JP3202744B2 - ポリエチレングリコール誘導体を含有する蛋白質修飾試薬 - Google Patents
ポリエチレングリコール誘導体を含有する蛋白質修飾試薬Info
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- JP3202744B2 JP3202744B2 JP09792490A JP9792490A JP3202744B2 JP 3202744 B2 JP3202744 B2 JP 3202744B2 JP 09792490 A JP09792490 A JP 09792490A JP 9792490 A JP9792490 A JP 9792490A JP 3202744 B2 JP3202744 B2 JP 3202744B2
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- protein
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、蛋白質の修飾試剤等として有用な高純度の
ポリエチレングリコール誘導体およびポリエチレングリ
コール誘導体の新規製造法に関するものである。
ポリエチレングリコール誘導体およびポリエチレングリ
コール誘導体の新規製造法に関するものである。
〔従来の技術〕 微生物や異種動物から得られる、ヒト由来のものと構
造を異にする蛋白質はヒトにとって非自己であるため、
ヒトに投与した場合、抗体を産生する。そして、これを
くり返し投与した場合には、アナフィラキシーショック
を起こし、生命に重大な危険を与えることが知られてい
る。このような問題点を解決するための有用な手段の１
つとして、次式 〔式中、Ｒはアルキル基を表し、ｎは任意に変わりうる
正の整数を表す。〕 で示されるポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）〔以
下、単に化合物（Ｉ）という〕を、蛋白質のアミノ基と
反応させ、ポリエチレングリコール修飾蛋白質に導き、
その蛋白質の抗原性を低下させる方法が知られている。
造を異にする蛋白質はヒトにとって非自己であるため、
ヒトに投与した場合、抗体を産生する。そして、これを
くり返し投与した場合には、アナフィラキシーショック
を起こし、生命に重大な危険を与えることが知られてい
る。このような問題点を解決するための有用な手段の１
つとして、次式 〔式中、Ｒはアルキル基を表し、ｎは任意に変わりうる
正の整数を表す。〕 で示されるポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）〔以
下、単に化合物（Ｉ）という〕を、蛋白質のアミノ基と
反応させ、ポリエチレングリコール修飾蛋白質に導き、
その蛋白質の抗原性を低下させる方法が知られている。
しかしながら、下記文献に記載の方法によって化合物
（Ｉ）の合成を試みたところ、高速ゲル濾過クロマトグ
ラフィーによる分析の結果、いずれの場合においても、
反応生成物は化合物（Ｉ）を含む混合物であることが判
明した。即ち、平均分子量5000であるポリエチレングリ
コールモノアルキルエーテルと塩化シアヌールを用いて
平均分子量10000の化合物（Ｉ）を得ようとする際、
特公昭61−42558号公報に記載の方法に従い、10gの無水
炭酸ソーダを含む100mlの無水ベンゼンに分子量5000の
モノメトキシポリエチレングリコール20gを溶解し、80
℃で30分間還流した後、２・４・６−トリクロロ−ｓ−
トリアジン365mgを加え、80℃にて24時間還流下反応さ
せた。反応残留物を濾去し、石油エーテル300mlを加え
て沈澱を生ぜしめ、沈澱を数回石油エーテルで洗うとい
う操作を行ったところ、また特開昭62−115280号公報
に記載の方法に従い、730mgの塩化シアヌールを40gのポ
リエチレングリコールモノメチルエーテル（平均分子量
5000）、200mlのベンゼン、20gの無水炭酸ナトリウムお
よび10gのモレキュラシーブ3Aの混合物に加え、80℃で2
0時間反応させた後、400mlの石油エーテルで沈澱を生成
させ、これをベンゼンに溶解、石油エーテルで再沈澱さ
せるという操作を３回繰り返したところ、およびの
いずれにおいても式 〔式中、Ｒおよびｎは前記と同意義〕 で示される化合物（III）（Ｒ＝CH3）が主である分子量
が5000から高分子量領域までの範囲にわたる数種の化合
物からなる混合物を得た（図２、３）。また、ケミスト
リーレタース,773（1980）に記載の方法に従い、730mg
の塩化シアヌールを40gのポリエチレングリコールモノ
メチルエーテル（平均分子量5000）、200mlの乾燥ベン
ゼン、20gの無水炭酸ナトリウムおよび10gのモレキュラ
シーブ3Aの混合物に加え、80℃で44時間反応させた後、
400mlの石油エーテルで沈澱を生成させ、これをベンゼ
ンに溶解、石油エーテルで再沈澱させるという操作を６
