JP3203108B2 - グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの安定化方法 - Google Patents
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの安定化方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はグルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼを用いた臨床検査において、グルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼを安定化する方法、お
よび安定化されたグルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼからなる安定性の良好な臨床検査用定量試薬に関す
る。
デヒドロゲナーゼを用いた臨床検査において、グルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼを安定化する方法、お
よび安定化されたグルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼからなる安定性の良好な臨床検査用定量試薬に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼは補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以
下、ＮＡＤという。）またはニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰという。）の存在
下で、グルコース−６−リン酸を酸化しグルコノ−δ−
ラクトン−６−リン酸および還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨという。）または
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（以下、ＮＡＤＰＨという。）を産生する反応、あるい
はこの逆反応を触媒する性質を有する酵素で、動植物界
に広く分布している。この性質を利用してグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼは分析試料中のグルコース
関連物質や補酵素の定量、およびグルコース関連酵素の
活性測定に使用されているが、実用上において安定性に
問題がある。
ゼは補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以
下、ＮＡＤという。）またはニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰという。）の存在
下で、グルコース−６−リン酸を酸化しグルコノ−δ−
ラクトン−６−リン酸および還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨという。）または
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（以下、ＮＡＤＰＨという。）を産生する反応、あるい
はこの逆反応を触媒する性質を有する酵素で、動植物界
に広く分布している。この性質を利用してグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼは分析試料中のグルコース
関連物質や補酵素の定量、およびグルコース関連酵素の
活性測定に使用されているが、実用上において安定性に
問題がある。
【０００３】グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
の安定性を改善する方法として、耐熱性菌由来の酵素を
用いる方法が知られている（特開昭５６−１６９５９８
号公報、特開昭５９−１５１８９９号公報）が、必ずし
も満足な安定性を得るに至っていない。また、グルコー
スの定量試薬において試薬中のグルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼとキレート剤またはＳＨ化合物とを共
存させる方法も知られている（ＥＰ０２５３５２０）
が、弱酸性側の試薬条件において満足な安定性を得るに
至っていない。
の安定性を改善する方法として、耐熱性菌由来の酵素を
用いる方法が知られている（特開昭５６−１６９５９８
号公報、特開昭５９−１５１８９９号公報）が、必ずし
も満足な安定性を得るに至っていない。また、グルコー
スの定量試薬において試薬中のグルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼとキレート剤またはＳＨ化合物とを共
存させる方法も知られている（ＥＰ０２５３５２０）
が、弱酸性側の試薬条件において満足な安定性を得るに
至っていない。
【０００４】
【発明の解決しようとする課題】本発明は、グルコース
−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いたグルコース関連
物質および補酵素の定量法ならびにグルコース関連酵素
の活性測定法に用いる液状臨床検査試薬において該酵素
の安定性を向上させる技術を提供することを目的とす
る。
−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いたグルコース関連
物質および補酵素の定量法ならびにグルコース関連酵素
の活性測定法に用いる液状臨床検査試薬において該酵素
の安定性を向上させる技術を提供することを目的とす
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、グルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを、ヒドロキシルア
