JP3133336B2

JP3133336B2 - 殺菌組成物における改善および殺菌組成物に関する改善

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Publication number: JP3133336B2
Application number: JP06504251A
Authority: JP
Inventors: ラボーン，ケネス・レスリー; ハツク，ジーヤ
Original assignee: ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ
Priority date: 1992-07-22
Filing date: 1993-07-14
Publication date: 2001-02-05
Anticipated expiration: 2016-02-05
Also published as: CA2140896A1; CZ14595A3; JPH07509236A; HU9500176D0; BR9306767A; WO1994002022A1; PL307168A1; ES2130276T3; HUT70688A; DE69324015D1; TW272114B; PL173758B1; AU4577493A; DE69324015T2; KR950702386A; SK6495A3; KR100252797B1; CN1086255A; EP0652709A1; EP0652709B1

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は（特に表面上用）殺菌組成物、すなわち微生
物、特に表面に付着した微生物を破壊または不活性化し
得る組成物に関する。

発明の要約本発明はその広い面において、微生物を光力学的に不
活性化し得る染料を含む表面殺菌組成物を提供する。

露光によって一重項酸素を発生する染料を使用するこ
とが好ましい。光エネルギーの吸収によって、染料分子
はその電子的基底状態（S₀）（電子スピンは対で、磁場
中において１つのエネルギーレベルを有している、分光
学的用語では一重項状態である）からより高エネルギー
状態または励起状態（S₁ ^＊）に転換される。

励起状態は短命であり、いくらかの経路、すなわち蛍
光としての光量子の放出、エネルギーの熱への崩壊とし
ての内部転換、異なった物質の分子との衝突（蛍光の消
光）によってエネルギーを失い基底状態に戻り得る。

短命の一重項状態はまた、長命の励起状態である三重
項状態（高エネルギーレベルの電子がより低エネルギー
レベルの電子と、もはやスピン対でいることができなく
なり、励起状態は磁場の中で３つのエネルギーレベルを
有するのでこの状態は「三重項」と呼ばれる）と系内交
差と呼ばれる過程を経ることもできる。

電子的励起一重項状態に進められた酸素原子にエネル
ギーが移されるので、励起三重項状態と基底状態の（通
常は三重項状態で存在する）酸素分子の相互作用により
染料の基底状態が再発生する。このことは、理想環境に
おいては、単一の光増感剤分子が何度もその濃度の一重
項酸素を発生し得ることを意味する。

一重項酸素原子は非常に反応性であり、このルートを
経由して進む光増感酸化はタイプII光酸化として知られ
ている。タイプII光酸化は一重項酸素を発生するために
用いた光増感剤とは無関係である。増感剤の重要な特徴
は、高い三重項形成の量子収率を持たねばならない（す
なわち、理想的には、三重項状態は各光量子吸収毎に形
成されねばならない）ということである。三重項状態と
の系内交差は分子中の重原子の存在により容易になる。

生物のいかなる生体構成物（タンパク質、ポリペプチ
ド、アミノ酸、アリル水素を有する脂質、トコフェノー
ル、糖およびセルロース）は光酸化を受けると細胞の死
を招き得る。

現在、好まれている染料には、ローズベンガル（Acid
Red 94,Colour Index No.45440）、エリスロシン
Ｂ（Acid Red 51,Colour Index No.45430）ならび
にアルミニウムフタロシアニンスルホネート（APS）お
よび亜鉛フタロシアニンスルホネート（ZPS）のような
フタロシアニンスルホネートが含まれる。ローズベンガ
ルおよびエリスロシンＢは公知の食用着色料であり（ロ
ーズベンガルはFood Colour Red No 105であり、エ
リスロシンＢはFood Colour Red No 14である）、
エリスロシンＢは化粧品への使用が許されている着色剤
のEECリストに載っており、これらの２つの染料は家庭
用組成物に使用するのによく適している。染料の混合物
も使用することができ、光力学的過程の最後において目
に見える染料を混合物中に含めることが望ましく有り得
る場合もある。

組成物中の染料の濃度は重要ではなく、典型的には10
0ppmまでであろう。10ppm〜20ppmの範囲の濃度で良い結
果が得られる。1ppmまでの低い濃度もまた妥当な結果を
もたらすであろう。

一重項酸素は短命であり、したがって拡散のための行
路長が短いので、効果を発揮するには一重項酸素を発生
する光増感染料は標的物質に近くなければならない。好
ましい染料はそれゆえに、典型的には生物表面の細胞タ
ンパク質または他の細胞成分、例えば細胞脂肪に結合す
ることによって、微生物に対して直接性である（すなわ
ち微生物と結合できる）。

上記の好ましい染料は露光することによって一重項酸
素を発生し、タンパク質に対して直接性であり、よって
細胞タンパク質を介して微生物と結合しやすい。このよ
うにして、標的の生物を死滅させることおよびこのよう
にして殺菌作用が可能となる。