回繰り返したところ、化合物（III）（Ｒ＝CH3）、化合
物（Ｉ）（Ｒ＝CH3）および高分子量領域の化合物から
なる混合物を得た（図４）。さらに、ジャパニーズ・ジ
ャーナル・オブ・カンサー・リサーチ，77,1264（198
6）に記載の方法に従い、1.12gの塩化シアヌールを60g
のポリエチレングリコールモノメチルエーテル、200ml
の無水ベンゼン、20gの無水炭酸ナトリウムおよび20gの
モレキュラシーブ4Aの混合物に加え、80℃で120時間反
応させ、ベンゼンを留去の後、アセトンに溶解、続いて
石油エーテルで析出させるという操作を３回繰り返した
ところ高分子量領域の化合物が主である種々の化合物を
含む混合物を得た（図５）。
（Ｉ）の合成を試みたところ、高速ゲル濾過クロマトグ
ラフィーによる分析の結果、いずれの場合においても、
反応生成物は化合物（Ｉ）を含む混合物であることが判
明した。即ち、平均分子量5000であるポリエチレングリ
コールモノアルキルエーテルと塩化シアヌールを用いて
平均分子量10000の化合物（Ｉ）を得ようとする際、
特公昭61−42558号公報に記載の方法に従い、10gの無水
炭酸ソーダを含む100mlの無水ベンゼンに分子量5000の
モノメトキシポリエチレングリコール20gを溶解し、80
℃で30分間還流した後、２・４・６−トリクロロ−ｓ−
トリアジン365mgを加え、80℃にて24時間還流下反応さ
せた。反応残留物を濾去し、石油エーテル300mlを加え
て沈澱を生ぜしめ、沈澱を数回石油エーテルで洗うとい
う操作を行ったところ、また特開昭62−115280号公報
に記載の方法に従い、730mgの塩化シアヌールを40gのポ
リエチレングリコールモノメチルエーテル（平均分子量
5000）、200mlのベンゼン、20gの無水炭酸ナトリウムお
よび10gのモレキュラシーブ3Aの混合物に加え、80℃で2
0時間反応させた後、400mlの石油エーテルで沈澱を生成
させ、これをベンゼンに溶解、石油エーテルで再沈澱さ
せるという操作を３回繰り返したところ、およびの
いずれにおいても式 〔式中、Ｒおよびｎは前記と同意義〕 で示される化合物（III）（Ｒ＝CH3）が主である分子量
が5000から高分子量領域までの範囲にわたる数種の化合
物からなる混合物を得た（図２、３）。また、ケミスト
リーレタース,773（1980）に記載の方法に従い、730mg
の塩化シアヌールを40gのポリエチレングリコールモノ
メチルエーテル（平均分子量5000）、200mlの乾燥ベン
ゼン、20gの無水炭酸ナトリウムおよび10gのモレキュラ
シーブ3Aの混合物に加え、80℃で44時間反応させた後、
400mlの石油エーテルで沈澱を生成させ、これをベンゼ
ンに溶解、石油エーテルで再沈澱させるという操作を６
回繰り返したところ、化合物（III）（Ｒ＝CH3）、化合
物（Ｉ）（Ｒ＝CH3）および高分子量領域の化合物から
なる混合物を得た（図４）。さらに、ジャパニーズ・ジ
ャーナル・オブ・カンサー・リサーチ，77,1264（198
6）に記載の方法に従い、1.12gの塩化シアヌールを60g
のポリエチレングリコールモノメチルエーテル、200ml
の無水ベンゼン、20gの無水炭酸ナトリウムおよび20gの
モレキュラシーブ4Aの混合物に加え、80℃で120時間反
応させ、ベンゼンを留去の後、アセトンに溶解、続いて
石油エーテルで析出させるという操作を３回繰り返した
ところ高分子量領域の化合物が主である種々の化合物を
含む混合物を得た（図５）。
また本文献には、Sephadex G−100を担体としたゲル
濾過クロマトグラフィーを行い、本クロマトグラフィー
において分子量10000での単一のピークを示す精製品を
得、均一な化合物（Ｉ）（Ｒ＝CH3）を得たと記載され
ている。しかしながら近年、Sephadex G−100などを担
体とした低速ゲル濾過クロマトグラフィーに比べ、分離
能が優れた高速ゲル濾過クロマトグラフィーが開発さ
れ、従来分離不可能であった分離が可能になった（生化
学，56,1481（1984））。すなわち、Sephadex G−100な
どを担体とした低速ゲル濾過クロマトグラフィーによる
分析は純度分析法としては不充分な方法である。事実、
本文献に従い、Sephadex G−100を担体としたゲル濾過
クロマトグラフィーを行い、本文献の分子量10000を示
した主ピークで分画後、本クロマトグラフィーにおいて
単一ピークを示す部分を高速ゲル濾過クロマトグラフィ
ーにより分析したところ、高分子量領域の化合物が主で
ある種々の化合物を含む混合物であった（図６）。
濾過クロマトグラフィーを行い、本クロマトグラフィー
において分子量10000での単一のピークを示す精製品を
得、均一な化合物（Ｉ）（Ｒ＝CH3）を得たと記載され
ている。しかしながら近年、Sephadex G−100などを担
体とした低速ゲル濾過クロマトグラフィーに比べ、分離
