JP3170276B2 - ニューモシスティス・カリニの検出用核酸プローブ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本願発明はニューモシスティス・カリニ（Pneumocyst
is carinii）種に属する真菌類（fungi）の検出に関す
るものであり、さらに具体的に言えば、ニューモシステ
ィス・カリニ（Pneumocystis carinii）の特殊検出用の
核酸プローブ及び組成物をその使用方法とともに提供す
るものである。

発明の背景 本願明細書中で用いられている「ニューモシスティス
・カリニ（Pneumocystis carinii）」という術語は、小
サブユニットrRNAの塩基配列に基づく系統発生学的分類
法によってこのように分類された真菌を指す。（エドマ
ンJ.C.（Edman,J.C.），コバックス,J.A.（Kovacs,J.
A.），マシュー,H.（Masur,H.），サンティ,D.V.（Sant
i,D.V.），エルウッド,H.J.（Elwood,H.J.）とソーギ
ン,M.L.（Sogin,M.L.）［1988］ネイチャー（Nature）,
334:519）ニューモシスティス・カリニ（Pneumocystis
carinii）はニューモシスティス（Pneumocystis）属の
一種である。ニューモシスティス・カリニは気道下部を
冒す日和見性病源体である。この原虫は小さい単細胞生
物で、哺乳類宿主中に２つの基本型すなわち栄養体（tr
ophozoite）と嚢胞（cyst）で存在すると信じられてい
る。ニューモシスティス・カリニは人及び大部分の哺乳
類宿主に感染する。

この寄生生物は正常個体中では稀にしか病気を引き起
こさないにもかかわらずある種の免疫不全の状況では、
生命をおびやかす間質性肺炎（interstitial pneumoni
a）を特徴として引き起こし、後天性免疫不全症候群の
罹患及び死亡をもたらす最大原因の１つである。

肺嚢腫肺炎（Pneumocystis pneumonia）の現在の診断
方法は、気管支肺胞洗浄（Bronchoalveolar lavage）サ
ンプルやもっとよく扱われるものでは、誘発喀痰サンプ
ルのような気道サンプルに対するゴモリメセナミン銀
（Gomori's methenamine siver）染色、トルイジンブル
ー（Toluidine Blue）染色，ギムザ（Giemsa）染色とい
うような組織学的技術の利用を含む。これらの染色法
は、結果の解釈に細胞学者の専門的知識を必要とする。
多数の迅速な実験室内での方法が最近利用可能になっ
た。抗体に基づく検査法もあれば、DNAに基づく検査法
もある。ニューモシスティス属に特異的で採取した物質
中に存在する他の真菌類や細菌類とは反応しない核酸プ
ローブを提供することが本発明の一つの側面である。こ
のようなプローブは伝統的方法に伴う多くの不便を避け
るような種々のアッセイ系において利用可能である。通
常のアッセイ条件下でプローブにとって結合しやすい標
的領域にハイブリダイズ可能なプローブを供給すること
も本発明の様相である。コーンら（Kohne et al）はrRN
A配列に対するプローブの作成方法について論じている
（Biophysical Journal8:1104−1118,1968）が、彼ら
は、ニューモシスティス・カリニに特異的にプローブの
作成に必要な教示内容は与えていない。

ペースとキャンベル（Pace and Campbell）は様々な
細菌種からとったリボソームリボ核酸の類似性とその類
似性の程度を低量的に測定するためのハイブリダイゼー
ション法を論じている（Journal of Bacteriology 10
7:543−547,1971）。同様に、ソーギン（Sogin），ソー
ギン及びウーズ（Woese）は、系統発生学的関係の評価
に、異なるリボゾームRNA分子の一時構造の特徴づけを
用いる理論的及び実際的側面について論じている（Jour
nal of Molecular Evolution1:173−184,1972）。フォ
ックス（Fox），ペックマン（Pechman）とウーズは原核
生物の系統化へのアプローチとして16Sリボソーム:RNA
の比較分類について論じている（International Journa
l of Systematic Bacteriology27:44−57,1977）。しか
しながら、これらの文献では、真菌類及び、とくに人の
ニューモシスティス・カリニに関してコーンの数えの欠
陥をおぎなうことは不可能であり、臨床サンプル中にお
けるニューモシスティス・カリニ検出アッセイに有用な
ニューモシスティス・カリニに特異的なプローブを提供
しない。

ホーガンら（Hogan et al）は真正細菌類（eubacteri
a）及び真菌類の広範な代表的生物にハイブリダイズす
ると主張されている多くのプローブについて記述してい
る（ヨーロッパ特許公報WO88/03957）。しかしながら、
ホーガンらは本発明のプローブの開示はしておらず、ま
たそのようなプローブのデザインに必要な教示内容も与
えていない。

エドマン（Edman），コバックス（Kovacs），マスー
ル（Masur），サンティ（Santi），エルウッド（Elwoo
d）とソーギン（Sogin）は（Nature 334,pp519−522,1
988）はラットのニューモシスティス（Pneumocystis）
の18SrRNAに対する３種のプローブセットについて記載
している（Nature,343,pp519−522,1988）。ラットのニ
ューモシスティスが人間の疾患を引き起こし得るか否か
がわかっていないため、ラットのニューモシスティス感
染と人のニューモシスティス感染との間の相互関係で、
明らかになっているものではない。

