝子との
間のスペーサー領域の16S rRNA近位端の核酸配列アライ
メントが示されている。
列）及びITM 4367（下列）の16Sと23S rRNA遺伝子との
間のスペーサー領域の16S rRNA近位端の核酸配列アライ
メントが示されている。
図２には、Bordetella pertussis ATCC 10380（上
列）及びBordetella bronchiseptica NCTC 452（下列）
の16Sと23S rRNAとの間のスペーサー領域の核酸配列ア
ライメントが示されている。
列）及びBordetella bronchiseptica NCTC 452（下列）
の16Sと23S rRNAとの間のスペーサー領域の核酸配列ア
ライメントが示されている。
図３には、Neisseria meningitidis NCTC 10025（上
列）及びNeisseria gonorrhoeae NCTC 8375（下列）の1
6Sと23S rRNAとの間のスペーサー領域の核酸配列アライ
メントが示されている。
列）及びNeisseria gonorrhoeae NCTC 8375（下列）の1
6Sと23S rRNAとの間のスペーサー領域の核酸配列アライ
メントが示されている。
図４には、Neisseria gonorrhoeae NCTC 8375（上
例）及びBordetella pertussis ATCC 10380（下列）の1
6Sと23S rRNAとの間のスペーサー領域の核酸配列アライ
メントが示されている。
例）及びBordetella pertussis ATCC 10380（下列）の1
6Sと23S rRNAとの間のスペーサー領域の核酸配列アライ
メントが示されている。
図５には、Branhamella catarrhalis ITM 4197（上
列）及びNeisseria gonorrhoeae NCTC 8375（下列）の1
6Sと23S rRNAとの間のスペーサー領域の核酸配列アライ
メントが示されている。
列）及びNeisseria gonorrhoeae NCTC 8375（下列）の1
6Sと23S rRNAとの間のスペーサー領域の核酸配列アライ
メントが示されている。
図６には、Haemophilus ducreyi CIP 542（上列）及
びEscherichia coli（下列）の16Sと23S rRNAとの間の
スペーサー領域の核酸配列アライメントが示されてい
る。
びEscherichia coli（下列）の16Sと23S rRNAとの間の
スペーサー領域の核酸配列アライメントが示されてい
る。
図７には、Branhamella catarrhalis ITM 4197（上
列）及びMoraxella nonliquefaciens ATCC 19975（下
列）の16Sと23S rRNAとの間のスペーサー領域の核酸配
列アライメントが示されている。
列）及びMoraxella nonliquefaciens ATCC 19975（下
列）の16Sと23S rRNAとの間のスペーサー領域の核酸配
列アライメントが示されている。
図８には、Haemophilus influenzae（バイオグループ
influenzae）NCTC 8143（上列）及びHaemophilus influ
enzae（バイオグループaegyptius）ITM 859（下列）の1
6Sと23S rRNAとの間のスペーサー領域の核酸配列アライ
メントが示されている。
influenzae）NCTC 8143（上列）及びHaemophilus influ
enzae（バイオグループaegyptius）ITM 859（下列）の1
6Sと23S rRNAとの間のスペーサー領域の核酸配列アライ
メントが示されている。
図９には、Streptococcus pneumoniae S90−5122（上
列）及びStreptococcus agalactiae U90−2817（下列）
の16Sと23S rRNAとの間のスペーサー領域の核酸配列ア
ライメントが示されている。
列）及びStreptococcus agalactiae U90−2817（下列）
の16Sと23S rRNAとの間のスペーサー領域の核酸配列ア
ライメントが示されている。
図10には、Campylobacter jejuni ATCC 33560（上
列）及びCampylobacter coli ATCC 33559（下列）の16S
と23S rRNAとの間のスペーサー領域の23S rRNA近位端の
核酸配列アライメントが示されている。
列）及びCampylobacter coli ATCC 33559（下列）の16S
と23S rRNAとの間のスペーサー領域の23S rRNA近位端の
核酸配列アライメントが示されている。
使用した株は、各々培地コレクション： ATCC:American Type Culture Collection,Rockville,M
D,USA. CIP:Collection de l′Institut Pasteur,Paris,Franc
e. ITM:Institute of Tropical Medicine,Antwerp,Belgiu
m. NCTC:National Collection of Type Cultures,Central
Public Health Laboratory,London,United Kingsom. から入手し得る。
D,USA. CIP:Collection de l′Institut Pasteur,Paris,Franc
e. ITM:Institute of Tropical Medicine,Antwerp,Belgiu
m. NCTC:National Collection of Type Cultures,Central
Public Health Laboratory,London,United Kingsom. から入手し得る。
以下の実施例は、本発明のプローブの製造法及び種々
のハイブリダイゼーションプロトコルを使用するプロー
ブの特異性及び感度に関する実験結果に関する。臨床に
適当な以下の生体:Neisseria gonorrhoeae、Neisseria
meningitidis、Branhamella catarrhalis、Haemophilus
ducreyi、Haemophilus influenzae及びBordetella per
tussisを選択した。
のハイブリダイゼーションプロトコルを使用するプロー
ブの特異性及び感度に関する実験結果に関する。臨床に
適当な以下の生体:Neisseria gonorrhoeae、Neisseria
meningitidis、Branhamella catarrhalis、Haemophilus
ducreyi、Haemophilus influenzae及びBordetella per
tussisを選択した。
実施例は、種−特異性で感度の高いプローブが、研究
した総ての生体のスペーサー領域に容易に知見されたこ
とを示している。さらに、種−特異性で感度の高いプロ
ーブが16S及びまたは23S rRNA分子に知見されない生体
のこの領域からプローブが構築され得ることを示してい
る。使用した方法は、他に記載しない限り、ROSSAUらの
J.Gen.Microbiol.;135:1735−1745,1989または欧州特許
出願第8940/045.3に記載の方法と本質的に同一である。
rRNA遺伝子フラグメントの酵素的増幅法及び逆ハイブリ
ダイゼーションを除く総ての方法は現在当業者に公知で
ある。16S−23S rRNAスペーサー領域を広げるrRNA遺伝
子フラグメントの酵素的増幅法は、Perkin Elmer Cetus
の“Gene Amp"キットに推薦される方法に従って実施し
たポリメラーゼ鎖反応法（PCR）により得られた。rRNA
分子中に保存されたまたは半分保存された（semi−cons
erved）領域に対応するヌクレオチドをPCRプライマーと
して使用した。逆ドット−ブロット法の原理及びプロト
コルは、Saikiら（1989）により記載されている。
した総ての生体のスペーサー領域に容易に知見されたこ
とを示している。さらに、種−特異性で感度の高いプロ
ーブが16S及びまたは23S rRNA分子に知見されない生体
のこの領域からプローブが構築され得ることを示してい
る。使用した方法は、他に記載しない限り、ROSSAUらの
J.Gen.Microbiol.;135:1735−1745,1989または欧州特許
出願第8940/045.3に記載の方法と本質的に同一である。
rRNA遺伝子フラグメントの酵素的増幅法及び逆ハイブリ
ダイゼーションを除く総ての方法は現在当業者に公知で
ある。16S−23S rRNAスペーサー領域を広げるrRNA遺伝
子フラグメントの酵素的増幅法は、Perkin Elmer Cetus
の“Gene Amp"キットに推薦される方法に従って実施し
たポリメラーゼ鎖反応法（PCR）により得られた。rRNA
分子中に保存されたまたは半分保存された（semi−cons
erved）領域に対応するヌクレオチドをPCRプライマーと
して使用した。逆ドット−ブロット法の原理及びプロト
コルは、Saikiら（1989）により記載されている。
実施例１ Neisseria meningitidis及びNeisseria gonorrhoeae
の両方は、各々髄膜炎及び淋疾に関連する重要なヒト病
原体である。これらの生体は非常に密接に関連してお
り、互い及び他のNeisseria種との差別化は間違い易
い。Neisseria meningitidis及びNeisseria gonorrhoea
eに特異的なDNAプローブは、両方のNeisseria種の間の
正しい差別化を速め且つ臨床サンプル中でこれらの種を
直接検出するために使用し得る。
の両方は、各々髄膜炎及び淋疾に関連する重要なヒト病
原体である。これらの生体は非常に密接に関連してお
り、互い及び他のNeisseria種との差別化は間違い易
い。Neisseria meningitidis及びNeisseria gonorrhoea
eに特異的なDNAプローブは、両方のNeisseria種の間の
正しい差別化を速め且つ臨床サンプル中でこれらの種を
直接検出するために使用し得る。
Neisseria gonorrhoeaeを検出するために多くのDNAプ
ローブについて記載されてきた（欧州特許出願第0272 0
09号及び同第0337 896号;URDEAら,Clin.Chem.35:1571−
1575,1989;TOTTENら,J.Infect.Dis.148:462−471,1989;
DONEGANら,Mol.Cell.Probes 3;13−26,1989;KOLBERGら,
Mol.Cell.Probes 3:59−72,1989）。しかしながら、こ
れらのプローブの内の幾つかは、非−Neisseria gonorr
hoeae株と交差するか、感度が高くないことが知見され
た。これらのプローブは総て16S−23S rRNAスペーサー
領域由来ではなかった。
ローブについて記載されてきた（欧州特許出願第0272 0
09号及び同第0337 896号;URDEAら,Clin.Chem.35:1571−
1575,1989;TOTTENら,J.Infect.Dis.148:462−471,1989;
DONEGANら,Mol.Cell.Probes 3;13−26,1989;KOLBERGら,
Mol.Cell.Probes 3:59−72,1989）。しかしながら、こ
れらのプローブの内の幾つかは、非−Neisseria gonorr
hoeae株と交差するか、感度が高くないことが知見され
た。これらのプローブは総て16S−23S rRNAスペーサー
領域由来ではなかった。
Neisseria meningitidis株を検出するDNAプローブも
報告された（KOLBERGら,Mol.Cell.Probes 3:59−72,198
9）。Neisseria gonorrhoeaeのピリン遺伝子から誘導さ
れたこのプローブも、Neisseria meningitidisに関して