能が優れた高速ゲル濾過クロマトグラフィーが開発さ
れ、従来分離不可能であった分離が可能になった（生化
学，56,1481（1984））。すなわち、Sephadex G−100な
どを担体とした低速ゲル濾過クロマトグラフィーによる
分析は純度分析法としては不充分な方法である。事実、
本文献に従い、Sephadex G−100を担体としたゲル濾過
クロマトグラフィーを行い、本文献の分子量10000を示
した主ピークで分画後、本クロマトグラフィーにおいて
単一ピークを示す部分を高速ゲル濾過クロマトグラフィ
ーにより分析したところ、高分子量領域の化合物が主で
ある種々の化合物を含む混合物であった（図６）。
しかして、このような広範囲にわたる分子量をもつ種
々の化合物を含む混合物を使用して、蛋白質を修飾した
場合には、修飾された蛋白質は不均一となり、一定の品
質のものを常に得ることが極めて困難などの問題点があ
る。
々の化合物を含む混合物を使用して、蛋白質を修飾した
場合には、修飾された蛋白質は不均一となり、一定の品
質のものを常に得ることが極めて困難などの問題点があ
る。
一方、このような広範囲にわたる分子量をもつ種々の
化合物を含む混合物から工業的な分離、精製手段（再結
晶、再沈澱、限外濾過など）によって効率的に目的物で
ある化合物（Ｉ）を高純度に得ることは、従来なし得ら
れていないのが実情である。
化合物を含む混合物から工業的な分離、精製手段（再結
晶、再沈澱、限外濾過など）によって効率的に目的物で
ある化合物（Ｉ）を高純度に得ることは、従来なし得ら
れていないのが実情である。
そこで、本発明の目的は高純度の化合物（Ｉ）を提供
することである。
することである。
本発明の別の目的は化合物（Ｉ）を製造しうる新規製
造方法を提供することである。
造方法を提供することである。
本発明者らは鋭意検討の結果、極めて高い純度の化合
物（Ｉ）を得ることに成功し、さらに研究を重ねて本発
明を完成した。
物（Ｉ）を得ることに成功し、さらに研究を重ねて本発
明を完成した。
即ち、本発明は式 〔式中、Ｒはアルキル基を表し、ｎは任意に変わり得る
正の整数を表す。〕で示される高純度なポリエチレング
リコール誘導体、即ち高純度な化合物（Ｉ）を提供せん
とするものである。また、本発明は高速ゲル濾過クロマ
トグラフィーによる純度が75％以上である化合物（Ｉ）
を提供せんとするものである。さらにまた、本発明は次
式 ＲOCH2CH2 nOH （II） 〔式中、Ｒおよびｎは前記と同意義〕 で示される化合物（II）と塩化シアヌールとをII B族金
属化合物の共存下に反応させることによって製造され
得、高分子量の生成物ならびに化合物（II）と塩化シア
ヌールの各々１分子が反応して生成する式 〔式中、Ｒおよびｎは前記と同意義〕 で示される化合物（III）等の副生成物が極めて少ない
高純度の化合物（Ｉ）を提供せんとするものである。さ
らに別の本発明は、化合物（II）と塩化シアヌールとを
II B族金属化合物の共存下に反応させることによる化合
物（Ｉ）の製造法である。
正の整数を表す。〕で示される高純度なポリエチレング
リコール誘導体、即ち高純度な化合物（Ｉ）を提供せん
とするものである。また、本発明は高速ゲル濾過クロマ
トグラフィーによる純度が75％以上である化合物（Ｉ）
を提供せんとするものである。さらにまた、本発明は次
式 ＲOCH2CH2 nOH （II） 〔式中、Ｒおよびｎは前記と同意義〕 で示される化合物（II）と塩化シアヌールとをII B族金
属化合物の共存下に反応させることによって製造され
得、高分子量の生成物ならびに化合物（II）と塩化シア
ヌールの各々１分子が反応して生成する式 〔式中、Ｒおよびｎは前記と同意義〕 で示される化合物（III）等の副生成物が極めて少ない
高純度の化合物（Ｉ）を提供せんとするものである。さ
らに別の本発明は、化合物（II）と塩化シアヌールとを
II B族金属化合物の共存下に反応させることによる化合
物（Ｉ）の製造法である。
上記各式中、Ｒで示されるアルキル基としては炭素数
１〜18のものが好ましく、例えばメチル、エチル、ｎ−
プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、se
c−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシ
ル、イソヘキシル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、イソノ
ニル、ｎ−デシル、イソデシル、ｎ−ウンデシル、ｎ−
ドデシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ペ
ンタデシル、ｎ−ヘキサデシル、ｎ−ヘプタデシル、ｎ
−オクタデシルなどが挙げられ、中でも炭素数１〜４の
ものが特に好適である。最も好ましいものはメチルであ
る。
１〜18のものが好ましく、例えばメチル、エチル、ｎ−
プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、se
c−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシ
ル、イソヘキシル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、イソノ
ニル、ｎ−デシル、イソデシル、ｎ−ウンデシル、ｎ−
ドデシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ペ
ンタデシル、ｎ−ヘキサデシル、ｎ−ヘプタデシル、ｎ
−オクタデシルなどが挙げられ、中でも炭素数１〜４の
ものが特に好適である。最も好ましいものはメチルであ
る。
上記各式中、ｎで示される正の整数としては10〜700
が好ましく、とりわけ50〜350が好適である。
が好ましく、とりわけ50〜350が好適である。
前記した高純度の化合物（Ｉ）は、例えば以下のよう
にして製造することができる。
にして製造することができる。
即ち、化合物（II）と塩化シアヌールとをII B族金属
化合物の共存下に、適当な溶媒中で反応させることによ
って製造される。反応時間は、通常１〜300時間であ
り、反応温度は、通常50〜140℃、好適には70〜110℃程
度である。ここで用いられる溶媒としては、本発明に用
いる試剤に対し不活性な溶媒ならいずれでも良く、例え
ばベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素系溶媒およ
び1,2−ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素系溶
媒が挙げられる。
化合物の共存下に、適当な溶媒中で反応させることによ
って製造される。反応時間は、通常１〜300時間であ
り、反応温度は、通常50〜140℃、好適には70〜110℃程
度である。ここで用いられる溶媒としては、本発明に用
いる試剤に対し不活性な溶媒ならいずれでも良く、例え
ばベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素系溶媒およ
び1,2−ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素系溶
媒が挙げられる。
共存させるII B族金属化合物としては、好ましくは酸
化亜鉛、酸化カドミウム、酸化水銀のII B族金属酸化物
があげられる。また、反応系内より水分を除去する手段
を講じることが望ましく、例えばモレキュラシーブなど
が用いられる。
化亜鉛、酸化カドミウム、酸化水銀のII B族金属酸化物
があげられる。また、反応系内より水分を除去する手段
を講じることが望ましく、例えばモレキュラシーブなど
が用いられる。
本発明の高純度ポリエチレングリコール誘導体の純度
は高速ゲル濾過クロマトグラフ法を用い以下の条件にて
測定した。
は高速ゲル濾過クロマトグラフ法を用い以下の条件にて
測定した。
（条件） カラム:TSK−gel G3000SWφ7.5mm×60cm（東ソー社
製） 溶出液：エタノール／〔0.01Mリン酸緩衝液（pH7）＋
0.2M食塩水〕＝1/19 流速 :0.7ml/分 検出波長:254nm 後記図１〜６に示した分析はこの条件によった。
製） 溶出液：エタノール／〔0.01Mリン酸緩衝液（pH7）＋
0.2M食塩水〕＝1/19 流速 :0.7ml/分 検出波長:254nm 後記図１〜６に示した分析はこの条件によった。
図１に示されるように本発明によるポリエチレングリ
コール誘導体は従来技術によって得られたいずれのもの
に比しても（図２〜６）はるかに高純度であり、高速ゲ
ル濾過クロマトグラフィーによる純度が75％を超えるも
のである。
コール誘導体は従来技術によって得られたいずれのもの
に比しても（図２〜６）はるかに高純度であり、高速ゲ
ル濾過クロマトグラフィーによる純度が75％を超えるも
のである。
ここに、高速ゲル濾過クロマトグラフィーによる純度
とは、高速ゲル濾過クロマトグラフィーのチャートによ
って形成される面積に対して、化合物（Ｉ）によって形
成されるピークの占める面積百分率である。通常、デー
タ処理は、例えばクロマトパックＣ−R6A（島津）など
のデータ処理機を用いて行う。
とは、高速ゲル濾過クロマトグラフィーのチャートによ
って形成される面積に対して、化合物（Ｉ）によって形
成されるピークの占める面積百分率である。通常、デー
タ処理は、例えばクロマトパックＣ−R6A（島津）など
のデータ処理機を用いて行う。
上記方法によって得られる反応生成物は既に化合物
（Ｉ）を高純度に含むため、そのまま、例えば蛋白質の
修飾試剤として使用可能であるが、さらに高純度の化合
物（Ｉ）を得ることを所望するならば、再結晶、再沈
澱、限外濾過などの工業的な分離、精製手段を施すこと
が好ましい。
（Ｉ）を高純度に含むため、そのまま、例えば蛋白質の