ミン類およびその塩ならびにアルデヒド捕捉剤およびそ
の塩から選ばれる少なくとも一つの安定化剤と共存させ
ることを特徴とする、グルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼの安定化方法を提供することができる。
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを、ヒドロキシルア
ミン類およびその塩ならびにアルデヒド捕捉剤およびそ
の塩から選ばれる少なくとも一つの安定化剤と共存させ
ることを特徴とする、グルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼの安定化方法を提供することができる。
【０００６】以下に、本発明を詳細に説明する。本発明
に用いられるヒドロキシルアミン類は、一般式（I)
に用いられるヒドロキシルアミン類は、一般式（I)
【０００７】
【化３】
【０００８】（式中、Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ3 は同一もし
くは異なって、水素、置換もしくは非置換低級アルキ
ル、シクロアルキル、低級アルケニル、置換もしくは非
置換アラルキル、置換もしくは非置換アリール、低級ア
ルカノイル、置換もしくは非置換アロイル、シンナミル
またはシンナモイルを示すか、あるいはＲ2 とＲ3 が一
緒になって窒素原子をはさんで含窒素複素環基を形成し
てもよい。）で表わされる化合物〔以下、化合物（I）
という。〕である。
くは異なって、水素、置換もしくは非置換低級アルキ
ル、シクロアルキル、低級アルケニル、置換もしくは非
置換アラルキル、置換もしくは非置換アリール、低級ア
ルカノイル、置換もしくは非置換アロイル、シンナミル
またはシンナモイルを示すか、あるいはＲ2 とＲ3 が一
緒になって窒素原子をはさんで含窒素複素環基を形成し
てもよい。）で表わされる化合物〔以下、化合物（I）
という。〕である。
【０００９】本発明に用いられるアルデヒド捕捉剤は、
一般式（II）
一般式（II）
【００１０】
【化４】
【００１１】（式中、Ｒ4およびＲ5は同一もしくは異な
って、水素、置換もしくは非置換低級アルキル、シクロ
アルキル、低級アルケニル、置換もしくは非置換アラル
キル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置
換複素環基、低級アルカノイル、置換もしくは非置換ア
ロイル、ピリジルカルボニル、低級アルコキシカルボニ
ル、置換もしくは非置換アミノを示し、Ｘは酸素または
硫黄原子を示し、ｎは０〜２の整数を示す。）で表わさ
れる化合物〔以下、化合物（II）という。〕、（Ｃ
Ｈ3） 2 ＮＣＳＣｌ〔以下、化合物（III）という。〕お
よびＨ2ＮＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＯＨ〔以下、化合
物（IV）という。〕から選ばれる化合物である。
って、水素、置換もしくは非置換低級アルキル、シクロ
アルキル、低級アルケニル、置換もしくは非置換アラル
キル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置
換複素環基、低級アルカノイル、置換もしくは非置換ア
ロイル、ピリジルカルボニル、低級アルコキシカルボニ
ル、置換もしくは非置換アミノを示し、Ｘは酸素または
硫黄原子を示し、ｎは０〜２の整数を示す。）で表わさ
れる化合物〔以下、化合物（II）という。〕、（Ｃ
Ｈ3） 2 ＮＣＳＣｌ〔以下、化合物（III）という。〕お
よびＨ2ＮＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＯＨ〔以下、化合
物（IV）という。〕から選ばれる化合物である。
【００１２】化合物（I）および化合物（II）の定義に
おいて、低級アルキルおよび低級アルコキシカルボニル
のアルキル部分としては、直鎖または分岐状の炭素数１
〜６の、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピ
ル、ブチル、イソブチル、sec −ブチル、tert−ブチ
ル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等を表し、シク
ロアルキルとしては、炭素数３〜８の、例えばシクロプ
ロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシ
ル、シクロヘプチル、シクロオクチル等を表し、低級ア
ルケニルとしては、直鎖または分岐状の炭素数２〜６
の、例えばビニル、アリル、イソプロペニル、4-ペンテ
ニル、5-ヘキセニル等を表し、アラルキルとしては、炭
素数７〜１５の、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリ
ル、フェニルプロピル等を表し、アリールおよびアロイ
ルのアリール部分としては、フェニルまたはナフチルを
表し、Ｒ2 およびＲ3 が一緒になって形成する含窒素複
素環基としては、ピロリジニリル、ピペリジノ、モルホ
リノ、ピペラジニル等を表し、複素環基としては、フリ
ル、チエニル、ピロリル、ピラニル、チオピラニル、ピ
リジル、チアゾリル、イミダゾリニル、ピリミジニル、
トリアジニル、インドリル、キノリル、プリニル、ベン
ゾチアゾリル等を表し、低級アルカノイルとしては、直
鎖もしくは分岐状の炭素数１〜６の、例えばホルミル、
アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、ピバロ
イル、ペンタノイル等を表す。
おいて、低級アルキルおよび低級アルコキシカルボニル
のアルキル部分としては、直鎖または分岐状の炭素数１
