JP3201780B2 - ウシの雄特異的ｄｎａおよびウシ雌雄の判別方法 - Google Patents
ウシの雄特異的ｄｎａおよびウシ雌雄の判別方法Info
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- JP3201780B2 JP3201780B2 JP16352491A JP16352491A JP3201780B2 JP 3201780 B2 JP3201780 B2 JP 3201780B2 JP 16352491 A JP16352491 A JP 16352491A JP 16352491 A JP16352491 A JP 16352491A JP 3201780 B2 JP3201780 B2 JP 3201780B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ウシの雄特異的ＤＮＡ
および該ＤＮＡをプローブとして用いるウシ雌雄の判別
方法に関する。
および該ＤＮＡをプローブとして用いるウシ雌雄の判別
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、胎児または胚の性別判定は、重要
な課題となっている。特に、胎児移植などの生殖生物学
分野で重要となりつつある。例えば、乳牛及び食肉業の
分野だけでも、１９８５年にはおよそ５０，０００例の
胎児移植が報告されている。胎児を母体に移植する前に
簡単にその性別の判定ができれば、雌の子孫を増すこと
が可能となり、乳牛業において極めて有利となる。ま
た、胎児の性別が簡単に判定できれば、乳を多く出すこ
とができるとか子供を多く生むことができるなどの望ま
しい特質を持った子孫を選択することが可能となる。
な課題となっている。特に、胎児移植などの生殖生物学
分野で重要となりつつある。例えば、乳牛及び食肉業の
分野だけでも、１９８５年にはおよそ５０，０００例の
胎児移植が報告されている。胎児を母体に移植する前に
簡単にその性別の判定ができれば、雌の子孫を増すこと
が可能となり、乳牛業において極めて有利となる。ま
た、胎児の性別が簡単に判定できれば、乳を多く出すこ
とができるとか子供を多く生むことができるなどの望ま
しい特質を持った子孫を選択することが可能となる。
【０００３】性別（雄もしくは雌）が性染色体によって
決定されるということは従来より広く知られている。哺
乳動物において、Ｙ染色体上に存在する遺伝子が雄とし
ての特徴形成の原因となるので、個々の哺乳動物の性別
は、ある特定のＤＮＡ配列をそのゲノムが含んでいるか
否かに依存することになる。従って、ＤＮＡ中のＹ染色
体特異的遺伝子を分析することによって雌雄の判別をす
ることができる。あるいは、遺伝子的に関連した配列、
具体的にはＹ染色体と関連した配列を分析することによ
っても判定することができる。
決定されるということは従来より広く知られている。哺
乳動物において、Ｙ染色体上に存在する遺伝子が雄とし
ての特徴形成の原因となるので、個々の哺乳動物の性別
は、ある特定のＤＮＡ配列をそのゲノムが含んでいるか
否かに依存することになる。従って、ＤＮＡ中のＹ染色
体特異的遺伝子を分析することによって雌雄の判別をす
ることができる。あるいは、遺伝子的に関連した配列、
具体的にはＹ染色体と関連した配列を分析することによ
っても判定することができる。
【０００４】従来より、ＤＮＡによる雌雄判別の方法と
しては種々の報告がある。例えばヒトの男性ＤＮＡと優
先的にハイブリダイズするＤＮＡ配列は多くの研究者に
よって同定されている（Kunkel et al, Science191, 11
89-1190 (1976), Bishop etal, Nature 303, 831 (198
3))。しかし、これらのＤＮＡ配列がヒト以外の他の
種、例えばウシのＤＮＡ配列とハイブリダイズするか否
かについては不明である。一方特開昭６３−５００２１
４号公報には、雄性ＤＮＡと優先的にハイブリダイズす
るウシＤＮＡプローブが記載されている。このＤＮＡ
は、胎児および胚の性別を判定するためのハイブリダイ
ゼーションプローブとして有用であるといわれている。
また、ウシの亜科に属し、ことにボス属の反芻動物の胚
もしくは胎児の性別を決定するのに有用な雄特異的ＤＮ
Ａが特開昭６２─２７３０００号公報に、牛、ヒツジ、
ヤギおよび他の反芻動物のＹ染色体特異的ＤＮＡ配列に
のみハイブリダイズすることのできるＤＮＡが特表平１
−５００７２０号公報に開示されている。
しては種々の報告がある。例えばヒトの男性ＤＮＡと優
先的にハイブリダイズするＤＮＡ配列は多くの研究者に
よって同定されている（Kunkel et al, Science191, 11
89-1190 (1976), Bishop etal, Nature 303, 831 (198
3))。しかし、これらのＤＮＡ配列がヒト以外の他の
種、例えばウシのＤＮＡ配列とハイブリダイズするか否
かについては不明である。一方特開昭６３−５００２１
４号公報には、雄性ＤＮＡと優先的にハイブリダイズす
るウシＤＮＡプローブが記載されている。このＤＮＡ
は、胎児および胚の性別を判定するためのハイブリダイ
ゼーションプローブとして有用であるといわれている。
また、ウシの亜科に属し、ことにボス属の反芻動物の胚
もしくは胎児の性別を決定するのに有用な雄特異的ＤＮ
Ａが特開昭６２─２７３０００号公報に、牛、ヒツジ、
ヤギおよび他の反芻動物のＹ染色体特異的ＤＮＡ配列に
のみハイブリダイズすることのできるＤＮＡが特表平１
−５００７２０号公報に開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ウシの
雌雄判別に関する前記の特開昭６３−５００２１４号公
報に記載のプローブは長すぎるという点が、また、特開
昭６２−２７３０００号公報記載のＤＮＡでは短かすぎ
るのでＰＣＲ等には使えないといった問題点が指摘され
る。また、特表平１−５００７２０号公報では実用性の
例が示されてない。
雌雄判別に関する前記の特開昭６３−５００２１４号公
報に記載のプローブは長すぎるという点が、また、特開
昭６２−２７３０００号公報記載のＤＮＡでは短かすぎ
るのでＰＣＲ等には使えないといった問題点が指摘され
る。また、特表平１−５００７２０号公報では実用性の
例が示されてない。
【０００６】このように当業界では前記のようなウシの
性別判定の重要性に鑑み、簡便にかつ高感度に雌雄判別
ができるような方法の開発が望まれているものの、未だ