修飾試剤として使用可能であるが、さらに高純度の化合
物（Ｉ）を得ることを所望するならば、再結晶、再沈
澱、限外濾過などの工業的な分離、精製手段を施すこと
が好ましい。
本発明の高純度の化合物（Ｉ）にて蛋白質、例えばＬ
−アスパラギナーゼ分子中のアミノ基を修飾して得られ
る修飾アスパラギナーゼは、従来品〔特公昭61−42558
号公報、ケミストリーレタース,773（1980）、ジャパニ
ーズ ジャーナル オブ カンサー リサーチ，77,126
4（1986）参照〕に比べ、次式 〔式中、Ｒおよびｎは前記と同意義であり、ｘは１から
92を示す。〕 で示される修飾アスパラギナーゼを高純度に含む修飾ア
スパラギナーゼである。
−アスパラギナーゼ分子中のアミノ基を修飾して得られ
る修飾アスパラギナーゼは、従来品〔特公昭61−42558
号公報、ケミストリーレタース,773（1980）、ジャパニ
ーズ ジャーナル オブ カンサー リサーチ，77,126
4（1986）参照〕に比べ、次式 〔式中、Ｒおよびｎは前記と同意義であり、ｘは１から
92を示す。〕 で示される修飾アスパラギナーゼを高純度に含む修飾ア
スパラギナーゼである。
本発明の高純度の化合物（Ｉ）による蛋白質の修飾
は、従来と同様の方法により行うことができる。即ち、
pH8〜10のホウ酸、リン酸または酢酸などの緩衝溶液
中、０℃〜室温の範囲で１〜72時間反応させればよい。
化合物（Ｉ）は、通常蛋白質のアミノ基の数に対し、１
〜20倍モルを用いるが、所望の修飾度合いに応じて変化
させて用いる。反応液は必要に応じて限外濾過、イオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフ
ィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラ
フィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、電気泳動、
透析などの通常用いられる手段によって精製し、目的の
修飾蛋白質を得ることができる。
は、従来と同様の方法により行うことができる。即ち、
pH8〜10のホウ酸、リン酸または酢酸などの緩衝溶液
中、０℃〜室温の範囲で１〜72時間反応させればよい。
化合物（Ｉ）は、通常蛋白質のアミノ基の数に対し、１
〜20倍モルを用いるが、所望の修飾度合いに応じて変化
させて用いる。反応液は必要に応じて限外濾過、イオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフ
ィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラ
フィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、電気泳動、
透析などの通常用いられる手段によって精製し、目的の
修飾蛋白質を得ることができる。
以下に実施例、参考例をもって本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
実施例１ 2,4−ビス−メトキシポリエチレングリコール−６−ク
ロロ−ｓ−トリアジンの製造 平均分子量が5000であるポリエチレングリコールモノ
メチルエーテル110gとモレキュラシーブ4A25gをベンゼ
ン0.5中で６時間、80℃にて還流した。室温まで放冷
後、酸化亜鉛50gと塩化シアヌール1.85gを加え、53時
間、80℃にて加熱還流した。室温まで冷却後、ベンゼン
0.5を加えて濾過した後、濾液を濃縮乾固し、標記化
合物108gを得た。
ロロ−ｓ−トリアジンの製造 平均分子量が5000であるポリエチレングリコールモノ
メチルエーテル110gとモレキュラシーブ4A25gをベンゼ
ン0.5中で６時間、80℃にて還流した。室温まで放冷
後、酸化亜鉛50gと塩化シアヌール1.85gを加え、53時
間、80℃にて加熱還流した。室温まで冷却後、ベンゼン
0.5を加えて濾過した後、濾液を濃縮乾固し、標記化
合物108gを得た。
物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK−gel G3000SWφ7.5mm×60cm（東ソー社
製） 溶出液：エタノール／〔0.01Mリン酸緩衝液（pH7）＋
0.2M食塩水〕＝1/19 流速 :0.7ml/分 検出波長:254nm 保持時間:20,967分 純度:91.5％（面積百分率） チャート：図１の通り ・シリカゲル薄層クロマトグラフィー シリカゲル：キーセルゲル60（メルク社製） 展開溶媒：塩化メチレン／メタノール＝15/2 Rf値:0.5 実施例２ 2,4−ビス−メトキシポリエチレングリコール−６−ク
ロロ−ｓ−トリアジンの製造 平均分子量が5000であるポリエチレングリコールモノ
メチルエーテル11gをベンゼン50ml中で４時間、80℃に
て加熱還流し、室温まで放冷後、モレキュラシーブ4A2.
