JP3145122B2

JP3145122B2 - Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ発酵プロセス

Info

Publication number: JP3145122B2
Application number: JP51517696A
Authority: JP
Inventors: ロベルトオリビエリ，; リノラプオリ，; ジョンライルドテルフォード，
Original assignee: カイロンエセ．ピー．アー．
Priority date: 1994-11-04
Filing date: 1995-11-06
Publication date: 2001-03-12
Anticipated expiration: 2015-11-06
Also published as: CA2204276A1; WO1996014393A1; JPH10500864A; DE69517995T2; EP0789754B1; DE69517995D1; PT789754E; GR3033866T3; ES2148571T3; DK0789754T3; GB9422331D0; EP0789754A1; ATE194646T1; EP0990700A1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、Helicobacter pyloriの培養、およびH.pyl
oriが生産するサイトトキシンの精製のための新規の方
法に関する。詳細には本発明の適用は、H.pyloriの発酵
のための新規の培地に関する。

H.pyloriは、湾曲した（curved）グラム陰性の微好気
性細菌で、ヒトのＢ型胃炎に関する細菌として約10年前
に単離された。H.pyloriはヒトの異粘膜にコロニーを形
成して慢性的な感染を確立し、その結果胃潰瘍および十
二指腸潰瘍を起こし得（Blazer,1990,Journal of Infec
tious diseases,161,629−633）そして胃癌の発生の危
険因子になり得る（Parsonnetら、1991,New England Jo
urnal of Medicine,325,1227−1131）。H.pyloriと胃の
病気との間の関係の発見により、これらの疾患の治療的
アプローチは、抗酸薬による症状の処置から抗生物質を
用いた細菌感染の根絶へと変化した（Marshall、1993,G
astroenterol.Clin.Northam,22,183−198）。

長い間、感染およびそれによって引き起こされる疾患
はワクチンを接種することによって、予防および処置さ
れ得た。現在、細菌の付着、コロニー形成および毒性に
関するいくつかの因子が同定されており、そしてワクチ
ンの構成成分としてのこれらの適合の研究が行なれてい
る。最も興味深い因子の１つは、空胞化（vacuolatin
g）サイトトキシン（Vac A）であり、これは何種類かの
哺乳類細胞株において大きな塊となった空砲形成を引き
起こし（Luenk、1991,Rev.Infect.Dis.13（増刊８）,s6
83−s689）、そしてマウスにおいて潰瘍形成を引き起こ
す（Telfordら、J.Exp.Med.179,1653−1658）。精製さ
れたサイトトキシンは、87KDから94KDのタンパク質であ
り（Telfordら、前出;CoverおよびBlazer,1992,J.Biol.
Chem.267,10570−10575）、細菌の培養上清から極微量
精製され得る。Vac Aの作用機構の理解、ならびにその
血清学の研究、その疾患における役割、およびワクチン
抗原としてのその実用性を得るためには、大量のタンパ
ク質が必要である。通常用いられているH.pyloriの培養
およびサイトトキシン精製の方法を用いて、このような
大量のタンパク質を得ることはできない。

H.pyloriの実験室の培養は困難で、そして通常血清、
血液、または血液の派生物を含む複合培地を必要とする
（Shahamatら、1991,J.Clin.Microbiol.29,2838−2837;
BuckおよびSmith,1987,J.Clin.Microbiol.25,597−599:
Morganら、1987,J.Clin.Microbiol.25,2123−2125）。
これらの培地は、サイトトキシンの単離に用いられる精
製手順を防害する。

最近、シクロデキストリンの培養培地への添加が、上
記に同定された添加物を代用し得、そしてH.pyloriの増
殖を維持し得ることが示されている（Olivieriら、199
3,J.Clin.Microbiol.31,160−162）。しかし、生物の増
殖は比較的遅いままである。

一般に、H.pyloriに必要とされる不可欠な増殖因子お
よびその代謝については、ほとんど知られていない。例
えば、糖からの酸の生成に基づく早期の研究は、糖類の
発酵経路についての証拠を見いださなかったが、さらに
最近の証拠は、H.pyloriがグルコースのような糖類を異
化代謝し得ることを示す。ペントースリン酸経路および
グルコキナーゼ活性の存在が、最近証明されており（Me
ndzおよびHazzell 1991,FEMS Microbiol.Lett.84,331−
336;MendzおよびHazzell,1993,Arch.Biochem.Biophys.3
00,522−525）、そしてグルコースの利用が証明されて
いる（Mendzら、1993,J.Gen.Microbiol.139,3023−302
8）。