露光することによって白くなる染料を使用することも
また好ましい。微生物に直接性である光漂白性染料を使
用することによって、微生物の存在の可視標的を提供す
ることを可能とし得る。染料が白くなると、光力学作用
が微生物の死もしくは不活性化を引き起こして進む。低
いレベルの光の存在下では、漂白および光力学的活性は
よりゆっくりと進むと考えられており、一方、高い光強
度において、両方の過程はより迅速に起こる。このよう
に、漂白および光力学的活性の相対速度に依存して、可
視染料の存在によって使用者には全ての存在する微生物
の光力学的不活性化が不完全であることがわかる。

ローズベンガルのような染料による懸濁液中の微生物
の光力学的不活性化は公知である。例えば、Journal o
f Applied Bacterionogy 1985、［58］第391〜400
頁、Photochemistry and Photobiology 1988、［4
8］第607〜612頁（Neckers等）、およびShokuhin Eise
igaku Zasshi 1962、10（５）、第334〜347頁参照。
しかしながら、適当な染料は表面上の微生物を光力学的
に不活性化することができることをいまや知見し、そし
てこれに基いて本発明を成した。微生物はプランクトン
または懸濁状態において殺生物剤に対して非常により感
受性であることが良く知られている。微生物は、（その
通常のまたは好ましい状態である）表面に付着したとき
不活性化するのは非常により難しい。微生物は通常は
「バイオフィルム（biofilm）」の形態で表面上に存在
している、すなわち、細胞外物質のマトリックス中に埋
め込まれている。この細胞外物質は文献中において「付
着物（adhesin）」と呼ばれることもあり得る。したが
って、プランクトン状態の微生物に作用する方法が、変
更を必要とせずに表面に付着した微生物に作用すること
は自明ではない。表面付着微生物は、家庭、施設および
産業環境における汚染の重要なかつ実質的な供給源に該
当し、本発明はこのような微生物への標的殺菌作用を可
能とし得る。

本発明の組成物は特に家庭および産業における硬質表
面、例えばガラス、プラスチック、セラミックおよび金
属表面に使用するのに適している。特に、該組成物は、
表面の欠陥部、接合部および他の比較的限定された領域
の、細菌学的汚染の可能性のある汚れが存在するかもし
れない表面への使用に効果的である。

酸性組成物はグラム陰性（Ｇ−）微生物に対して、中
性の組成物と比較して実質的に強められた効果を有する
ことが見出されたので、組成物は酸性、例えばpH4のよ
うな３〜５の範囲のpHを有するのが好ましい。グラム陽
性（Ｇ＋）の微生物に対する効果は顕著にはpHに影響さ
れないようである。組成物を比較的マイルドな有機酸、
例えば酢酸を使用して酸性化するのが便利である。

Neckers等（上記）は、染料ローズベンガルそれ自身
の細胞壁を通過しての侵入が不活性化の本質であるとい
う矛盾する証拠を検討した。彼等は、彼等自身の結果
は、第１のＧ＋およびＧ−の種の異なった不活性化を基
礎とする染料侵入の仮定を裏付けると示唆した。Ｇ−細
菌のエンベロープは、実質的にリポポリサッカライドで
構成される付加的な外膜を有し、Necker等は潜在的に毒
性を有する物質の障害物として働くと考えた。別の解釈
は次の通りである。細胞壁に露出しているタンパク質の
量は、pHによって変わる染料に対する結合親和性によっ
てＧ＋およびＧ−種の間で非常に異なっており、Ｇ＋の
ほうがＧ−よりも多い。したがって、細胞壁に結合する
染料の濃度はpHの関数である。この解釈により、殺菌速
度とpHとの変化の我々の観察が説明されるであろう（し
かしながら、Ｇ＋種枯草菌および巨大菌の見掛けの耐性
を説明しない）。

内生胞子の非存在下におけるローズベンガルによる光
力学作用に対する感受性において、内生胞子形成種の枯
草菌と非胞子形成の黄色ぶどう球菌には違いはない。我
々の研究によって示された明らかな相違点はおそらく、
一重項酸素に対して細菌自身よりも明らかにより耐性で
ある枯草菌および巨大菌の両方の場合内生胞子の存在に
依存するのであろう。胞子はローズベンガルおよび露光
に生き抜き、次いで発芽し、数えられるコロニーを形成
する。胞子は染色するのが難しいことおよび、おそら
く、いかなる使用条件下でもローズベンガルに対して親
和性を有さないであろうことが知られている。一重項酸
素の胞子に対する毒性に関する文献はほとんど無い。Ne
urospora crassaのできるだけ耐性の少ない分生子の研
究から（Photochem.Photobiol.,33,349（1981））、こ
の点で一重項酸素が潜在力を有する。

組成物は任意に他の成分、例えば１種以上の（洗浄
用）界面活性剤および／または１種以上の溶媒を含み得
る。

界面活性剤は好ましくはアルコキシル化、より好まし
くはエトキシル化されており例えば、エトキシル化アル
コールの形態である。アルコールは好ましくは４〜15個
の炭素原子を有し、直鎖または分枝鎖配置であり、かつ
10〜14の、例えば12のHLB値（親水親油バランス）を有
している。

広範囲の好適な界面活性剤が市販されており、このよ
うな物質の１つはImbentin 91−35という商標でKolbか
ら市販されている界面活性剤であり、それは、アルコー
ル１モルに対して平均５モルのエチレンオキシドを有す
るノニオン性C_9-11アルコールエトキシレートである。