非常に特異性でもなく感度も高くはなかった。
報告された（KOLBERGら,Mol.Cell.Probes 3:59−72,198
9）。Neisseria gonorrhoeaeのピリン遺伝子から誘導さ
れたこのプローブも、Neisseria meningitidisに関して
非常に特異性でもなく感度も高くはなかった。
Neisseria gonorrhoeae及びNeisseria meningitidis
型株の16Sと23S rRNA遺伝子との間のスペーサー領域の
配列を、スペーサー領域を広げるPCRフラグメント由来
のクローン化した物質を使用して決定した。図３に示さ
れている両方の列から、幾つかの潜在的なプローブ配列
が明らかになった。
型株の16Sと23S rRNA遺伝子との間のスペーサー領域の
配列を、スペーサー領域を広げるPCRフラグメント由来
のクローン化した物質を使用して決定した。図３に示さ
れている両方の列から、幾つかの潜在的なプローブ配列
が明らかになった。
約60塩基対の予想外の挿入配列を、Neisseria mening
itidis株のスペーサー領域中に検出した。以下の配列： を有するオリゴヌクレオチドを、この挿入した配列から
誘導した。
itidis株のスペーサー領域中に検出した。以下の配列： を有するオリゴヌクレオチドを、この挿入した配列から
誘導した。
（図３のNeisseria meningitidis配列の塩基対365〜386
由来の）スペーサー領域のもう１つのエリアでも、Neis
seria meningitidisとNeisseria gonorrhoeaeとの間で
かなりの度合いで食い違いが明らかになった。このエリ
アから、２種類のオリゴヌクレオチドプローブ（Neisse
ria meningitidis及びNeisseria gonorrhoeaeの検出用
のNMI3及びNGI1）： が化学的に合成された。
由来の）スペーサー領域のもう１つのエリアでも、Neis
seria meningitidisとNeisseria gonorrhoeaeとの間で
かなりの度合いで食い違いが明らかになった。このエリ
アから、２種類のオリゴヌクレオチドプローブ（Neisse
ria meningitidis及びNeisseria gonorrhoeaeの検出用
のNMI3及びNGI1）： が化学的に合成された。
これらのヌクレオチドを、ポリヌクレオチドキナーゼ
を使用してその５′末端を32Pラベルするか、またはタ
ーミナルトランスフェラーゼを使用してその３′末端で
ジゴキシゲニル化したUTPと結合して、ハイブリダイゼ
ーションプローブとして使用した。ターゲットとして、
種々の位置由来の多くのNeisseria meningitidis及びNe
isseria gonorrhoeae株由来のドット−スポットした変
性ゲノムDNA及び他の細菌（bacterial taxa）由来の幾
つかの株を使用した。
を使用してその５′末端を32Pラベルするか、またはタ
ーミナルトランスフェラーゼを使用してその３′末端で
ジゴキシゲニル化したUTPと結合して、ハイブリダイゼ
ーションプローブとして使用した。ターゲットとして、
種々の位置由来の多くのNeisseria meningitidis及びNe
isseria gonorrhoeae株由来のドット−スポットした変
性ゲノムDNA及び他の細菌（bacterial taxa）由来の幾
つかの株を使用した。
ハイブリダイゼーション−混合物は、３×SSC、25mM
リン酸カリウム緩衝液、pH7、脱イオン化ホルムアミド
（20％,v/v）、Ficoll（0.02％,w/v）、ウシ血清アルブ
ミン（0.02％,w/v）、ポリビニルピロリドン（0.02％,w
/v）及びシェアをかけて変性したサケ精液DNA（0.1mg/m
l）であるか、または５×SSCの代わりに３×SSC（１×S
SC:0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリウム,pH7.0）を使
用し且つホルムアミドを20％（v/v）まで添加した以外
には、非−放射性DNAラベル及び検出キット（Boehringe
r Mannheim製）のプロトコルシートの溶液であった。洗
浄液は、３×SSC、20％ホルムアミド及び25mMリン酸塩
緩衝液pH7.1を含んでいた。
リン酸カリウム緩衝液、pH7、脱イオン化ホルムアミド
（20％,v/v）、Ficoll（0.02％,w/v）、ウシ血清アルブ
ミン（0.02％,w/v）、ポリビニルピロリドン（0.02％,w
/v）及びシェアをかけて変性したサケ精液DNA（0.1mg/m
l）であるか、または５×SSCの代わりに３×SSC（１×S
SC:0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリウム,pH7.0）を使
用し且つホルムアミドを20％（v/v）まで添加した以外
には、非−放射性DNAラベル及び検出キット（Boehringe
r Mannheim製）のプロトコルシートの溶液であった。洗
浄液は、３×SSC、20％ホルムアミド及び25mMリン酸塩
緩衝液pH7.1を含んでいた。
ハイブリダイゼーションの結果は、以下の表にまとめ
られている。各プローブ毎のハイブリダイゼーション及
び洗浄温度は、括弧内に示されている。試験した総ての
プローブは、Neisseria gonorrhoeae（プローブNGI1）
またはNeisseria menigitidis（プローブNMI1,NMI2及び
NMI3）に対し非常に特異性で且つ感度が高かったことが
証明された。
られている。各プローブ毎のハイブリダイゼーション及
び洗浄温度は、括弧内に示されている。試験した総ての
プローブは、Neisseria gonorrhoeae（プローブNGI1）
またはNeisseria menigitidis（プローブNMI1,NMI2及び
NMI3）に対し非常に特異性で且つ感度が高かったことが
証明された。
NMI3及びNGI3で検出する特異性を、16S rRNA遺伝子の
３′末端及び23S rRNA遺伝子の５′末端に各々配置して
いる以下の増幅プライマー： とのスペーサー領域の酵素的増幅後においてもチェック
した。Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidi
s、Haemophilus ducreyi、Bordetella pertussis及びBr
anhamella catarrhalisの株由来のゲノムDNAの100ナノ
グラムをPCR反応に使用した。増幅後、収量の1/10をア
ガロースゲルに装填し、電気泳動させ、ナイロン膜上に
ブロットした。
３′末端及び23S rRNA遺伝子の５′末端に各々配置して
いる以下の増幅プライマー： とのスペーサー領域の酵素的増幅後においてもチェック
した。Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidi
s、Haemophilus ducreyi、Bordetella pertussis及びBr
anhamella catarrhalisの株由来のゲノムDNAの100ナノ
グラムをPCR反応に使用した。増幅後、収量の1/10をア
ガロースゲルに装填し、電気泳動させ、ナイロン膜上に
ブロットした。
続いてこの膜をプローブNGI1及びNMI3でハイブリダイ
ズした。
ズした。
各々NGI1またはNMI3をプローブとして使用したとき、
Neisseria gonorrhoeaeまたはNeisseria meningitidis
物質が存在するレーンだけにはっきりしたハイブリダイ
ゼーションシグナルが検出できた。
Neisseria gonorrhoeaeまたはNeisseria meningitidis
物質が存在するレーンだけにはっきりしたハイブリダイ
ゼーションシグナルが検出できた。
実施例２ Bordetella pertussisは、百日咳の原因となる因子で
ある。再度の予防接種キャンペーンにより、この病気は
先進国では殆ど問題ではない。しかしながら第３世界の
国々に於いては、Bordetella pertussisは、幼児の致死
率のトップである。
ある。再度の予防接種キャンペーンにより、この病気は
先進国では殆ど問題ではない。しかしながら第３世界の
国々に於いては、Bordetella pertussisは、幼児の致死
率のトップである。
３種類のBordetella種（Bordetella pertussis,Borde
tella parapertussis,Bordetella bronchiseptica）の
株は非常に関連しているので（KLOOSら,Int.J.Syst.Bac
teriol.31:173−176,1981;DE LEYら,Int.J.Syst.Bacter
iol.36:405−414:1986）、ひとつの遺伝子種に属するも
のとして考えるべきである。この遺伝子型の関係は、こ
れらの細菌の他の多くの特徴にも反映するので、その表
現型の差別化が冗長となる。
tella parapertussis,Bordetella bronchiseptica）の
株は非常に関連しているので（KLOOSら,Int.J.Syst.Bac
teriol.31:173−176,1981;DE LEYら,Int.J.Syst.Bacter
iol.36:405−414:1986）、ひとつの遺伝子種に属するも
のとして考えるべきである。この遺伝子型の関係は、こ
れらの細菌の他の多くの特徴にも反映するので、その表
現型の差別化が冗長となる。
百日咳の臨床兆候はたいてい非定型であり、検査室診
断が必要である。感度が高く、特異的で迅速な試験はま
だ無い。培地には選択方法が残っているが、回収率は低
き且つ結果は通常、接種後３〜７日しか有効でない（FR
IEDMAN,Clin.Microbiol.Rev.4:365−376,1988;HALPERIN
ら,J.Clin.Microbiol.27:752−757,1989）。DNAプロー
ブベースの分析は、Bordetella pertussis感染の診断を
非常に改良し得る。
断が必要である。感度が高く、特異的で迅速な試験はま
だ無い。培地には選択方法が残っているが、回収率は低
き且つ結果は通常、接種後３〜７日しか有効でない（FR
IEDMAN,Clin.Microbiol.Rev.4:365−376,1988;HALPERIN
ら,J.Clin.Microbiol.27:752−757,1989）。DNAプロー
ブベースの分析は、Bordetella pertussis感染の診断を
非常に改良し得る。
Bordetella pertussisの検出用プローブは、文献（PA
RKら,FEMS Microbiol.Lett.52:19−24,1988;McPHEAT及
びMcNALLY,J.Gen.Microbiol.133:323−330,1987及びFEM
S Microbiol.Lett.41:357−360,1987;McLAFFERTYら,Abs
tracts of the Annual Meeting of the American Socie
ty for Microbiology C−168,1986及びＣ−322,1987）
に記載されている。McLAFFERTYら（1986及び1987）に記
載のプローブは、特異性が高くない。記載の他のプロー
ブに関しては、示されたデータは特異性及び感度の度合
いを推論するには不十分である。
RKら,FEMS Microbiol.Lett.52:19−24,1988;McPHEAT及
びMcNALLY,J.Gen.Microbiol.133:323−330,1987及びFEM
S Microbiol.Lett.41:357−360,1987;McLAFFERTYら,Abs
tracts of the Annual Meeting of the American Socie
ty for Microbiology C−168,1986及びＣ−322,1987）
に記載されている。McLAFFERTYら（1986及び1987）に記
載のプローブは、特異性が高くない。記載の他のプロー