H.pyloriがグルコースを利用できることは証明されて
いるが、現在までグルコースがこの生物にとって好まし
い基質であるかどうかは決定されていない。さらに、H.
pyloriにおけるグルコース利用の効果は未知のままであ
り、そしてグルコース利用が、細菌の増殖に対して、正
または負の方向に影響を与えているかどうかは明らかで
はない。

発明者らはここで、H.pylori培養液へグルコースを流
加すること（feeding）により、その結果、この生物の
増殖速度の実質的な改善をもたらし、そして発酵プロセ
スの終了時点で利用可能なバイオマスを増大することを
示した。さらに、空胞化サイトトキシンの生産量が改善
される。従って、本発明の第１の局面によれば、空胞化
サイトトキシンを生産するH.pyloriを培養するための方
法を提供する。これは、H.pyloriを1Lあたり1gを超える
グルコースを含有する培地中で培養する方法である。

好ましくは、グルコースはＤ−グルコースである。培
養培地中にグルコースを用いることにより、その結果、
培地の光学密度（これは存在するH.pyloriの細胞数を示
す）を、ほぼ一桁増大することが示されている。さら
に、空胞化サイトトキシンの生産量は４倍になる。

好都合には、グルコースを補充した増殖培地は、bruc
ella broth（トリプトン（1Lあたり10g）、ペプタミン
（1Lあたり10g）、グルコース（1Lあたり1g）、酵母抽
出物（1Lあたり2g）、塩化ナトリウム（1Lあたり5g）、
および重亜硫酸ナトリウム（1Lあたり0.1g）からなる複
合培地）である。この培地は、先行技術のように血液の
派生物を補充され得るが、好都合には、以前に記載され
ているように（Olivieriら、前出）、シクロデキストリ
ンで補充される。好ましくは、brucella broth 1Lあ
たり約2gのシクロデキストリンを用いる。

グルコースは、発酵プロセスの開始時点で、単回量の
添加として添加され得る。しかし好ましくは、グルコー
スは、複数回、または流加培養プロセス（fed batch pr
ocess）での発酵中の継続的な流加によって添加され
る。培養液に添加されるグルコース量は、培地中のグル
コースレベルを（好ましくは1Lあたり2gから6gの間に）
維持するために十分であるべきである。好ましくは、グ
ルコース濃度は、培養期間（好都合には36時間から96時
間の間）を通じてこのレベルまたはこれを超えるレベル
に保たれる。

本発明の第２の局面によれば、H.pylori空胞化サイト
トキシンを生産するための方法が提供される。これは、
本発明の第１の局面による、グルコース補充培地におい
てH.pyloriを培養する工程を含む。

空胞化サイトトキシンは、当該分野で公知の任意の適
切な方法による細菌培養培地から単離され得る。しかし
好ましくは、空胞化サイトトキシンは、タンパク質を硫
酸セルロースマトリックスに吸着する工程、および続い
て塩濃度勾配を用いてそれらを溶出する工程を含む方法
により、単離される。

当該分野で以前に記載された方法（空胞化サイトトキ
シンを単離するためにフェニルセファロースへの吸着を
用いる方法）は、不十分であり、かつ非常に低い収率
（0.5％のオーダー）を得ることがわかっている。これ
と比較して、硫酸セルロースとの結合は本質的に定量的
で、かつ15％から20％の収率が可能である。

本発明はさらに、H.pylori空胞化サイトトキシンの精
製方法を提供する。これは以下の工程を含む：ａ） H.pylori発酵液の上清中のタンパク質を濃縮する
ために、H.pylori発酵液の上清を処理する工程；ｂ） 100mM NaClに相当する塩濃度を含有する緩衝液中
で、このタンパク質を懸濁する工程；ｃ）このタンパク質を、硫酸セルロースカラムに吸着
させる工程；ｄ）リン酸緩衝液（pH6.5）中の0.1〜1.5M NaClに相
当する塩濃度勾配を用いて、カラムから結合したタンパ
ク質を溶出する工程；ｅ）空胞化サイトトキシンを含む溶出物の画分を選択
する工程；ｆ）必要に応じて、サイトトキシンをさらに濃縮し、
そして制御された細孔（pore）マトリックスを用いて、
サイズ分離する工程。