第１級エトキシスルフェートもまた使用し得る。

所望であれば界面活性剤の混合物を使用し得る。

界面活性剤は好ましくはノニオン性もしくはアニオン
性であるかまたは両方のタイプの混合物である。

この目的に好ましいアニオン性界面活性剤は第１級ア
ルキルスルフェート（PAS）、好ましくはナトリウムド
デシルスルフェート（SDS）を含む。実質的な量のドデ
シルスルフェートを含む市販混合物（例えばEmpicol L
X）は特に好ましい。ドデシルスルフェートは公知のタ
ンパク質変性剤であり、表面からタンパク質を除くのに
適しており、殺生物性である。

組成物は好ましくは実質的にカチオン性界面活性剤を
含まないが、少量ならカチオン性殺菌剤を含んでも良
い。

界面活性剤は好ましくは組成物全重量の0.05〜2.5重
量％の量、典型的には0.5〜1.5重量％、例えば0.7重量
％のノニオン性界面活性剤と0.2重量％までの任意の量
のアニオン性界面活性剤と共に構成される。

溶媒は好ましくは極性でありかつ好ましくは直鎖また
は分枝鎖のC₂〜C₅アルコール、例えばエタノール、ブタ
ノール、イソプロパノール（プロパン−２−オール）
（IPN）、Ｎ−ブトキシプロパン−２−オール（プロピ
レングリコールｎ−ブチルエーテル）、２−ブトキシエ
タノール（エチレングリコールモノブチルエーテル）で
ある。IPAが現在好ましい溶媒である。

２価アルコール、例えばエチレングリコール、および
水混合性エーテル、例えばジメトキシエタンもまた使用
し得る。

所望により、溶媒の混合物、例えばエタノールとＮ−
ブトキシプロパン−２−オールとの混合物も使用し得
る。

溶媒は、好ましくは組成物全重量の２〜20重量％の範
囲の量存在する。

これらの溶媒のうちの少なくともいくつか、例えばエ
タノールは微生物の細胞壁を弱くし、より浸透性にし
て、一重項酸素の浸透に対してより感応性にする。こう
した溶媒は染料の微生物死滅効果を強める効果を有す
る。

界面活性剤を含ませることは染料の光力学的効果を減
少し得ること（おそらく、染料を可溶性にすることおよ
び細胞壁への吸着を阻止することによって）、および溶
媒を含ませることもまた染料の光力学的効果を減らし得
ること（おそらく、一重項酸素に対して競合することに
よって）が知見された。しかしながら、染料、界面活性
剤および溶媒を含む３成分処方物を用いると、染料の光
力学的効果の減少が界面活性剤と溶媒の予想された相和
効果よりも少ないことが知見された。したがって界面活
性剤および溶媒は相乗効果を有し、その結果染料の光力
学効果の減少を下げる。

したがって、好ましい面において本発明は微生物を光
力学的に不活性化し得る染料、界面活性剤および溶媒を
含む表面洗浄および殺菌組成物を提供する。

組成物は以下を含む多数の任意成分を含み得る。

1. 洗浄促進剤、好ましくは金属キレート剤、例えばエ
チレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）。金属キレート剤
（EDTAを含む）はまた、細胞壁を透過性にするといわれ
ており、したがって生物を殺生物剤に対してより感受性
とし得る。

2. 緩衝液または塩のような電解質（例えばNa₂SO₄）は
染料の水性相からタンパク質塩への動きを促進すること
によって染料はタンパク質への結合を助ける働きをす
る。電解質は一般に、市販形態としていろいろな染料処
方物中に存在するが、所望であれば付加的な電解質を加
えてもよい。組成物の全電解質存在量は典型的には０〜
１重量％、好ましくは約0.1％である。

3. 香料。

4. 濃厚剤。

組成物は等方性の単相組成物の形態であり、硬質表面
の殺菌剤（おそらく洗浄効果も伴う）として特に有用で
あり、広範囲の用途、家庭内の用途、例えば厨房および
便器を含む浴室表面、施設内の例えば学校、病院等およ
び商業建物例えば工場、事務所、ホテル等への用途が見
出された。

少なくとも家庭用のためには、組成物は好ましくは噴
霧による適用を意図する製品として処方され、適当な容
器、例えば、手動式引き金スプレーまたはエアロゾル推
進ディスペンサーを有する容器に包装するのが便利であ
る。容器は好ましくは光不透過性である。

使用において、組成物は処理しようとする表面に、例
えば適当なディスペンサーからスプレーすること、布ま
たはスポンジのようなキャリヤーで塗り付けることまた
は容器から注ぐこと等のいかなる便利な方法を用いてで
も適用し得る。特に産業的洗浄において、これをこの後
に光源、水晶ハロゲンランプまたは蛍光「昼光」源のよ
うな例えば白色光源に露光することがある。（この工程
は、例えば254nmで共鳴放射を発生する低圧水銀放電ラ
ンプからの危険な殺菌放射を使用することの代替とな
る。このような放射は保護していない目にたいして有害
である。）もしも必要であれば、この工程には、例えば
キャリヤーによって抜くことによってまたは水流を適用
すること等による濯ぎステップが続く。