〜６の、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピ
ル、ブチル、イソブチル、sec −ブチル、tert−ブチ
ル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等を表し、シク
ロアルキルとしては、炭素数３〜８の、例えばシクロプ
ロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシ
ル、シクロヘプチル、シクロオクチル等を表し、低級ア
ルケニルとしては、直鎖または分岐状の炭素数２〜６
の、例えばビニル、アリル、イソプロペニル、4-ペンテ
ニル、5-ヘキセニル等を表し、アラルキルとしては、炭
素数７〜１５の、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリ
ル、フェニルプロピル等を表し、アリールおよびアロイ
ルのアリール部分としては、フェニルまたはナフチルを
表し、Ｒ2 およびＲ3 が一緒になって形成する含窒素複
素環基としては、ピロリジニリル、ピペリジノ、モルホ
リノ、ピペラジニル等を表し、複素環基としては、フリ
ル、チエニル、ピロリル、ピラニル、チオピラニル、ピ
リジル、チアゾリル、イミダゾリニル、ピリミジニル、
トリアジニル、インドリル、キノリル、プリニル、ベン
ゾチアゾリル等を表し、低級アルカノイルとしては、直
鎖もしくは分岐状の炭素数１〜６の、例えばホルミル、
アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、ピバロ
イル、ペンタノイル等を表す。
【００１３】低級アルキルの置換基としては、同一また
は異なって置換数１〜３の、例えばヒドロキシ、低級ア
ルコキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、低
級アルキルチオ、ハロゲン、アミノ、モノまたはジアル
キル置換アミノ、フタルイミドおよびピロリジニル、ピ
ラゾリル、インドリル等の含窒素複素環基等が挙げら
れ、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、低級
アルキルチオ、アルキル置換アミノのアルキル部分は、
前記低級アルキルの定義と同じであり、ハロゲンはフッ
素、塩素、臭素、ヨウ素を表す。
は異なって置換数１〜３の、例えばヒドロキシ、低級ア
ルコキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、低
級アルキルチオ、ハロゲン、アミノ、モノまたはジアル
キル置換アミノ、フタルイミドおよびピロリジニル、ピ
ラゾリル、インドリル等の含窒素複素環基等が挙げら
れ、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、低級
アルキルチオ、アルキル置換アミノのアルキル部分は、
前記低級アルキルの定義と同じであり、ハロゲンはフッ
素、塩素、臭素、ヨウ素を表す。
【００１４】アラルキル、アリール、アロイル、および
複素環基の置換基としては、同一または異なって１〜５
個の、例えば低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルコキ
シ、ハロゲン、ニトロ、アミノ等が挙げられ、低級アル
キル、低級アルコキシのアルキル部分は、前記低級アル
キルの定義と同じであり、ハロゲンは前記ハロゲンの定
義と同じである。
複素環基の置換基としては、同一または異なって１〜５
個の、例えば低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルコキ
シ、ハロゲン、ニトロ、アミノ等が挙げられ、低級アル
キル、低級アルコキシのアルキル部分は、前記低級アル
キルの定義と同じであり、ハロゲンは前記ハロゲンの定
義と同じである。
【００１５】置換アミノの置換基としては、同一または
異なって１〜２個の、例えば前記と同義の低級アルキ
ル、アラルキル、置換もしくは非置換アリール、低級ア
ルカノイル、置換もしくは非置換アロイルおよびアルキ
リデン等が挙げられ、アルキリデンは直鎖または分岐状
の炭素数１〜６の、例えばメチレン、エチリデン、プロ
ピリデン、イソプロピリデン、ブチリデン、イソブチリ
デン、sec −ブチリデン、tert−ブチリデン、ペンチリ
デン、ネオペンチリデン、ヘキシリデン等を表す。
異なって１〜２個の、例えば前記と同義の低級アルキ
ル、アラルキル、置換もしくは非置換アリール、低級ア
ルカノイル、置換もしくは非置換アロイルおよびアルキ
リデン等が挙げられ、アルキリデンは直鎖または分岐状
の炭素数１〜６の、例えばメチレン、エチリデン、プロ
ピリデン、イソプロピリデン、ブチリデン、イソブチリ
デン、sec −ブチリデン、tert−ブチリデン、ペンチリ
デン、ネオペンチリデン、ヘキシリデン等を表す。
【００１６】ヒドロキシルアミン類、アルデヒド捕捉剤
として利用される塩は、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、
硫酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩ある
いはシュウ酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マ
レイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩または
ナトリウム塩、カリウム塩等の塩基付加塩が挙げられ
る。
として利用される塩は、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、
硫酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩ある
いはシュウ酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マ
レイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩または
ナトリウム塩、カリウム塩等の塩基付加塩が挙げられ
る。
【００１７】化合物（I）および（II）の具体例につい
て、その名称を第１表および第３表に、その構造式を第
２表および第４表にそれぞれ示す。また、化合物（II
I）および（IV）の名称は、それぞれジメチルチオカル
バモイルクロライドおよび２−（２−アミノエチルアミ
ノ）エタノールである。
て、その名称を第１表および第３表に、その構造式を第
２表および第４表にそれぞれ示す。また、化合物（II
I）および（IV）の名称は、それぞれジメチルチオカル
バモイルクロライドおよび２−（２−アミノエチルアミ
ノ）エタノールである。
【００１８】
【表１】
【００１９】
【表２】
【００２０】
【表３】
【００２１】
【表４】
【００２２】なお、第１〜４表に示したヒドロキシルア
ミン類およびアルデヒド捕捉剤、ならびに化合物（II
I）および（IV）は既知の化合物であり、例えばアルド
リッチ、同仁化学研究所等から入手できる。本発明に用
いられるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは、
微生物、例えばロイコノストック・メセンテロイデス
（Leuconostoc mesenteroides ）、バチルス・ステアロ
サーモフィルス（Bacillus stearothermophilus ）、ア
ゾトバクター・ビネランディ（Azotobacter vinelandi
i）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas
fluorescens ）、酵母、あるいは動植物等のいずれに
由来するものでもよい。
ミン類およびアルデヒド捕捉剤、ならびに化合物（II
I）および（IV）は既知の化合物であり、例えばアルド
リッチ、同仁化学研究所等から入手できる。本発明に用
いられるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは、
微生物、例えばロイコノストック・メセンテロイデス
（Leuconostoc mesenteroides ）、バチルス・ステアロ
サーモフィルス（Bacillus stearothermophilus ）、ア
ゾトバクター・ビネランディ（Azotobacter vinelandi
i）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas
fluorescens ）、酵母、あるいは動植物等のいずれに
由来するものでもよい。
【００２３】グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
を含有し、かつグルコース関連物質や補酵素の定量ある
いはグルコース関連酵素の活性測定を行うための試薬
に、ヒドロキシルアミン類、アルデヒド捕捉剤あるいは
これらの塩類を０. ００１〜１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは
０. ０１〜０．１ｍｏｌ／ｌの濃度で添加することによ
り該定量試薬を安定化することができる。
を含有し、かつグルコース関連物質や補酵素の定量ある
いはグルコース関連酵素の活性測定を行うための試薬
に、ヒドロキシルアミン類、アルデヒド捕捉剤あるいは
これらの塩類を０. ００１〜１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは
０. ０１〜０．１ｍｏｌ／ｌの濃度で添加することによ
り該定量試薬を安定化することができる。
【００２４】該定量試薬組成物を用いて定量しうるグル
コース関連物質や補酵素、およびその活性を測定しうる
グルコース関連酵素としては、グルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼの基質であるグルコース−６−リン酸
に導けるものであればいずれでもよいが、定量の対象と
なるグルコース関連物質や補酵素としては、例えばラク
トース、マルトース、グリコーゲン、スターチ、シュー
クロース、グルコース、フルクトース、マンノース、ク
レアチンリン酸、グルコース−６−リン酸、フルクトー
ス−６−リン酸、マルトース−６−リン酸、フルクトー
ス−２−リン酸、Ｌ−ソルボース−６−リン酸、グルコ
ース−１−リン酸、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ウリジン三リン
酸、アデノシン三リン酸、ウリジン二リン酸グルコース
等が挙げられ、活性測定の対象となるグルコース関連酵
素としては、例えばクレアチンキナーゼ、ヘキソキナー
ゼ、グルコキナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラ
クトシダーゼ、アミログルコシダーゼ、インベルター
ゼ、トランスアルドラーゼ、ガラクトース−１−リン酸
ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホグルコースイソメ
ラーゼ、フルクトースジフォスファターゼが挙げられ
る。
コース関連物質や補酵素、およびその活性を測定しうる
グルコース関連酵素としては、グルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼの基質であるグルコース−６−リン酸
に導けるものであればいずれでもよいが、定量の対象と
なるグルコース関連物質や補酵素としては、例えばラク
トース、マルトース、グリコーゲン、スターチ、シュー
クロース、グルコース、フルクトース、マンノース、ク
レアチンリン酸、グルコース−６−リン酸、フルクトー