上記の方法の工程ａ）に必要とされるようなタンパク
質を濃縮する方法は、当該分野で公知である。例えばタ
ンパク質は、硫酸アンモニウム（好ましくは50％の飽和
硫酸アンモニウム）中に、容易に沈澱し得、続いて、工
程ｂ）において、100mM NaCl、20mMリン酸緩衝液（pH6.
5）中に再懸濁され得る。あるいは、タンパク質は、接
線濾過（tangentrial filtration）およびダイアフィル
トレーション（Miniset OMEGA,cut−off 300kDa,Filtro
n）によって濃縮され得る。

好ましくは、硫酸セルロースカラムはMatrex^TMカラム
である。好ましくは、カラムからの溶出が、リン酸緩衝
液（pH6.5）において、0.1Mと1.5Mとの間のNaCl塩勾配
で行われる。カラムから溶出された画分は、好都合に
は、VacA特異的抗血清を用いたウェスタンブロットによ
りVacAについてアッセイされる。

VacAは、VacAを含む画分をプールし、そしてこのタン
パク質を濃縮することによって単離され得る（例えば、
硫酸アンモニウムでの沈澱、PBSへの再懸濁、そしてこ
れに次ぐサイズ分離による）。この後者の工程は、例え
ばPBSで平衡化されたSuperose6（Pharmacia）カラムに
おいて行われ得る。

好ましくは、この方法は、本発明の第一の局面で記載
したような、グルコースを補充した培地においてH.pylo
riを培養する工程をさらに包含する。

本発明はまた、H.pylori感染に対して生物をワクチン
接種するための方法を提供する。この方法は、上記のVa
cA試料を調製する工程、およびそれによって調製された
VacAを含む組成物、あるいはH.pylori特異的免疫原性を
保持するVacAのフラグメントまたは誘導体を生物に投与
する工程を含む。

本発明のワクチンは、当該分野で公知のいくつかの技
術により処方され得る。

本発明のワクチンは、予防的（感染を防ぐために）ま
たは治療的（感染後の疾患を処置するために）のいずれ
でもあり得る。

このようなワクチンは、単数または複数の抗原を含
む。通常は、「薬学的に受容可能なキャリアー」と組み
合わせる。この「薬学的に受容可能なキャリアー」に
は、それ自身では、組成物を受容する個体に有害な抗体
生産を誘導しない任意のキャリアーが含まれる。適性な
キャリアーは、代表的に大きく、ゆっくりと代謝される
マクロ分子である（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳
酸、ポリグリコール酸、アミノ酸重合体、アミノ酸共重
合体、脂質集合体（aggregates）（例えばオイル小滴ま
たはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子）。この
ようなキャリアーは当業者において周知である。さら
に、これらのキャリアーは、さらなる免疫刺激剤（「ア
ジュバント」）として機能し得る。

さらに、この抗原は、細菌類毒素（例えば、ジフテリ
ア、破傷風、コレラ、H.pyloriなどの病原体由来の類毒
素）に結合され得る。

免疫原性の組成物（例えば、抗原、薬学的に受容可能
なキャリアー、およびアジュバント）は、代表的には希
釈液（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノ
ール）など）を含む。さらに、補助的物質（例えば、湿
潤剤、または乳化剤、pH緩衝化剤など）が、このような
ビヒクル中に存在し得る。

ワクチンとして用いられる免疫原性の組成物は、免疫
学的に有効な量のアジュバントおよび抗原、ならびに必
要な場合、任意の他の上記の成分を含む。「免疫学的に
有効な量」によって、単回用量でまたはシリーズの一部
としてのいずれかでの個体への免疫学的に有効な量の投
与は、処置または予防に効果的であることが意味され
る。この量は、以下に依存して変化する：処置されるべ
き個体の健康状態および肉体状態、処置されるべき個体
の分類学的グループ（例えば、非ヒト霊長類、霊長類な
ど）、個体の免疫系の抗体合成能、所望される防御の程
度、ワクチンの処方物、処置している医者の医学的状態
の評価、および他の関連因子。この量は、日常の試験に
より決定され得る相対的に広い範囲内に入ることが期待
される。