したがってさらなる面において、本発明は本発明組成
物を表面に適用することを含む表面上の細菌を殺す方法
を提供する。

本発明を実例として以下の実施例および添付図面を参
照することによりさらに説明する。

図１は、ローズベンガルおよび光のpH4および７の懸
濁液中のいろいろな微生物に対する致死効果を示すlog
（減少）値の２本の棒グラフである。図1aはグラム陽性
微生物に対する結果を示し、図1bはグラム陰性微生物お
よび酵母に対する結果を示す。

図２は、pHの関数としてのローズベンガルおよび光の
黄色ぶどう球菌および大腸菌の殺生物効果を示すlog
（減少）対pHの１対のグラフである。図2aは20分露光後
の結果を示し、図2bは60分露光後の結果を示す。

図３はローズベンガルの代わりにエリスロシンＢを使
用して得た図２と同様な１対のグラフを示す。

図４は、ローズベンガル（RB）とImbentin C91−35
（AE）、イソプロパノール（IPA）およびEmpicol LX
（PSA）とのさまざまな組合せの光衛生効果示すlog（減
少）の２本の棒グラフである。図4aは露光なしに得られ
た結果を示し、図4bは露光して得られた結果を示す。

図５はローズベンガルの大腸菌による吸着を吸着量
（ナノモル）対平衡濃度（マイクロモル/l）で示すグラ
フである。pH4での結果を正方形で示し、pH7で得られた
結果を＋印で示す。

図６は電解質の効果を示す図５と同様の１対のグラフ
である。図6aはpH4での結果を示し、図6bはpH7での結果
を示す。添加剤なしを正方形で示し、硫酸ナトリウム
（１％）での結果を＋印で示し、硫酸ナトリウム（５
％）での結果を＊印で示す。

図７は界面活性剤の効果を示す図５と同様のグラフで
ある。図7aはpH4での結果を示し、図7bはpH7での結果を
示す。添加剤なしでの結果を正方形で示し、ノニオン性
界面活性剤（0.7％）（NI）での結果を＋印で示し、PAS
（0.7％）での結果を＊印で示す。

図８はpH4での溶媒の効果を示す図５と同様のグラフ
である。添加剤なしでの結果を小さな正方形で示し、10
％IPAでの結果を＋印で示し、0.7％Imbentinでの結果を
＊で示し、10％IPAおよび0.7％のImbentinでの結果を大
きな正方形で示す。

図９は、ローズベンガルによる大腸菌の死滅速度への
pHの効果を示すlog（減少）対露光時間（分）のグラフ
である。pH4での結果を正方形で示し、pH7での結果を＋
印で示す。

図10はローズベンガルによる大腸菌の死滅速度へのpH
7での電解質の効果を示す図９と同様のグラフである。
電解質なしでの結果を正方形で示し、硫酸ナトリウムを
用いて得られた結果を＋印で示す。

実施例実験方法接種材料の調製以下の微生物（一般にthe National Collection o
f Type Cultures（NCTC）またはthe American Type
Culture Collection（ATCC）から入手）を以下に記
載の実験において使用した。

細菌黄色ぶどう球菌 NCTC 6535 グラム陽性大腸菌 NCTC 8196 グラム陰性緑膿菌 NCTC 5940 グラム陰性腸内細菌 NCTC 3281 グラム陰性クレブシェラ菌 ATCC 11677 グラム陰性枯草菌 NCTC 6432 グラム陽性巨大菌 NCTC 7581 グラム陽性酵母カンジダ・アルビカンス細菌に対しては普通ブイヨン中37℃で（緑膿菌に対し
ては28℃）、酵母に対してはSABSブイヨン（SABSはSabo
urandのデキストロース寒天であり、SBASブイヨンの場
合は液体培地である。Oxoid Ltd製）中28℃で生成物を
一夜のインキュベーションによって培養した。培養物を
0.45umのミリポアフィルターを使用して真空濾過により
単離し、４倍希釈した（quarter−strength）リンガー
液で洗浄し、リンガー液（10ml）中で再懸濁させた。懸
濁液中の生物を系列希釈および普通寒天（細菌）または
SABS寒天（酵母）にプレーティングすることにより計数
し、全生存数（TVC）は1ml毎のコロニー形成単位（cf
u）の数の常用対数として示した。

特に断らない限り、実験はpH7で行った。

１）寒天拡散ディスク法染料100ppmを含む水溶液を調製した。各染料溶液のア
リコート（10ml）をガラス製の万能ねじ込みキャップバ
イアル中で殺菌した。抗生物質アッセイディスク（13m
m、BDH製）もまた殺菌した。全ての生物を普通またはSA
BSブイヨン（10ml）中で１晩培養した。

各微生物に対して、２つの普通寒天プレート（酵母に
対してはSABS寒天）に１晩培養物（10ul）を接種し、プ
レート全体に融合性増殖を得た。無菌技術を使用して、
抗生物質ディスクを第１染料溶液に浸し、接種した寒天
プレートの表面に置いた。これを他の２つの染料溶液に
ついても繰り返し、一対のプレートについて３種類のデ
ィスクを得た。