エドマンら（Edman et al）は本発明に係る人のニュ
ーモシスティスプローブもフェレット（Ferret）ニュー
モシスティスプローブも開示しておらず、またそのよう
なプローブのデザインに必要な教示内容も与えていな
い。

リボソームは遺伝的情報を細胞のタンパク質や、生命
の主要な構成および触媒要素に翻訳する唯一の公知手段
として使えるのでリボソームはすべての生物にとって深
く重要である。すべての細胞にリボソームが存在するこ
とが、この重要性の明らかな現われである。

リボソームは、少なくともサッカロミセス・セレビシ
ェ（Saccharomyces cerevisiae）では5S,5.8S,18S,rRNA
として示される４つの別個のrRNA分子を含む。これらの
名称は歴史的に、その沈降速度により決定されたRNA分
子の大きさに関連している。しかし、実際には、リボソ
ームRNA分子の大きさは生物種間で微妙に異なってい
る。にもかかわらず、5S,5.8S,18S,28SrRNAは、通常ど
のような真正菌類細胞（eubacterial cell）でも相同R
NA分子に際する総称的名称として使用されており、本明
細書中においても、この慣例に従う。本明細書中で用い
ているように、プローブとは、定義された、前もって決
定しておいたストリンジェンシー（stringncy）条件下
で、プローブが特異的に（すなわち、優先的に下記のハ
イブリダイゼーションを参照）標的核酸配列にハイブリ
ダイズすることを可能にする、特定のヌクレオチド配列
を、デザインもしくは選択によって含む、合成のあるい
は生物学的に産生された核酸（DNA又はRNA）を言う。ハ
イブリダイゼーション特性に加えて、プローブは、特定
のアッセイ条件下で、適切に最適に機能することに関係
するある種の構成要素も含んでも良い。例えば、ヌクレ
アーゼによる分解に対して抵抗性を改善したり（すなわ
ち末端のキャッピング（end capping）によって）、検
出リガンド（すなわち蛍光、³²P,ビオチンなど）を持っ
たり、あるいは固相支持体上への保持を容易にする（す
なわちポリ−デオキシアデノシン“テール（tail
s）”）ために、プローブに部分的に修飾を施しても良
い。このような修飾は、ハイブリダイゼーションアッセ
イにおいて標的、非標的組織間の識別を有効に行える能
力という、基本的なプローブの機能をさらに精巧なもの
に作りあげる。ハイブリダイゼーションは、伝統的に、
あらかじめ設定した反応条件下で２つの部分的もしく
は、完全に相補的な核酸鎖が反平行なかたちで集まっ
て、特異的かつ安定な水素結合を有する二本鎖の核酸を
形成する過程として理解されている。

具体的な一組みのハイブリダイゼーション条件中のス
トリンジェンシーは、２つの核酸間の誤対合（mispairi
ng）の度合い及び幾何学的性質とともに、プローブ／標
的二重らせん（duplex）の塩基組成によって定義され
る。

ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液
中に存在するイオン種の濃度及び種類、存在する変性剤
の種類と濃度、及び／あるいはハイブリダイゼーション
の温度によっても支配されうる。通常、ハイブリダイゼ
ーション条件が厳しくなるにつれて、安定な複合体の形
成が可能ならば、プローブは長い方が好まれるようにな
る。当然の結論として、ハイブリダイゼーション条件
（例えば、行れるアッセイのタイプに基づく）のストリ
ンジェンシーは使用されるに好ましいプローブにある種
の特徴を要求する。このような関連はより理解されてお
り、したがって当業者による巧みなとり扱いが可能であ
る。一般的に、プローブの長さにもよるが、当業者の間
では、約0.9モルの塩溶液中でおよそ35℃−65℃がスト
リンジントな条件（stringent conditions）として理解
されている。

発明の要約 本発明の種々な原理と側面に従って、特定の条件下で
ニューモシスティス・カリニのリボソームRNA分子（rRN
A）もしくは、rRNA遺伝子（rDNA）にハイブリダイズし
テストサンプル中に存在すると予想される他の真菌類、
細菌類のrRNAやrDNAには同じ条件下でハイブリダイズし
ないようなDNAあるいはRNA塩基配列からなる核酸プロー
ブ及びプローブセットが提供される。つまり本発明のプ
ローブは、臨床サンプル中のニューモシスティス・カリ
ニの特異的検出に役立つ核酸ハイブリダイゼーションア
ッセイの開発の基礎を提供する。

本発明者らの経験では、このような核酸ハイブリダイ
ゼーションに基づくアッセイは、テストサンプル中の細
菌類、真菌類の検出のための目下のところもっとも有効
な微生物学的方法に関して高度の利用可能性をあたえる
べく発見されたものであり、下記の一般的特徴を有す
る。