ス−６−リン酸、マルトース−６−リン酸、フルクトー
ス−２−リン酸、Ｌ−ソルボース−６−リン酸、グルコ
ース−１−リン酸、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ウリジン三リン
酸、アデノシン三リン酸、ウリジン二リン酸グルコース
等が挙げられ、活性測定の対象となるグルコース関連酵
素としては、例えばクレアチンキナーゼ、ヘキソキナー
ゼ、グルコキナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラ
クトシダーゼ、アミログルコシダーゼ、インベルター
ゼ、トランスアルドラーゼ、ガラクトース−１−リン酸
ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホグルコースイソメ
ラーゼ、フルクトースジフォスファターゼが挙げられ
る。
【００２５】該定量試薬組成物には、緩衝剤としてトリ
ス−塩酸緩衝剤、イミダゾール−酢酸緩衝剤、リン酸緩
衝剤、クエン酸緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝
剤、フタル酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、酢酸緩衝剤、コ
ハク酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グッドバッ
ファー等の０．００５〜２ｍｏｌ／ｌ溶液が用いられ、
他の酵素、発色剤および界面活性剤等が含有されていて
もよい。
ス−塩酸緩衝剤、イミダゾール−酢酸緩衝剤、リン酸緩
衝剤、クエン酸緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝
剤、フタル酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、酢酸緩衝剤、コ
ハク酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グッドバッ
ファー等の０．００５〜２ｍｏｌ／ｌ溶液が用いられ、
他の酵素、発色剤および界面活性剤等が含有されていて
もよい。
【００２６】該定量試薬組成物に含有されてもよい他の
酵素としては、前記グルコース関連酵素の他に、例えば
ヌクレオシドジホスホキナーゼ、ペルオキシダーゼ、Ｎ
ＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダー
ゼ、カタラーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ウリカーゼ
等が挙げられる。発色剤としては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを直
接発色させる場合にはテトラゾリウム塩、例えばテトラ
ゾリウムブルー、ニトロテトラゾリウムブルー等が挙げ
られ、過酸化水素に導いて発色させる場合にはペルオキ
シダーゼの存在下でｏ−ジアニシジン、４−メトキシ−
１−ナフトール、2,2'−アジノ−ビス（３−エチルベン
ゾチアゾリン）−６−スルホン酸等の単独試薬、４−ア
ミノアンチピリンとフェノール、ｐ−クロロフェノー
ル、2,4,6−トリブロモフェノール等のフェノール系化
合物、N,N −ジメチルアニリン、N,N −ジエチルアニリ
ン等のアニリン系化合物またはN,N −ジエチル−ｍ−ト
ルイジン等のトルイジン系化合物との組み合わせ試薬、
３−メチル−２−ベンゾチアゾリノヒドラゾンとN,N −
ジメチルアニリンとの組み合わせ試薬、特開昭５７−２
９２９７号公報あるいは特開昭５９−７４７１３号公報
に記載の化合物等が挙げられ、界面活性剤としては、ポ
リエチレングリコール−モノ−ｐ−イソ−オクチルフェ
ニルエーテル等が挙げられる。
酵素としては、前記グルコース関連酵素の他に、例えば
ヌクレオシドジホスホキナーゼ、ペルオキシダーゼ、Ｎ
ＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダー
ゼ、カタラーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ウリカーゼ
等が挙げられる。発色剤としては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを直
接発色させる場合にはテトラゾリウム塩、例えばテトラ
ゾリウムブルー、ニトロテトラゾリウムブルー等が挙げ
られ、過酸化水素に導いて発色させる場合にはペルオキ
シダーゼの存在下でｏ−ジアニシジン、４−メトキシ−
１−ナフトール、2,2'−アジノ−ビス（３−エチルベン
ゾチアゾリン）−６−スルホン酸等の単独試薬、４−ア
ミノアンチピリンとフェノール、ｐ−クロロフェノー
ル、2,4,6−トリブロモフェノール等のフェノール系化
合物、N,N −ジメチルアニリン、N,N −ジエチルアニリ
ン等のアニリン系化合物またはN,N −ジエチル−ｍ−ト
ルイジン等のトルイジン系化合物との組み合わせ試薬、
３−メチル−２−ベンゾチアゾリノヒドラゾンとN,N −
ジメチルアニリンとの組み合わせ試薬、特開昭５７−２
９２９７号公報あるいは特開昭５９−７４７１３号公報
に記載の化合物等が挙げられ、界面活性剤としては、ポ
リエチレングリコール−モノ−ｐ−イソ−オクチルフェ
ニルエーテル等が挙げられる。
【００２７】該定量試薬組成物は液体の状態ばかりでな
く、全成分あるいは一部成分が凍結乾燥品の形で供給さ
れ、溶解液で該凍結乾燥品を溶解して最終的に作製され
ても構わない。この際に該定量試薬組成物は、凍結乾燥
品に含有されていても溶解液の側に含有されていても更
にその両者に含有されていても構わない。以下、実施例
により本発明の態様を具体的に説明する。
く、全成分あるいは一部成分が凍結乾燥品の形で供給さ