一対のプレートのうちの片方を直ちに、露光を最小限
にして適温のインキュベーター中に入れた。残りのプレ
ートをライトボックス上に３時間置いた。ライトボック
ス中からの放射は、蛍光「昼光」管（２×15ワット、Ex
al Ｘ−ray Accessories Ltd製、Hemal Hempstea
d）からの平均強度4000ルクスの拡散白色光であった。
光強度は散光器の表面でMegatron DA10光メーターを使
用して測定した。露光の後に、プレートを１晩インキュ
ベートしてディスクのまわりの阻害領域を検討した。こ
の方法を使用して、以下の結果を得た。

実施例１（ディスク法）ローズベンガル、エリスロシンＢおよびアルミニウム
フタロシアニンスルホネート（APS）の染料水溶液（100
ppm）に対する上記のようにpHにおける180分露光後の寒
天上の結果を表１にまとめる。表において、阻害の透明
な領域（広がった寒天プレート上の細菌の増殖のない領
域）の半径とディスクの半径との間の差（mm単位）で結
果を表現した。したがって、値が高ければ死菌した細菌
数が多い。

寒天拡散ディスク法によりローズベンガルが構造的に
類似のエリスロシンＢよりもより効果的であるとランキ
ングされた。これは、このランキングが一重項酸素形成
に対する量子収率の違いに帰することを示唆している。
メタノール中において、一重項酸素形成の量子収率は、
エリスロシンＢの0.6に比較してローズベンガルが0.76
である。しかしながら、いくらかの他の因子もまた染料
の拡散速度または寒天ゲルまたはディスク材料への染料
結合の違いのような観測された違いに寄与していると予
期される。

ディスク法からの結果の特徴は、少なくともpH7にお
けるグラム陽性（Ｇ＋）およびグラム陰性（Ｇ−）生物
の光力学的作用の感受性の明確な違いである。Ｇ−生物
が比較的耐性でり得ることの理由は別の箇所で議論す
る。

２）表面試験試験溶液 pH4の緩衝液中、ローズベンガル（20ppm）及び： 1. さらなる添加なし； 2. エタノール（10％v/v）およびImbentinC91−35（0.
75）； 3. プロパン−２−オール（10％v/v）およびImbentin
C91−35（0.7％）。

次亜塩素酸ナトリウム溶液（0.125％）を陽性コント
ロールとして使用した。

ペトリ皿のベースに付着する生物の数の評価微生物（例えば黄色ぶどう球菌）懸濁液（0.5ml）を
４倍希釈のリンガー液のアリコート（100ml）に加え、1
ml毎の平均cfuを決定した（TVC）。これらの溶液のアリ
コート（20ml）を無菌ペトリ皿に入れ、室温で５時間放
置した。接種物を無菌ビンにピペットで取り除き、懸濁
液中に残っている1ml毎の平均cfuを評価した。ペトリ皿
に付着した生物の平方cm毎の（cfuとしての）数を溶液
濃度の差から計算した。

試験法４倍に希釈したリンガー液（20ml）中の細菌懸濁液を
無菌プラスチック製ペトリ皿に入れ周囲温度で５時間放
置した。接種物をその後除き、皿を１回リンガー液を用
い手で優しく掻き回して洗浄し、溶液を流し出した。１
対の細菌で汚染したプレートを試験溶液で処理した。試
験溶液のアリコート（20ml）を１つの皿に注ぎ、溶液を
30秒後にデカントした。皿をpH4の緩衝液で濯ぎ、ライ
トボックス上に20分間置いた。別の実験において、溶液
を第２の皿中でライトボックス上で20分間露光し、その
後、デカントし、皿をpH4の緩衝液で濯いだ。両方の実
験を繰返した。

露光した後に、１組にしたプレートのうちの１つを１
％のグルコースおよび0.015％のNeutral Redを含む約5
0℃に冷却したトリプトン大豆寒天で覆った。他の組の
プレートは0.01％のアクリジンオレンジで30秒間染色
し、濯ぎ、顕微鏡（100倍アポクロマート油浸対物レン
ズ、10倍接眼レンズならびにB2−Ａ合成フィルター/2色
鏡ブロックおよび超高圧水銀ランプを有する螢光外（ep
ifluorescence）付属装置を具備したNikon「Optiphot」
顕微鏡）で検査した。覆った寒天プレートを37℃で48時
間インキュベートし、その時までにコロニーは、死滅し
ていなっかった付着細菌の外に増殖していた。コロニー
は中性赤を取り込み、見ることができ、皿の表面の寒天
下、数えた。（ＡＭＲ MacKenzieおよびＲＬ R
ivera−Calderon、Agar Overlay Method to Measur
e Adherence of Staphylococcus epidermidis to
Four Plastic Surfaces、Applied and Enviromen
tal Microbiology、50、第1322頁（1985））アクリジンオレンジで染色したプレートを検査し、写
真を撮った。染色された細菌の数を、マイクロメーター
のスケールで写真撮影することによって予め評価してお
いた視野中で数えた（集団は１つと数えた）。