充分な方法は見い出されていないのが実情である。しか
して、本発明の目的は、ウシ雌雄判別を簡便かつ高感度
に行うことのできるウシの雄特異的ＤＮＡおよびそれを
プローブとして用いるウシ雌雄の判別方法を提供するこ
とにある。
性別判定の重要性に鑑み、簡便にかつ高感度に雌雄判別
ができるような方法の開発が望まれているものの、未だ
充分な方法は見い出されていないのが実情である。しか
して、本発明の目的は、ウシ雌雄判別を簡便かつ高感度
に行うことのできるウシの雄特異的ＤＮＡおよびそれを
プローブとして用いるウシ雌雄の判別方法を提供するこ
とにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは前記課題を
解決するために鋭意検討した。その結果、ウシの雄特異
的ＤＮＡを見い出し、さらに該ＤＮＡを用いることによ
りウシ雌雄の判別を簡易かつ高感度に行うことのできる
ことを見い出し本発明を完成するに到った。
解決するために鋭意検討した。その結果、ウシの雄特異
的ＤＮＡを見い出し、さらに該ＤＮＡを用いることによ
りウシ雌雄の判別を簡易かつ高感度に行うことのできる
ことを見い出し本発明を完成するに到った。
【０００８】即ち、本発明の要旨は、 （１）ウシの雄特異的ＤＮＡおよび （２）前記のＤＮＡをプローブとして用いることを特徴
とするウシ雌雄の判別方法に関する。
とするウシ雌雄の判別方法に関する。
【０００９】本発明のウシの雄特異的ＤＮＡは、具体的
には次のものが挙げられる。 ＩＯ−１配列（配列番
号：１）からなるウシの雄特異的ＤＮＡ、または該ＤＮ
Ａにおいて塩基の置換、欠失又は挿入があり、かつ該Ｄ
ＮＡとハイブリダイズし得るウシの雄特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−１（９２ｂｐ） 5'-ACAGTCACCA GGCACAGGGC TAAGAACGGC ACACAGTCAC ACACAAACAC ACACACAAAC CGGTTGCACA GTCACCAGGG CACAGGGCTG AG-3'
には次のものが挙げられる。 ＩＯ−１配列（配列番
号：１）からなるウシの雄特異的ＤＮＡ、または該ＤＮ
Ａにおいて塩基の置換、欠失又は挿入があり、かつ該Ｄ
ＮＡとハイブリダイズし得るウシの雄特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−１（９２ｂｐ） 5'-ACAGTCACCA GGCACAGGGC TAAGAACGGC ACACAGTCAC ACACAAACAC ACACACAAAC CGGTTGCACA GTCACCAGGG CACAGGGCTG AG-3'
【００１０】 ＩＯ−２配列（配列番号：２）からな
るウシの雄特異的ＤＮＡ、または該ＤＮＡにおいて塩基
の置換、欠失又は挿入があり、かつ該ＤＮＡとハイブリ
ダイズし得るウシの雄特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−２（１４２ｂｐ） 5'-AGGGGCACAG GGCTGAGAAA TCAAATTACA CACGAGCAAA AAAAAACCTC TTGCACAGTT GCCAGGGGCA CAGGGCTGAG AACGGCACAC ACTCACATAC ACAGACAATC CGGTTGCACA GTCGCCAGGG CACAGGGCTG AG-3'
るウシの雄特異的ＤＮＡ、または該ＤＮＡにおいて塩基
の置換、欠失又は挿入があり、かつ該ＤＮＡとハイブリ
ダイズし得るウシの雄特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−２（１４２ｂｐ） 5'-AGGGGCACAG GGCTGAGAAA TCAAATTACA CACGAGCAAA AAAAAACCTC TTGCACAGTT GCCAGGGGCA CAGGGCTGAG AACGGCACAC ACTCACATAC ACAGACAATC CGGTTGCACA GTCGCCAGGG CACAGGGCTG AG-3'
【００１１】 ＩＯ−３配列（配列番号：３）からな
るウシの雄特異的ＤＮＡ、または該ＤＮＡにおいて塩基
の置換、欠失又は挿入があり、かつ該ＤＮＡとハイブリ
ダイズし得るウシの雄特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−３（１７０ｂｐ） 5'-TACAGTCGCC AGGGCACAGG GCTGAGAATT CACACACACA CCCAAACAAA CCTGTTGCAC AGTTGCCAGG GCACAGCGCT GAGTATGGCA CACACTCACA CACACACACA AACCGGTTGA ACCGTTACCA GAGCACAGGG CTGAGAACAG CACACACATA CACACACACC-3'
るウシの雄特異的ＤＮＡ、または該ＤＮＡにおいて塩基
の置換、欠失又は挿入があり、かつ該ＤＮＡとハイブリ
ダイズし得るウシの雄特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−３（１７０ｂｐ） 5'-TACAGTCGCC AGGGCACAGG GCTGAGAATT CACACACACA CCCAAACAAA CCTGTTGCAC AGTTGCCAGG GCACAGCGCT GAGTATGGCA CACACTCACA CACACACACA AACCGGTTGA ACCGTTACCA GAGCACAGGG CTGAGAACAG CACACACATA CACACACACC-3'
【００１２】 ＩＯ−４配列（配列番号：４）からな
るウシの雄特異的ＤＮＡ、または該ＤＮＡにおいて塩基
の置換、欠失又は挿入があり、かつ該ＤＮＡとハイブリ
ダイズし得るウシの雄特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−４（２２４ｂｐ） 5'-ACACACACAC ACACACACAC ACACACACTC ACAAATTCCA CAGTCGCCCG GGCACAGGGC TGAGAAGAAC ACATACATAG ACACATACAC ACACAAACTG CTTGCACAGT CGTCAGGGCT CAGGGCTGTG AATGGCACAC ACAAACACTG ACACACACAC ACACACGAAC AAACCATTGC ACAGTCACCA GGGCACAGGG CTGAGGCCAG GGCACAGGGC TGAG-3'
るウシの雄特異的ＤＮＡ、または該ＤＮＡにおいて塩基