投薬処置は、単回用量計画または複数回用量計画によ
り行われ得る。ワクチンは、他の免疫調節剤と共に投与
され得る。

特定の好ましい実施態様において、本発明によるワク
チンは粘膜アジュバント（mucosal adjuvant）との組み
合わせで投与される。この粘膜アジュバントは、好都合
には、本発明者らの同時係属中の英国特許出願第932617
4.1号で「粘膜アジュバント」と命名された、細菌のADP
−リボシル化（ribosylating）毒素の変異体である。

本発明は、ワクチンとして用いるための組成物の調製
について本発明の第一の局面に記載に従って調製された
VacAの使用を提供する。

ここで本発明を、単に例示する目的のために、以下の
図の参照と共に以下の実施例において記載する。

図１は、7Lのバイオリアクター中に2g/Lシクロデキス
トリンを含むbrucella broth培地中のH.pylori CCUG178
74の生育の速度論を示す；図２は、グルコースの流加が使用された以外は、図１
で示された実験と同一の実験の生育の速度論を示す。

図３は、グルコースを流加する（Ａ）、および流加し
ない（Ｂ）H.pyloriの増殖中のVacA濃度を示す。

図４は、吸光度280mmで測定したMatrexカラム（実
線）からのタンパク質の溶出プロフィールを示す。MaCl
濃度勾配を点線で示す。

図５は、Superose6カラムから部分的に精製されたサ
イトトキシン溶出物の、A₂₈₀のプロフィールを示す。

図６は、精製されたサイトトキシンのSDSゲルのクマ
シーブルーでの染色（Ａ）、およびＡで示された材料の
イムノブロット（B2）、ならびにプロセスされた37kDa
および58kDa産物示す同様の調製物（B1）を示す；およ
び図７は、サイトトキシンの空胞化活性の、調製された
VacAに対して惹起した抗血清による中和を示す。

図８は、スケールアップ（30L発酵槽）反応におけ
る、H.pyloriの増殖曲線およびVacA生産を示す。ここで
VacAは上清中（VacA（ｓ））、およびペレットと結合し
て（VacA（ｐ））見い出され得る。

実施例実施例１グルコース補充培地におけるVacA生産材料および方法細菌株 Helicobacter pylori CCUG17874（型株、培養
物コレクション、University of Goteborg）が、本研究
で用いられた。

培地および補充物以下の抗生物質（全てSigmaによ
る）によって補充されたColumbia blood agar（CBA）
（Difco）：セフスロジン6mg/L、バンコマイシン5mg/L
が、CFU決定のための固形培地として用いられた。2g/L
（2,6ジ−ｏ−メチル）−β−シクロデキストリン（C
D）（Teijin Lim.Tokyo,Japan）および上記抗生物質を
補充されたBrucella Broth（BB）（Difco）を、液体培
地として使用した。

保存接種源のための凍結アリコートが調製され、そし
て、溶液（グリセロール40％、ウシ胎児血清（HyClone,
Logan,Utah）20％、および0.4％CD）により1:2に希釈さ
れた。得られた懸濁液は、1.5mlのバイアルに分注さ
れ、−80℃で保存された。

液体培地での増殖最初の培養は、液体培地30mlを入れ
た130mlの三角フラスコ中で行った。凍結保存物1mlを培
養物に接種し、微好気条件で、36℃で36時間振盪培養
（100rpm、2.5cm幅（throw））した。フラスコを、BBL
Campy Pak envelope（Becton Dickinson）を用いて適切
な条件にした好気的ジャー（jar）に置いた。次いでこ
れらの培養物を用いて、150mlの培地を入れた500mlフラ
スコに接種し、そして上記と同じ条件下で培養した。こ
れらの培養物を用いて、バイオリアクターに接種した。

培養器および増殖条件回分発酵は、5Lの培地を含む7L
のバイオリアクター（MBRバイオリアクターAG,8620Wetz
ikon,CH）で行った。全ての培養物は、36℃で増殖し
た。pHの制御は行われなかった。溶存酸素圧力（tensio
n）（DOT）は、２段階の方法によりプレセット（pre−s
et）レベル（５％）に、自動的に保たれた。最初に、空
気流速を、培地のO₂要求の増大を満たすために、0.1L/L
・分から0.5L/L・分まで増大した。さらに増大が必要な
場合は、純粋なO₂を最大0.4L/L・分まで供給することに
よって得た。N₂およびCO₂の一定流量は、それぞれ0.2L/
Lおよび0.02L/L・分と同等に保たれた。攪拌速度は、13
0rpmに保たれた。攪拌器シャフトは、直径7cmを有する
２本のRhustonタービンを備え、そして、バイオリアク
ターの直径は17cmであった。