5gを加えて、４時間、80℃にて加熱還流した。室温まで
放冷後、酸化水銀（黄）13.5gと塩化シアヌール184mgを
加え、27時間、80℃にて加熱還流した。室温まで冷却
後、ベンゼン50mlを加えて遠心分離した後、ベンゼンを
留去、乾燥し、標記化合物9.79g（TSKG3000SWを用いた
高速ゲル濾過クロマトグラフィーにおける純度78.2％）
を得た。
製） 溶出液：エタノール／〔0.01Mリン酸緩衝液（pH7）＋
0.2M食塩水〕＝1/19 流速 :0.7ml/分 検出波長:254nm 保持時間:20,967分 純度:91.5％（面積百分率） チャート：図１の通り ・シリカゲル薄層クロマトグラフィー シリカゲル：キーセルゲル60（メルク社製） 展開溶媒：塩化メチレン／メタノール＝15/2 Rf値:0.5 実施例２ 2,4−ビス−メトキシポリエチレングリコール−６−ク
ロロ−ｓ−トリアジンの製造 平均分子量が5000であるポリエチレングリコールモノ
メチルエーテル11gをベンゼン50ml中で４時間、80℃に
て加熱還流し、室温まで放冷後、モレキュラシーブ4A2.
5gを加えて、４時間、80℃にて加熱還流した。室温まで
放冷後、酸化水銀（黄）13.5gと塩化シアヌール184mgを
加え、27時間、80℃にて加熱還流した。室温まで冷却
後、ベンゼン50mlを加えて遠心分離した後、ベンゼンを
留去、乾燥し、標記化合物9.79g（TSKG3000SWを用いた
高速ゲル濾過クロマトグラフィーにおける純度78.2％）
を得た。
実施例３ 2,4−ビス−メトキシポリエチレングリコール−６−ク
ロロ−ｓ−トリアジンの製造 平均分子量が5000であるポリエチレングリコールモノ
メチルエーテル11gをベンゼン50ml中で４時間、80℃に
て加熱還流し、室温まで放冷後、モレキュラシーブ4A2.
5gを加えて、４時間、80℃にて加熱還流した。室温まで
放冷後、酸化カドミウム7.8gと塩化シアヌール184mgを
加え、34時間、80℃にて加熱還流した。室温まで冷却
後、ベンゼン50mlを加えて遠心分離した後、ベンゼンを
留去、乾燥し、標記化合物9.35g（TSK gel G3000SWを
用いた高速ゲル濾過クロマトグラフィーにおける純度7
8.5％）を得た。
ロロ−ｓ−トリアジンの製造 平均分子量が5000であるポリエチレングリコールモノ
メチルエーテル11gをベンゼン50ml中で４時間、80℃に
て加熱還流し、室温まで放冷後、モレキュラシーブ4A2.