れ、溶解液で該凍結乾燥品を溶解して最終的に作製され
ても構わない。この際に該定量試薬組成物は、凍結乾燥
品に含有されていても溶解液の側に含有されていても更
にその両者に含有されていても構わない。以下、実施例
により本発明の態様を具体的に説明する。
【００２８】
実施例１ （クレアチンキナーゼ活性測定用試薬中のグ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのヒドロキシル
アミン類、アルデヒド捕捉剤による安定化） クレアチンキナーゼ活性測定用試薬として、下記成分を
含有する試薬液１、２液を調製した。 試薬１液 イミダゾール−酢酸緩衝剤（ｐＨ６. ６） 115mM エチレンジアミン四酢酸 2.3mM 酢酸マグネシウム 11.5mM Ｎ−アセチルシステイン 23mM アデノシン二リン酸 2.3mM アデノシン一リン酸 5.8mM アデノシンペンタホスフェート 11.5μM グルコース 23mM ＮＡＤＰ 2.3mM ヘキソキナーゼ 3.45U/ml グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ 1.725U/ml 試薬２液 クレアチンリン酸 345mM 試薬１液中に含まれるグルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼのヒドロキシルアミン類またはアルデヒド補足
剤の添加による安定化の効果を検討するために、化合物
（Ｉ−１〜１３）、化合物（II−１〜１７）、化合物
（III）および化合物（IV）を、試薬１液にそれぞれ単
独で１０ｍＭ添加したものを調製し、１０℃で保存し
た。なお、対照として試薬１液に何も添加しないものを
同様に１０℃で保存した。それぞれの化合物を添加した
試薬１液のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの
活性を試薬調製直後、３か月保存後および１２か月保存
後に測定した。
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのヒドロキシル
アミン類、アルデヒド捕捉剤による安定化） クレアチンキナーゼ活性測定用試薬として、下記成分を
含有する試薬液１、２液を調製した。 試薬１液 イミダゾール−酢酸緩衝剤（ｐＨ６. ６） 115mM エチレンジアミン四酢酸 2.3mM 酢酸マグネシウム 11.5mM Ｎ−アセチルシステイン 23mM アデノシン二リン酸 2.3mM アデノシン一リン酸 5.8mM アデノシンペンタホスフェート 11.5μM グルコース 23mM ＮＡＤＰ 2.3mM ヘキソキナーゼ 3.45U/ml グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ 1.725U/ml 試薬２液 クレアチンリン酸 345mM 試薬１液中に含まれるグルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼのヒドロキシルアミン類またはアルデヒド補足
剤の添加による安定化の効果を検討するために、化合物
（Ｉ−１〜１３）、化合物（II−１〜１７）、化合物
（III）および化合物（IV）を、試薬１液にそれぞれ単
独で１０ｍＭ添加したものを調製し、１０℃で保存し
た。なお、対照として試薬１液に何も添加しないものを
同様に１０℃で保存した。それぞれの化合物を添加した
試薬１液のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの
活性を試薬調製直後、３か月保存後および１２か月保存
後に測定した。
【００２９】グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
の活性は、Ｄ−グルコース−６−リン酸を基質としＮＡ
ＤＰを補酵素とする反応液に、グルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼを添加したときのＮＡＤＰＨの生成量
を３４０ｎｍの吸光度変化から測定した。得られたグル
コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの活性の測定値か
ら、試薬調製直後の活性を１００％として３か月保存後
および１２か月保存後の残存活性を算出した。
の活性は、Ｄ−グルコース−６−リン酸を基質としＮＡ
ＤＰを補酵素とする反応液に、グルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼを添加したときのＮＡＤＰＨの生成量
を３４０ｎｍの吸光度変化から測定した。得られたグル
コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの活性の測定値か
ら、試薬調製直後の活性を１００％として３か月保存後
および１２か月保存後の残存活性を算出した。
【００３０】その結果を第５表に示す。
【００３１】
【表５】
【００３２】 からなる、クレアチンキナーゼ活性測定用の組成物。
【００３３】
【発明の効果】本発明によれば、グルコース−６−リン
酸デヒドロゲナーゼを用いたグルコース関連物質および
補酵素の定量化法ならびにグルコース関連酵素の活性測
定法に用いる液状臨床検査試薬において該酵素の安定性
を顕著に向上させることができる。
酸デヒドロゲナーゼを用いたグルコース関連物質および
補酵素の定量化法ならびにグルコース関連酵素の活性測
定法に用いる液状臨床検査試薬において該酵素の安定性
を顕著に向上させることができる。
Claims (9)
- 【請求項１】 一般式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒ 1 、Ｒ 2 およびＲ 3 は同一もしくは異なって、
水素、置換もしくは非置換低級アルキル、シクロアルキ