の置換、欠失又は挿入があり、かつ該ＤＮＡとハイブリ
ダイズし得るウシの雄特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−４（２２４ｂｐ） 5'-ACACACACAC ACACACACAC ACACACACTC ACAAATTCCA CAGTCGCCCG GGCACAGGGC TGAGAAGAAC ACATACATAG ACACATACAC ACACAAACTG CTTGCACAGT CGTCAGGGCT CAGGGCTGTG AATGGCACAC ACAAACACTG ACACACACAC ACACACGAAC AAACCATTGC ACAGTCACCA GGGCACAGGG CTGAGGCCAG GGCACAGGGC TGAG-3'
【００１３】本発明のウシの雄特異的ＤＮＡは、前記の
ようにＩＯ−１配列、ＩＯ−２配列ＩＯ−３配列および
ＩＯ−４配列のそれぞれ全部からなるものであってもよ
く、またウシ雌雄の判別方法にプローブとして使用する
ことができるものであればその一部を含有するものであ
ってもよい。さらに、同様にウシ雌雄の判別方法にプロ
ーブとして使用することができるものであれば、該ＤＮ
Ａとハイブリダイズし得るものも本発明のウシの雄特異
的ＤＮＡに含まれる。ここで、該ＤＮＡとハイブリダイ
ズし得るものとしては、例えばＩＯ−１配列のＤＮＡの
一部に塩基の置換、欠失、挿入等の変異のあるものであ
っても該ＤＮＡとハイブリダイズし得るもの等を挙げる
ことができる。
ようにＩＯ−１配列、ＩＯ−２配列ＩＯ−３配列および
ＩＯ−４配列のそれぞれ全部からなるものであってもよ
く、またウシ雌雄の判別方法にプローブとして使用する
ことができるものであればその一部を含有するものであ
ってもよい。さらに、同様にウシ雌雄の判別方法にプロ
ーブとして使用することができるものであれば、該ＤＮ
Ａとハイブリダイズし得るものも本発明のウシの雄特異
的ＤＮＡに含まれる。ここで、該ＤＮＡとハイブリダイ
ズし得るものとしては、例えばＩＯ−１配列のＤＮＡの
一部に塩基の置換、欠失、挿入等の変異のあるものであ
っても該ＤＮＡとハイブリダイズし得るもの等を挙げる
ことができる。
【００１４】本発明のウシの雄特異的ＤＮＡを得るに
は、例えば次のような方法が挙げられる。 （１）ゲノムＤＮＡの抽出 ウシの白血球、精巣、卵巣、肝臓などから得られた新
鮮、凍結あるいはホルマリンなどで固定した検体をプロ
テイナーゼ等の酵素処理によりタンパク質を消化した
後、フェノール抽出およびエタノール沈澱処理など常法
によりＤＮＡを抽出する。
は、例えば次のような方法が挙げられる。 （１）ゲノムＤＮＡの抽出 ウシの白血球、精巣、卵巣、肝臓などから得られた新
鮮、凍結あるいはホルマリンなどで固定した検体をプロ
テイナーゼ等の酵素処理によりタンパク質を消化した
後、フェノール抽出およびエタノール沈澱処理など常法
によりＤＮＡを抽出する。
【００１５】（２）ＰＣＲによるゲノムＤＮＡの増幅 ＥＳ８プローブ（Ellis ら、Theriogenology 29:242, 1
988 ）の１−２０ｂｐ（ＭＩ３０４）および５４１−５
６０ｂｐ（ＭＩ３０５）に相同する配列を有するオリゴ
ヌクレオチドをＤＮＡ合成機（例えば、ＡＢＩ社製）を
用いて合成し、得られたオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして用い、常法によりＰＣＲを行うことによりウシ
ゲノムＤＮＡの増幅を行う。これらのプライマーの塩基
配列は次のとおりである。 プライマーＭＩ３０４（配列番号：５）： 5'-CACCAGGGCA CAGGGCTGAG-3' プライマーＭＩ３０５（配列番号：６）： 5'-ACAGTCGCCA GGGCACAGGG-3' ＰＣＲに用いるゲノムＤＮＡ量は、通常１μｇ程度を標
準とし、プライマーの量は通常、１００pmol程度を用い
る。ＰＣＲの条件は、ディナチュレーション工程は通常
９３℃で１．５分、アニーリング工程が通常６０℃で２
分、イクステンション工程が通常８０℃で２．５分の条
件であり、これらの工程を１サイクルとしたＰＣＲを通
常３０サイクル行なう。
988 ）の１−２０ｂｐ（ＭＩ３０４）および５４１−５
６０ｂｐ（ＭＩ３０５）に相同する配列を有するオリゴ
ヌクレオチドをＤＮＡ合成機（例えば、ＡＢＩ社製）を
用いて合成し、得られたオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして用い、常法によりＰＣＲを行うことによりウシ
ゲノムＤＮＡの増幅を行う。これらのプライマーの塩基
配列は次のとおりである。 プライマーＭＩ３０４（配列番号：５）： 5'-CACCAGGGCA CAGGGCTGAG-3' プライマーＭＩ３０５（配列番号：６）： 5'-ACAGTCGCCA GGGCACAGGG-3' ＰＣＲに用いるゲノムＤＮＡ量は、通常１μｇ程度を標
準とし、プライマーの量は通常、１００pmol程度を用い
る。ＰＣＲの条件は、ディナチュレーション工程は通常
９３℃で１．５分、アニーリング工程が通常６０℃で２
分、イクステンション工程が通常８０℃で２．５分の条
件であり、これらの工程を１サイクルとしたＰＣＲを通
常３０サイクル行なう。
【００１６】（３）クローニング （２）で得られた増幅されたＤＮＡ断片は、アガロース
ゲル電気泳動にかける。電気泳動を行ったゲルより、用
いたプライマーから推定される鎖長を有するバンドを切
りだし、目的の鎖長を有するＤＮＡ断片を得る。次いで
得られたＤＮＡ断片を市販のプラスミドに挿入し、さら
に該プラスミドを大腸菌などの適切な宿主に導入する。
形質転換体の有するプラスミドの挿入ＤＮＡの鎖長を調
べ、目的の挿入ＤＮＡを有するクローンを陽性とする。
ゲル電気泳動にかける。電気泳動を行ったゲルより、用
いたプライマーから推定される鎖長を有するバンドを切
りだし、目的の鎖長を有するＤＮＡ断片を得る。次いで
得られたＤＮＡ断片を市販のプラスミドに挿入し、さら
に該プラスミドを大腸菌などの適切な宿主に導入する。
形質転換体の有するプラスミドの挿入ＤＮＡの鎖長を調
べ、目的の挿入ＤＮＡを有するクローンを陽性とする。
【００１７】（４）制限酵素による消化 （３）で得られた陽性クローンのプラスミドＤＮＡをＥ
ｃｏＲＩとＰｓｔＩにより消化することにより本発明の
ＩＯ−１配列、ＩＯ−２配列ＩＯ−３配列およびＩＯ−
４配列を得ることができる。
ｃｏＲＩとＰｓｔＩにより消化することにより本発明の
ＩＯ−１配列、ＩＯ−２配列ＩＯ−３配列およびＩＯ−