5gを加えて、４時間、80℃にて加熱還流した。室温まで
放冷後、酸化カドミウム7.8gと塩化シアヌール184mgを
加え、34時間、80℃にて加熱還流した。室温まで冷却
後、ベンゼン50mlを加えて遠心分離した後、ベンゼンを
留去、乾燥し、標記化合物9.35g（TSK gel G3000SWを
用いた高速ゲル濾過クロマトグラフィーにおける純度7
8.5％）を得た。
実施例４ 2,4−ビス−メトキシポリエチレングリコール−６−ク
ロロ−ｓ−トリアジンのゲル濾過精製 実施例１で得た反応生成物800mgを20mlの水に溶か
し、TSK gel G3000SW（21.5mmφ×600mm、水にて溶
出）にてゲル濾過精製を行い、目的物を含む画分を凍結
乾燥し、標記化合物のより高度の精製物を324mg（TSK
gel G3000SWを用いた高速ゲル濾過クロマトグラフィー
における純度99.6％）得た。
ロロ−ｓ−トリアジンのゲル濾過精製 実施例１で得た反応生成物800mgを20mlの水に溶か
し、TSK gel G3000SW（21.5mmφ×600mm、水にて溶
出）にてゲル濾過精製を行い、目的物を含む画分を凍結
乾燥し、標記化合物のより高度の精製物を324mg（TSK
gel G3000SWを用いた高速ゲル濾過クロマトグラフィー
における純度99.6％）得た。
物性値 融点:56〜58℃ 元素分析:C 53.65（54.17）,H 8.99（9.05）,N 0.46
（0.41）,Cl 0.33（0.35）括弧内はポリエチレングリコ
ールモノメチルエーテルの分子量を5004とした時の理論
値。
（0.41）,Cl 0.33（0.35）括弧内はポリエチレングリコ
ールモノメチルエーテルの分子量を5004とした時の理論
値。
13C−NMR（CDCl3、コンプリート デカップリング） δ:58.6,67.9,68.2,69.7,69.9,70.1,70.3,70.6,71.5,
171.6,172.1 参考例１ ポリエチレングリコール修飾アスパラギナーゼの製造 アスパラギナーゼ976mgをpH10.0に調製した0.1Mホウ
酸緩衝溶液195mlに溶解し、実施例１で得た高純度の2,4
−ビス−メトキシポリエチレングリコール−６−クロロ
−ｓ−トリアジン29.0gを60分間に３回に分けて４℃で
加えた。４℃で22時間撹拌した後、水を加えて4.5と
し、５％酢酸水溶液にて中和後、限外濾過によって標記
目的物を蛋白含量0.14mg/mlの水溶液として6.5得た。
171.6,172.1 参考例１ ポリエチレングリコール修飾アスパラギナーゼの製造 アスパラギナーゼ976mgをpH10.0に調製した0.1Mホウ
酸緩衝溶液195mlに溶解し、実施例１で得た高純度の2,4
−ビス−メトキシポリエチレングリコール−６−クロロ
−ｓ−トリアジン29.0gを60分間に３回に分けて４℃で
加えた。４℃で22時間撹拌した後、水を加えて4.5と
し、５％酢酸水溶液にて中和後、限外濾過によって標記
目的物を蛋白含量0.14mg/mlの水溶液として6.5得た。
物性値 カラム：高速ゲル濾過クロマトグラフィー（TSK−gel
G4000PWXL φ7.8mm×30cm 2本連結、ガードカラム TSKguard columnPWXL φ6.0mm×4cm）（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水 流速 :0.6ml/分 検出波長:254nm 保持時間:24.3分 〔発明の効果〕 本発明の高純度の化合物（Ｉ）は、蛋白質の抗原性の
低下を目的とした修飾のほかに、生体内クリアランスの
遅延、組織への送達の向上などを目的とした蛋白質の修
飾に有用である。当該高純度の化合物（Ｉ）を用いて蛋
白質を修飾することによって、医薬組成物として満足し
得る品質の修飾蛋白質、例えば修飾アスパララギナーゼ
を容易に得ることができる。
G4000PWXL φ7.8mm×30cm 2本連結、ガードカラム TSKguard columnPWXL φ6.0mm×4cm）（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水 流速 :0.6ml/分 検出波長:254nm 保持時間:24.3分 〔発明の効果〕 本発明の高純度の化合物（Ｉ）は、蛋白質の抗原性の
低下を目的とした修飾のほかに、生体内クリアランスの
遅延、組織への送達の向上などを目的とした蛋白質の修
飾に有用である。当該高純度の化合物（Ｉ）を用いて蛋
白質を修飾することによって、医薬組成物として満足し
得る品質の修飾蛋白質、例えば修飾アスパララギナーゼ
を容易に得ることができる。
また、本発明の製造法によれば、従来に比較して、上
述の如き高純度の化合物（Ｉ）を製造することができ
る。
述の如き高純度の化合物（Ｉ）を製造することができ
る。
図1:実施例１の方法によって得られる高純度ポリエチレ
ングリコール誘導体の高速ゲル濾過クロマトグラフィ
ー。 図2:特公昭61−42558号公報に記載の方法に従って得ら
れるポリエチレングリコール誘導体の高速ゲル濾過クロ
マトグラフィー。 図3:特開昭62−115280号公報に記載の方法に従って得ら
れるポリエチレングリコール誘導体の高速ゲル濾過クロ
マトグラフィー。 図4:ケミストリーレタース、773（1980）に記載の方法
に従って得られるポリエチレングリコール誘導体の高速
ゲル濾過クロマトグラフィー。 図5:ジャパニーズ ジャーナル オブ カンサー リサ
ーチ 77 1264（1986）に記載の方法に従って得られる
ポリエチレングリコール誘導体の高速ゲル濾過クロマト
グラフィー。 図6:ジャパニーズ ジャーナル オブ カンサー リサ
ーチ 77 1264（1986）に記載の方法に従い、合成した