グルコースの流加 50％のグルコース溶液を用いた。

バイオマスの決定増殖を、CFU決定法および水のブラ
ンクに対する599nmでの光路1cmの光学密度（Perkin Elm
er35分光光度計）によりモニターした。試料の純度のチ
ェックは、グラム染色および試料をCBAプレート上で二
次培養（通常の大気中で37℃、24時間インキュベートし
た）することにより行った。

VacAタンパク質の定量分析条件発酵中の決定された時
間点において、培養試料を、8300×ｇで10分間の遠心分
離（Biofuge A,Heareus）を行った。

上清をトリクロロ酢酸で沈殿し、そしてBioRad Mini
Protean II装置を用いて、９％SDS−PAGEを行った。タ
ンパク質を、ニトロセルロースフィルター（Schleicher
＆ Schuell）に移し、次いで、VacAタンパク質に対し
て惹起したポリクローナル抗血清（Telfordら；前出）
と共に、一般インキュベートした。西洋ワサビペルオキ
シダーゼ結合二次抗体（Sigma）と共に２時間インキュ
ベートした後、免疫反応性のバンドを、４−クロロナフ
トール染色によって可視化した。各イムノブロットにつ
いて、培養上清中のシクロトキシンの量を、既知の量の
精製されたVacAタンパク質により得られた標準曲線を用
いて評価した。定量的評価を、Image Master Desk Top
Scanner（Pharmacia）を用いて、1D反射率方式で超スキ
ャナー（Ultrascanner）濃度計により行った。

グルコースアッセイ Glu−cinet、グルコース試験（Sc
lavo S.p.A.,Italy）を使用した。

結果図１に示すように、H.pyloriの増殖は、グルコースを
流加しない場合には、培地中にグルコースが存在する限
り、指数関数的であり、そして、これらの条件下での倍
加時間は、7.5時間であると見積もられた。定常期は、
培地のO.D.が約2.5の値に到達した時に、結果として起
こる。本発明者らは、CFUの測定も、増殖中の様々な磁
気の間に行った（図１）。明らかに示されているよう
に、CFU曲線は、グルコースが涸渇されない限り、O.D.
曲線によく相関していた。本明細書中に記載された培養
条件において、本発明者らは、培地のpH値の低下（33時
間の増殖後には6.9から6.7に）を観察した。pH値は次い
で、増殖期の最後には7.4の値に到達し、そして定常期
の終わりには7.9の値に到達した。broth中のVacAの蓄積
を、図３（Ａ）に報告する。VacAの最大濃度（5mg/L）
は、65時間で到達し、そして少なくとも10時間一定のま
ま保たれることが観察され得る。これらの最初の結果よ
り、生産されるVacA量が、蓄積された全細胞量に関係し
得ることが推測された。

この仮説を証明するために、グルコースの流加を用
い、この炭素源およびエネルギー源が常に培地中に存在
することを確実にした。図２は、これらの条件下で増殖
が、7.7O.Dユニットの値および３×10⁹/mlのCFUに達す
ることを示す。グルコースが完全に代謝された時（図
１）に得られた結果とは逆に、この場合時間に対するCF
U曲線が、O.D.値を用いて得られた曲線と、より関係し
ている。グルコースの流加なしの発酵（図１）について
は、定常期におけるpH値でさえ、明らかに異なる。この
型の発酵においては、グルコースの存在は、培地の緩衝
能力（CO₂生産能力により）が増大し、そして細胞容菌
を回避した。最終的なpH値は、グルコースを流加しない
発酵の7.9に対し7.6であった。H.pyloriをグルコース存
在下で培養した場合、培地中のVacA濃度は、19mg/Lとい
う非常に期待できる値に到達した。