ブに関しては、示されたデータは特異性及び感度の度合
いを推論するには不十分である。
以下の株のリボソームRNA遺伝子の一部を酵素的に増
幅し、プラスミドベクター:Bordetella pertussis ATCC
10380、Bordetella parapertussis NCTC 5952（型株）
及びBordetella bronchiseptica NCTC 452（型株）にク
ローン化した。種々の種類のクローン化したフラグメン
トを、ジデオキシ鎖停止法を使用して一部配列し、その
配列を比較した。16S rRNA遺伝子に拘わる配列情報は、
種−特異性プローブが与えられないことを示している
（ROSSAUら，未発表）。しかしながら図２のアライメン
トに示されたように、相同でないエリア（271塩基対〜
約300）がBordetella pertussis及びBordetella bronch
iseptica株の16Sと23S rRNA遺伝子との間のスペーサー
領域に知見された。
幅し、プラスミドベクター:Bordetella pertussis ATCC
10380、Bordetella parapertussis NCTC 5952（型株）
及びBordetella bronchiseptica NCTC 452（型株）にク
ローン化した。種々の種類のクローン化したフラグメン
トを、ジデオキシ鎖停止法を使用して一部配列し、その
配列を比較した。16S rRNA遺伝子に拘わる配列情報は、
種−特異性プローブが与えられないことを示している
（ROSSAUら，未発表）。しかしながら図２のアライメン
トに示されたように、相同でないエリア（271塩基対〜
約300）がBordetella pertussis及びBordetella bronch
iseptica株の16Sと23S rRNA遺伝子との間のスペーサー
領域に知見された。
Bordetella parapertussis株のスペーサー領域の配列
は、Bordetella bronchiseptica配列と大体同一である
（ROSSAUら，未発表）。
は、Bordetella bronchiseptica配列と大体同一である
（ROSSAUら，未発表）。
Bordetella pertussisのスペーサー領域のヌクレオチ
ド271と295との間のエリアから、以下の配列： を有するオリゴヌクレオチドプローブを誘導した。
ド271と295との間のエリアから、以下の配列： を有するオリゴヌクレオチドプローブを誘導した。
オリゴヌクレオチドプローブを化学合成し、ターミナ
ルトランスフェラーゼを使用してジゴキシゲニン−UTP
でラベルした。ターゲットとしてドット−スポットし、
変性したゲノムDNAで得られた結果を以下の表にまとめ
た。
ルトランスフェラーゼを使用してジゴキシゲニン−UTP
でラベルした。ターゲットとしてドット−スポットし、
変性したゲノムDNAで得られた結果を以下の表にまとめ
た。
使用条件下に於いて、プローブBPI1はBordetella per
tussisに対し100％特異性で且つ100％の感度であること
を証明した。
tussisに対し100％特異性で且つ100％の感度であること
を証明した。
ハイブリダイゼーション混合物は、５×SSCの代わり
に３×SSC（１×SSC:0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリ
ウム,pH7.0）を使用し、ホルムアミドを20％（v/v）ま
で添加したことを除いて、非−放射性DNAラベル及び検
出キット（Boehringer Mannheim製）のプロトコルシー
トに記載のものと同じであって。洗浄液は３×SSC、20
％ホルムアミド及び25mMリン酸塩緩衝液pH7.1を含んで
いた。ハイブリダイゼーション及び洗浄温度は55℃であ
った。
に３×SSC（１×SSC:0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリ
ウム,pH7.0）を使用し、ホルムアミドを20％（v/v）ま
で添加したことを除いて、非−放射性DNAラベル及び検
出キット（Boehringer Mannheim製）のプロトコルシー
トに記載のものと同じであって。洗浄液は３×SSC、20
％ホルムアミド及び25mMリン酸塩緩衝液pH7.1を含んで
いた。ハイブリダイゼーション及び洗浄温度は55℃であ
った。
逆ドット−ブロット分析を利用すると、上記表に示さ
れているのと本質的に同一結果が得られた。この分析は
以下のように実施した： 異なる細菌種から得られた種々の株からの殺菌DNA1ng
を、ジオキシゲニン−11−dUTP（Boehringer Mannhei
m）を増幅混合物に添加して最終濃度40μＭとした以外
には、GeneAmpキット（Perkin Elmer Cetus）の製造業
者により推奨されるように酵素的に増幅した。プライマ
ーAP16及びAP23（実施例１参照）を用いて全部で50μ
で30サイクル（１分/95℃,1分/50℃,1分/72℃）実施
し、その後各PCR混合物の５μを膜の存在下にハイブ
リダイゼーション混合物（上記定義通りの組成物）1ml
に添加し、これにプローブBPI1の0.2pmol、0.02pmol及
び0.002pmolを固定した。ハイブリダイゼーションを55
℃で１時間実施した。洗浄工程を同一温度で10分間実施
した。非−放射性DNAラベル及び検出キット（Boehringe
r Mannheim製）に記載の如く検出した。ゲル電気泳動及
び逆ドット−ブロットプロトコルを使用する臭化エチジ
ウム染色後に実験した全サンプル中にはっきりしたバン
ドを検出したが、もっぱらBordetella pertussis DNAが
存在するサンプルにはっきりした陽性シグナルが得られ
た。
れているのと本質的に同一結果が得られた。この分析は
以下のように実施した： 異なる細菌種から得られた種々の株からの殺菌DNA1ng
を、ジオキシゲニン−11−dUTP（Boehringer Mannhei
m）を増幅混合物に添加して最終濃度40μＭとした以外
には、GeneAmpキット（Perkin Elmer Cetus）の製造業
者により推奨されるように酵素的に増幅した。プライマ
ーAP16及びAP23（実施例１参照）を用いて全部で50μ
で30サイクル（１分/95℃,1分/50℃,1分/72℃）実施
し、その後各PCR混合物の５μを膜の存在下にハイブ
リダイゼーション混合物（上記定義通りの組成物）1ml
に添加し、これにプローブBPI1の0.2pmol、0.02pmol及
び0.002pmolを固定した。ハイブリダイゼーションを55
℃で１時間実施した。洗浄工程を同一温度で10分間実施
した。非−放射性DNAラベル及び検出キット（Boehringe
r Mannheim製）に記載の如く検出した。ゲル電気泳動及
び逆ドット−ブロットプロトコルを使用する臭化エチジ
ウム染色後に実験した全サンプル中にはっきりしたバン
ドを検出したが、もっぱらBordetella pertussis DNAが
存在するサンプルにはっきりした陽性シグナルが得られ
た。
実施例３ Moraxella catarrhalisまたはNeisseria catarrhalis
とも知られるBranhamella catarrhalisは、特殊培養基
を必要とする生化学的に不活性な細菌である。近年、そ
の重要な病原体としての潜在能力が認識された。
とも知られるBranhamella catarrhalisは、特殊培養基
を必要とする生化学的に不活性な細菌である。近年、そ
の重要な病原体としての潜在能力が認識された。
Branhamella catarrhalisは、重い気道感染症によく
含まれる（HAGERら,Rev.Infect.Dis.9:1140−1149,198
7）。Branhamella catarrhalisの診断には、特殊培養基
を必要としない微生物による異常増殖により阻止される
この生体の培地と、この生体と口腔内に存在する共動生
物（例えば、Neisseria種など）とを区別するための一
組の表現型試験器具とが必要である。
含まれる（HAGERら,Rev.Infect.Dis.9:1140−1149,198
7）。Branhamella catarrhalisの診断には、特殊培養基
を必要としない微生物による異常増殖により阻止される
この生体の培地と、この生体と口腔内に存在する共動生
物（例えば、Neisseria種など）とを区別するための一
組の表現型試験器具とが必要である。
時々、表現型が類似の細菌由来のBranhamella catarr
halisを差別化する試験が限られているので、表現型試
験は、推定上のBranhamella catarrhalis単離物の識別
に関しては決定的ではない（RIOU及びGUIBOURDENCHE,Dr
ugs 31［補追.3］:1−6,1986）。分析に基づいてDNAプ
ローブを使用すると、Branhamella catarrhalisの検査
室診断をかなり簡素化できる。未特定DNAフラグメント
から誘導し、Neisseria caviae由来のDNAで交差ハイブ
リダイズしたBranhamella catarrhalis用とDNAプローブ
については、BEAULIEU及びROYにより記載されている（A
bstracts of the Annual Meeting of the American Soc
iety for Microbiology,Abstract No.D−249,1989）。
halisを差別化する試験が限られているので、表現型試
験は、推定上のBranhamella catarrhalis単離物の識別
に関しては決定的ではない（RIOU及びGUIBOURDENCHE,Dr
ugs 31［補追.3］:1−6,1986）。分析に基づいてDNAプ
ローブを使用すると、Branhamella catarrhalisの検査
室診断をかなり簡素化できる。未特定DNAフラグメント
から誘導し、Neisseria caviae由来のDNAで交差ハイブ
リダイズしたBranhamella catarrhalis用とDNAプローブ
については、BEAULIEU及びROYにより記載されている（A
bstracts of the Annual Meeting of the American Soc
iety for Microbiology,Abstract No.D−249,1989）。
Branhamella catarrhalis ITG 4197のrRNA遺伝子の一
部を、ポリメラーゼ鎖反応法により酵素的に増幅させ、
プラスミドベクターにクローン化した。続いて16S−23S
rRNAスペーサー領域を広げるフラグメントをジデオキ
シ鎖停止法により配列した。この配列は図７に示されて
いる（上列）。配列データより、以下のオリゴヌクレオ
チド： を選択し、化学的に合成した。
部を、ポリメラーゼ鎖反応法により酵素的に増幅させ、
プラスミドベクターにクローン化した。続いて16S−23S
rRNAスペーサー領域を広げるフラグメントをジデオキ
シ鎖停止法により配列した。この配列は図７に示されて
いる（上列）。配列データより、以下のオリゴヌクレオ
チド： を選択し、化学的に合成した。
このオリゴヌクレオチドをその５′末端でポリヌクレ
オチドキナーゼで23Pラベルし、ハイブリダイゼーショ
ンプローブとして使用した。ターゲットとして、異なる
位置の31 Branhamella catarrhalis株及び他の細菌分類
の19株のドット−スポットした。変性ゲノムDNAを使用
した。
オチドキナーゼで23Pラベルし、ハイブリダイゼーショ
ンプローブとして使用した。ターゲットとして、異なる
位置の31 Branhamella catarrhalis株及び他の細菌分類
の19株のドット−スポットした。変性ゲノムDNAを使用
した。
ハイブリダイゼーション−混合物は、３×SSC（１×S
SC:0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0）、
25mMリン酸カリウム緩衝液、pH7、脱イオン化ホルムア
ミド（20％,v/v）、Ficoll（0.02％,w/v）、ウシ血清ア
ルブミン（0.02％,w/v）、ポリビニルピロリドン（0.02
％,w/v）及びシェアをかけて変性したサケ精液DNA（0.1
mg ml-1）であった。洗浄液は、３×SSC、20％ホルムア
ミド及び25mMリン酸塩緩衝液pH7.1を含んでいた。ハイ
ブリダイゼーション及び洗浄温度は、30℃であった。
SC:0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0）、
25mMリン酸カリウム緩衝液、pH7、脱イオン化ホルムア
ミド（20％,v/v）、Ficoll（0.02％,w/v）、ウシ血清ア
ルブミン（0.02％,w/v）、ポリビニルピロリドン（0.02
％,w/v）及びシェアをかけて変性したサケ精液DNA（0.1
mg ml-1）であった。洗浄液は、３×SSC、20％ホルムア
ミド及び25mMリン酸塩緩衝液pH7.1を含んでいた。ハイ
ブリダイゼーション及び洗浄温度は、30℃であった。
使用条件下で、プローブBCI1を総てのBranhamella ca
tarrhalis株にハイブリダイズした。他の細菌種の属す
る試験した株は総て、このプローブに対し強いハイブリ
ダイゼーションシグナルを与えなかった。
tarrhalis株にハイブリダイズした。他の細菌種の属す
る試験した株は総て、このプローブに対し強いハイブリ
ダイゼーションシグナルを与えなかった。
試験した非−Branhamella catarrhalis株は： Moraxella lacunata ATCC 17967 Moraxella lacunata ATCC 17952 Moraxella bovis ITM 1601 Moraxella nonliquefaciens ATCC 19975 Neisseria cuniculi ITM 3388 Neisseria ovis NCTC 11227 Neisseria caviae ATCC 14659 Alysiella sp. ATCC 29468 Moraxella osloensis LMG 1043 Moraxella osloensis ATCC 17974 “Moraxella paraphenylpyruvica" LMG 5125 “Moraxella camembertii" LMG 7022 Psychrobacter immobilis LMG 6784 Acinetobacter calcoaceticus ATCC 23005 Escherichia coli B Haemophilus influenzae NCTC 8143 Eikenella corrodens NCTC 10596 Xanthomonas maltophilia LMG 958 Xanthomonas campestris LMG 568 であった。
実施例４ 軟性下疳の原因となるHaemophilus ducreyiは、特殊
培養基を必要とするグラム陰性細菌である。この生体の
培地は、困難で且つ感度が無いが、依然として、Haemop
hilus ducreyi感染の診断のための選択方法である。特
異性の高いプローブを使用すると、培地が不要で且つ診
断の感度が強くなる。他のHaemophilus及びPasteurella
種と弱い交差反応性を示し、蛋白質をコードする遺伝子
をターゲットとするHaemophilus ducreyi用のクローン
化したDNAプローブは、PARSONSらにより記載されている
（J.Clin.Microbiol.27:1441−1445,1989）。
培養基を必要とするグラム陰性細菌である。この生体の
培地は、困難で且つ感度が無いが、依然として、Haemop
hilus ducreyi感染の診断のための選択方法である。特
異性の高いプローブを使用すると、培地が不要で且つ診
断の感度が強くなる。他のHaemophilus及びPasteurella
種と弱い交差反応性を示し、蛋白質をコードする遺伝子
をターゲットとするHaemophilus ducreyi用のクローン
化したDNAプローブは、PARSONSらにより記載されている
（J.Clin.Microbiol.27:1441−1445,1989）。
Haemophilus ducreyi CIP 542型株のrRNA遺伝子の一
部をポリメラーゼ鎖反応により酵素的に増幅し、プラス
ミドベクターにクローン化した。
部をポリメラーゼ鎖反応により酵素的に増幅し、プラス
ミドベクターにクローン化した。
16Sと23S rRNA遺伝子との間のスペーサー領域の配列
は、ジデオキシ鎖停止法により得られた。核酸配列よ
り、以下のオリゴヌクレオチド： を選択し、化学的に合成した。
は、ジデオキシ鎖停止法により得られた。核酸配列よ
り、以下のオリゴヌクレオチド： を選択し、化学的に合成した。
オリゴヌクレオチドをその５′末端で32Pラベルする
か、またはターミナルトランスフェラーゼを使用してジ
ゴキシン化UTPでその３′末端を結合し、ハイブリダイ
ゼーションプローブとして使用した。
か、またはターミナルトランスフェラーゼを使用してジ
ゴキシン化UTPでその３′末端を結合し、ハイブリダイ
ゼーションプローブとして使用した。
ターゲットとして、種々の位置からの41 Haemophilus
ducreyi株及び他のバクテリア分類の幾つかの株の、ド
ット−スポットした変性したゲノムDNAを使用した。総
てのHaemophilus ducreyi株にもっぱらハイブリダイズ
したオリゴヌクレオチドプローブを試験した。
ducreyi株及び他のバクテリア分類の幾つかの株の、ド
ット−スポットした変性したゲノムDNAを使用した。総
てのHaemophilus ducreyi株にもっぱらハイブリダイズ
したオリゴヌクレオチドプローブを試験した。
ハイブリダイゼーション−混合物は、５×SSCの代わ
りに３×SSC（１×SSC:0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナト
リウム,pH7.0）を使用し、ホルムアミドを20％（v/v）
まで添加したことを除いて、３×SSC、25mMリン酸カリ
ウム緩衝液、pH7、脱イオン化ホルムアミド（20％,v/
v）、Ficoll（0.02％,w/v）、ウシ血清アルブミン（0.0
2％,w/v）、ポリビニルピロリドン（0.02％,w/v）及び
シェアをかけて変性したサケ精液DNA（0.1mg ml-1）ま
たは、非−放射性DNAラベル及び検出キット（Boehringe
r Mannheim製）のプロトコルシートの溶液であった。洗
浄液は、３×SSC、20％ホルムアミド及び25mMリン酸塩
緩衝液pH7.1を含んでいた。ハイブリダイゼーション及
び洗浄温度は、40℃であった。
りに３×SSC（１×SSC:0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナト
リウム,pH7.0）を使用し、ホルムアミドを20％（v/v）
まで添加したことを除いて、３×SSC、25mMリン酸カリ
ウム緩衝液、pH7、脱イオン化ホルムアミド（20％,v/
v）、Ficoll（0.02％,w/v）、ウシ血清アルブミン（0.0
2％,w/v）、ポリビニルピロリドン（0.02％,w/v）及び
シェアをかけて変性したサケ精液DNA（0.1mg ml-1）ま
たは、非−放射性DNAラベル及び検出キット（Boehringe
r Mannheim製）のプロトコルシートの溶液であった。洗
浄液は、３×SSC、20％ホルムアミド及び25mMリン酸塩
緩衝液pH7.1を含んでいた。ハイブリダイゼーション及
び洗浄温度は、40℃であった。
試験した非−Haemophilus ducreyi株は： Escherichia coli MC 1061 Escherichia coli B Actinobacillus actinomycetemcomitans NCTC 9710 Actinobacillus lignieresii NCTC 4189 Haemophilus aphrophilus NCTC 5906 Haemophilus influenzae NCTC 8143 Histophilus ovis HIM 896−７ Pasteurella multocida NCTC 10322 Branhamella catarrhalis ITM 4197 Comamonas testosteroni ATCC 17407 Oligella urethralis LMG 6227 Neisseria gonorrhoeae ITM 4437 Campylobacter jejuni CCUG 11284 Acinetobacter calcoaceticus ATCC 23055 未識別株ITM 3565 であった。
実施例５ グラム陰性細菌種Haemophilus influenzaeは、２種類
のバイオグループ:influenzae及びaegyptiusに分類する
ことができる（Casinら,Ann.Inst.Pasteur/Microbiol.1
37B:155−163,1986）。influenzaeバイオグループの生
体は、重要な呼吸器道の病原体であり、子供の脳膜炎及
び耳炎の原因でもある。バイオグループaegyptius単離
物は、暑い気候では、細菌性結膜炎の原因として作用す
る因子であり、ブラジル紫斑熱と関連しているらしい
（Brennerら,J.Clin.Microbiol.26:1524−1534,198
8）。分類可能な及び非−分類可能なHaemophilus influ
enzaeは、核酸プローブにより迅速に検出され得る。
のバイオグループ:influenzae及びaegyptiusに分類する
ことができる（Casinら,Ann.Inst.Pasteur/Microbiol.1
37B:155−163,1986）。influenzaeバイオグループの生
体は、重要な呼吸器道の病原体であり、子供の脳膜炎及
び耳炎の原因でもある。バイオグループaegyptius単離
物は、暑い気候では、細菌性結膜炎の原因として作用す
る因子であり、ブラジル紫斑熱と関連しているらしい
（Brennerら,J.Clin.Microbiol.26:1524−1534,198
8）。分類可能な及び非−分類可能なHaemophilus influ
enzaeは、核酸プローブにより迅速に検出され得る。
この種のDNAプローブは、文献に記載されている（Ter
pstraら,Scand.J.Infect.Dis.19:641−646,1987;Maloui
nら,J.Clin.Microbiol.26:2132−2138,1988）。これら
のプローブは16S−23S rRNAプペーサー領域から誘導さ
れているものではない。
pstraら,Scand.J.Infect.Dis.19:641−646,1987;Maloui
nら,J.Clin.Microbiol.26:2132−2138,1988）。これら
のプローブは16S−23S rRNAプペーサー領域から誘導さ
れているものではない。
Haemophilus influenzae NCTC 8143型株のrRNA遺伝式
の一部を、ポリメラーゼ鎖反応により酵素的に増幅さ
せ、次いでプラスミドベクターにクローン化した。
の一部を、ポリメラーゼ鎖反応により酵素的に増幅さ
せ、次いでプラスミドベクターにクローン化した。
16Sと23S rRNA遺伝子との間のスペーサー領域の配列
がジデオキシ鎖停止方法により得られた。核酸配列か
ら、以下のオリゴヌクレオチド： を選択し、化学的に合成した。
がジデオキシ鎖停止方法により得られた。核酸配列か
ら、以下のオリゴヌクレオチド： を選択し、化学的に合成した。
オリゴヌクレオチドをその５′末端で32Pラベルし、
ハイブリダイゼーションプローブとして使用した。ター
ゲットとして、細菌の分類単位のドット−スポットし
た、変性したゲノムDNAを使用した。
ハイブリダイゼーションプローブとして使用した。ター
ゲットとして、細菌の分類単位のドット−スポットし
た、変性したゲノムDNAを使用した。
両方のプローブを使用したハイブリダイゼーション結
果を以下の表にまとめた。使用したハイブリダイゼーシ
ョン及び洗浄温度では、プローブHII1はHaemophilus in
fluenzaeバイオグループaegyptius株にハイブリダイズ
しなかった。プローブHII2は、両方のバイオグループの
株にハイブリダイズした。両方のプローブは、表示温度
で、Institute of Tropical Medicine,Antwerp,Belguim
から得た他の15種類のHaemophilus influenzaeバイオグ
ループinfluenzaeの臨床単離物にもハイブリダイズし
た。
果を以下の表にまとめた。使用したハイブリダイゼーシ
ョン及び洗浄温度では、プローブHII1はHaemophilus in
fluenzaeバイオグループaegyptius株にハイブリダイズ
しなかった。プローブHII2は、両方のバイオグループの
株にハイブリダイズした。両方のプローブは、表示温度
で、Institute of Tropical Medicine,Antwerp,Belguim
から得た他の15種類のHaemophilus influenzaeバイオグ
ループinfluenzaeの臨床単離物にもハイブリダイズし
た。
ハイブリダイゼーション混合物は、３×SSC、25mMリ
ン酸カリウム緩衝液,pH7、脱イオン化ホルムアミド（20
％,v/v）、Ficoll（0.02％,w/v）、ウシ血清アルブミン
（0.02％,w/v）、ポリビニルピロリドン（0.02％,w/v）
及びシェアをかけて変性したサケ精液DNA（0.1mg m
l-1）であった。洗浄液は、３×SSC、20％ホルムアミド
及び25mMリン酸塩緩衝液pH7.1を含んでいた。
ン酸カリウム緩衝液,pH7、脱イオン化ホルムアミド（20
％,v/v）、Ficoll（0.02％,w/v）、ウシ血清アルブミン
（0.02％,w/v）、ポリビニルピロリドン（0.02％,w/v）
及びシェアをかけて変性したサケ精液DNA（0.1mg m
l-1）であった。洗浄液は、３×SSC、20％ホルムアミド
及び25mMリン酸塩緩衝液pH7.1を含んでいた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バン・フーベルスウイン，ヒユーホ ベルギー国、ベー―9288・ラールネ、コ ルマンストラート・62 (56)参考文献 特表 昭60−501339（ＪＰ，Ａ) 「生化学辞典 第１版」東京化学同人 （昭59．４．10）Ｐ．1343 Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，193 （1984）Ｐ．427−430
Claims (39)
- 【請求項１】検出すべき細菌種の16Sおよび23SrRNA遺伝
子間の転写スペーサー領域の約15〜約100連続ヌクレオ
チドのオリゴヌクレオチド配列から構成され、tRNA遺伝
子配列を含まないプローブを用いて細菌種を特異的に検
出する方法であって、16S及び23SrRNA遺伝子の３′末端
及び５′末端の保存領域に割り当てられたプライマーを
使用して標的部位を酵素増幅し、前記プローブを前記増
幅標的部位へハイブリダイゼーションさせる工程を含む
方法。 - 【請求項２】前記オリゴヌクレオチド配列が、 検出すべき生物の16Sおよび23SrRNA遺伝子間のスペーサ
ー領域のヌクレオチド配列を、最近隣種のスペーサー領
域配列と比較し、 検出すべき生物の16Sおよび23SrRNA遺伝子間のスペーサ
ー領域の約15〜約100の連続ヌクレオチドの配列であっ
て、最近隣種のうちの少なくとも１種のスペーサー領域
配列との間に少なくとも１つのミスマッチを有するヌク
レオチド配列を選択することにより、選択される請求項
１に記載の方法。 - 【請求項３】 から選択される検出すべき細菌種の16Sおよび23SrRNA遺
伝子間の転写スペーサー領域の核酸に属しており且つ15
〜選択された核酸の最大数の連続したヌクレオチドを含
む配列を含み、tRNA遺伝子配列を含まないことを特徴と
するプローブ。 - 【請求項４】１種以上のNeisseria gonorrhoeae株を検
出するためのプローブであって、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数の連続したヌクレオチドを含む配列を含むこ
とを特徴とするプローブ。 - 【請求項５】生物学的サンプル中でNeisseria gonorrh
oeae株を検出するための方法であって、場合によりプロ
ーブの標的配列にフランキングする２種のプライマー、
より好ましくは進化的に高保存性の２種のプライマーを
介するポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅させた検出
すべき株の核酸（DNA又はRNA）を必要に応じて適切な変
性条件下でハブリダイゼーションできるようにしておい
た前記生物学的サンプルを、プローブとサンプル中に存
在し得るNeisseria gonorrhoeae株の相補的核酸との間
のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で請求項
４に記載のプローブと接触させる段階と、特にサンプル
中に存在し得るNeisseria gonorrhoeae株のDNA及びRNA
の両方とハイブリダイズするプローブとの間でハイブリ
ッドが形成された場合にこれを検出する段階とを含むこ
とを特徴とする方法。 - 【請求項６】ハイブリダイゼーション媒体が、約３×SS
C（１×SSC＝0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリウム、
pH7.0）、約25mMのリン酸緩衝液pH7.1、20％脱イオン化
ホルムアミド、0.02％Ficoll、0.02％ウシ血清アルブミ
ン、0.02％ポリビニルピロリドン及び約0.1mg/mlの剪断
変性サケ精子DNAを含有しており、及び／又は洗浄媒体
が、約３×SSC、25mMリン酸緩衝液pH7.1及び20％脱イオ
ン化ホルムアミドを含有しており、使用されるプローブ
が請求項４に記載のプローブのいずれかであり、ハイブ
リダイゼーション温度が約50℃の範囲及び／又は洗浄温
度が約50℃の範囲に適宜調節され、特に、前記標的配列
と対応する該当ハイブリダイゼーション温度（HT）及び
洗浄温度（WT）が夫々、 HT及び／又はWT:50℃、 HT及び／又はWT:50℃であることを特徴とする請求項５
に記載の生物学的サンプル中でNeisseria gonorrhoeae
を検出するための方法。 - 【請求項７】生物学的サンプル中で多数の、好ましくは
全てのNeisseria gonorrhoeae株をin vitro検出する
ためのキットであって、 −請求項４に記載のプローブのいずれかから選択された
少なくとも１種のプローブと、 −これらのプローブと多数の、好ましくは全てのNeisse
ria gonorrhoeae株のDNA及び／又はRNAとの間にハイブ
リダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝液
又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、−前記ハ
イブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを
適時検出するための手段とを含むか、又は −同一核酸分子を標的にし、少なくとも１種がNeisseri
a gonorrhoeaeに対して特異的であり且つ請求項４に記
載のプローブのいずれか１種から選択された少なくとも
２種のプローブと、 −これらのプローブとNeisseria gonorrhoeae株のDNA
及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を
生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成する
ために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むか、又は −固体支持体に固定された請求項４に記載のプローブの
いずれかから選択された少なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又はこれらのプローブ
とNeisseria gonorrhoeae株のDNA及び／又はRNAとの間
にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能
な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むことを特徴と
するキット。 - 【請求項８】１種以上のNeisseria meningitidis株を
検出するためのプローブであって、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数の連続したヌクレオチドを含む配列を含むこ
とを特徴とするプローブ。 - 【請求項９】生物学的サンプル中でNeisseria meningi
tidis株を検出するための方法であって、場合によりプ
ローブの標的配列にフランキングする２種のプライマ
ー、より好ましくは進化的に高保存性の２種のプライマ
ーを介するポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅させた
検出すべき株の核酸（DNA又はRNA）を必要に応じて適切
な変性条件下でハイブリダイゼーションできるようにし
ておいた前記生物学的サンプルを、プローブとサンプル
中に存在し得るNeisseria meningitidis株の相補的核
酸との間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下
で請求項８に記載のプローブと接触させる段階と、特に
サンプル中に存在し得るNeisseria meningitidis株のD
NA及びRNAの両方とハイブリダイズするプローブとの間
でハイブリッドが形成された場合にこれを検出する段階
とを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項１０】ハイブリダイゼーション媒体が、約３×
SSC（１×SSC＝0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリウ
ム、pH7.0）、約25mMのリン酸緩衝液pH7.1、20％脱イオ
ン化ホルムアミド、0.02％Ficoll、0.02％ウシ血清アル
ブミン、0.02％ポリビニルピロリドン及び約0.1mg/mlの
剪断変性サケ精子DNAを含有しており、及び／又は洗浄
媒体が、約３×SSC、25mMリン酸緩衝液pH7.1及び20％脱
イオン化ホルムアミドを含有しており、使用されるプロ
ーブが請求項８に記載のプローブのいずれかであり、ハ
イブリダイゼーション温度が約40〜58℃の範囲及び／又
は洗浄温度が約40〜58℃の範囲に適宜調節され、特に、
前記標的配列と対応する該当ハイブリダイゼーション温
度（HT）及び洗浄温度（WT）が夫々、 HT及び／又はWT:45℃、 HT及び／又はWT:45℃、 HT及び／又はWT:40℃、 HT及び／又はWT:48℃、 HT及び／又はWT:58℃、 HT及び／又はWT:50℃であることを特徴とする請求項９
に記載の生物学的サンプル中でNeisseria meningitidi
sを検出するための方法。 - 【請求項１１】生物学的サンプル中で多数の、好ましく
は全てのNeisseria meningitidis株をin vitro検出す
るためのキットであって、−請求項８に記載のプローブ
のいずれかから選択された少なくとも１種のプローブ
と、 −これらのプローブと多数の、好ましくは全てのNeisse
ria meningitidis株のDNA及び／又はRNAとの間にハイ
ブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝
液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むか、又は −同一核酸分子を標的にし、少なくとも１種がNeisseri
a meningitidisに対して特異的であり且つ請求項８に
記載のプローブのいずれか１種から選択された少なくと
も２種のプローブと、 −これらのプローブとNeisseria meningitidis株のDNA
及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を
生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成する
ために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むか、又は −固体支持体に固定された請求項８に記載のプローブの
いずれかから選択された少なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又はこれらのプローブ
とNeisseria meningitidis株のDNA及び／又はRNAとの
間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可
能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分
と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むことを特徴と
するキット。 - 【請求項１２】１種以上のHaemophilus ducreyi株を検
出するためのプローブであって、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数の連続したヌクレオチドを含む配列を含むこ
とを特徴とするプローブ。 - 【請求項１３】生物学的サンプル中でHeamophilus duc
reyi株を検出するための方法であって、場合によりプロ
ーブの標的配列にフランキングする２種のプライマー、
より好ましくは進化的に高保存性の２種のプライマーを
介するポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅させた検出
すべき株の核酸（DNA又はRNA）を必要に応じて適切な変
性条件下でハイブリダイゼーションできるようにしてお
いた前記生物学的サンプルを、プローブとサンプル中に
存在し得るHaemophilus ducreyi株の相補的核酸との間
のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で請求項
12に記載のプローブと接触させる段階と、特にサンプル
中に存在し得るHaemophilus ducreyi株のDNA及びRNAの
両方とハイブリダイズするプローブとの間でハイブリッ
ドが形成された場合にこれを検出する段階とを含むこと
を特徴とする方法。 - 【請求項１４】ハイブリダイゼーション媒体が、約３×
SSC（１×SSC＝0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリウ
ム、pH7.0）、約25mMのリン酸緩衝液pH7.1、20％脱イオ
ン化ホルムアミド、0.02％Ficoll、0.02％ウシ血清アル
ブミン、0.02％ポリビニルピロリドン及び約0.1mg/mlの
剪断変性サケ精子DNAを含有しており、及び／又は洗浄
媒体が、約３×SSC、25mMリン酸緩衝液pH7.1及び20％脱
イオン化ホルムアミドを含有しており、使用されるプロ
ーブが請求項12に記載のプローブのいずれかであり、ハ
イブリダイゼーション温度が約40℃の範囲及び／又は洗
浄温度が約40℃の範囲に適宜調節され、特に、前記標的
配列と対応する該当ハイブリダイゼーション温度（HT）
及び洗浄温度（WT）が夫々、 HT及び／又はWT:40℃であることを特徴とする請求項13
に記載の生物学的サンプル中でHaemophilus ducreyiを
検出するための方法。 - 【請求項１５】生物学的サンプル中で多数の、好ましく
は全てのHaemophilus ducreyi株をin vitro検出する
ためのキットであって、 −請求項12に記載のプローブのいずれかから選択された
少なくとも１種のプローブと、 −これらのプローブと多数の、好ましくは全てのHaemop
hilus ducreyi株のDNA及び／又はRNAとの間にハイブリ
ダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝液又
は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むか、又は −同一核酸分子を標的にし、少なくとも１種がHaemophi
lus ducreyiに対して特異的であり且つ請求項12に記載
のプローブのいずれか１種から選択された少なくとも２
種のプローブと、 −これらのプローブとHaemophilus ducreyi株のDNA及
び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を生
じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するた
めに必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むか、又は −固体支持体に固定された請求項12に記載のプローブの
いずれかから選択された少なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又はこれらのプローブ
とHaemophilus ducreyi株のDNA及び／又はRNAとの間に
ハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な
緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むことを特徴と
するキット。 - 【請求項１６】１種以上のBranhamella catarrhalis株
を検出するためのプローブであって、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数の連続したヌクレオチドを含む配列を含むこ
とを特徴とするプローブ。 - 【請求項１７】生物学的サンプル中でBranhamella cat
arrhalis株を検出するための方法であって、場合により
プローブの標的配列にフランキングする２種のプライマ
ー、より好ましくは進化的に高保存性の２種のプライマ
ーを介するポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅させた
検出すべき株の核酸（DNA又はRNA）を必要に応じて適切
な変性条件下でハイブリダイゼーションできるようにし
ておいた前記生物学的サンプルを、プローブとサンプル
中に存在し得るBranhamella catarrhalis株の相補的核
酸との間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下
で請求項16に記載のプローブと接触させる段階と、特に
サンプル中に存在し得るBranhamella catarrhalis株の
DNA及びRNAの両方とハイブリダイズするプローブとの間
でハイブリッドが形成された場合にこれを検出する段階
とを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項１８】ハイブリダイゼーション媒体が、約３×
SSC（１×SSC＝0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリウ
ム、pH7.0）、約25mMのリン酸緩衝液pH7.1、20％脱イオ
ン化ホルムアミド、0.02％Ficoll、0.02％ウシ血清アル
ブミン、0.02％ポリビニルピロリドン及び約0.1mg/mlの
剪断変性サケ精子DNAを含有しており、及び／又は洗浄
媒体が、約３×SSC、25mMリン酸緩衝液pH7.1及び20％脱
イオン化ホルムアミドを含有しており、使用されるプロ
ーブが請求項16に記載のプローブのいずれかであり、ハ
イブリダイゼーション温度が約30〜42℃の範囲及び／又
は洗浄温度が約30〜42℃の範囲に適宜調節され、特に、
前記標的配列と対応する該当ハイブリダイゼーション温
度（HT）及びい洗浄温度（WT）が夫々、 HT及び／又はWT:30℃ HT及び／又はWT:42℃であることを特徴とする請求項17
に記載の生物学的サンプル中でBranhamella catarrhal
isを検出するための方法。 - 【請求項１９】生物学的サンプル中で多数の、好ましく
は全てのBranhamella catarrhalis株をin vitro検出
するためのキットであって、 −請求項16に記載のプローブのいずれかから選択された
少なくとも１種のプローブと、 −これらのプローブと多数の、好ましくは全てのBranha
mella catarrhalis株のDNA及び／又はRNAとの間にハイ
ブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝
液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むか、又は −同一核酸分子を標的にし、少なくとも１種がBranhame
lla catarrhalisに対して特異的であり且つ請求項16に
記載のプローブのいずれか１種から選択された少なくと
も２種のプローブと、 −これらのプローブとBranhamella catarrhalis株のDN
A及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を
生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成する
ために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むか、又は −固体支持体に固定された請求項16に記載のプローブの
いずれかから選択された少なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又はこれらのプローブ
とBranhamella catarrhalis株のDNA及び／又はRNAとの
間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可
能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分
と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むことを特徴と
するキット。 - 【請求項２０】１種以上のBordetella pertussis株を
検出するためのプローブであって、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数の連続したヌクレオチドを含む配列を含むこ
とを特徴とするプローブ。 - 【請求項２１】生物学的サンプル中でBordetella pert
ussis株を検出するための方法であって、場合によりプ
ローブの標的配列にフランキングする２種のプライマ
ー、より好ましくは進化的に高保存性の２種のプライマ
ーを介するポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅させた
検出すべき株の核酸（DNA又はRNA）を必要に応じて適切
な変性条件下でハイブリダイゼーションできるようにし
ておいた前記生物学的サンプルを、プローブとサンプル
中に存在し得るBordetella pertussis株の相補的核酸
との間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で
請求項20に記載のプローブと接触させる段階と、特にサ
ンプル中に存在し得るBordetella pertussis株のDNA及
びRNAの両方とハイブリダイズするプローブとの間でハ
イブリッドが形成された場合にこれを検出する段階とを
含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２２】ハイブリダイゼーション媒体が、約３×
SSC（１×SSC＝0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリウ
ム、pH7.0）、約25mMのリン酸緩衝液pH7.1、20％脱イオ
ン化ホルムアミド、0.02％Ficoll、0.02％ウシ血清アル
ブミン、0.02％ポリビニルピロリドン及び約0.1mg/mlの
剪断変性サケ精子DNAを含有しており、及び／又は洗浄
媒体が、約３×SSC、25mMリン酸緩衝液pH7.1及び20％脱
イオン化ホルムアミドを含有しており、使用されるプロ
ーブが請求項20に記載のプローブのいずれかであり、ハ
イブリダイゼーション温度が約55℃の範囲及び／又は洗
浄温度が約55℃の範囲に適宜調節され、特に、前記標的
配列と対応する該当ハイブリダイゼーション温度（HT）
及び洗浄温度（WT）が夫々、 HT及び／又はWT:55℃であることを特徴とする請求項21
に記載の生物学的サンプル中でBordetella pertussis
を検出するための方法。 - 【請求項２３】生物学的サンプル中で多数、好ましくは
全Bordetella pertussis株をin vitro検出するための
キットであって、 −請求項20に記載のプローブのいずれかから選択された
少なくとも１種のプローブと、 −これらのプローブと多数の、好ましくは全てのBordet
ella pertussis株のDNA及び／又はRNAとの間にハイブ
リダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝液
又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、−前記ハ
イブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを
適時検出するための手段とを含むか、又は −同一核酸分子を標的にし、少なくとも１種がBordetel
la pertussisに対して特異的であり且つ請求項20に記
載のプローブのいずれか１種から選択された少なくとも
２種のプローブと、 −これらのプローブとBordetella pertussis株のDNA及
び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を生
じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するた
めに必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むか、又は −固体支持体に固定された請求項20に記載のプローブの
いずれかから選択された少なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又はこれらのプローブ
とBordetella pertussis株のDNA及び／又はRNAとの間
にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能
な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むことを特徴と
するキット。 - 【請求項２４】１種以上のHaemophilus influenzae株
を検出するためのプローブであって、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数の連続したヌクレオチドを含む配列を含むこ
とを特徴とするプローブ。 - 【請求項２５】生物学的サンプル中でHaemophilus inf
luenzae株を検出するための方法であって、場合により
プローブの標的配列にフランキングする２種のプライマ
ー、より好ましくは進化的に高保存性の２種のプライマ
ーを介するポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅させた
検出すべき株の核酸（DNA又はRNA）を必要に応じて適切
な変性条件下でハイブリダイゼーションできるようにし
ておいた前記生物学的サンプルを、プローブとサンプル
中に存在し得るHaemophilus influenzae株の相補的核
酸との間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下
で請求項24に記載のプローブと接触させる段階と、特に
サンプル中に存在し得るHaemophilus influenzae株のD
NA及びRNAの両方とハイブリダイズするプローブとの間
でハイブリッドが形成された場合にこれを検出する段階
とを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２６】ハイブリダイゼーション媒体が、約３×
SSC（１×SSC＝0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリウ
ム、pH7.0）、約25mMのリン酸緩衝液pH7.1、20％脱イオ
ン化ホルムアミド、0.02％Ficoll、0.02％ウシ血清アル
ブミン、0.02％ポリビニルピロリドン及び約0.1mg/mlの
剪断変性サケ精子DNAを含有しており、及び／又は洗浄
媒体が、約３×SSC、25mMリン酸緩衝液pH7.1及び20％脱
イオン化ホルムアミドを含有しており、使用されるプロ
ーブが請求項24に記載のプローブのいずれかであり、ハ
イブリダイゼーション温度が約35〜55℃の範囲及び／又
は洗浄温度が約35〜55℃の範囲に適宜調節され、特に、
前記標的配列と対応する該当ハイブリダイゼーション温
度（HT）及び洗浄温度（WT）が夫々、 HT及び／又はWT:55℃、 HT及び／又はWT:35℃であることを特徴とする請求項25
に記載の生物学的サンプル中でHaemophilus influenza
eを検出するための方法。 - 【請求項２７】生物学的サンプル中で多数の、好ましく
は全てのHaemophilus influenzae株をin vitro検出す
るためのキットであって、 −請求項24に記載のプローブのいずれかから選択された
少なくとも１種のプローブと、 −これらのプローブと多数の、好ましくは全てのHaemop
hilus influenzae株のDNA及び／又はRNAとの間にハイ
ブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝
液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むか、又は −同一核酸分子を標的にし、少なくとも１種がHaemophi
lus influenzaeに対して特異的であり且つ請求項24に
記載のプローブのいずれか１種から選択された少なくと
も２種のプローブと、 −これらのプローブとHaemophilus influenzae株のDNA
及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応を
生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成する
ために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むか、又は −固体支持体に固定された請求項24に記載のプローブの
いずれかから選択された少なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又はこれらのプローブ
とHaemophilus influenzae株のDNA及び／又はRNAとの
間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可
能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分
と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むことを特徴と
するキット。 - 【請求項２８】１種以上のStreptococcus pneumoniae
株を検出するためのプローブであって、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数の連続したヌクレオチドを含む配列を含むこ
とを特徴とするプローブ。 - 【請求項２９】生物学的サンプル中でStreptococcus p
neumoniae株を検出するための方法であって、場合によ
りプローブの標的配列にフランキングする２種のプライ
マー、より好ましくは進化的に高保存性の２種のプライ
マーを介するポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅させ
た検出すべき株の核酸（DNA又はRNA）を必要に応じて適
切な変性条件下でハイブリダイゼーションできるように
しておいた前記生物学的サンプルを、プローブとサンプ
ル中に存在し得るStreptococcus pneumoniae株の相補
的核酸との間のハイブリダイゼーションを可能にする条
件下で請求項28に記載のプローブと接触させる段階と、
特にサンプル中に存在し得るStreptococcus pneumonia
e株のDNA及びRNAの両方とハイブリダイズするプローブ
との間でハイブリッドが形成された場合にこれを検出す
る段階とを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項３０】ハイブリダイゼーション媒体が、約３×
SSC（１×SSC＝0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリウ
ム、pH7.0）、約25mMのリン酸緩衝液pH7.1、20％脱イオ
ン化ホルムアミド、0.02％Ficoll、0.02％ウシ血清アル
ブミン、0.02％ポリビニルピロリドン及び約0.1mg/mlの
剪断変性サケ精子DNAを含有しており、及び／又は洗浄
媒体が、約３×SSC、25mMリン酸緩衝液pH7.1及び20％脱
イオン化ホルムアミドを含有しており、使用されるプロ
ーブが請求項28に記載のプローブのいずれかであり、ハ
イブリダイゼーション温度が約45℃の範囲及び／又は洗
浄温度が約45℃の範囲に適宜調節され、特に、前記標的
配列と対応する該当ハイブリダイゼーション温度（HT）
及び洗浄温度（WT）が夫々、 HT及び／又はWT:45℃、 HT及び／又はWT:45℃、 HT及び／又はWT:45℃であることを特徴とする請求項29
に記載の生物学的サンプル中でStreptococcus pneumon
iaeを検出するための方法。 - 【請求項３１】生物学的サンプル中で多数の、好ましく
は全てのStreptococcus pneumoniae株をin vitro検出
するためのキットであって、 −請求項28に記載のプローブのいずれかから選択された
少なくとも１種のプローブと、 −これらのプローブと多数の、好ましくは全てのStrept
ococcus pneumoniae株のDNA及び／又はRNAとの間にハ
イブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩
衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むか、又は −同一核酸分子を標的にし、少なくとも１種がStreptoc
occus pneumoniaeに対して特異的であり且つ請求項28
に記載のプローブのいずれか１種から選択された少なく
とも２種のプローブと、 −これらのプローブとStreptococcus pneumoniae株のD
NA及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応
を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成す
るために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むか、又は −固体支持体に固定された請求項28に記載のプローブの
いずれかから選択された少なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又はこれらのプローブ
とStreptococcus pneumoniae株のDNA及び／又はRNAと
の間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが
可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分
と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むことを特徴と
するキット。 - 【請求項３２】１種以上のStreptococcus agalactiae
株を検出するためのプローブであって、 から選択される核酸に属しており且つ15〜選択された核
酸の最大数の連続したヌクレオチドを含む配列を含むこ
とを特徴とするプローブ。 - 【請求項３３】生物学的サンプル中でStreptococcus a
galactiae株を検出するための方法であって、場合によ
りプローブの標的配列にフランキングする２種のプライ
マー、より好ましくは進化的に高保存性の２種のプライ
マーを介するポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅させ
た検出すべき株の核酸（DNA又はRNA）を必要に応じて適
切な変性条件下でハイブリダイゼーションできるように
しておいた前記生物学的サンプルを、プローブとサンプ
ル中に存在し得るStreptococcus agalactiae株の相補
的核酸との間のハイブリダイゼーションを可能にする条
件下で請求項32に記載のプローブと接触させる段階と、
特にサンプル中に存在し得るStreptococcus agalactia
e株のDNA及びRNAの両方とハイブリダイズするプローブ
との間でハイブリッドが形成された場合にこれを検出す
る段階とを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項３４】ハイブリダイゼーション媒体が、約３×
SSC（１×SSC＝0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリウ
ム、pH7.0）、約25mMのリン酸緩衝液pH7.1、20％脱イオ
ン化ホルムアミド、0.02％Ficoll、0.02％ウシ血清アル
ブミン、0.02％ポリビニルピロリドン及び約0.1mg/mlの
剪断変性サケ精子DNAを含有しており、及び／又は洗浄
媒体が、約３×SSC、25mMリン酸緩衝液pH7.1及び20％脱
イオン化ホルムアミドを含有しており、使用されるプロ
ーブが請求項32に記載のプローブのいずれかであり、ハ
イブリダイゼーション温度が約35〜45℃の範囲及び／又
は洗浄温度が約35〜45℃の範囲に適宜調節され、特に、
前記標的配列と対応する該当ハイブリダイゼーション温
度（HT）及び洗浄温度（WT）が夫々、 HT及び／又はWT:35℃、 HT及び／又はWT:45℃、 HT及び／又はWT:45℃、 HT及び／又はWT:37であることを特徴とする請求項33に
記載の生物学的サンプル中でStreptococcus agalactia
eを検出するための方法。 - 【請求項３５】生物学的サンプル中で多数の、好ましく
は全てのStreptococcus agalactiae株をin vitro検出
するためのキットであって、 −請求項32に記載のプローブのいずれかから選択された
少なくとも１種のプローブと、 −これらのプローブと多数の、好ましくは全てのStrept
ococcus agalactiae株のDNA及び／又はRNAとの間にハ
イブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩
衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むか、又は −同一核酸分子を標的にし、少なくとも１種がStreptoc
occus agalactiaeに対して特異的であり且つ請求項32
に記載のプローブのいずれか１種から選択された少なく
とも２種のプローブと、 −これらのプローブとStreptococcus agalactiae株のD
NA及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応
を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成す
るために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むか、又は −固体支持体に固定された請求項32に記載のプローブの
いずれかから選択された少なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又はこれらのプローブ
とStreptococcus agalactiae株のDNA及び／又はRNAと
の間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが
可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分
と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むことを特徴と
するキット。 - 【請求項３６】生物学的サンプル中でCampylobacter j
ejuni及びCampylobacter coli株を検出するための方法
であって、プローブの標的配列にフランキングする２種
のプライマーを介するポリメラーゼ連鎖反応を応用して
増幅させた検出すべき株の核酸（DNA又はRNA）を必要に
応じて適切な変性条件下でハイブリダイゼーションでき
るようにしておいた前記生物学的サンプルを、プローブ
とサンプル中に存在し得るCampylobacter jejuni及びC
ampylobacter coli株の相補的核酸との間のハイブリダ
イゼーションを可能にする条件下で１種以上のCampylob
acter jejuni及びCampylobacter coli株を検出するた
めのプローブであって、プローブが適切な条件でCampyl
obacter jejuni及びCampylobacter coli由来のDNA及
び／又はRNAのみとハイブリダイズし、他の生物由来のD
NA及び／又はRNAとはハイブリダイズしないという条件
下で、図10に示す16S−23SrRNAスペーサー配列から選択
される15〜最大数の連続したクレオチドの配列又はその
相補配列を含むことを特徴とするプローブと接触させる
段階と、特にサンプル中に存在し得るCampylobacter j
ejuni及びCampylobacter coli株のDNA及びRNAの両方と
ハイブリダイズするプローブとの間でハイブリッドが形
成された場合にこれを検出する段階とを含むことを特徴
とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３７】生物学的サンプル中で多数の、好ましく
は全てのCampylobacter jejuni及びCampylobacter co
li株をin vitro検出するためのキットであって、 −１種以上のCampylobacter jejuni及びCampylobacter
coli株を検出するためのプローブであって、プローブ
が適切な条件でCampylobacter jejuni及びCampylobact
er coli由来のDNA及び／又はRNAのみとハイブリダイズ
し、他の生物由来のDNA及び／又はRNAとはハイブリダイ
ズしないという条件下で、図10に示す16S−23SrRNAスペ
ーサー配列から選択される15〜最大数の連続したヌクレ
オチドの配列又はその相補配列を含むことを特徴とする
プローブのいずれかから選択された少なくとも１種のプ
ローブと、 −これらのプローブと多数、好ましくは全Campylobacte
r jejuni及びCampylobacter coli株のDNA及び／又はR
NAとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせるこ
とが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な
成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むか、又は −同一核酸分子を標的にし、少なくとも１種がCampylob
acter jejuni及びCampylobacter coliに対して特異的
であり且つ前記プローブのいずれか１種から選択された
少なくとも２種のプローブと、 −これらのプローブとCampylobacter jejuni及びCampy
lobacter coli株のDNA及び／又はRNAとの間にハイブリ
ダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝液又
は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むか、又は −固体支持体に固定された前記プローブのいずれかから
選択された少なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又はこれらのプローブ
とCampylobacter jejuni及びCampylobacter coli株の
DNA及び／又はRNAとの間にハイブリダイゼーション反応
を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成す
るために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むことを特徴と
するキット。 - 【請求項３８】検出すべき微生物に特異的な請求項３、
４、８、12、16、20、24、28及び32のいずれか一項に記
載のプローブを使用して生物学的サンプル中に含まれる
１種の微生物又は数種の微生物を同時にin vitro検出
するための方法であって、好ましくはプローブ領域にフ
ランキングする少なくとも１組のプライマーによる酵素
的増幅を使用して、生物学的サンプル中に存在する（標
的配列を含む）DNA及び／又はRNAを標識し、増幅した標
的配列と膜上のプローブとの特異的ハイブリダイゼーシ
ョンを可能にする媒体中で、１種以上のオリゴヌクレオ
チドプローブを既知の位置にドットスポットした膜に前
記生物学的サンプルを接触させ、ハイブリダイゼーショ
ンにより形成されたハイブリッドを適切な手段により検
出することを特徴とする方法。 - 【請求項３９】生物学的サンプル中に含まれる１種の微
生物又は数種の微生物を同時にin vitro検出するため
のキットであって、 −検出すべき微生物に特異的であり、膜にドットスポッ
トした請求項３、４、８、12、16、20、24、28及び32の
いずれか一項に記載のプローブの少なくとも１種と、 −該プローブの標的配列を含むDNA及び／又はRNAの酵素
的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又はこれらのプローブ
と検出すべき微生物のDNA及び／又はRNAとの間にハイブ
リダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝液
又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブ
リッドを適時検出するための手段とを含むことを特徴と
するキット。
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