後、同文献に従いゲル濾過クロマトグラフィーにより精
製して得られるポリエチレングリコール誘導体の高速ゲ
ル濾過クロマトグラフィー。
ングリコール誘導体の高速ゲル濾過クロマトグラフィ
ー。 図2:特公昭61−42558号公報に記載の方法に従って得ら
れるポリエチレングリコール誘導体の高速ゲル濾過クロ
マトグラフィー。 図3:特開昭62−115280号公報に記載の方法に従って得ら
れるポリエチレングリコール誘導体の高速ゲル濾過クロ
マトグラフィー。 図4:ケミストリーレタース、773（1980）に記載の方法
に従って得られるポリエチレングリコール誘導体の高速
ゲル濾過クロマトグラフィー。 図5:ジャパニーズ ジャーナル オブ カンサー リサ
ーチ 77 1264（1986）に記載の方法に従って得られる
ポリエチレングリコール誘導体の高速ゲル濾過クロマト
グラフィー。 図6:ジャパニーズ ジャーナル オブ カンサー リサ
ーチ 77 1264（1986）に記載の方法に従い、合成した
後、同文献に従いゲル濾過クロマトグラフィーにより精
製して得られるポリエチレングリコール誘導体の高速ゲ
ル濾過クロマトグラフィー。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 前田 弘雄 大阪府大阪市此花区春日出中３丁目１番 98号 住友製薬株式会社内 (56)参考文献 特開 昭62−115280（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−126900（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−60375（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−95200（ＪＰ，Ａ) Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ ｓ．，Ｖｏｌ．77，ｐ．1264−1270 （1986) 癌と化学療法，Ｖｏｌ．11（10）, ｐ．2227−2235（1984) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 17/08 C08G 65/321 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
Claims (4)
- 【請求項１】式 〔式中、Ｒは炭素数１〜18のアルキル基を表し、ｎは10
〜700の整数を表す。〕で示されるポリエチレングリコ
ール誘導体を含有する蛋白質修飾試剤であって、該蛋白
質修飾試剤中における該誘導体の高速ゲル濾過クロマト
グラフィーによる純度が75％以上である蛋白質修飾試
剤。 - 【請求項２】該誘導体の純度が91.5％以上である請求項
１記載の蛋白質修飾試剤。 - 【請求項３】式（Ｉ）において、ｎが50〜350の整数で
ある請求項１または２記載の蛋白質修飾試剤。 - 【請求項４】式（Ｉ）において、Ｒが炭素数１〜４のア
ルキル基である請求項１〜３のいずれかに記載の蛋白質
修飾試剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09792490A JP3202744B2 (ja) | 1989-05-27 | 1990-04-13 | ポリエチレングリコール誘導体を含有する蛋白質修飾試薬 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13419289 | 1989-05-27 | ||
| JP1-134192 | 1989-05-27 | ||
| JP09792490A JP3202744B2 (ja) | 1989-05-27 | 1990-04-13 | ポリエチレングリコール誘導体を含有する蛋白質修飾試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0372469A JPH0372469A (ja) | 1991-03-27 |
| JP3202744B2 true JP3202744B2 (ja) | 2001-08-27 |
Family
ID=26439064
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09792490A Expired - Lifetime JP3202744B2 (ja) | 1989-05-27 | 1990-04-13 | ポリエチレングリコール誘導体を含有する蛋白質修飾試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3202744B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20070027621A (ko) * | 2004-06-08 | 2007-03-09 | 알자 코포레이션 | 4-성분 축합 반응에 의한 고분자 콘쥬게이트의 제조 |
-
1990
- 1990-04-13 JP JP09792490A patent/JP3202744B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．７７，ｐ．１２６４−１２７０（１９８６） |
| 癌と化学療法，Ｖｏｌ．１１（１０），ｐ．２２２７−２２３５（１９８４） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0372469A (ja) | 1991-03-27 |
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