実施例２（表面試験）上記の直接螢光外顕微鏡を使用し懸濁液なし（suspen
sion depletion）のコントロール実験表面試験は、（1
0万/cm²のオーダーの）プラスチックの皿の表面に付着
し得る細菌（黄色ぶどう球菌）の数に関して同様の値を
与えた。

表面の陽性のコントロール（次亜塩素酸ナトリウム溶
液、30秒間）と接触させると生存細菌の数が０に減る。
光力学的に不活性化された細菌の結果を、露光前後の生
存細菌の減少の常用対数（log（減少））、すなわち、l
og（初めの数）−log（最終の数）として表２にまとめ
た。

実施例３処方：ローズベンガル（20ppm）、ノニオン性界面活性
剤（Imbentin C91−35、0.7％）、プロパン−２−オー
ル（10％）（pH4）。

実験法は、細菌の表面付着がそれらを指数増殖期にあ
ることを必要としたことを除いて、上記の方法と同様で
ある。このことは、プラスチック性ペトリ皿中において
普通ブイヨン（細菌に対して）またはSABSブイヨン（酵
母に対して）中での３時間のインキュベーションによっ
て実現した。実施例２では、リンガー液中の非増殖細菌
の懸濁液は単に５時間放置しただけであった。このこと
は黄色ぶどう球菌に対しては良く作用したが、他の細菌
に対しては良く作用しなかった。結果を表３に示す。

直接螢光外顕微鏡を使用する以前の実験は、融合性繁
殖が得られれば、このことは、1000000/cm²のオーダー
の生存微生物の初期表面密度に等価であるであろうこと
を示唆している。使用したペトリ皿の表面領域は約57cm
²であり、全てのケースの処理は表面汚染のレベルを少
なくとも５のオーダ（log5）で減らした。

表面試験は懸濁試験よりも実行が難しく、この理由に
よって、いろいろな条件の効果を証明するほとんどの実
験操作は懸濁液中で行った。

３）懸濁液試験溶液の調製以下の原料溶液を（溶媒を含むものを除いて）秤量お
よび殺菌することにより調製した。

プロパン−２−オール（95％）中ローズベンガル（0.
2％）ノニオン性界面活性剤（Imbentin C91−35、14％）
（略号AE（アルコールエトキシレート）を用いて示すこ
ともある）アニオン性界面活性剤（Empicol LX、14％）（PASと
示すこともある） pH4の緩衝液（クエン酸（0.1M、307ml）＋二塩基性リ
ン酸ナトリウム（0.2M、193ml）） pH7の緩衝液（オルトリン酸二水素ナトリウム（0.4
M、468ml）＋オイルリン酸水素二ナトリウム12水和物
（0.4M、732ml）） pH5、６、８および９の緩衝液はCRC Handbook of
Chemistry and Physics、８−36、第73版、CRC Pres
s（1992−1993）に示されているように調製した。

試験溶液中の最終濃度は典型的には：ローズベンガル − 20ppm エタノール − 10.0％（v/v）界面活性剤 − 0.7％（w/v）特定したように異なった濃度を使用した実施例もあ
る。

試験法試験溶液を深さ5mmまで（30ml）に無菌プラスチック
製ペトリ皿中に準備した。微生物の懸濁液（0.3ml）を
各溶液に加え、優しく混ぜた。ローズベンガル試験溶液
に入れた場合には露光を最小にするために最後に加え
た。溶液はライトボックス上で露光するか、暗所に置く
（露光を減らした条件）かまたは作業台上に置くかし
た。ライトボックス散光器表面の平均強度は、Megatron
DA 10 Light meter（Megatron Ltd製）を使用し
て4000ルクスであった。特定の露光時間後、系列希釈お
よび寒天にブレーティングした後にインキュベーション
し生き残った細菌をコロニー形成単位（cfu/ml）として
計数した。（1ml毎のコロニー形成単位として）残った
細菌の数の常用対数を決定し、露光前の数と、log（初
めの数）−log（最後の数）として比較した。値が大き
ければ、死滅細菌数が多い。

いろいろな生物に対していろいろな条件下で懸濁液試
験を行い、グラム陰性生物および酵母をいろいろな微生
物に対する光力学的作用を最適化した。言及しない結果
は関連した表中にまとめた。これらの表中において、結
果を1ml毎のコロニー形成単位の最初の数の、露光後に
残っている数に対する割合の常用対数として示した（lo
g（減少））。この表記を使用すると、０という値は、
条件への露光に続いて生物の数の変化がないことを意味
する。対数減少の数字の前の「＋」という表記は微生物
の増殖が観測されない（すなわち、全て死滅した）こと
を示す。

実施例４上記のように懸濁液試験を行い、ローズベンガルおよ
び光の懸濁液中の微生物に対する致死効果、特に低pHと
エタノール溶媒との共働作用を示した。試験はローズベ
ンガル（20ppm）のみまたはエタノール（10％、（v/
v））とともに、20分間の露光（ライトボックス）を用
いて行った。log（減少）値として表現した結果を表４
に示す。