実施例２スケールアップ 15Lの培地（トリプトン10g/L、Y.E.5g/L、NaCl5g/L、
シクロデキストリン2g/L、グルコース5g/L（本培地は、
BBの単純化したものである）からなる）を入れた30Lの
発酵槽中で、H.pyloriのスケールアップ培養を行った。
表面の曝気は、酸素および攪拌によりDOTを５％に保つ
ことにより行った。5g/Lのグルコースの流加を、OD反応
が約３に到達した時供給した。倍加時間は、５時間であ
った。pHの制御は行わなかった。得られた増殖曲線およ
びVacA生産を、図８に示す。VacAは上清中（VacA
（ｓ））、およびペレットと結合して（VacA（ｐ））見
い出され得る。

実施例３ VacAの精製 Helicobacter pylori CCUG17874株（実施例１）の約5
Lの培養物から得たバイオマスを、11000×ｇ、20分間の
遠心分離で除去し、そして上清液（約4L）を、固体の硫
酸アンモニウムを加えることにより、50％飽和にした。
この懸濁物を、11000×ｇで20分間遠心分離し、そし
て、沈澱したタンパク質を、100mM NaCl、20mMリン酸塩
pH6.5（緩衝液Ａ）に再懸濁した。このようにして得ら
れた懸濁物を、緩衝液Ａに対して大規模に透析した。

透析物は、250mLの容量に調節し、そして流速2.5mL/
分で、緩衝液Ａで平衡化したMatrex^TM（硫酸セルロー
ス、Amicon,Danver,Mass.）を含む2.5×11cmカラム（Ec
ono column,Bio Rad）にアプライした。緩衝液Ａで大規
模に洗浄した後、カラムから20mMリン酸緩衝液（pH6.
5）中のNaCl濃度勾配（0.1M〜1.5M）により、タンパク
質を溶出し、そして、280nmにおける吸光度によってモ
ニターした（図４）。0.5Mと0.8M NaClとの間の溶出物
（VacAタンパク質を含む）を回収し、そして硫酸アンモ
ニウムによって50％飽和にした。この懸濁物を11000×
ｇで20分間遠心分離し、そしてペレット化したタンパク
質を3.5mLのPBSに再懸濁した。不溶性物質を、85000×
ｇで30分間の遠心分離によって除去し、そして、透明な
溶液を、Superose6（Pharmacia,Uppsala,Sweden）を充
填した16mm×81mmカラムにアプライした。タンパク質
を、14mL/時間の流速でPBSにより溶出し、そして280nm
の吸光度によってモニターした（図５）。

カラムからのピーク２（図５）に対応する画分は、変
性ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクマシーブル
ー染色による分析においては、その顕著な94kDaのポリ
ペプチドを含む（図6A）。特異的ウサギ抗VacA抗血清を
用いたこれらの産物のイムノブロッティングにより、94
kDaのポリペプチドが、VacAタンパク質であることが明
らかにされた（図6B）。時折、37kDaおよび58kDaのポリ
ペプチドの跡がイムノブロットにおいて検出され得た。
これは、Telfordら（J.Exp.Med.,179:1653,1994）によ
り既に述べられたように、プロセスされた分子に対応す
る。

精製された画分中のタンパク質濃度は、ウシ血清アル
ブミンを標準として用いたMicro BCAタンパク質アッセ
イ試薬キット（Pierce,Rockford,Ill）を用いて測定し
た。1Lの培養物あたり約1gのタンパク質が得られ、これ
は全毒素の15％の収率に相当した。ウサギを、アジュバ
ントとして1mg/ml水酸化アルミニウム溶液1ml中に、精
製した毒素各25μｇを、７日の間隔をあけて４用量を皮
内に注入することにより免疫した。免疫グロブリンを、
プロテインＧセファロースを用いて精製し、そして、イ
ンビトロの空胞形成アッセイにおいて、そのVacAサイト
トキシン活性を中和する能力をテストした（Papiniら、
Mol.Microbiol 7:323,1993）。精製したIg画分の連続的
な希釈物を、細胞に加える前に、培養培地100μｇ中の
精製毒素1.85μｇと共にインキュベートした。1:100に
希釈した場合において、抗体は、完全にサイトトキシン
活性を中和し得た（図７）。

実施例４ VacAを用いた免疫化による被験体の予防マウス（６週齢CD1/SPFおよびBALB/C（Charles Rive
r,Calco Italy））に、単離した新鮮なH.pylori（本発
明らの対応する英国特許出願第9419661.5号において記
載された。本明細書中に参考として援用される）を注入
した。

