JP3122762B2 - ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素、アミノ酸配列、遺伝子塩基配列 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、グルコース−６−
リン酸より２−デオキシ−シロ−イノソース（２−Ｄｅ
ｏｘｙ−ｓｃｙｌｌｏ−ｉｎｏｓｏｓｅ）を合成する反
応を触媒する、２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵
素、当該酵素のアミノ酸配列、及びアミノ酸配列をコー
ド化する遺伝子塩基配列に関する。

【０００２】

【従来の技術】２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯ
Ｉ）合成酵素は、グルコース−６−リン酸（Ｇ−６−
Ｐ）を基質として、２−デオキシ−シロ−イノソース
（ＤＯＩ）を合成する反応を触媒する環化酵素である
（図１）。ＤＯＩ合成酵素は２−デオキシストレプタミ
ンをアグリコンとして含有するアミノグリコシド抗生物
質の生合成に関与する酵素であり、その生成物であるＤ
ＯＩは、医薬原料や化学工業資源として有用な物質であ
る。これまでＤＯＩを合成する方法は多段階の反応と有
害又は高価な金属を使用する方法があるのみで、短工程
の方法はこれまで知られていなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ＤＯＩ合成酵素の特性
を考えると、当該酵素を他の微生物に導入する事によ
り、多量に存在しているグルコースを原料として、有用
資源であるＤＯＩを効率的に、短工程で生産できる可能
性がある。これまで、ＤＯＩ合成酵素について、その存
在は予想されていたものの、実態は明らかではなく、当
該酵素の性質は明らかにされていなかった。また、当該
酵素の単離、精製は成功しておらず、産業上利用するに
は至らなかった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで、ＤＯＩ合成酵素
を産業上利用する手段を得る目的で、本発明者らは土壌
より分離した細菌バチルスサーキュランスＳＡＮＫ７２
０７３よりＤＯＩ合成酵素を精製し、その酵素の特性を
明らかにした。更に、当該酵素のアミノ酸配列及びアミ
ノ酸配列をコード化する遺伝子の塩基配列を初めて明ら
かにした。更にＤＯＩ合成酵素を大腸菌に発現させて、
組み換えＤＯＩ合成酵素の性質を明らかにした。

【０００５】

【実施例】（細菌の培養）ブチロシン生産菌バチルスサ
ーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＳＡＮＫ７２
０７３の懸濁液を、栄養グリセロール培地（１％肉エキ
ス、１％ペプトン、０．５％ＮａＣｌ、１％グリセロー
ル）中で培養した。６６０ｎｍにおけるＯＤが７．０−
９．０になるまで、２８℃においてロータリーシェーカ
ー上で前培養を行った。前培養を行った一部を採取し
て、ＯＤが８．０−９．０になるまで更に培養を行っ
た。遠心分離（６０００ｇ、３０分、４℃）を行って細
胞を回収し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー溶
液（ｐＨ７．７）で洗浄した（６０００ｇ、３０分、４
℃）。

【０００６】（ＤＯＩ合成酵素の精製）回収したＢ．ｃ
ｉｒｃｕｌａｎｓ細胞（湿重量で８０ｇ）を、５０μＭ
ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌ
ｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）と５０μＭ ＥＤＴＡを含む
２４０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー中に懸濁し、
氷浴中０℃において、ブランソンソニファイアー２５０
型でソニケーションを行った。ソニケーションの後、６
０００ｇで３０分間遠心分離を行い、上清について定法
により硫酸アンモニウム（硫安）沈殿を行った。４０−
７０％飽和の硫安沈殿で得られた沈殿物につき、５０μ
Ｍ ＰＭＳＦと５０μＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．７）中で４℃で一
晩透析を行った。透析物を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
バッファー（ｐＨ７．７）で平衡化したＤＥＡＥセルロ
ファインＡ−８００カラム（チッソ）に流し込み、カラ
ムに吸着したタンパク質を０Ｍ（３００ｍｌ）から０．
４Ｍ（３００ｍｌ）のＮａＣｌ濃度勾配により溶出し
た。ＤＯＩ合成酵素活性は、ＮａＣｌ濃度が０．２Ｍ付
近で検出された。