４配列を得ることができる。
【００１８】本発明のウシ雌雄の判別方法は、これらの
本発明の雄特異的ＤＮＡのうち少なくとも１つをプロー
ブとして用いることを特徴とするものである。具体的に
は、本発明のウシの雄特異的ＤＮＡをプローブとして用
い、検体中のＤＮＡとハイブリダイゼーションが生じる
か否かにより雌雄を判別する。即ち、ハイブリダイゼー
ションを認めればその検体は雄性であり、認めなければ
雌性と判定される。
本発明の雄特異的ＤＮＡのうち少なくとも１つをプロー
ブとして用いることを特徴とするものである。具体的に
は、本発明のウシの雄特異的ＤＮＡをプローブとして用
い、検体中のＤＮＡとハイブリダイゼーションが生じる
か否かにより雌雄を判別する。即ち、ハイブリダイゼー
ションを認めればその検体は雄性であり、認めなければ
雌性と判定される。
【００１９】このハイブリダイゼーションの方法は、こ
のような目的を達成することができるものであれば特に
制限されるものではない。例えば、ドットブロットハイ
ブリダイゼーションにより行うことができる。この場
合、本発明の雄特異的ＤＮＡは該ＤＮＡを保持するプラ
スミドＤＮＡをプローブとし、ニックトランスレーショ
ンによって放射標識して用いることができる。具体的に
は、まずドットブロットフォーマットを用い、アルカリ
変性および熱変性処理を行った後、検体のＤＮＡをニト
ロセルロースフィルターに吸着させる。該フィルターを
ハイブリダイゼーション液（５×ＳＳＰＥ、５×デンハ
ルト溶液、０．５％ｖ／ｖＳＤＳ）に７５℃で１時間浸
漬することによって、プレハイブリダイゼーションを行
う。次いで、該フィルターを前記プローブとともに１晩
ハイブリダイゼーションに付した後、該フィルターを６
×ＳＳＣ液で１時間洗浄し、Ｘ線フィルムに−８０℃で
一夜露光させることにより行われる。
のような目的を達成することができるものであれば特に
制限されるものではない。例えば、ドットブロットハイ
ブリダイゼーションにより行うことができる。この場
合、本発明の雄特異的ＤＮＡは該ＤＮＡを保持するプラ
スミドＤＮＡをプローブとし、ニックトランスレーショ
ンによって放射標識して用いることができる。具体的に
は、まずドットブロットフォーマットを用い、アルカリ
変性および熱変性処理を行った後、検体のＤＮＡをニト
ロセルロースフィルターに吸着させる。該フィルターを
ハイブリダイゼーション液（５×ＳＳＰＥ、５×デンハ
ルト溶液、０．５％ｖ／ｖＳＤＳ）に７５℃で１時間浸
漬することによって、プレハイブリダイゼーションを行
う。次いで、該フィルターを前記プローブとともに１晩
ハイブリダイゼーションに付した後、該フィルターを６
×ＳＳＣ液で１時間洗浄し、Ｘ線フィルムに−８０℃で
一夜露光させることにより行われる。
【００２０】本発明のウシ雌雄の判別方法は、本発明の
雄特異的ＤＮＡのうち少なくとも１つをプローブとして
用いればよいが、複数の雄特異的ＤＮＡを同時にプロー
ブとして用いてドットブロットハイブリダイゼーション
を行ってもよい。
雄特異的ＤＮＡのうち少なくとも１つをプローブとして
用いればよいが、複数の雄特異的ＤＮＡを同時にプロー
ブとして用いてドットブロットハイブリダイゼーション
を行ってもよい。
【００２１】
【実施例】以下、実施例により本発明についてさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら
限定されるものではない。 実施例 （１）ＤＮＡ試料 成熟ホルスタイン牛（雌雄１頭づつ）の末梢血５ｍｌを
遠心分離にかけた。白血球画分をプロテイナーゼＫ、Ｒ
Ｎase およびフェノールで処理し、ＤＮＡを抽出した。
得られたＤＮＡを定量した後、−２０℃で保存した。
しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら
限定されるものではない。 実施例 （１）ＤＮＡ試料 成熟ホルスタイン牛（雌雄１頭づつ）の末梢血５ｍｌを
遠心分離にかけた。白血球画分をプロテイナーゼＫ、Ｒ
Ｎase およびフェノールで処理し、ＤＮＡを抽出した。
得られたＤＮＡを定量した後、−２０℃で保存した。
【００２２】（２）ＰＣＲによるウシゲノムＤＮＡの増
幅 増幅に用いたＤＮＡの量は、雄ウシ細胞ＤＮＡの場合は
１０-6〜１μｇであり、雌ウシ細胞ＤＮＡの場合は１μ
ｇであった。ＥＳ８プローブ（Ellis ら、Theriogenolo
gy 29:242,1988）の１−２０ｂｐ（ＭＩ３０４）および
５４１−５６０ｂｐ（ＭＩ３０５）に相同する配列を有
するプライマーをＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社製）を用いて
合成した。得られたプライマーはそれぞれ１００ｐｍｏ
ｌをＰＣＲに用いた。これらのプライマーの塩基配列は
次のとおりである。 プライマーＭＩ３０４（配列番号：５）： 5'-CACCAGGGCA CAGGGCTGAG-3' プライマーＭＩ３０５（配列番号：６）： 5'-ACAGTCGCCA GGGCACAGGG-3' Ｉｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ（Academic Press
Inc. 3-12, 1990）の方法に従って調製したＰＣＲ用緩
衝液に、最終容量が１００μｌになるよう前記のプライ
マーを加えた。２．５ユニットの耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ、シータス社製）を各試料に
加えた後、プログラム式熱コントローラー（ＭＪリサー
チ社製）を用いてＰＣＲ操作（６０℃で２分間反応さ
せ、８０℃で２．５分間反応させ、さらに９３℃で１．
５分間反応させる操作）を３０回繰り返した。ＰＣＲの
終了後、反応生成物を４％アガロースゲル（シーケムＭ
Ｅ、ＦＭＣ社製）上で電気泳動にかけ、臭化エチジウム
染色後、紫外線照射下で現像した。
幅 増幅に用いたＤＮＡの量は、雄ウシ細胞ＤＮＡの場合は
１０-6〜１μｇであり、雌ウシ細胞ＤＮＡの場合は１μ
ｇであった。ＥＳ８プローブ（Ellis ら、Theriogenolo
gy 29:242,1988）の１−２０ｂｐ（ＭＩ３０４）および
５４１−５６０ｂｐ（ＭＩ３０５）に相同する配列を有
するプライマーをＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社製）を用いて
合成した。得られたプライマーはそれぞれ１００ｐｍｏ
ｌをＰＣＲに用いた。これらのプライマーの塩基配列は