ａ） 増大感度、すなわち与えられたサンプル中の細菌
類あるいは真菌類をより高頻度で検出する能力； ｂ） 安価な試薬の使用と労力削減によるアッセイコス
トの潜在的に重要な削減； ｃ） 標的細菌類あるいは真菌類の生化学的に特異な菌
株でさえ正確に同定できる能力； ｄ） このような検査が検査前にサンプルからの標的細
菌類あるいは真菌類の単離を必要としないことによって
得られるより迅速な結果。

本発明のプローブをrRNAに対応するものにすることに
よって受ける他の利点には、検出されるrRNAは、細胞質
量（cellular mass）の重要成分を構成しているという
事実が含まれていることが認識されている。細胞内リボ
ソーム含有量の推定はさまざまであるが、活発に増殖し
ているニューモシスティス・カリニは、細胞あたり50,0
00リボソーム以上、したがってrRNAの各々について50,0
00コピー以上（リボソーム中に化学量論的に1:1:1:1で
存在）含有し得る。これに対して、遺伝子やそのRNA転
写産物のような他の細胞内標的分子となりうるものは、
含有量がはるかに低いためリボソームのように理想的と
は言えない。さらに予想外の利点は、rRNA（及びそれら
を特定している遺伝子）は同世代での微生物（organism
s）間で側方転移（lateral transfer）を受けにくいと
見られることである。したがって、例えば、同世代微生
物間に側方伝達（lateral transmission）を受ける可能
性のある、プラスミドに運ばれる遺伝子又はその生成物
について多分あてはまる遺伝子特異的標的よりむしろ微
生物特異的分子標的をrRNAの一次構造は与える。加え
て、本発明では、これまでに検査されたすべてのヒト由
来ニューモシスティス・カリニの単離物において十分に
類似しているニューモシスティス・カリニrRNA標的配列
に対するプローブを提供し、当該プローブはこのような
すべてのヒトのニューモシスティス・カリニにおける標
的領域にハイブリダイズすることができる。都合のよい
ことに、ほとんどのヒト以外のニューモシスティス・カ
リニrRNAでは、これらの同一のrRNA標的配列は十分に異
なっているため、プローブ1485及び1487がヒトのニュー
モシスティス・カリニrRNAにハイブリダイズする条件下
では、これらはほとんどヒト以外のニューモシスティス
・カリニrRNAにはハイブリダイズしない。これらのプロ
ーブの特性は、おのの包括性（inclusivity）及び排他
性（exclusivety）として定義される。

本発明の他のプローブである1159,1162,1484,1486,14
88,1491,1492,1486は、プローブ1485,1487と同様にテス
トされたヒトのニューモシスティス・カリニのすべての
単離物に関して包括的（inclusive）であり、さらに、
これらのプローブはヒト以外ニューモシスティス・カリ
ニにもハイブリダイズする。プローブ1493,1494,1495,
は白イタチ（ferret）のニューモシスティス・カリニに
はハイブリダイズするがヒトのニューモシスティス・カ
リニにはハイブリダイズしない。プローブ1159は他の真
菌類にもハイブリダイズし、ある種のアッセイ方式では
特に役立ち得るプローブの組みあわせの有用な構成要素
の１つである。現在のところ、ヒト以外の起源のニュー
モシスティス・カリニも人に感染可能かどうか明らかで
はないので、すべての上記のプローブは、少なくとも研
究アッセイで初期のうちは有用であろう。

ニューモシスティス・カリニに関する本発明のプロー
ブの顕著な包括性及び排他性を有するプローブを作成で
きたという発見は、予測不可能かつ予想外であった。

図表の簡単な説明 以下の表及び図を参照することで、本発明の原理及び
様相をさらに深く理解しうると推測する。

第１表−本発明の望ましい18S rRNAを標的とするプ
ローブのヌクレオチド配列をこれらのニューモシスティ
ス・カリニ標的ヌクレオチド配列と並べて示す。サッカ
ロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）由
来の18S rRNAの対応部位を比較のため示す。RNA（標
的）塩基配列は５′から３′の向きに記されており、プ
ローブの塩基配列はDNAで３′から５′の向きに記され
ている。プローブは、その包括性及び排他性の反応（be
havior）を左右するバリエーションのコア領域とともに
示してある。

第２表−ドットブロット・ハイブリダイゼーション・
アッセイにおいて、ニューモシスティス・カリニ菌株か
らのDNA及びRNA調製物の代表的サンプルに対する望まし
い18S rRNAプローブの包括性反応を例示している。

第３表−ドットブロット・ハイブリダイゼーション・
アッセイにおいて、ニューモシスティス・カリニ以外の
真菌類及び細菌類の代表的サンプルに対する望ましい18
S rRNAプローブの排他性反応を例示している。

第１図−イン−サイチュー（In−situ）ハイブリダイ
ゼーションデータ：ローダミン−Ｘでラベルしたプロー
ブ1486の（Ａ）ニューモシスティス・カリニ陽性の患者
の気管支洗浄（bronchial lavage）サンプル（1000
X），及び（Ｂ）ニューモシスティス・カリニ陽性の患
者の誘発喀痰サンプル（1000X）に対するイン−サイチ
ューハイブリダイゼーションの結果 発明及び最良の実施形態の詳細な説明 プローブ開発計画 本発明のプローブの開発の第１段階は、まず、18S r
RNA中で、ニューモシスティス・カリニ特異的核酸ブロ
ーブの標的部位として役立ちうる領域の同定を含む。実
際には、ニューモシスティス・カリニ以外のどの生物が
どんなテストサンプル中に存在するかを非分析的に予想
することは困難である。ニューモシスティス・カリニ以
外のかかる潜在的な真菌類及び細菌類が非常に多数いる
ためどの与えられたプローブの塩基配列についても排他
姓を証明することは、予測不可能なだけでなく、非常に
困難でありかつ骨が折れる。最終的にプローブを使用し
てスクリーンするすべてのテストサンプル中に存在しう
るニューモシスティス・カリニ以外の真菌類及び細菌類
がどのような種類のものであるか調べる必要を除くた
め、より厳格な基準を採用した。

これは、ニューモシスティス・カリニ間及びニューモ
システィス・カリニと他の真菌類間の系統発生論的関係
についての知識を必要とする。具体的には、効果はある
が前もって立証されていない仮説が採用された。その仮
説とは、ニューモシスティス・カリニの代表的かつ進化
論的な近縁種のrRNAにおける相同領域とは十分異なる、
ニューモシスティス・カリニrRNAにおける特定の標的領
域が同定可能ならば、そのような配列に対するプローブ
は、ハイブリダイゼーションアッセイによってニューモ
システィス・カリニとその近縁種を識別するために使用
できるということを決定することで排他性の基準が満足
され得るというものである。系統発生学的観察にもとづ
いて、そこで、その実際の同一性は必ずしもわからない
場合でも、より離れた関係にある微生物のrRNA塩基配列
は、前述したニューモシスティス・カリニの進化論的な
近縁種をよりさらに、塩基配列の特定領域において、予
想可能であるほど異なっているはずであると推定した。
しかしながら、このような領域が存在するか、また存在
するとしてrRNAのどこにそのような領域は位置している
かを非分析的に推測することは不可能である。

核酸ハイブリダイゼーションプローブの有効な標的部
位となりうるニューモシスティス・カリニrRNAの領域を
同定する際の最初の段階として、数種の代表的なニュー
モシスティス・カリニの18S rRNAの核酸塩基配列を決
定した。

ニューモシスティス・カリニの18S rRNA遺伝子コー
ド領域を遺伝子増幅法（polymerase chain reaction）
（米国特許第4,683,202号）によって、約0.5から1.0μ
ｇのヒトあるいは白イタチの肺組織に感染したニューモ
システィス・カリニの全DNAをプライマー936（フォワー
ド（forward）プライマー）とプライマー935（リバース
（reverse）プライマー）を用いて増幅した。プライマ
ー936はその真菌の18S rRNAに相補的な18S rDNA遺伝
子鎖にハイブリダイズするようにデザインされる。プラ
イマー935は18SリボソームRNA遺伝子のrRNA類似の鎖に
ハイブリダイズする。増幅した18S rRNA遺伝子を標準
的な研究室用プロトコール（マニアティスら（Maniatis
etal）1982,Molecula colning;A Laboratovy Manual,C
old Spring Harbor Laboratory,New York pp,545）によ
って、このプライマーに組み込まれた制限エンドヌクレ
アーゼ部位を用いてクローニングした。塩基配列決定
は、サンガーら（Samger et al）,1977,Proceedings of
the National Academy of Science,USA 74;5463−546
7の方法に従って行われた。決定されたニューモシステ
ィス・カリニのrRNAヌクレオチド配列は、他の入手可能
なrRNAヌクレオチド配列、とくにサッカロミセス・セレ
ビシエのものと比較した。異なる宿主特異的ニューモシ
スティス・カリニとその近縁種であるサッカロミセス・
セレビシエとのrRNAヌクレオチド配列の比較は特に有用
であることが判明した。異なる宿主特異的ニューモシス
ティス・カリニとニューモシスティス以外の真菌との間
で異なるような、配列のいくつかの領域を同定した。18
S rRNA配列中におけるこれらの領域の位置を第１表に
示す。本発明の目的とする状況において、ヒト、ラット
あるいは白イタチ（ferret）のニューモシスティス・カ
リニ；もしくは３つすべてに選択的にハイブリダイズす
るようなオリゴヌクレオチドプローブ（33−48ヌクレオ
チド長さ）がデザインされた。

これらは次のようにデザインされた。１） ニューモ
システィス・カリニをサッカロミセス・セレビシエか
ら、あるいはニューモシスティス・カリニを他の真菌類
から識別するような核酸塩基配列の違い［コア．バリエ
ーション領域中で大文字を入れる上段の活字ケース中の
文字で示されている］を最大限利用する。２）標的rRNA
中及びプローブ分子間両方に局在している自己相補的効
果を最小限にする。他の上記の（背景）中で議論されて
いるものと同様にこれらのパラメータを最高に活性する
ことは、望ましい特異性をハイブリダイゼーション効率
を備えたプローブに帰結する。

第２表はニューモシスティス・カリニの代表的サンプ
ルに対する望ましいプローブのサザン・ブロットハイブ
リダイゼーションアッセイによる包括性の反応を例示し
ている。

第３表はニューモシスティス・カリニ以外の真菌類及
び細菌類に対する望ましいプローブのドットブロット・
ハイブリダイゼーション・アッセイで示す排他的反応を
例示している。

プローブの物質的説明 前述のプローブ選択方法により臨床サンプル中のニュ
ーモシスティス・カリニ同定に有用な数種のプローブを
与えた。1159,1162,1484,1485,1486,1487,1488,1491,14
92,1493,1494,1495,1496,1497のプローブはすべて18S
rRNA塩基配列からデザインされている。以下の望ましい
オリゴヌクレオチドプローブを本明細書に開示する； プローブと、ニューモシスティス・カリニの18S rRNA
における前記プローブの標的配列を表１に示す。サッカ
ロミセス・セレビシエ18S rRNAの対応するヌクレオチ
ド位置も同様に示す。加えて、２種のオリゴヌクレオチ
ドプライマー935と936が、このような培養不可能な生物
中のこれらの遺伝子解析を容易にするため、ニューモシ
スティス18S rRNA遺伝子のPCR増幅のためデザインされ
た。これら２つのプライマーは、L.メドリン（Medli
n）,H.L.エルウッド,S.S.スティッケル（Stickel）とM.
L.ソーギン（Gene71;491−499,1988）に記載されてい
る。これらのプライマーの塩基配列は以下に示してお
り、明確に表されている。

プライマー935と963に関して、小文字活字ケース中の
文字部分は有用な制限エンドヌクレアーゼ認識クローニ
ング部位を増幅産物に付加するようデザインされてい
る。大文字活字ケース中の文字部分は、18S rRNA遺伝
子の５′（プライマー936）もしくは３′（プライマー9
35）末端に特異的にハイブリダイズするヌクレオチドに
対応する。

表１に示されているいくつかの標的領域に対して２以
上のプローブがデザインされた。その標的領域は、１）
ニューモシスティス・カリニの異なる単離物の配列の補
体（この場合そのような単離物はいくつかの配列差異を
示す）、又は２）すべてのニューモシスティス・カリニ
（この場合、ニューモシスティス・カリニ単離物間にほ
とんど又は全く配列バリエーションが見い出せなかっ
た）に対応している。各々のプローブの基礎となってい
る（即ち相補的である）特定の塩基配列が表１にプロー
ブと標的塩基配列を並べたものを観察することで与えら
れている。したがって、例えば、表１をみればプローブ
1484はヒトのニューモシスティス・カリニ配列に対し
て、この標的領域を通して相補的であり、関連したプロ
ーブ1493は白イタチ（ferret）のニューモシスティス・
カリニに相補的であることがわかる。（塩基対の法則
は、ＡはＴもしくはＶとＧはと１対になるように指示し
ているが、第１近似（firat approximation）に応じて
種々の非標準的塩基対［すなわち、G:U,G:T又はA:G］
が、特定の目的のためにプローブに導入され得る。）し
かしながら、ニューモシスティス・カリニ菌株間で１つ
もしくは両方のプローブによるクロス−ハイブリダイゼ
ーションが起こることが期待される（とともに望まし
い）。上述したプローブの特異的ハイブリダイゼーショ
ン反応は、それらが使用されたアッセイ方式に、たいへ
ん強く依存している。逆に、アッセイ方式は特定のプロ
ーブの最適デザインの特徴をある程度指示する。本発明
のプローブの“本質（essence）”は上で名づけたプロ
ーブのヌクレオチド鎖に限定されると解釈されるべきで
はない。例えば、後述するドットブロットアッセイ（及
びある種の他の予期されるアッセイ）中では、これら特
定のオリゴヌクレオチドの長さが用途により最適化され
た。当業者間では、最適プローブ長は、選択されたハイ
ブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの１つの
機能（function）であることは、よく知られており、従
って、本発明のプローブの長さも、それに伴って変化さ
せてもよい。また１つ以上のプローブからなる組みわわ
せについて考慮すると、すべてのその用いられるどの特
定の方式においても一致した挙動をすべてのプローブが
示すことが望ましい。したがって、ある特定のプローブ
の正確な長さは、ある程度まではその特定の意図されて
いる使用法を反映すると予想される。

本明細書に記されたプローブの“本質（essence）”
は、上記した、また表１（コア・バリエーション）に記
載されたニューモシスティス・カリニに特異的な配列の
発見及び利用に存する。

プローブ反応のハイブリダイゼーション解析 表１に示される塩基配列データは、本発明によるプロ
ーブが他の真菌類や細菌類を排除し、ニューモシスティ
ス・カリニを特異的に検出する点に於いて、プローブの
有効なハイブリダイゼーション反応が多様であることを
示唆する。しかし、相対的にニューモシスティス・カリ
ニの塩基配列はほとんど調べられていない。塩基配列解
析により調べられていない他のニューモシスティス・カ
リニに塩基配列のバリエーションが存在することもあり
得る。そのようなバリエーションはこれら未調査のニュ
ーモシスティス・カリニ単離物に対して使える見込みの
あるプローブによるハイブリダイゼーションを弱めるか
又は排除する可能性もある。プローブの包括的な性質と
同様に重要なのは、プローブの排他的な性質、即ちニュ
ーモシスティス・カリニ以外の真菌類や細菌類に対する
プローブの反応性である。潜在的にニューモシスティス
属の微生物を含むテストサンプル中にひょっとして存在
するかもしれないニューモシスティス・カリニ以外の菌
株数や種類は非常に多い。

それ故に、代表的なニューモシスティス・カリニ及び
ニューモシスティス・カリニ以外の真菌類や細菌類に対
するプローブの特性をドットブロット法を利用したハイ
ブリダイゼーション分析により決定した。

本発明の個々のプローブの各々に対するハイブリダイ
ゼーションデータが提供されている一方で、個々のプロ
ーブの総和であるハイブリダイゼーション特性を示すプ
ローブの有用な組み合わせ（セット）もまた、このデー
タによって明確に予測されることが留意されるべきであ
る。

実施例1:プローブハイブリダイゼーション反応のサザン
ブロット解析 サザンブロット解析は、周知の手法に従い、アクリル
アミド又はアガロースゲル上でDNAをサイズ分け（size
fractionating）し、ゲル内でDNAを変性させ、電気泳動
又は毛管現象（すなわち、ブロッティング）によりDNA
を当該ゲルからニトロセルロース、ナイロン或いは他の
誘導体化膜（derivatized membranes）のようなフィル
ター（これらは特にこの目的のための市販品を容易に入
手できる）上に移して固定する。続いて、そのDNAに対
し様々な条件（即ち、ストリンジェンシーズ）のいずれ
かに於て、目的のヌクレオチド配列やプローブを用いて
ハイブリダイゼーションテストを行う。ストリンジェン
トな条件下では、標的となる塩基配列に対してより高い
相補性をもつプローブが、相補性のより低いものより強
くハイブリダイズする。

表２に示した実験に用いたDNAはニューモシスティス
・カリニ陽性の（ヒト）患者の気管支洗浄（bronchial
lavage）サンプル又は誘導化痰（indnced spatum）サン
プルから標的な方法で調整した。18S rRNA特異的プラ
イマー935（正向き（forward）プライマー）及び936
（逆向き（revese）プライマー）を用いた遺伝子増幅法
（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション:PCR）（米国
特許第4,683,202）により0.5μｇから1.0μｇの全DNAか
らニューモシスティス・カリニの18S rDNA遺伝子を増
幅させた。PCR試料の10分の１を１％アガロースで電気
泳動し、サザンの示した方法（Maniatis Cloning Manue
t）によりニトロセルロースフィルター上に移した。リ
ン32（³²P）で末端標識したオリゴヌクレオチドプロー
ブをフィルターにハイブリダイズさせた。ハイブリダイ
ゼーション液（0.9M NaCl,0.12M Tris−HCl pH7.8,6
mM EDTA,0.1M KPO₄,0.1％SDS,0.1％ピロリン酸、0.00
2％フィコル（ficoll）,0.02％BSA,0.002％ポリビニル
ピロリジンを含む）中で、60℃,14時間から16時間、標
的のrDNAに対し、ここに記述したオリゴヌクレオチドプ
ローブをハイブリダイズさせ、60℃で15分間、３回（0.
03M NaCl,0.004M Tris−HCl pH7.8,0.2mM EDTA,0.1
％SDS中で）ハイブリダイゼーション後の洗浄を行い、
結合していないプローブを除いた。

上述のハイブリダイゼーションと洗浄に引き続き、そ
のハイブリダイゼーションフィルターをＸ線フィルムに
露光させ、既知量の標的材料（DNA）の対照レーン（con
trol lane）と比べ、視覚的にシグナルの強さで“計測
（score）”した。ハイブリダイゼーション強度は＋＋
＋＋（塩基配列の決定により、明らかにプローブと標的
の塩基配列が完全に一致する対照ニューモシスティス・
カリニのレーンと同等のハイブリダイゼーション強度を
示すもの）から＋（Ｘ線フィルムに長時間露光させ、よ
うやく検出できるもの）又は（ハイブリダイゼーション
なし）までの段階を用い、種々の微生物とそのプローブ
間のハイブリダイゼーション強度を比較し易くした。こ
の表示形式（reporting format）はハイブリダイゼーシ
ョンの程度を示す要約データを即座に視覚的に一覧でき
るため、未処理の生の数値で表示するよりも好まれる。

表２から明らかなように、プローブ1159,1162,1484,1
486,1488,1491及び1492は調査したすべてのニューモシ
スティス・カリニの単離物の増幅した16SリボソームRNA
遺伝子及びRNAとハイブリダイズした。その他のプロー
ブは様々な潜在的に有用なパターンで、種々の宿主特異
的なニューモシスティス・カリニとハイブリダイズし
た。

実施例2:プローブハイブリダイゼーション反応のドット
ブロット解析 周知の手法に従い、ドットブロット解析は一種類或い
は一群の核酸を、特にこの目的のための市販品を容易に
入手できるニトロセルロース，ナイロン或いは他の誘導
体化膜のようなフィルターに固定化する。DNA又はRNAの
いずれもこれらのフィルター上に容易に固定され、続い
て様々な条件（即ち、ストリンジェンシーズ）のいずれ
かに下で目的のヌクレオチド配列やプローブを用いてハ
イブリダイゼーションテストを行うことができる。スト
リンジェントな条件下では、標的の塩基配列に対してよ
り高い相補性をもつプローブが相補性のより低いものよ
り強くハイブリダイズする。

表３に示した実験では、示した微生物より調整した1/
10マイクログラムの精製RNA（レーンら（Lane et al）,
1985,Proceedings of the National Academy of Scienc
e,USA 82:6955−6959）をニトロセルロースフィルター
上にスポットした。オリゴヌクレオチドプローブは標準
的な方法により放射性のリン32で末端標識した。

ドットのrRNAに対するオリゴヌクレオチドプローブの
ハイブリダイゼーションは実施例１で記載したのと同じ
方法で行った。

ハイブリダイゼーションと洗浄に引き続き、ハイブリ
ダイゼーションフィルターをＸ線フィルムに露光させ、
前述（実施例１）のように既知量の標的材料（RNA）の
対照スポットと比較し、視覚的にシグナルの強さを“計
測（scored）”した。

表３に示されるように、1159を除くすべてのプローブ
が卓越した排他性（即ち、ニューモシスティス・カリニ
［表２］とはハイブリダイズし、他の真菌類や細菌類と
はハイブリダイズしない）を示した。プローブ1159は他
のプローブに比べてより広い包括性をもつ。テストした
すべてのニューモシスティス・カリニ単離物にハイブリ
ダイズするのに加え、他のいくつかの真菌類や哺乳類の
rRNAとも（様々な程度で）ハイブリダイズする。プロー
ブ1159は“仲間（companion）”探索リガンドを持った
プローブとして設計され、以下の実施例４で記載するよ
うな二重プローブハイブリダイゼーション方式で記載さ
れたニューモシスティス特異性プローブとともに使用さ
れると有用である。

実施例3:イン・サイチュー（in−situ）ハイブリダイゼ
ーションアッセイによるプローブハイブリダイゼーショ
ン反応の包括性の解析 放射性同位元素や蛍光で標識したプローブを用いたイ
ン・サイチュー（in−situ）に於ける核酸のハイブリダ
イゼーションはRNAや遺伝子の細胞内での位置と量の決
定に広く用いられている（ゴール,J.G及びパーデュー,
M.L.（Gall.J.G and Pordue,M.L.）［1969］Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 63:378;ブリガティ,D.,マイエルソン，
リアリ,J.J.,スパルホルツ,B.,トラビス,S,Z.,フォン,
C.K.Y.,シャン,G.D.,ワード,D.C.,（Brigati,D.,Myerso
n,Learry,J.J.,Spalholz,B.,Travis,S.Z.,Fong,C.K.Y.,
Hsung,G,D.,and Ward,D.C.,）［1983］Virology126;32;
コックス,K.C.,ディリオン,D.V.,アンガラー,L.B.,アン
ガラー,R.C.,（Cox,K.C.,Deleon,D.V.,Angerer,L.M.,an
d Angerer,R.C.,）［1984］Devel,Biol,101;485;ローレ
ンス,J.B.,ヴィルネイブ,C.A.,シンガー,R.H.,（Lawreu
ce,J.B.,Villnave,C.A.,and Singer,R.H.,）［1988］Ce
ll 52:51;デロング,E.F.,ウィッカム,G.S.,ペース,N.
R.,（Delong,E.F.,Wickhem,G.S.,and Pace,N.R.,［198
9］Science243:1360）。固定した未処理の細胞又は組織
切片に18SリボソームRNA（rRNA）に相補的に蛍光標識し
たオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、蛍光顕微
鏡で観察した。

ニューモシスティス・カリニ陽性の患者から採った気
管支洗浄サンプルや痰のサンプルは遠心分離により元の
体積の10分の１に濃縮し、その30μｌをきれいなスライ
ドガラス上に塗布した。肺の組織は直接スライドガラス
に接触させて調整した。組織を接触させて塗布したサン
プルを風乾させ、75％メタノール−25％氷酢酸中、室温
で10分間処理して固定し、再び風乾した。サンプルを一
連のエタノール（50％,70％,90％,100％の順に）浸して
脱水し、風乾した。

もし既に組織がパラフィンに包埋されているならば、
サンプルをキシレン処理（10分間処理を３回）し、組織
のパラフィンを除去する。過剰のキシレンを100％エタ
ノールですすいで除き、風乾する。５倍SET（750mM Na
Cl,100mM Tris−HCl pH7.8,5mM EDTA）と0.2％ウシ
血清アルブミン（シグマ社製;fractionV）,10％デキス
トランサルフェート（シグマ社製；平均分子量50,000）
及びローダミン−Ｘ標識した1.7−2.0ng/μｌのオリゴ
ヌクレオチドプローブ1486を含むプローブハイブリダイ
ゼーション混合液をそれぞれのスライドに塗布した。オ
リゴヌクレオチドのローダミン−Ｘ標識はデロングら
（Delong et al）（Science243y1660;1989）の方法によ
った。スライドをカバースリップ（cover slip）で覆
い、蒸気室中で60℃で16−18時間インキュベートした。
２×SETに浸してカバースリップを外し、スライドは直
ちに0.2×SET中、60℃10分間の洗浄を３回行った。スラ
イドを風乾し、直ちに観察、或いは観察するまで４℃の
暗所に保管した。サンプルをACCU.MOUNT 60TMマウンテ
ィングメディウム（mounting medium）に載せ、油浸で5
00倍及び1000倍で検鏡した。

ニューモシスティス・カリニ陽性を示す気管支洗浄サ
ンプル又は痰のサンプルの本実験の結果は図１に示す。

図1A及び図1Bから明らかなように、ローダミン−Ｘ標
識したニューモシスティス・カリニに特異的なプローブ
1486は気管支洗浄サンプル及び誘導化された痰のサンプ
ル中のニューモシスティス・カリニに対してのみ強くハ
イブリダイズした（明るい赤色蛍光で示される）。ヒ
ト、ラット、白イタチ（ferret）の試料を用いた他の実
験でも（データは示さない）すべてのプローブは表２及
び表３に示されるハイブリダイゼーションパターンから
予期される通りの結果を示した。

実施例4:液相ハイブリダイゼーションアッセイによるプ
ローブハイブリダイゼーション反応の包括性の解析 本発明によるプローブ及びその誘導体は様々なハイブ
リダイゼーションの形式において重要な価値を持つ可能
性を秘めている。そのような形式の一つ、二重プローブ
のサンドイッチ型ハイブリダイゼーションアッセイ形式
（例えば、USSN（米国特許出願）277,579;USSN169,646
又はUSSN233,683に記載されているホモポリマー捕獲二
重プローブ液相ハイブリダイゼーション形式）をこの実
施例で示す。このような方法においては、一般に、プロ
ーブの３′末端に約20から200長のある領域のデオキシ
アデノシン（dA）残基を付加する修飾を施す。この修飾
は（液相ハイブリダイゼーションに続いて）サンプルか
らこの目的のためにポリデオキシチミジン（dT）を適当
に付加した固相の支持体（例えばビーズ、プラスチック
の表面、フィルターなど）に目的のrRNA“捕獲（captur
e）”するのに用いられる。第二のプローブは“検出用
（detection）”プローブで、適当な検出可能なリガン
ド（例えば³²P、フルオレセイン、ビオチンなど）を付
けておく。原則として、検出用プローブはオリゴヌクレ
オチド又はより長いDNAやRNAのプローブであって良い。
テストサンプル中における標的核酸の存在は、一連のハ
イブリダイゼーション作用によって固相の表面に検出す
べきリガンドが捕獲されることにより検出される。

この現象は当該テストサンプル中に標的となる核酸が
存在する場合にのみ生じ得る。原則として、上の図式は
例えばアッセイの感度を高めるなどの目的で複数の捕獲
と検出用プローブ（プローブのセット）に適用し得るで
あろう。

本発明の上記記述ではrRNA検出に関して言及したが、
明細書で記載したプローブ及び明細書で記載したプロー
ブと、相補的なプローブは、rRNAを特定する遺伝子（DN
A）の検出にも有用であることが容易に理解され、従っ
てそのようなプローブは明細書に記載したプローブと均
等であると見なされ、本発明及び添付の特許請求の範囲
の精神及び範囲に包含されるべきものである。

フロントページの続き (72)発明者 レーン，デビッド・ジェイ アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01757，ミルフォード，オリオール・ド ライブ ９ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/11 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ハイブリダイゼーション分析においてヒト
   ニューモシスティス・カリニ（Pneumocystis carini
   i）を検出するためのプローブとして使用する核酸フラ
   グメントであって、前記フラグメントは、以下の： またはその全長相補的な配列から選択される配列から本
   質的になる、前記核酸フラグメント。
2. 【請求項２】ハイブリダイゼーション分析においてヒト
   ニューモシスティス・カリニ（Pneumocystis carini
   i）を検出するためのプローブとして使用する核酸フラ
   グメントであって、前記フラグメントは、以下の： またはその全長相補的な配列から選択される配列から本
   質的になる、前記核酸フラグメント。
3. 【請求項３】試料中のニューモシスティス・カリニ（Pn
   eumocystis carinii）の存在を検出する方法であっ
   て、 前記試料を請求項１又は２のプローブと、上記プローブ
   がニューモシスティス・カリニのrRNAにハイブリダイズ
   するような条件下で接触させて、ハイブリッド核酸複合
   体を形成し；そして 前記試料中にニューモシスティス・カリニが存在するこ
   とを示唆するものとして前記ハイブリッド核酸複合体を
   検出する ことからなる前記方法。
4. 【請求項４】ハイブリダイゼーション分析においてヒト
   ニューモシスティス・カリニ（Pneumocystis carini
   i）を検出するために捕獲用プローブとして検出用プロ
   ーブともに使用するための核酸フラグメントであって、
   前記フラグメントは、以下の： またはその全長相補的な配列から選択される配列から本
   質的になる、前記核酸フラグメント。