【０００７】活性画分をセントリプレップ−１０（アミ
コン）で１０ｍｌまで濃縮し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌバッファー（ｐＨ７．７）で平衡化した、ＴＳＫ−
ｇｅｌ ＡＦ−Ｂｌｕｅ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０
ＭＬ（トーソー）に濃縮サンプルを流し込んだ。吸着し
たタンパク質を、１ＭのＮａＣｌを含む同様のバッファ
ーで溶出した。活性画分を同様に２ｍｌまで濃縮して、
０．１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
バッファー（ｐＨ７．７）で平衡化したＨｉＬｏａｄ
２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ＦＰＬ
Ｃ）に、濃縮サンプルを流し込んだ。活性画分を同様に
２ｍｌまで濃縮して、０．１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．７）で平衡
化したＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ１０／１０（ＦＰＬＣ）に、
濃縮サンプルを流し込んだ。吸着したタンパク質は、Ｎ
ａＣｌ濃度０．１３Ｍから０．１６Ｍにおいて溶出され
た。酵素活性は、ＮａＣｌ濃度０．１４Ｍにおいて検出
された。図２に、ＤＯＩ合成酵素の精製の各段階におけ
るＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）のパターンを示す。レーン１は精製前の細胞抽
出液、レーン２は硫安沈殿後、レーン３はＤＥＡＥ精製
後、レーン４はＴＳＫ−ｇｅｌ ＡＦ−Ｂｌｕｅ Ｔｏ
ｙｏｐｅａｒｌ ６５０ＭＬ精製後、レーン５はＳｕｐ
ｅｒｄｅｘ２００精製後、レーン６はＭｏｎｏＱ精製
後、レーン７は分子量マーカーを示す。また、表１にＤ
ＯＩ精製の各段階における精製率を示す。

【０００８】

【表１】 Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来のＤＯＩの
精製 段階 総タンパク量 総活性 比活性^b)精製ファクター^b)回収率^b) (mg) (U) (U/mg) (%) 抽出物 5516 n.d. ^a) n.d. ^a) n.d.^a) n.d. ^a) 40-70% 2431 n.d. ^a) n.d. ^a) n.d. ^a) n.d. ^a) (NH₄)₂SO₄ DEAE 817 99.7 0.122 1 100 Blue^C) 119 42.4 0.356 2.87 42.5 Sephadex 200 9.787 60.8 6.23 51.1 61.0 Mono Q 0.778 14.1 18.1 148 14.1 ａ）未決定 ｂ）ＤＥＡＥクロマトグラフィーの後に計算した ｃ）ＴＳＫ−ｇｅｌ ＡＦ−Ｂｌｕｅ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０ＭＬ

【０００９】（ＤＯＩ合成酵素の分子量の決定）精製に
より得られた酵素の分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解
析したところ、４２ｋＤａと２３ｋＤａの二つのペプチ
ドが検出された（図２、レーン７）。一方、ネイティブ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡ
ＧＥ）を行ったところ単一のバンドが検出された（図
３）。更に、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＴＳＫ−ｇ
ｅｌ Ｇ３０００ＳＷ）を行ったところ、未変性条件下
では単一のバンドとして検出されたが、０．１％ＳＤＳ
を含有する変性条件下では二つのペプチドに分離して検
出され、等電点クロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ ＰＨＲ
５／２０）を行ったところ、単一のバンドが検出され
た。以上の結果は、得られた酵素は４２ｋＤａと２３ｋ
Ｄａのペプチドより成る、６５ｋＤａの二量体タンパク
質である事を示している。

【００１０】（ＤＯＩ合成酵素活性の測定）２−デオキ
シ−シロ−イノソース（ＤＯＩ）合成酵素活性は、ＨＰ
ＬＣ法を用いて検出した。一定量の酵素溶液（７０μ
ｌ）を、５ｍＭ Ｇ−６−Ｐ、５ｍＭＮＡＤ⁺ 及び５ｍ
Ｍ ＣｏＣｌ₂ を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．７、最終容量１００μｌ）と混合し、４６℃で一
時間インキュベートした。１００μｌのメタノールを添
加して、反応を停止した。得られた混合液に、塩酸Ｏ−
（４−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミン（ＮＢＨ
Ａ）のピリジン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌ添加し
て、オキシム誘導体を生成させた。溶液全体を６０℃で
一時間加熱した後、空気を流し込んで溶媒を除去した。
残査を２ｍｌのクロロフォルムとメタノールの混合液
（２０：１）に溶解し、Ｓｅｐ−Ｐａｋプラスシリカに
流し込んだ。ＤＯＩのＯ−（４−ニトロベンジル）オキ
シム誘導体を、クロロフォルムとメタノールの混合液
（５：１）により溶出した。溶出液をエバポレートし
て、残査を１００μｌのメタノールに溶解した。溶液の
一部（５μｌ）をＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ
ＣＴＲカラム（東ソー）に注入して、２６２ｎｍにおけ
る紫外線吸収を測定した。ＤＯＩのＯ−（４−ニトロベ
ンジル）オキシム誘導体の量を、標準曲線法により定量
した。酵素活性の１ユニットは、１分間に１ｎｍｏｌの
ＤＯＩを生成すると定義した。