次のとおりである。 プライマーＭＩ３０４（配列番号：５）： 5'-CACCAGGGCA CAGGGCTGAG-3' プライマーＭＩ３０５（配列番号：６）： 5'-ACAGTCGCCA GGGCACAGGG-3' Ｉｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ（Academic Press
Inc. 3-12, 1990）の方法に従って調製したＰＣＲ用緩
衝液に、最終容量が１００μｌになるよう前記のプライ
マーを加えた。２．５ユニットの耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ、シータス社製）を各試料に
加えた後、プログラム式熱コントローラー（ＭＪリサー
チ社製）を用いてＰＣＲ操作（６０℃で２分間反応さ
せ、８０℃で２．５分間反応させ、さらに９３℃で１．
５分間反応させる操作）を３０回繰り返した。ＰＣＲの
終了後、反応生成物を４％アガロースゲル（シーケムＭ
Ｅ、ＦＭＣ社製）上で電気泳動にかけ、臭化エチジウム
染色後、紫外線照射下で現像した。
【００２３】このようにしてＤＮＡ断片を電気泳動で分
画したものを図１に示した。即ち、図１は反応生成物の
１／１０を４％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、臭
化エチジウム染色後、紫外線照射下で現像した結果であ
る。レーン１〜７はそれぞれ１、１０-1、１０-2、１０
-3、１０-4、１０-5および１０-6μｇのウシ雄ＤＮＡか
ら増幅された生成物の泳動結果を示したものである。レ
ーン８はウシ雌ＤＮＡ１μｇから増幅された生成物につ
いての泳動結果である。図中で矢印を付した４つの未知
のバンドが雄ＤＮＡ検体で見られた。
画したものを図１に示した。即ち、図１は反応生成物の
１／１０を４％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、臭
化エチジウム染色後、紫外線照射下で現像した結果であ
る。レーン１〜７はそれぞれ１、１０-1、１０-2、１０
-3、１０-4、１０-5および１０-6μｇのウシ雄ＤＮＡか
ら増幅された生成物の泳動結果を示したものである。レ
ーン８はウシ雌ＤＮＡ１μｇから増幅された生成物につ
いての泳動結果である。図中で矢印を付した４つの未知
のバンドが雄ＤＮＡ検体で見られた。
【００２４】このバンドを分析したところ、約１００ｂ
ｐ、１３０ｂｐ、１８０ｂｐおよび２３０ｂｐの位置に
存在していた。また他の位置にも残存するプライマーに
由来するバンドが出現した。これらのＤＮＡ断片は、１
０-6μｇのＤＮＡ試料のＰＣＲでも確認された。一方、
１μｇの雌ＤＮＡ試料をＰＣＲで分析したが、このよう
なＤＮＡ断片は見られなかった。
ｐ、１３０ｂｐ、１８０ｂｐおよび２３０ｂｐの位置に
存在していた。また他の位置にも残存するプライマーに
由来するバンドが出現した。これらのＤＮＡ断片は、１
０-6μｇのＤＮＡ試料のＰＣＲでも確認された。一方、
１μｇの雌ＤＮＡ試料をＰＣＲで分析したが、このよう
なＤＮＡ断片は見られなかった。
【００２５】（３）ＰＣＲ生成物のクローニングと配列
決定 ＰＣＲ生成物をプラスミドＤＮＡ ｐＵＣ１１９のＳｍ
ａＩサイトに結合させた後、大腸菌ＭＶ１１８４にクロ
ーン化した（図２参照、ａはＰｓｔＩサイトを、ｂはＳ
ｍａＩサイトを、ｃは挿入ＤＮＡを、そしてｄはＥｃｏ
ＲＩサイトを示す）。クローニング終了後、プラスミド
ＤＮＡをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩにより制限酵素による分
析に付した後、サンガーらのジデオキシ法によって配列
を決定した。
決定 ＰＣＲ生成物をプラスミドＤＮＡ ｐＵＣ１１９のＳｍ
ａＩサイトに結合させた後、大腸菌ＭＶ１１８４にクロ
ーン化した（図２参照、ａはＰｓｔＩサイトを、ｂはＳ
ｍａＩサイトを、ｃは挿入ＤＮＡを、そしてｄはＥｃｏ
ＲＩサイトを示す）。クローニング終了後、プラスミド
ＤＮＡをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩにより制限酵素による分
析に付した後、サンガーらのジデオキシ法によって配列
を決定した。
【００２６】その結果、制限酵素による分析によりＰＣ
Ｒ生成物を４種に分けることができた（図３）。図３
は、４種のＰＣＲ生成物をもつプラスミドをＥｃｏＲＩ
とＰｓｔＩで同時に消化し、その各種の一部を４％アガ
ロースゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジウム染色し
た結果を示すものである。図中の＊はマーカーである。
これらのＤＮＡ断片についてジデオキシ法で決定した塩
基配列を図４に示した。これら４種のＤＮＡ断片のサイ
ズは、それぞれ９２ｂｐ（Ｉ０−１）、１４２ｂｐ（Ｉ
０−２）、１７０ｂｐ（Ｉ０−３）、および２２４ｂｐ
（Ｉ０−４）であった。これらのサイズは、電気泳動度
に基づく推定値とほぼ同じであった。
Ｒ生成物を４種に分けることができた（図３）。図３
は、４種のＰＣＲ生成物をもつプラスミドをＥｃｏＲＩ
とＰｓｔＩで同時に消化し、その各種の一部を４％アガ
ロースゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジウム染色し
た結果を示すものである。図中の＊はマーカーである。
これらのＤＮＡ断片についてジデオキシ法で決定した塩
基配列を図４に示した。これら４種のＤＮＡ断片のサイ
ズは、それぞれ９２ｂｐ（Ｉ０−１）、１４２ｂｐ（Ｉ
０−２）、１７０ｂｐ（Ｉ０−３）、および２２４ｂｐ
（Ｉ０−４）であった。これらのサイズは、電気泳動度
に基づく推定値とほぼ同じであった。
【００２７】これら４種のＤＮＡ断片の塩基配列はＥＳ
５やＥＳ８の塩基配列と一致していなかった。ＥＳ８と
４種のＤＮＡ断片の塩基配列の一致度を調べたところ、
Ｉ０−１断片では全配列の６５％、Ｉ０−２断片では５
１％、Ｉ０−３断片では５７％、Ｉ０−４断片では８４
％のホモロジーがみられた。また、図４の塩基配列から
も明らかなようにこれら４種のＤＮＡ断片はいずれも反
復ＣＡ配列を有していた。
５やＥＳ８の塩基配列と一致していなかった。ＥＳ８と
４種のＤＮＡ断片の塩基配列の一致度を調べたところ、
Ｉ０−１断片では全配列の６５％、Ｉ０−２断片では５
１％、Ｉ０−３断片では５７％、Ｉ０−４断片では８４
％のホモロジーがみられた。また、図４の塩基配列から
も明らかなようにこれら４種のＤＮＡ断片はいずれも反