ル、低級アルケニル、置換もしくは非置換アラルキル、
置換もしくは非置換アリール、低級アルカノイル、置換
もしくは非置換アロイル、シンナミルまたはシンナモイ
ルを示すか、あるいはＲ 2 とＲ 3 が一緒になって窒素原子
をはさんで含窒素複素環基を形成してもよい。）で表さ
れるヒドロキシルアミン類およびその塩ならびに一般式
（ＩＩ） 【化２】 （式中、Ｒ 4 およびＲ 5 は同一もしくは異なって、水素、
置換もしくは非置換低級アルキル、シクロアルキル、低
級アルケニル、置換もしくは非置換アラルキル、置換も
しくは非置換アリール、置換もしくは非置換複素環基、
低級アルカノイル、置換もしくは非置換アロイル、ピリ
ジルカルボニル、低級アルコキシカルボニル、置換もし
くは非置換アミノを示し、Ｘは酸素または硫黄原子を示
し、ｎは０〜２の整数を示す。）で表される化合物、 （ＣＨ 3 ） 2 ＮＣＳＣｌ およびＨ 2 ＮＣＨ 2 ＣＨ 2 ＮＨＣＨ 2 ＣＨ 2 ＯＨからなる群
より選ばれるアルデヒド捕捉剤およびその塩から選ばれ
るグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの安定化
剤。 - 【請求項２】 グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼに、一般式（Ｉ） 【化３】 （式中、Ｒ 1 、Ｒ 2 およびＲ 3 は同一もしくは異なって、
水素、置換もしくは非置換低級アルキル、シクロアルキ
ル、低級アルケニル、置換もしくは非置換アラルキル、
置換もしくは非置換アリール、低級アルカノイル、置換
もしくは非置換アロイル、シンナミルまたはシンナモイ
ルを示すか、あるいはＲ 2 とＲ 3 が一緒になって窒素原子
をはさんで含窒素複素環基を形成してもよい。）で表さ
れるヒドロキシルアミン類およびその塩ならびに一般式
（ＩＩ） 【化４】 （式中、Ｒ 4 およびＲ 5 は同一もしくは異なって、水素、
置換もしくは非置換低級アルキル、シクロアルキル、低
級アルケニル、置換もしくは非置換アラルキル、置換も
しくは非置換アリール、置換もしくは非置換複素環基、
低級アルカノイル、置換もしくは非置換アロイル、ピリ
ジルカルボニル、低級アルコキシカルボニル、置換もし
くは非置換アミノを示し、Ｘは酸素または硫黄原子を示
し、ｎは０〜２の整数を示す。）で表される化合物、 （ＣＨ 3 ） 2 ＮＣＳＣｌ およびＨ 2 ＮＣＨ 2 ＣＨ 2 ＮＨＣＨ 2 ＣＨ 2 ＯＨからなる群
より選ばれる アルデヒド捕捉剤およびその塩から選ばれ
る少なくとも一つの安定化剤を共存させることを特徴と
する、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの安定
化方法。 - 【請求項３】 安定化剤の濃度が０．００１〜１ｍｏｌ
／ｌであることを特徴とする、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼに、一般式（Ｉ） 【化５】 （式中、Ｒ 1 、Ｒ 2 およびＲ 3 は同一もしくは異なって、
水素、置換もしくは非置換低級アルキル、シクロアルキ
ル、低級アルケニル、置換もしくは非置換アラルキル、
置換もしくは非置換アリール、低級アルカノイル、置換
もしくは非置換アロイル、シンナミルまたはシンナモイ
ルを示すか、あるいはＲ 2 とＲ 3 が一緒になって窒素原子
をはさんで含窒素複素環基を形成してもよい。）で表さ
れるヒドロキシルアミン類およびその塩ならびに一般式
（ＩＩ） 【化６】 （式中、Ｒ 4 およびＲ 5 は同一もしくは異なって、水素、
置換もしくは非置換低級アルキル、シクロアルキル、低
級アルケニル、置換もしくは非置換アラルキル、置換も
しくは非置換アリール、置換もしくは非置換複素環基、
低級アルカノイル、置換もしくは非置換アロイル、ピリ
ジルカルボニル、低級アルコキシカルボニル、置換もし
くは非置換アミノを示し、Ｘは酸素または硫黄原子を示
し、ｎは０〜２の整数を示す。）で表される化合物、 （ＣＨ 3 ） 2 ＮＣＳＣｌ およびＨ 2 ＮＣＨ 2 ＣＨ 2 ＮＨＣＨ 2 ＣＨ 2 ＯＨからなる群
より選ばれるアルデヒド捕捉剤およびその塩から選ばれ
る少なくとも一つの安定化剤を共存させるグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼの安定化方法を利用するこ
とを特徴とする、グルコース−６−リン酸の定量方法。 - 【請求項５】 安定化剤の濃度が０．００１〜１ｍｏｌ
／ｌである請求項４記載の定量方法。 - 【請求項６】 グルコース−６−リン酸が、ラクトー
ス、マルトース、グリコーゲン、スターチ、シュークロ
ース、グルコース、フルクトース、マンノース、クレア
チンリン酸、グルコース−６−リン酸、フルクトース−
６−リン酸、マルトース−６−リン酸、フルクトース−
２−リン酸、Ｌ−ソルボース−６−リン酸、グルコース
−１−リン酸、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ウリジン三リン酸、
アデノシン三リン酸、ウリジン二リン酸グルコース、ク
レアチンキナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、
β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アミロ
グルコシダーゼ、インベルターゼ、トランスアルドラー
ゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラ
ーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびフルクトー
スジフォスファターゼからなる群より選ばれる物質に由
来するグルコース−６−リン酸である請求項４または５