【００１１】（ＤＯＩ合成酵素の性質）ＤＯＩ合成酵素
活性に及ぼすｐＨの影響を検討したところ、ｐＨ７．５
から８．５にかけて最大活性が検出された（図４）。Ｎ
ＡＤ⁺ 及びコバルトイオンの存在下における温度の影響
を検討したところ、ＤＯＩ合成酵素は４６℃において最
大活性を示した（図５）。一方、ＮＡＤ⁺ 及びコバルト
イオンの非存在下では４６℃において活性が失われ、Ｎ
ＡＤ⁺ 及びコバルトイオンは酵素反応に用いられるのみ
ならず、ＤＯＩ合成酵素の安定化に作用しているものと
思われる。更に、種々の二価金属イオンが、ＤＯＩ合成
酵素活性に及ぼす影響を検討した（表２）。ＥＤＴＡの
存在下においては酵素活性が認められなかった事より、
金属イオンの存在はＤＯＩ合成酵素反応に必須であると
思われる。また、コバルトイオンは最も酵素活性を高め
る作用を有したが、マグネシウム、カルシウム、マンガ
ンイオンは酵素活性に影響を与えなかった。一方、銅、
亜鉛イオンは酵素活性を低下させた。

【００１２】

【表２】 二価金属イオンがＤＯＩ合成酵素活性に及
ぼす影響 添加イオン Vmax 添加イオン Vmax なし 0.353 Co²⁺ 1 Mg²⁺ 0.398 Ni²⁺ 0.163 Ca²⁺ 0.367 Cu²⁺ 0 Mn²⁺ 0.376 Zn²⁺ 0 Fe²⁺ 0.099 EDTA 0

【００１３】（ＤＯＩ合成酵素の反応速度論）反応速度
論の解析に先立ち、ＤＯＩ合成酵素反応の経時変化を検
討したところ、反応開始より２時間後に反応速度は低下
した。そこで、反応速度論解析においては反応開始後１
時間で反応を停止した。酵素反応の速度定数（Ｋ_cat 値
及びＫ _m 値）を、ＤＯＩ合成反応の初期速度よりライン
ウェーバーバークプロットを行う事により求めた。その
結果、４６℃、ｐＨ７．７におけるＧ−６−Ｐに対する
Ｋ_m 値は９．０Ｘ１０^-4Ｍ、ＮＡＤに対するＫ_m 値は
１．７Ｘ１０^-4Ｍであり、Ｋ_cat 値は７．３Ｘ１０^-2ｓ
^-1、そしてＫ_cat ／Ｋ_m は８２Ｍ^-1ｓ^-1であった。

【００１４】（ＤＯＩ合成酵素Ｎ末端アミノ酸配列の決
定）Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓより精製されたＤＯＩ合成
酵素の４２ｋＤａと２３ｋＤａのサブユニットを、１
２．５％のトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離を行っ
た。電気泳動を行った後、エレクトロブロッティングに
より、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜へ転写した。ク
マシーブリリアントブルーにより染色を行って二つのバ
ンドを切り取り、ペプチドシークエンサー（島津、ＰＰ
ＳＱ−２１）により配列決定を行った。

【００１５】（ＤＯＩ合成酵素遺伝子のクローニング）
決定されたＮ末端アミノ酸配列の一部分（ＦＮＦＡＦＧ
ＥＨＶ）に基づき、４０ｋＡ（５’−ＴＴＹＧＣＮＴＴ
ＹＧＧＮＧＡＲＣＡＹＧＴ−３’）と４０ｋＢ（５’−
ＴＣＮＣＣＲＡＡＮＧＣＲＡＡＲＴＴＲＡＡ−３’）の
オリゴヌクレオチドを設計して合成して、３’末端をＤ
ＩＧ（ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ）でラベルし
た。Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓの染色体ＤＮＡを制限酵素
により切断し、得られた加水分解物をアガロースゲル電
気泳動で分離を行い、ＤＮＡ断片をブロッティング膜
（ゼータプローブＧＴゲノミックテスティッドブロッテ
ィング膜 バイオラッド）に転写した。ハイブリダイゼ
ーションは、キットの標準プロトコールに従って行っ
た。オリゴヌクレオチド（２０ｍｅｒ）については５０
℃、より長いサイズのＤＮＡについては６５℃でハイブ
リダイゼーションを行った。オリゴヌクレオチドについ
ては２ＸＳＳＣで５０℃、大きなサイズのＤＮＡについ
ては１ＸＳＳＣで６５℃で、洗浄を行った。ハイブリダ
イズしたバンドは、ＤＩＧ蛍光検出キット（ベーリンガ
ーマンハイム）で検出した。

【００１６】両者のプローブとハイブリダイズしたＤＮ
Ａ断片の中で、染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで分解して得
られた４．２ｋｂｐの断片を選択し、ｐＵＣ１９と結合
させた。得られたプラスミドを用いて、大腸菌ＪＭ１０
５の形質転換を行った。形質転換体を、アンピシリン
（５０μｇ／ｍｌ）、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド（ＩＰＴＧ）（２００μｇ／ｍｌ）及び
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド（４０μｇ／ｍｌ）を含むＬｕｒｉａ
−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天培地で選択を行った。形
質転換体をハイボンド−Ｎ＋膜（アマシャム）に転写し
て、可溶化し、ＤＮＡを固定した。同じＤＩＧプローブ
を用いてコロニーハイブリダイゼーションをして、更に
スクリーニングを行った。

【００１７】（ＤＯＩ合成酵素遺伝子の塩基配列の決
定）その結果、陽性クローンであるｐＤＳ１が得られ、
その塩基配列を決定した。。ｐＤＳ１の、種々の制限酵
素断片の塩基配列を、サーモシークエナーゼサイクルシ
ークエンシングキット（アマシャム）、Ｍ１３順方向プ
ライマー、Ｍ１３逆方向プライマー（アマシャム）、及
びＤＮＡシークエンサー（Ｌｉ−ｃｏｒ４２００型）を
用いて、ジデオキシヌクレオチド法により決定した。両
鎖の全配列は、ＤＮＡを用いて決定した。ＤＮＡ配列は
ＧＥＮＥＴＹＸプログラム（ソフトウェアディベロップ
メント）により解析し、３つの読み枠が存在することが
判った。ネット上においてＢＬＡＳＴ及びＦＥＳＴＡソ
フトウェアを用いて、ＥＭＢＬ、ジーンバンク又はＳＷ
ＩＳＳＰＲＯＴデータライブラリーに対して相同性検索
を行った。その結果、ｐＤＳ１がコード化する推定アミ
ノ酸配列には、上述したＤＯＩ合成酵素のＮ末端アミノ
酸配列と完全に一致する部分が含まれていた。しかし、
ｐＤＳ１には４２ｋＤａサブユニットをコード化する遺
伝子の一部しか含まれていなかった。

【００１８】そこで、ＤＩＧラベルしたｐＤＳ１のＢａ
ｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、全体の遺伝子を拾うプロー
ブとして設計した。そのプローブを用いて同様のサザン
ハイブリダイゼーションを行った結果、４．０ｋｂｐの
ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片（ｐＤＳ２）が同定され、ｐ
ＵＣ１９と結合させて、得られた形質転換体について同
様のプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーショ
ンでスクリーニングを行った。その結果ｐＤＳ２を同定
することができ、その塩基配列をｐＤＳ１と同じ方法で
決定した。そのようにして、ｐＤＳ２にはＤＯＩ合成酵
素の配列番号１に示す４２ｋＤａサブユニット遺伝子の
全体が含まれていると、分子サイズから推定された。Ｄ
ＯＩ合成酵素遺伝子の配列より、当該遺伝子は３６８ア
ミノ酸より成る、分子量４０７４６Ｄａのポリペプチド
（配列番号２）をコード化していることが判った。

【００１９】（ＤＯＩ合成酵素遺伝子の発現）ＤＯＩ合
成酵素遺伝子の機能を確認するために、当該遺伝子の大
量発現を試みた。ｐＤＳ２をテンプレートとして、４０
ｋｆ（５’−ＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＡＣ
ＧＡＣＴＡＡ−３’）及び４０ｋｒ（５’−ＡＡＡＧＣ
ＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＴＧＧＴＴＣＡＴＣＣ−３’）
（アマシャムファルマシア）をプライマーとして用い
て、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ＤＯＩ合
成酵素遺伝子を増幅した。ＰＣＲは、ＵＩＴｍａ ＤＮ
Ａポリメラーゼ（ロッシュ）を用いて、遺伝子増幅ＰＣ
Ｒシステム９７００（パーキンエルマー、アプライトバ
イオサイエンス）により行った。５０μｇのｐＤＳ２
ＤＮＡ、６０ｐｍｏｌの両プライマー及び０．２５ｍＭ
のｄＮＴＰｓを、インキュベーションバッファー中に添
加して、反応（１００μｌ）を行った。ＰＣＲは、９５
℃で１分間最初に変性を行った後に酵素を添加して、引
き続き９５℃で３０秒間、６０℃で４５秒間、７２℃で
３０秒間を３０サイクル行い、更に７２℃で７分間反応
する事により行った。ＰＣＲにより増幅された生成物を
ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより分解して、更にｐ
ＵＣ１９の適切な部位中へクローン化して、得られたｐ
ＤＳ３を単離した。

【００２０】ｐＤＳ３の塩基配列を決定した後、Ｎｄｅ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩで分解する事により、挿入したＤＮ
Ａをプラスミドから切り離して、発現ベクターｐＥＴ３
０ｂ（＋）のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトへ結合し
た。得られたｐＤＳ４により、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）を形質転換した。ｐＤＳ４を含む形質転換体を、６
００ｎｍにおけるＯＤが０．６に達するまで、３７℃で
前培養して、その一部分を培養培地に接種した。６００
ｎｍにおけるＯＤが０．６に達するまで３７℃で震盪培
養を行い、ＩＰＴＧを添加して（最終濃度０．４ｍ
Ｍ）、培養を更に２−３時間続けた。遠心分離（４００
０ｇ、１０分、４℃）により細胞を回収して、０．２ｍ
Ｍ ＣｏＣｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッ
ファー（ｐＨ７．７）で洗浄した。大腸菌（ｐＤＳ４）
中において発現したＤＯＩ合成酵素（組み換えＤＯＩ合
成酵素）は全可溶性タンパク質の２０％にも達した。図
６はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のパターン
であり、レーン１は分子量マーカー、レーン２はｐＥＴ
３０ｂを含む大腸菌抽出物、レーン３はＩＰＴＧ誘導後
のｐＥＴ３０ｂを含む大腸菌抽出物、レーン４はｐＤＳ
４を含む大腸菌抽出物、レーン５はＩＰＴＧ誘導後のｐ
ＤＳ４を含む大腸菌抽出物、レーン６はＢ．ｃｉｒｃｕ
ｌａｎｓ由来の天然ＤＯＩ合成酵素である。

【００２１】（組み換えＤＯＩ合成酵素の活性確認）ｐ
ＤＳ４により形質転換した大腸菌を０．２ｍＭ ＣｏＣ
ｌ₂ を含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ
７．７）に懸濁して（１５０ｍｌ中に、湿細胞５ｇ）、
氷冷下（０℃）ブランソンソニファイアー２５０型によ
り細胞破砕（２分間、１０回）を行った。細胞破砕の後
に遠心分離（１２０００ｇ、３０分）を行い、上清を採
種して無細胞系の酵素反応に使用した。５ｍｌの無細胞
抽出液に、基質としてグルコース６−リン酸又は［６，
６− ²Ｈ₂ ］−グルコース６−リン酸、５ｍＭのＮＡＤ
⁺ 及び５ｍＭのＣｏ²⁺を添加して、４６℃で２時間イン
キュベートして酵素反応を行った。反応生成物のＯ−
（４−ニトロベンジル）オキシム誘導体化を行い、薄層
クロマトグラフィーにより精製した（メルク、キーゼル
ゲルＦ₂₅₄ ）。８．４ｍｇのグルコース６−リン酸よ
り、予期した反応産物である、約３ｍｇのＤＯＩのＯ−
（４−ニトロベンジル）オキシム誘導体が得られた。生
成物について¹ Ｈ−ＮＭＲ及び² Ｈ−ＮＭＲスペクトル
により確認を行った。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｃ
Ｄ₃ ＯＤ）δ：１．９０（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，１３．
８Ｈｚ，Ｈ−２ａｘ）、３．１９（ｔ，Ｊ＝８．８Ｈ
ｚ，Ｈ−４）、３．５１（ｄｄ，Ｊ＝４．９，１３．８
Ｈｚ，Ｈ−２ｅｑ）、３．３−３．４（Ｈ−３、Ｈ−
５）、４．０３（ｄ，９．０Ｈｚ，Ｈ−６）、５．２５
（ｓ）、７．５８（ｄ，８．５Ｈｚ）、８．２１（ｄ，
８．５Ｈｚ）。［６，６− ²Ｈ ₂ ］−グルコース６−リ
ン酸由来のＤＯＩ生成物の類似の誘導体の² Ｈ−ＮＭＲ
（６１．４ＭＨｚ，ＣＨ₃ ＯＨ）δ：１．８２、３．４
６。これらの結果より予期した反応生成物が確認され、
２３ｋＤａサブユニットの非存在下においても大腸菌発
現産物はＤＯＩ合成酵素反応を触媒し、得られたタンパ
ク質は組み換えＤＯＩ合成酵素である事が証明された。