復ＣＡ配列を有していた。
【００２８】（４）ＤＮＡ断片の雄特異性のドットブロ
ット分析 前記のようにして配列の決定された４種のＤＮＡ断片を
保持するプラスミドＤＮＡをプローブとし、ニックトラ
ンスレーションによって放射標識した後、以下のハイブ
リダイゼーションによる分析を行った。即ち、まずドッ
トブロットフォーマットを用い、アルカリ変性および熱
変性処理を行った後、ウシゲノムＤＮＡをニトロセルロ
ースフィルターに吸着させた。該フィルターをハイブリ
ダイゼーション液（５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶
液、０．５％ｖ／ｖＳＤＳ）に７５℃で１時間浸漬する
ことによって、プレハイブリダイゼーションを行った。
次いで、該フィルターを前記プローブとともに１晩ハイ
ブリダイゼーションに付した。続いて、該フィルターを
６×ＳＳＣ液で１時間洗浄した後、Ｘ線フィルム（コニ
カ社製）に−８０℃で一夜露光させた。
ット分析 前記のようにして配列の決定された４種のＤＮＡ断片を
保持するプラスミドＤＮＡをプローブとし、ニックトラ
ンスレーションによって放射標識した後、以下のハイブ
リダイゼーションによる分析を行った。即ち、まずドッ
トブロットフォーマットを用い、アルカリ変性および熱
変性処理を行った後、ウシゲノムＤＮＡをニトロセルロ
ースフィルターに吸着させた。該フィルターをハイブリ
ダイゼーション液（５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶
液、０．５％ｖ／ｖＳＤＳ）に７５℃で１時間浸漬する
ことによって、プレハイブリダイゼーションを行った。
次いで、該フィルターを前記プローブとともに１晩ハイ
ブリダイゼーションに付した。続いて、該フィルターを
６×ＳＳＣ液で１時間洗浄した後、Ｘ線フィルム（コニ
カ社製）に−８０℃で一夜露光させた。
【００２９】図５はこのようにして得られたドットブロ
ットハイブリダイゼーション分析の結果を示す図であ
る。即ち、ウシ雄およびウシ雌ＤＮＡ１μｇを４種のニ
トロセルロースフィルターにアプライし、32Ｐで標識し
た４種のＤＮＡ断片をそれぞれハイブリダイズさせた。
図中、１はＩ０−１断片を、２はＩ０−２断片を、３は
Ｉ０−３断片を、４はＩ０−４断片をそれぞれハイブリ
ダイズさせた結果である。図５から明らかなようにこれ
ら４種のＤＮＡ断片を雌雄ウシゲノムＤＮＡのそれぞれ
とハイブリダイズさせたところ、４種の断片はいずれも
雄ゲノムＤＮＡのみに対して陽性反応を示し、これらの
ＤＮＡ断片は雄特異性を有することが明らかとなった。
ットハイブリダイゼーション分析の結果を示す図であ
る。即ち、ウシ雄およびウシ雌ＤＮＡ１μｇを４種のニ
トロセルロースフィルターにアプライし、32Ｐで標識し
た４種のＤＮＡ断片をそれぞれハイブリダイズさせた。
図中、１はＩ０−１断片を、２はＩ０−２断片を、３は
Ｉ０−３断片を、４はＩ０−４断片をそれぞれハイブリ
ダイズさせた結果である。図５から明らかなようにこれ
ら４種のＤＮＡ断片を雌雄ウシゲノムＤＮＡのそれぞれ
とハイブリダイズさせたところ、４種の断片はいずれも
雄ゲノムＤＮＡのみに対して陽性反応を示し、これらの
ＤＮＡ断片は雄特異性を有することが明らかとなった。
【００３０】
【発明の効果】本発明において、ＥＳ８から得たプライ
マーを用いたＰＣＲでは、予想されたＥＳ８の増幅は起
こらず、４種の本発明のＤＮＡ断片（９２ｂｐ、１４２
ｂｐ、１７０ｂｐ、２２４ｂｐ）が得られた。これらの
増幅ＤＮＡ断片の塩基配列は、ＥＳ８の塩基配列と部分
的に一致が見られたものの、ＥＳ５あるいはＥＳ８とも
完全に同一のものではなかった。ＥＳ８はウシＹ染色体
上に存在する約６００コピーにのぼる反復配列の１単位
を成していることが知られているので（Bondioliら、Th
eriogenology 31:95-104, 1989）、多少異なる部分もあ
るが類似している塩基配列を有する一群に含まれるもの
と思われる。したがって、プライマーＭＩ３０４および
ＭＩ３０５で増幅させた本発明の４種のＤＮＡ断片は前
記の類似する塩基配列に由来するものである可能性が高
いと思われる。
マーを用いたＰＣＲでは、予想されたＥＳ８の増幅は起
こらず、４種の本発明のＤＮＡ断片（９２ｂｐ、１４２
ｂｐ、１７０ｂｐ、２２４ｂｐ）が得られた。これらの
増幅ＤＮＡ断片の塩基配列は、ＥＳ８の塩基配列と部分
的に一致が見られたものの、ＥＳ５あるいはＥＳ８とも
完全に同一のものではなかった。ＥＳ８はウシＹ染色体
上に存在する約６００コピーにのぼる反復配列の１単位
を成していることが知られているので（Bondioliら、Th
eriogenology 31:95-104, 1989）、多少異なる部分もあ
るが類似している塩基配列を有する一群に含まれるもの
と思われる。したがって、プライマーＭＩ３０４および
ＭＩ３０５で増幅させた本発明の４種のＤＮＡ断片は前
記の類似する塩基配列に由来するものである可能性が高
いと思われる。
【００３１】また、４種のＤＮＡ断片の塩基配列はいず
れも反復ＣＡ配列を含んでいた。この反復配列はＥＳ８
の塩基配列のかなりの部分を占めていた。この点につい
て、Ｋａｓｈｉら（Genomics. 7:31-36 1990）は、（Ｔ
Ｇ）10塩基配列を有するプローブを制限酵素（ＨａｅII
IまたはＭｂｏＩ）で消化した後で雌雄ウシゲノムＤＮ
Ａにハイブリダイズさせると、数ｋｂ〜数１０ｋｂの位
置に雄特異性バンドが検出されたと報告している。これ
らの知見から、反復ＣＡ配列はウシＹ染色体に特有の塩
基配列であることが推察される。このようにこれらの４
種のＤＮＡ断片は雄特異性であり、これらをプライマー
及びプローブとして用いることにより簡易にかつ高感度
にウシ雌雄を判別することができる。
れも反復ＣＡ配列を含んでいた。この反復配列はＥＳ８
の塩基配列のかなりの部分を占めていた。この点につい
て、Ｋａｓｈｉら（Genomics. 7:31-36 1990）は、（Ｔ
Ｇ）10塩基配列を有するプローブを制限酵素（ＨａｅII
IまたはＭｂｏＩ）で消化した後で雌雄ウシゲノムＤＮ
Ａにハイブリダイズさせると、数ｋｂ〜数１０ｋｂの位
置に雄特異性バンドが検出されたと報告している。これ
らの知見から、反復ＣＡ配列はウシＹ染色体に特有の塩
基配列であることが推察される。このようにこれらの４
種のＤＮＡ断片は雄特異性であり、これらをプライマー
及びプローブとして用いることにより簡易にかつ高感度
にウシ雌雄を判別することができる。