マウスの、H.pylori感染の免疫化による予防の可能性
を評価するために、本発明により得られた精製されたVa
cAを、１日、14日、および21日でH.pylori100mgのVacA
とLT粘膜アジュバントとを組み合わせて経口投与し、そ
してLT100mgを各用量で投与した。

28日、30日、および32日目において免疫したマウス
に、上記の感染手順に従って、H.pyloriをチャレンジし
た。42日目に、マウスを屠殺し、H.pyloriによる胃粘膜
のコロニー形成を評価した。この結果を表１に示す。

表１−VacAを用いたワクチン接種による予防処置感染予防（％）生理食塩水 5/5 ０ LT 3/4 25 VacA 3/4 25 VacA＋LT 1/3 77

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者テルフォード，ジョンライルドイタリア国イ−53010 モンテリギオニ，ウオピーニ，ビアサンブコ， 43 (56)参考文献特開平５−260955（ＪＰ，Ａ) 国際公開93／16723（ＷＯ，Ａ１) 社団法人日本生化学会編「新生化学実験講座１タンパク質▲Ｉ▼−分離・精製・性質−」第１版（1990年２月26日) 株式会社東京化学同人ｐ．169−175 ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ＆Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，Ｏｃｔｏｂｅｒ 1993，Ｖｏｌ．５（ｓｕｐｐｌ２）：Ｓ76−Ｓ78 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 1/20 C12P 21/00 A61K 39/02 A61K 39/106 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】空胞化サイトトキシンを生産するためにH.
pyloriを培養するための方法であって、ここで該方法
は、1g/Lを越えるグルコースを含む培地においてH.pylo
riを培養し、そして該培地のグルコース濃度が、培養期
間を通じて2g/Lと6g/Lとの間に維持される、方法。
【請求項２】前記培地が、グルコースおよび血液産物を
補充したBrucella Broth培地である、請求項１に記載の
方法。
【請求項３】前記培地が、グルコースおよびシクロデキ
ストリンを補充したBrucella Broth培地である、請求項
１に記載の方法。
【請求項４】前記グルコースが、複数回または流加培養
プロセスにおいて連続的に流加することによって供給さ
れる、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】H.pylori空胞化サイトトキシンを生産する
ための方法であって、請求項１〜４のいずれか１つに記
載のグルコース補充培地において、H.pyloriを培養する
工程を包含する、方法。
【請求項６】前記サイトトキシンを硫酸セルロースマト
リックスに吸着し、およびその後、塩濃度勾配を用いて
それを溶出することにより、該サイトトキシンを精製す
る工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】H.pylori空胞化サイトトキシンを精製する
ための方法であって、以下の工程：ａ）請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法によって
得られたH.pyloriの発酵液の上清中のタンパク質を濃縮
するために、該上清を処理する工程；ｂ）100mM NaClに相当する塩濃度を含有する緩衝液中
に、該タンパク質を懸濁する工程；ｃ）硫酸セルロースカラムに該タンパク質を吸着させる
工程；ｄ）リン酸緩衝液pH6.5中の0.1Mから1.5MのNaClに相当
する塩濃度勾配を用いて、カラムから結合した該タンパ
ク質を溶出する工程；ｅ）該空胞化サイトトキシンを含む溶出物の画分を選択
する工程；ｆ）必要に応じて、該サイトトキシンをさらに濃縮し、
そして制御された細孔マトリックスを用いて該濃縮物を
サイズ分離する工程、を包含する、方法。
【請求項８】工程ａ）が、硫酸アンモニウム中の沈澱反
応を包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】工程ａ）およびｂ）が、試料の接線濾過お
よびダイアフィルトレーションを含む、請求項７に記載
の方法。
【請求項１０】前記サイトトキシンの精製が、請求項７
〜９のいずれか１つに記載のように行われる、請求項６
に記載の方法。
【請求項１１】ワクチンとして使用するための組成物の
精製において、請求項７〜10のいずれか１つに記載の方
法により精製される場合の、H.pylori空胞化サイトトキ
シンの使用。
【請求項１２】H.pylori感染に対して生物にワクチン接
種するための薬学的組成物であって、請求項７〜10のい
ずれか１つに記載される方法によって精製されたH.pylo
ri空胞化サイトトキシン、および薬学的に受容可能なキ
ャリアを含む、薬学的組成物。