長い露光時間（60および100分間）によってグラム陰
性生物への性能が特にpH7において改善される。

グラム陰性の生物に対する性能はpH4において、p7Hに
おけると比べて非常に良く改善されている。

実施例５ pH4およびpH7において懸濁液試験を上述のように行
い、ローズベンガル（20ppm）および光（ライトボック
ス上での20分間の露光）の懸濁液中のいろいろなグラム
陽性およびグラム陰性微生物および酵母への致死効果を
示し、log（減少）として表した結果を図1aおよび図1b
にグラフで示した。図1aはグラム陽性微生物に対する結
果を示し、図1bはグラム陰性微生物および酵母に対する
結果を示した。

実施例６異なったpHの範囲において上記のように懸濁液試験を
行い、ローズベンガル（20ppm）および光の黄色ぶどう
球菌（Ｇ＋）および大腸菌（Ｇ−）に対する致死効果
を、pHの関数として示し、log（減少）として表した結
果を図2a（露光時間20分）および図2b（露光時間60分）
にグラフで示した。図において、＋印はコントロール
（Ｇ−）への結果を示し、＊印は大腸菌への結果を示
し、倒立した三角形はコントロール（Ｇ＋）への結果を
示し、三角形は黄色ぶどう球菌への結果を示す。

同様な懸濁液試験を行い、エリトロシンＢおよび光の
黄色ぶどう球および大腸菌に対する殺生物効果をpHの関
数として示した。結果を、他の点では図2aおよび2bと同
様の図3aおよび3bにグラフとして示す。れらは、エリス
ロシンＢがpHに対する光殺生物特性においてローズベン
ガルと類似性を示すことを示している。

実施例７以下の溶液を使用して上記のようにpH7においてさら
なる懸濁液試験を行った。

ノニオン性界面活性剤Imbentin C91−35（0.7％） Imbentin C91−35（0.7％）とローズベンガル（100p
pm）アニオン性界面活性剤 Empicol LX（0.7％） Empicol LXとローズベンガル（100ppm） Imbentin C91−35、Empicol LX（両方共に0.7％）
およびローズベンンガル（100ppm）結果を以下の表５に示す。表において、「暗」という
用語は、全くの闇というよりはむしろ減少した光への露
光という条件を示す。なぜならば、全く露光を避けるこ
とは実際上難しいからである。表中において、「明」と
いう用語は統計的に計画された実験で広い範囲の時間
（20分間、１時間および３時間）にわたって行われたい
くらかの実験の平均を示す。

pH7において大腸菌に対して同様にして得られた結果
を図４に棒グラフとして図示する。この図において、PA
SはEmpicol LXの略号として使用し、IPAはイソプロパ
ノールの略号、そしてAEはImebentin C91−35の略号と
して使用する。この図はAE0.7％、PAS0.7％,IPA10％に
対する平均データを示す。

実施例８１種以上の以下のものを使用して、pH4において大腸
菌に対してさらなる懸濁液試験を行った。ローズベンガ
ル40ppm、界面活性剤0.7％（Imebentin C91−35または
Empicol LX）、IPA（イソプロパノール）10％。結果を
表６に示す。

以下の実施例は一般に上記のように、しかしながら、
pH4において行った懸濁液試験に関する。ローズベンガ
ルを使用したときとの濃度は20ppmであるが、ローズベ
ンガルなしのコントロール溶液を露光したケースもあ
り、これらの結果は上部の欄に「ローズベンガルなし」
と示した。

実施例９、10、11および12ではグラム陽性生物の黄色
ぶどう球菌を使用し、実施例13および14ではグラム陰性
生物の大腸菌を使用した。他の使用した試薬は実施例中
で示した。これらの全ての実施例において、試料を20分
間ライトボックス上で露光した。散光器の表面での平均
強度は、Megatron DA10 light meter（Megatron Lt
d製）で測定して4000ルクスであった。

実施例９ローズベンガル、エタノールおよびImebentin C91−
35を使用して黄色ぶどう球菌で懸濁液試験を行った。黄
色ぶどう球菌の初めの濃度の常用対数log（開始）は6.8
であった。結果を表７に示す。

実施例10 ローズベンガル、Dowanol PnBおよびImebentin C91
−35を使用して黄色ぶどう球菌で懸濁液試験を行った。
log（開始）は6.9であった。結果を表８に示す。

この実施例はDowanol PnBがある程度の殺生物能力を
有することを示す。

実施例11 ローズベンガル、エチレングリコールおよびImebenti
n C91−35を使用して黄色ぶどう球菌で懸濁液試験を行
った。log（開始）は6.8であった。結果を表９に示す。

実施例12 ローズベンガル、IPAおよびLialet 111を使用して黄
色ぶどう球菌で懸濁液試験を行った。Lialet 111はEni
chemから市販されている、平均鎖長11で平均エトキシル
化度が３のエーテルスルフェート処方物の商標である。
log（開始）は6.7であった。結果を表10に示す。

実施例13 ローズベンガル、プロパン−２−オールおよびImeben
tin C91−35を使用して大腸菌で懸濁液試験を行った。
log（開始）は6.8であった。結果を表11に示す。

実施例14 ローズベンガル、エタノールおよびImebentin C91−
35を使用して大腸菌で懸濁液試験を行った。log（開
始）は7.1であった。結果を表12に示す。

実施例15 ローズベンガル吸着を溶液濃度の枯渇から決定した。
濃度は、WPA Linton S110分光機を使用して、遠心分
離によって微生物から取り除かれた上澄み液の最大吸収
波長（ca.549nm）での吸収から分光学的に決定した。

結果を図５から８に示す。

結果から光殺生物効果は染料の吸着に依存することが
示された。染料吸着は：ａ）低いpHで増加し（図４）；ｂ）中性の電解質（電解質は中性pHにおける大腸菌への
光殺生物効果を増加させる）で増加し（図６）；ｃ）界面活性剤で減少し（図７）；ｄ）プロパン−２−オールで増加する（図８）。

染料が集まると考えられていることおよび大腸菌の計
算された表面は小さく見積もられている（繊毛／ピリを
考慮していない）に違いないことを考慮して、計算によ
り大腸菌に吸着した量は正しく単層被覆の大きさのオー
ダーである。計算の詳細を以下に示す。ローズベンガル
の分子の大きさはスケールモデルから得た（Catalin L
td.,London）。

大腸菌の表面領域 1E7cm² ローズベンガルの領域 2nm²（平面） 0.5nm²（側面）単層被覆 5E6（平面）または 20E6（側面）測定した吸着２〜8E−16分子／細菌分子数細菌毎に120〜480E6 実施例16 上記のように懸濁液試験を行い、ローズベンガル（20
ppm）のpHおよびpH7における電解質（硫酸ナトリウム、
５％）の添加による大腸菌の死滅速度への効果を決定
し、結果をそれぞれ図９および10にグラフとして示し
た。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ０９Ｂ 47/04 Ｃ０９Ｂ 47/04 61/00 61/00 Ｚ (31)優先権主張番号９３０４７３２．２ (32)優先日平成５年３月９日(1993．3．9) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (56)参考文献特開昭58−105989（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−264064（ＪＰ，Ａ) 特開昭56−39004（ＪＰ，Ａ) 特開昭57−38704（ＪＰ，Ａ) 特開平２−22398（ＪＰ，Ａ) ＭＥＬＶＩＮ，Ｉ．Ｒ．，ｅｔａｌ．，”ＴｈｅＡｎｔｉｖｉｒａｌＥｆｆｅｃｔｓｏｆＲｏｓｅＢｅｎｇａｌａｎｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ”Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．，1987，Ｖｏｌ．105，Ｎｏ．10, ｐ．1415−1417 日本防菌防黴学会事典編集委員会、防菌防黴剤事典、日本国、日本防菌防黴学会、1986年８月22日発行、第84−85頁ＴＡＬＢＥＴ，Ｎ．Ｅ．，ｅｔａｌ．，”ＳｅｎｓｉｔｉｚｅｄＰｈｏｔｏｏｘｉｄａｔｉｏｎｆｏｒＷａｓｔｅｗａｔｅｒＤｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＤｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ”Ｗａｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．，1987，Ｖｏｌ．19，Ｎｏ．７, ｐ．1255−1258 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A01N 61/00 A01N 43/16 A01N 43/713 A61L 2/16 C09B 11/28 C09B 47/04 C09B 61/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】微生物を光力学的に不活性化し得る染料を
含む組成物を表面に適用することからなる該表面上のバ
イオフィルム内の微生物を殺菌する方法。
【請求項２】上記染料が露光により一重項酸素を発生す
る請求項１に記載の方法。
【請求項３】上記染料が微生物に対して直接性である請
求項１または２に記載の方法。
【請求項４】上記染料が露光により白くなる請求項１乃
至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】上記染料がローズベンガル、エリスロシン
Ｂおよびフタロシアニンスルホネートからなる群から選
択される請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】染料が１乃至100ppmの量で存在する請求項
１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】上記組成物がさらに一種以上の界面活性剤
を含む請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】上記界面活性剤がアルコキシル化されてい
る請求項７に記載の方法。
【請求項９】上記界面活性剤がエトキシル化されている
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】上記界面活性剤が少なくとも主にノニオ
ン性および／またはアニオン性である請求項７乃至９の
いずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】界面活性剤が上記組成物中に該組成物の
全重量に対して0.05〜2.5重量％の量で存在する請求項
７乃至10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】上記組成物が一種以上の溶媒を含む請求
項１乃至11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】上記溶媒が極性である請求項12に記載の
方法。
【請求項１４】上記溶媒が直鎖若しくは分岐鎖C2〜C5ア
ルコールである請求項13に記載の方法。
【請求項１５】溶媒が上記組成物中に該組成物の全重量
に対して２〜20重量％の量で存在する請求項12乃至14の
いずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】上記組成物のpHが３〜５である請求項１
乃至15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】上記組成物のpHが約４である請求項16に
記載の方法。
【請求項１８】微生物を光力学的に不活性化し得る染
料、界面活性剤および溶媒を含む組成物を表面に適用す
ることからなる該表面の洗浄および該表面上のバイオフ
ィルム内の微生物を殺菌する方法。