【００３２】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：９２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源：成熟ホルスタイン牛の末梢血の白血球 配列 ACAGTCACCA GGCACAGGGC TAAGAACGGC ACACAGTCAC ACACAAACAC ACACACAAAC 60 CGGTTGCACA GTCACCAGGG CACAGGGCTG AG 92
【００３３】配列番号：２ 配列の長さ：１４２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源：成熟ホルスタイン牛の末梢血の白血球 配列 AGGGGCACAG GGCTGAGAAA TCAAATTACA CACGAGCAAA AAAAAACCTC TTGCACAGTT 60 GCCAGGGGCA CAGGGCTGAG AACGGCACAC ACTCACATAC ACAGACAATC CGGTTGCACA 120 GTCGCCAGGG CACAGGGCTG AG 142
【００３４】配列番号：３ 配列の長さ：１７０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源：成熟ホルスタイン牛の末梢血の白血球 配列 TACAGTCGCC AGGGCACAGG GCTGAGAATT CACACACACA CCCAAACAAA CCTGTTGCAC 60 AGTTGCCAGG GCACAGCGCT GAGTATGGCA CACACTCACA CACACACACA AACCGGTTGA 120 ACCGTTACCA GAGCACAGGG CTGAGAACAG CACACACATA CACACACACC 170
【００３５】配列番号：４ 配列の長さ：２２４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源：成熟ホルスタイン牛の末梢血の白血球 配列 ACACACACAC ACACACACAC ACACACACTC ACAAATTCCA CAGTCGCCCG GGCACAGGGC 60 TGAGAAGAAC ACATACATAG ACACATACAC ACACAAACTG CTTGCACAGT CGTCAGGGCT 120 CAGGGCTGTG AATGGCACAC ACAAACACTG ACACACACAC ACACACGAAC AAACCATTGC 180 ACAGTCACCA GGGCACAGGG CTGAGGCCAG GGCACAGGGC TGAG 224
【００３６】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CACCAGGGCA CAGGGCTGAG 20
【００３７】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ACAGTCGCCA GGGCACAGGG 20
【図１】図１は反応生成物の１／１０を４％アガロース
ゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジウム染色後、紫外
線照射下で現像した結果を示す図である。レーン１〜７
はそれぞれ１、１０-1、１０-2、１０-3、１０-4、１０
-5および１０-6μｇのウシ雄ＤＮＡから増幅された生成
物の泳動結果を示したものである。レーン８はウシ雌Ｄ
ＮＡ１μｇから増幅された生成物についての泳動結果で
ある。
ゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジウム染色後、紫外
線照射下で現像した結果を示す図である。レーン１〜７
はそれぞれ１、１０-1、１０-2、１０-3、１０-4、１０
-5および１０-6μｇのウシ雄ＤＮＡから増幅された生成
物の泳動結果を示したものである。レーン８はウシ雌Ｄ
ＮＡ１μｇから増幅された生成物についての泳動結果で
ある。
【図２】図２は大腸菌ＭＶ１１８４にＰＣＲ生成物をプ
ラスミドＤＮＡｐＵＣ１１９のＳｍａＩ部位に結合さ
せ、クローン化した状態を示す図である。図中、ａは P
stIサイトを、ｂは Sma Iサイトを、ｃは挿入ＤＮＡ
を、そしてｄは EcoRIサイトを示す
ラスミドＤＮＡｐＵＣ１１９のＳｍａＩ部位に結合さ
せ、クローン化した状態を示す図である。図中、ａは P
stIサイトを、ｂは Sma Iサイトを、ｃは挿入ＤＮＡ
を、そしてｄは EcoRIサイトを示す
【図３】図３は４種のＰＣＲ生成物をもつプラスミドを
EcoRIと Pst Iで同時に消化し、その各種の一部を４％
アガロースゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジウム染
色した結果を示すものである。Ｍはマーカーである。
EcoRIと Pst Iで同時に消化し、その各種の一部を４％
アガロースゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジウム染
色した結果を示すものである。Ｍはマーカーである。
【図４】図４は４種のＤＮＡ断片、それぞれ９２ｂｐ
（Ｉ０−１）、１４２ｂｐ（Ｉ０−２）、１７０ｂｐ
（Ｉ０−３）および２２４ｂｐ（Ｉ０−４）の塩基配列
を示した図である。
（Ｉ０−１）、１４２ｂｐ（Ｉ０−２）、１７０ｂｐ
（Ｉ０−３）および２２４ｂｐ（Ｉ０−４）の塩基配列
を示した図である。
【図５】図５はドットブロットハイブリダイゼーション
分析の結果である。図中、１はＩ０−１断片を、２はＩ
０−２断片を、３はＩ０−３断片を、４はＩ０−４断片
をそれぞれハイブリダイズした結果である。
分析の結果である。図中、１はＩ０−１断片を、２はＩ
０−２断片を、３はＩ０−３断片を、４はＩ０−４断片
をそれぞれハイブリダイズした結果である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 米国特許4960690（ＵＳ，Ａ) Ａｎｉｍａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．１，ｐ．61 −73（1991) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C12Q 1/68 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ)
Claims (5)