記載の定量法。 - 【請求項７】 グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼと一般式（Ｉ） 【化７】 （式中、Ｒ 1 、Ｒ 2 およびＲ 3 は同一もしくは異なって、
水素、置換もしくは非置換低級アルキル、シクロアルキ
ル、低級アルケニル、置換もしくは非置換アラルキル、
置換もしくは非置換アリール、低級アルカノイル、置換
もしくは非置換アロイル、シンナミルまたはシンナモイ
ルを示すか、あるいはＲ 2 とＲ 3 が一緒になって窒素原子
をはさんで含窒素複素環基を形成してもよい。）で表さ
れるヒドロキシルアミン類およびその塩ならびに一般式
（ＩＩ） 【化８】 （式中、Ｒ 4 およびＲ 5 は同一もしくは異なって、水素、
置換もしくは非置換低級 アルキル、シクロアルキル、低
級アルケニル、置換もしくは非置換アラルキル、置換も
しくは非置換アリール、置換もしくは非置換複素環基、
低級アルカノイル、置換もしくは非置換アロイル、ピリ
ジルカルボニル、低級アルコキシカルボニル、置換もし
くは非置換アミノを示し、Ｘは酸素または硫黄原子を示
し、ｎは０〜２の整数を示す。）で表される化合物、 （ＣＨ 3 ） 2 ＮＣＳＣｌ およびＨ 2 ＮＣＨ 2 ＣＨ 2 ＮＨＣＨ 2 ＣＨ 2 ＯＨからなる群
より選ばれる アルデヒド捕捉剤およびその塩から選ばれ
る少なくとも一つの安定化剤が共存することからなるグ
ルコース−６−リン酸の定量試薬組成物。 - 【請求項８】 安定化剤の濃度が０．００１〜１ｍｏｌ
／ｌであることを特徴とする、請求項７記載の定量試薬
組成物。 - 【請求項９】 グルコース−６−リン酸が、ラクトー
ス、マルトース、グリコーゲン、スターチ、シュークロ
ース、グルコース、フルクトース、マンノース、クレア
チンリン酸、グルコース−６−リン酸、フルクトース−
６−リン酸、マルトース−６−リン酸、フルクトース−
２−リン酸、Ｌ−ソルボース−６−リン酸、グルコース
−１−リン酸、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ウリジン三リン酸、
アデノシン三リン酸、ウリジン二リン酸グルコース、ク
レアチンキナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、
β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アミロ
グルコシダーゼ、インベルターゼ、トランスアルドラー
ゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラ
ーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびフルクトー
スジフォスファターゼからなる群より選ばれる物質に由
来するグルコース−６−リン酸である請求項７または８
記載の定量用組成物。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21120293A JP3203108B2 (ja) | 1993-08-26 | 1993-08-26 | グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの安定化方法 |
| US08/294,586 US5424204A (en) | 1993-08-26 | 1994-08-23 | Method for stabilizing glucose 6-phosphate dehydrogenase with hydroxylamines, aldehyde scavengers, dimethylthiocarbamoyl chloride or 2-(2-aminoethylamino) ethanol |
| CA002130705A CA2130705A1 (en) | 1993-08-26 | 1994-08-23 | Method for stabilizing glucose 6-phosphate dehydrogenase |
| EP94113326A EP0640686A3 (en) | 1993-08-26 | 1994-08-25 | Method for stabilizing glucose 6-phosphate dehydrogenase |
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|---|---|---|---|
| JP21120293A JP3203108B2 (ja) | 1993-08-26 | 1993-08-26 | グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの安定化方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0759566A JPH0759566A (ja) | 1995-03-07 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21120293A Expired - Fee Related JP3203108B2 (ja) | 1993-08-26 | 1993-08-26 | グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの安定化方法 |
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| US (1) | US5424204A (ja) |
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| JP (1) | JP3203108B2 (ja) |
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