【００２２】（組み換えＤＯＩ合成酵素の精製）精製し
ている間、ＤＯＩ合成酵素は硫安沈殿及び透析の条件
下、凝集する傾向を示した。また、コバルトイオンの非
存在下で５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー中におい
て貯蔵した場合には短期間の貯蔵であっても酵素活性は
消失した。これらの結果は、組み換えＤＯＩ合成酵素は
天然の酵素と比較して、タンパク質安定性という点にお
いて異なっている。そこで、組み換え２−ＤＯＩ合成酵
素の場合には、下記に示す、天然酵素と異なる精製方法
を用いた。組み換え２−ＤＯＩ合成酵素は、０．２ｍＭ
ＣｏＣｌ₂ を含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ
ー（ｐＨ７．７）中において取り扱った。４℃又−７５
℃で貯蔵した場合でさえも、１０日間貯蔵した後には精
製した酵素の約６０％が失活した。

【００２３】無細胞系抽出溶液を、０．２ｍＭ ＣｏＣ
ｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐ
Ｈ７．７）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムにかけた。吸着したタンパ
ク質を０Ｍ ＮａＣｌ（３００ｍｌ）から０．４Ｍ Ｎ
ａＣｌ（３００ｍｌ）のリニアグラジエントにより溶出
した。ＤＯＩ合成酵素活性は、０．２ＭのＮａＣｌ画分
付近で検出された。活性画分をセントリプレップ−１０
（アミコン）により１０ｍｌまで濃縮した。濃縮液を
０．１Ｍ ＮａＣｌと０．２ｍＭ ＣｏＣｌ₂ を含む５
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．７）で平
衡化したＨｉＬｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２０
０ｐｇ（ＦＰＬＣ）にかけて、同様に活性画分を得た。
図６のレーン７は組み換えＤＯＩ合成酵素はＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動のパターンであり、４２ｋ
Ｄａの単一のバンドを示した。表３に組み換えＤＯＩ精
製の各段階における精製率を示す。

【００２４】

【表３】 組み換えＤＯＩ合成酵素の精製 段階 総タンパク量 総活性 比活性 精製ファクター 回収率 (mg) (U) (U/mg) (%) 抽出物 364 65.0 0.179 - - DEAE 84.7 57.4 0.678 3.8 88.3 Sephadex 200 45.9 49.1 1.07 6.0 75.5

【００２５】（組み換えＤＯＩ合成酵素の性質）ｐＨ、
添加する金属イオン又は温度に対する、組み換えＤＯＩ
合成酵素の活性の特性を検討した。ｐＨ６．５から８．
０については５０ｍＭのＭＯＰＳ−ＫＯＨバッファー、
ｐＨ７．０−９．０についてはＴｒｉｓ−ＨＣｌバッフ
ァーを用いて検討した。組み換えＤＯＩ合成酵素の活性
は、天然ＤＯＩ合成酵素で用いたＨＰＬＣ法にを改変し
て測定した。１μｌの酵素調製液を、１０μｌの５０ｍ
Ｍグルコース６−リン酸、１０μｌの５０ｍＭ ＮＡＤ
⁺ 及び７９μｌの０．２ｍＭ ＣｏＣｌ₂ を含む５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．７、最終反応
量１００μｌ、グルコース６−リン酸及びＮＡＤ⁺ の最
終濃度５ｍＭ）と混合して、４６℃で５分間インキュベ
ートを行った。その後は、前に述べたＨＰＬＣ法によ
り，酵素活性を測定した。組み換えＤＯＩ合成酵素の酵
素反応に及ぼすｐＨの影響を、図７に示す。図７より、
最大活性は、ｐＨ７．５から８．５の間で認められた。
図７において、四角の点はＭＯＰＳ−ＫＯＨバッファ
ー、丸の点はＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファーを用いて検討
した結果を示す。

【００２６】酵素反応の温度条件及び温度安定性につい
て検討を行った。至適な反応温度条件については、１５
℃から５５℃の間で酵素反応を行う事により検討した。
図８の四角の点に示すように、５分間の酵素反応では、
ＮＡＤ⁺ 及びＣｏ²⁺を含む条件下では、５５℃付近で最
大活性が認められた。２０℃から６０℃で５分間処理し
た後に残った酵素活性を測定する事により温度安定性を
検討したところ、図８の丸の点で示すように、５０℃以
上では酵素活性が低下した。組み換えＤＯＩ合成酵素
は、５０℃以上で変性してしまうものと思われる。更
に、二価金属イオン要求性について、１ｍＭのコバル
ト、マグネシウム、マンガン、銅、鉄、カルシウム、亜
鉛及びニッケルイオンの存在下で解析を行った（表
４）。コバルトイオンの存在は組み換えＤＯＩ合成酵素
にとって必須であり、前に述べた様に、コバルトイオン
の非存在下においては組み換えＤＯＩ合成酵素を精製す
る事はできなかった。また、ＥＤＴＡの存在下において
は、酵素活性は消失した。マグネシウム、カルシウム、
マンガン及び鉄は酵素活性を促進も抑制も行わなかった
が、銅及び亜鉛は酵素活性を強力に抑制した。

【００２７】

【表４】 二価金属イオンが組み換えＤＯＩ合成酵素に
及ぼす影響 添加イオン 相対的Vmax 添加イオン 相対的Vmax なし 1.00 Co²⁺ 1 Mg²⁺ 1.06 Ni 0.79 Ca²⁺ 0.87 Cu 0.43 Mn²⁺ 0.93 Zn 0.05 Fe²⁺ 0.93 EDTA 0

【００２８】（組み換えＤＯＩ合成酵素の反応速度論）
２μＭの組み換えＤＯＩ合成酵素を用いて、酵素反応の
経時変化を検討した。その結果、反応開始後３０分間は
一定の初速度を示した。反応開始後５分で反応を止め
て、ＤＯＩ合成反応の初期速度よりラインウェーバーバ
ークプロットを行う事により、酵素反応の速度定数（Ｋ
_cat 値及びＫ_m 値）を求めた。その結果、４６℃、ｐＨ
７．７におけるグルコース−６−リン酸に対するＫ_m 値
は２．１Ｘ１０^-4Ｍ、Ｋ_cat 値は１．０ｓ^-1であり、Ｋ
_cat ／Ｋ_m は４．８Ｘ１０³ Ｍ^-1ｓ ^-1であった。また、
ＮＡＤに対するＫ_m 値は２．３Ｘ１０^-5Ｍであった。

【００２９】

【発明の効果】本発明により、グルコース−６−リン酸
より２−デオキシ−シロ−イノソースを合成する反応を
触媒する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が精
製されて、当該酵素のアミノ酸配列、及びアミノ酸配列
をコード化する遺伝子塩基配列が与えられた。

【００３０】

【配列表】 ＜１１０＞出願人氏名：東京工業大学長 ＜１２０＞発明の名称：２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素、アミノ酸配 列、遺伝子塩基配列 ＜１６０＞配列の数：２ ＜２１０＞配列番号：１ ＜２１１＞配列の長さ：１１０７ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：Bacillus circulans SANK72073 ２−デオキシ−シロ−イノソ ース合成酵素 ４２ｋＤａサブユニット ＜４００＞配列 ATGACGACTA AACAAATTTG TTTTGCGGAC CGGTGTTTTA ACTTTGCATT CGGCGAACAT 60 GTTTTGGAAT CGGTTGAATC CTATATTCCC CGGGATGAAT TCGATCAATA TATCATGATT 120 TCGGACTCGG GGGTACCGGA CTCGATTGTT CATTATGCGG CCGAATACTT CGGCAAACTC 180 GCCCCTGTAC ATATTCTTCG CTTTCAGGGC GGAGAAGAAT ACAAAACACT TTCAACCGTG 240 ACAAATTTGC AAGAGCGGGC AATTGCTCTG GGAGCCAACC GAAGAACCGC TATCGTAGCG 300 GTTGGCGGAG GGTTAACCGG AAACGTTGCC GGAGTGGCGG CCGGCATGAT GTTTCGCGGG 360 ATTGCGCTTA TTCACGTTCC GACCACGTTT TTGGCGGCCT CCGATTCGGT TCTTTCGATT 420 AAGCAGGCTG TTAATTTAAC GAGCGGAAAG AACCTGGTCG GCTTTTATTA TCCGCCACGC 480 TTCGTGTTCG CCGATACCCG AATCTTGTCG GAGTCGCCGC CCCGTCAGGT GAAAGCGGGA 540 ATGTGCGAGC TGGTAAAAAA TATGCTGATT CTGGAAAACG ACAACAAGGA ATTTACAGAG 600 GATGATTTAA ATTCAGCCAA TGTGTATTCT CCGAAGCAGC TGGAGACGTT TATCAACTTC 660 TGCATATCGG CCAAAATGTC GGTATTAAGC GAAGATATTT ACGAGAAAAA GAAGGGCCTG 720 ATCTTTGAGT ACGGCCATAC GATCGGTCAT GCGATCGAGC TTGCCGAGCA GGGAGGGATC 780 ACGCACGGAG AAGCCATTGC AGTGGGCATG ATTTACGCCG CTAAAATAGC GAACCGGATG 840 AACCTGATGC CCGAACATGA CGTGTCCGCC CATTACTGGC TTTTAAATAA AATCGGGGCC 900 TTGCAGGATA TTCCGCTCAA ATCGGACCCG GATTCGATCT TCCATTATTT AATCCACGAT 960 AACAAGAGGG GCTACATTAA GCTGGATGAG GATAATTTGG GTATGATTTT ACTTAGCGGA1020 GTCGGTAAAC CGGCGATGTA TAACCAAACG CTGCTTACAC CGGTCAGAAA AACGCTCATA1080 AAAGAAGTGA TCCGGGAAGG GCTGTAA 1107 ＜２１０＞配列番号：２ ＜２１１＞配列の長さ：３６８ ＜２１２＞配列の型：アミノ酸 ＜２１３＞起源：Bacillus circulans SANK72073 ２−デオキシ−シロ−イノソ ース合成酵素 ４２ｋＤａサブユニット ＜４００＞配列 MTTKQICFAD RCFNFAFGEH VLESVESYIP RDEFDQYIMI SDSGVPDSIV HYAAEYFGKL 60 APVHILRFQG GEEYKTLSTV TNLQERAIAL GANRRTAIVA VGGGLTGNVA GVAAGMMFRG 120 IALIHVPTTF LAASDSVLSI KQAVNLTSGK NLVGFYYPPR FVFADTRILS ESPPRQVKAG 180 MCELVKNMLI LENDNKEFTE DDLNSANVYS PKQLETFINF CISAKMSVLS EDIYEKKKGL 240 IFEYGHTIGH AIELAEQGGI THGEAIAVGM IYAAKIANRM NLMPEHDVSA HYWLLNKIGA 300 LQDIPLKSDP DSIFHYLIHD NKRGYIKLDE DNLGMILLSG VGKPAMYNQT LLTPVRKTLI 360 KEVIREGL 368

【図面の簡単な説明】

【図１】２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素によ
り触媒される反応。

【図２】精製した２−デオキシ−シロ−イノソース合成
酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥのパターン。

【図３】精製した２−デオキシ−シロ−イノソース合成
酵素のｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥのパターン。

【図４】２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素活性
に及ぼす、ｐＨの影響。

【図５】２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素活性
に及ぼす、温度の影響。

【図６】ｐＥＴ３０ｂ及びｐＤＳ４を含む大腸菌抽出物
の、ＩＰＴＧ誘導前後のＳＤＳ−ＰＡＧＥのパターン、
及び精製した、天然及び組み換え２−デオキシ−シロ−
イノソース合成酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥのパターン。

【図７】組み換え２−デオキシ−シロ−イノソース合成
酵素活性に及ぼす、ｐＨの影響。

【図８】組み換え２−デオキシ−シロ−イノソース合成
酵素活性に及ぼす、温度の影響。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡＳ ＯＮＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の性質を有する２−デオキシ−シロ
   −イノソース合成酵素： （１）グルコース−６−リン酸より２−デオキシ−シロ
   −イノソースを生成する反応を触媒し； （２）４２ｋＤａと２３ｋＤａのペプチドより成る二量
   体タンパク質であり； （３）コバルトイオンの存在下において酵素活性が促進
   され； （４）鉄、亜鉛、銅イオンの存在下において酵素活性が
   抑制され； （５）ＮＡＤ⁺ を補酵素として反応を行う。
2. 【請求項２】 以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配
   列からなることを特徴とする、遺伝子。 （ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基番号１−１１０
   ７で示される塩基配列からなることを特徴とする、遺伝
   子。 （ｂ）２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素活性を
   有するポリペプチドをコードし、（ａ）の一部が欠失、
   置換若しくは付加された、遺伝子。
3. 【請求項３】 バチルスサーキュランスＳＡＮＫ７２０
   ７３の２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素４２ｋ
   Ｄａサブユニットを暗号化する、請求項２記載の遺伝
   子。
4. 【請求項４】 以下の（ｃ）または（ｄ）に示すアミノ
   酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。 （ｃ）配列表の配列番号２に示す、アミノ酸番号１−３
   ６８で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とす
   る、ポリペプチド。 （ｄ）２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素活性を
   有し、（ｃ）の一部が欠失、置換若しくは付加された、
   ポリペプチド。
5. 【請求項５】 バチルスサーキュランスＳＡＮＫ７２０
   ７３の２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素４２ｋ
   Ｄａサブユニットに由来する、請求項４記載のポリペプ
   チド。
6. 【請求項６】 グルコース−６−リン酸を原料として、
   請求項１記載の２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵
   素を用いた触媒反応により２−デオキシ−シロ−イノソ
   ースを製造する、製造方法。
7. 【請求項７】 請求項２記載の遺伝子を挿入した、大腸
   菌形質転換体。
8. 【請求項８】 請求項２記載の遺伝子を大腸菌内で発現
   させる事により得られる、組み換え２−デオキシ−シロ
   −イノソース合成酵素。
9. 【請求項９】 グルコース−６−リン酸を原料として、
   請求項８記載の組み換え２−デオキシ−シロ−イノソー
   ス合成酵素を用いた触媒反応により２−デオキシ−シロ
   −イノソースを製造する、製造方法。