- 【請求項１】 ＩＯ−１配列（配列番号：１）からなる
ウシの雄特異的ＤＮＡ、または該ＤＮＡにおいて塩基の
置換、欠失又は挿入があり、かつ該ＤＮＡとハイブリダ
イズし得るウシの雄特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−１（９２ｂｐ） 5'-ACAGTCACCA GGCACAGGGC TAAGAACGGC ACACAGTCAC ACACAAACAC ACACACAAAC CGGTTGCACA GTCACCAGGG CACAGGGCTG AG-3' - 【請求項２】 ＩＯ−２配列（配列番号：２）からなる
ウシの雄特異的ＤＮＡ、または該ＤＮＡにおいて塩基の
置換、欠失又は挿入があり、かつ該ＤＮＡとハイブリダ
イズし得るウシの雄特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−２（１４２ｂｐ） 5'-AGGGGCACAG GGCTGAGAAA TCAAATTACA CACGAGCAAA AAAAAACCTC TTGCACAGTT GCCAGGGGCA CAGGGCTGAG AACGGCACAC ACTCACATAC ACAGACAATC CGGTTGCACA GTCGCCAGGG CACAGGGCTG AG-3' - 【請求項３】 ＩＯ−３配列（配列番号：３）からなる
ウシの雄特異的ＤＮＡ、または該ＤＮＡにおいて塩基の
置換、欠失又は挿入があり、かつ該ＤＮＡとハイブリダ
イズし得るウシの雄特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−３（１７０ｂｐ） 5'-TACAGTCGCC AGGGCACAGG GCTGAGAATT CACACACACA CCCAAACAAA CCTGTTGCAC AGTTGCCAGG GCACAGCGCT GAGTATGGCA CACACTCACA CACACACACA AACCGGTTGA ACCGTTACCA GAGCACAGGG CTGAGAACAG CACACACATA CACACACACC-3' - 【請求項４】 ＩＯ−４配列（配列番号：４）からなる
ウシの雄特異的ＤＮＡ、または該ＤＮＡにおいて塩基の
置換、欠失又は挿入があり、かつ該ＤＮＡとハイブリダ
イズし得るウシの雄特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−４（２２４ｂｐ） 5'-ACACACACAC ACACACACAC ACACACACTC ACAAATTCCA CAGTCGCCCG GGCACAGGGC TGAGAAGAAC ACATACATAG ACACATACAC ACACAAACTG CTTGCACAGT CGTCAGGGCT CAGGGCTGTG AATGGCACAC ACAAACACTG ACACACACAC ACACACGAAC AAACCATTGC ACAGTCACCA GGGCACAGGG CTGAGGCCAG GGCACAGGGC TGAG-3' - 【請求項５】 請求項１〜４いずれか記載のＤＮＡの少
なくとも１つをプローブとして用いることを特徴とする
ウシ雌雄の判別方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16352491A JP3201780B2 (ja) | 1991-06-06 | 1991-06-06 | ウシの雄特異的ｄｎａおよびウシ雌雄の判別方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16352491A JP3201780B2 (ja) | 1991-06-06 | 1991-06-06 | ウシの雄特異的ｄｎａおよびウシ雌雄の判別方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04360687A JPH04360687A (ja) | 1992-12-14 |
| JP3201780B2 true JP3201780B2 (ja) | 2001-08-27 |
Family
ID=15775510
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16352491A Expired - Fee Related JP3201780B2 (ja) | 1991-06-06 | 1991-06-06 | ウシの雄特異的ｄｎａおよびウシ雌雄の判別方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3201780B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100679154B1 (ko) * | 2004-08-09 | 2007-02-05 | 진주산업대학교 산학협력단 | 형광접합보인법을 이용한 소 수정란의 성감별법 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4960690A (en) | 1985-05-31 | 1990-10-02 | The Salk Institute Biotechnology Industrial Associates, Inc. | Nucleic acid probes for prenatal sexing |
-
1991
- 1991-06-06 JP JP16352491A patent/JP3201780B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4960690A (en) | 1985-05-31 | 1990-10-02 | The Salk Institute Biotechnology Industrial Associates, Inc. | Nucleic acid probes for prenatal sexing |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ａｎｉｍａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．１，ｐ．６１−７３（１９９１） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04360687A (ja) | 1992-12-14 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |