JP3222465B2 - 個体の糖尿病前症、糖尿病および／または関連合併症の予防または治療に用いる、ガラクトース−３−０−サルフェート部分を含有する硫酸化糖脂質類およびその特異的キャッチャー - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 インスリン依存性（Ｉ型）糖尿病は体液性および細胞
性の免疫機構の両者が病因に役割を演じていると思われ
る疾患である。Ｉ型糖尿病を研究するのにいくつかの動
物モデルがある。これら動物のなかではBBラットが最も
重要である。このBBラットは60〜120日齢で自発的に糖
尿病を起こし、その糖尿病は機能性胸腺依存性免疫系に
依存している。リンパ球浸潤（インスリン炎）がランゲ
ルハンス島に起こり、島細胞に対する自己抗体が検出さ
れる場合がある。いくつかの研究グループはBBラットま
たは同等のNODマウスから島細胞特異的モノクローナル
自己抗体を生じさせることができるようになっている。

真性糖尿病を予防できるようにしかつ関連するマーカ
ー抗体を検出するために、該疾患の背景になっている疾
患の機構を理解するのに、関連するβ細胞抗原を知るこ
とが極めて重要と考えられる。

機能の程度に依存して低量的に変化する抗原の発現
は、インスリンの産生が糖尿病を起こすのに重要である
ことを示すいくつかの研究による知見に関連する機構で
あるかもしれない。最も重要な研究の中でも以下のもの
には言及しなければならない。

糖尿病の発生率の増大はインスリン産生が増大した後
に見られる。低投与量ストレプトゾトシンのマウスモデ
ルの場合、視床下部領域の腹側正中部に損傷を与えると
糖尿病は発生率が高くなりかつ重篤である。ヒトの場合
は、妊娠の最後のトリメスターすなわちβ細胞からのイ
ンスリンの放出量が高いことを特徴とする期間に真正の
インスリン依存生糖尿病の発生率が高い。

インスリン産生量が減少した後に糖尿病の発生率の低
下が見られる。BBラットの場合、糖尿病発生危険期間中
に予防的にインスリンで治療すると系内のインスリンの
産生量は減少するが、糖尿病の発生率は低下する。低投
与量ストレプトゾトシンモデルの場合、炭水化物の含有
量が少ない食餌をとると糖尿病の発生率が低下する。

最後に、高インスリン血症は糖尿病誘発に関連して観
察される。EMC−Ｍウイルスマウスモデルでは、臨床糖
尿病がはじまる前に末梢血液中のインスリン濃度が高く
なる。平行して、ヒト第一度糖尿病の患者は、血糖刺激
に応答してインスリンが増大する。

最近では、いくつもの研究グループが種々のタンパク
質の抗原候補体として示唆している。これらのタンパク
質には、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（64KDの自己
抗原）、熱ショックタンパク質65、およびインスリン分
泌顆粒の膜の中の38KDのタンパク質が含まれる。しかし
抗原は非タンパク質構造である場合があり、実際に島細
胞抗体（ICA）（糖尿病と診断されている患者の大部分
に依存し、β細胞とα細胞の両者をラベルしている）は
糖脂質に対して特異的であると考えられる。さらに、β
細胞に対するいくつかのモノクローナル抗体はガングリ
オシドのエピトープ（3G5,A2B5,R2D6）をもっている。

スルファチド（３′−スルホガラクトシルセラミド）
は細胞膜中に位置する酸性のグリコスフィンゴリピドで
ある。それは、希突起膠細胞とシュバン細胞の分化の初
期マーカーであり（Zalc,B.およびBaumann,N.,Adv.Exp.
Med.Biol.,152巻、439〜443頁、1982年）、ミエリン中
に著しく増大する。

脱髄障害の患者の組織と体液中のスルファチドの定量
検定に用いるのに充分に特異的なスルファチドに対する
抗体を作ることを目的として、Fredmanら（Biochem.J.,
251巻、17〜22頁、1988年）はモノクローナル抗体Sulph
Iを製造した。Balb/Cマウスを、サルモネラ・ミネソタ
（Salmonella minnesota）の被膜でコートしたスルファ
チド免疫化した。そのマウス由来の脾臓細胞をマウス骨
髄腫細胞と融合させ、得られたハイブリドーマをELISA
法によってスルファチドに対してスクリーニングし、次
いで陽性のハイブリッドを限界希釈法によってクローン
化した。その抗原のサブクラスはIgG1であることが見出
された。

Predmanらは、前記モノクローナル抗体Sulph Iが、３
種の糖脂質すなわちガラクトシルセラミド−３−サルフ
ェート（スルファチド）、ラクトシルセラミド−３−サ
ルフェート、およびセミノリピドに対しアフィニティー
をもっていることを発見した。これらの３種の糖脂質は
すべて同じ末端基：ガラクトース−３−Ｏ−サルフェー
トをもっている。非硫酸化糖脂質類のガラクトシルセラ
ミドとラクトシルセラミド、およびいくつかのビス硫酸
化ムコ多糖類はその抗体を捕捉しなかった。スルファチ
ドとセミノリピドから脂肪酸を除くとそれらの対応する
溶解化合物（lyso compound）になり、上記抗体に対す
る統合性が著しく減少した。

硫酸化糖脂質類は、いくぶん特異な分子である。ガラ
クトシルスルファチドは、脳組織特にミエリン中に比較
的豊富に存在している。そしてこれは希突起膠細胞によ
って合成され、これらの細胞の分化マーカーである。生
体外において、希突起膠細胞上でのガラクトシルスルフ
ァチドの生合成と細胞表面発現が調節され、これらの細
胞の、スルファチド特異的モノクローナル抗体存在下で
の培養は細胞の増殖と分化に著しく影響する。

島細胞は内胚葉起源の細胞と考えられるが、最近の発
見で、ランゲルハンス島と神経組織間の抗原決定基を共
有していることが分かっている。グルタミン酸デカルボ
キシラーゼは、異なる種類のガングリオシド類のように
両方の組織に存在している。さらに、Ｉ型（インスリン
依存生）糖尿病と神経学的障害“スティッフマン症候
群”、および“ギャン−バレー”症候群（炎症性脱髄多
発神経根神経障害）も含まれる可能性がある統計的な同
時発生によって、可能性があるジョイント抗原に達する
関心が強くなっている。“ギャン−バレー”症候群にお
いて、患者は抗スルファチド抗体を示し、Fredmanら
（上記文献）は、モノクローナル抗スルファチド抗体Su
lph Iを用いて、脱髄の形態で対応する抗原を伴う構造
変化を示した。

発明が基づいている発見 下記の実施例１では、島細胞および特にβ細胞中のス
ルファチド（または非常によく似ている硫酸化糖脂質）
の存在を試験した。Sulph Iによるラベリングの可能性
を、膵臓の組織学的セクション、単離した島細胞、およ
びそのβ細胞画分と非β細胞画分（蛍光活性化細胞ソー
ターによって分離した）について試験した。

糖脂質スルファチドまたはよく似た類緑構造体に対す
るエピトープが島細胞（β細胞と非β細胞の両方）に存
在するが、腎臓の細管細胞と糸球体細胞および神経細胞
以外の他の被検細胞には検出できないようである。さら
に使用した抗スルファチドモノクローナル抗体はランゲ
ルハンス島を非常にあざやかに染色するので島細胞を便
利に高い信頼性で検出するのに有利である。

Ｉ型糖尿病患者由来の島細胞抗体（ICA）は、Sulph I
と同様に、β細胞とα細胞の両方をラベルし、発生率が
増大することはICAが糖脂質に対して特異的であること
を示している。凍結片上では、島細胞の抗原はシアル酸
を含有する糖脂質の特性をもっていることが見出され
た。血清のICA反応性はヒト膵臓由来のモノガングリオ
シド−糖脂質抽出物とともに前インキュベーションを行
うことによってブロックすることができた。さらにヒト
のランゲルハンス島はG_M1−G_M2ガングリオシドを含有し
ているので、ラットのランゲルハンス島を使用する研究
ではガングリオシドの発現はモノクローナル抗体IC2とA
2B5に対応する抗原に見つけられたものと同様に代謝に
よって調節可能であった。Ｉ型糖尿病の血清は、RIN腫
瘍由来の他のガングリオシド（G_T3）に対して反応性を
示した。最後に、ICA陽性Ｉ型糖尿病の患者の血清中の
ヒト膵臓フコガングリオシドに対する自己抗体は、薄層
クロマトグラフィーを用いて報告した。

下記の実施例２では、ランゲルハンス島をスルファチ
ドの構造について試験する（モノクローナル抗スルファ
チド抗体Sulph Iによる染色によって示す）。糖尿病の
後期合併症に体する（自己）免疫病原が示唆されたの
で、腎臓組織と神経学的構造も研究した。さらに、新た
にＩ型糖尿病であると診断された患者は、抗スルファチ
ド抗体の存在について試験した。

ランゲルハンス島および糖尿病の腎臓の細管構造と糸
球体はSulph Iによって明確に染色されることが見出さ
れ、かつ末梢血液中に、Ｉ型糖尿病に関連する抗スルフ
ァチド抗体が存在することが実証された。

この研究によって、ランゲルハンス島、腎臓構造およ
び神経組織は、同じモノクローナル抗体のSulph I（ス
ルファチドに対して特異的である）でラベルされること
が分かった。言及した組織はすべてＩ型糖尿病の自然の
過程を通る。

免疫電子顕微鏡法によってα細胞とβ細胞のSulph I
による標識付けが分泌顆粒の膜と内容物に関連している
ことが分かった。またICAはインスリン分泌顆粒の膜を
標識するようである。同様にＩ型糖尿病のＴ細胞反応性
38KDタンパク質はインスリン分泌顆粒膜をラベルする。
カルボキシペプチダーゼＨすなわちλGT11cDNAライブラ
リイ中の、ICAの標的として同定される可能性があるβ
細胞自己抗原はβ細胞分泌顆粒内の酵素であり、膜とし
ては存在し、（？）可溶形態で存在している。一方、GA
Dはβ細胞中、シナプス様微小水庖のまわりに位置して
いることを報告する。

糸球体のSulph Iによる染色はBBラットとヒトの両方
にみられたが、Ｉ型糖尿病が起こったときだけである。
糸球体間質細胞および毛細血管わなのラベリングがみら
れたが基底膜は染色されないまゝであった。糖尿病のラ
ベリングの理由は不明である。その染色は実質的な析出
物で起こるのではないようである。というのは糖尿病
は、基底膜が厚くなることを除いてBBラットの糸球体の
形態変化を誘発しないからである。したがって、糖尿病
BBラットの糸球体の変化は、周囲毛細管壁に関する細
胞、糸球体間質細胞または糸球体間質マトリックスの部
分容積（fractional volume）には全く見られない。膜
の糸球体症とギャン−バレー症候群間に関連があると示
唆されたが、これらの疾患の間の関連の証拠は存在しな
い。さらにギャン−バレーの腎症は、必らずしも抗原の
シェア（antigen share）に左右されず、独自に、脱髄
のプロセスにその一次起源を有する免疫複合体が原因で
あるかもしれない。

遠位の細管がSulph Iで染色されるということは、ス
ルファチドがこれらの構造体中に早期に現われることと
よく一致している。細管中のスルファチドは、塩化ナト
リウムが管腔から間隙空間への受動拡散（passive diff
usion）に関与している。

ギャン−バレー症候群には、抗スルファチド抗体が見
られる。Sulph Iを用いる本発明の試験によって、島細
胞中に（神経細胞中と同様に）スルファチドがみとめら
れたので、本発明の発明者らは、新たに発病したＩ型糖
尿病患者中に、スルファチドに対する抗体を探したとこ
ろ、それらの患者の88％が〔後述の試験結果の項で述べ
る区別レベル（cut off level）で〕診断時に1:3200ま
での力価をもってくることを見出した。さらにその６箇
月間の寛解期間中、その疾患は安定化し59％が陽性であ
った。本発明の発明者らの知見は、抗スルファチド抗体
はＩ型糖尿病に対するマーカーとして有用であろうとい
うことを示している。今日最も普通に用いられるマーカ
ーはICAであるがこれは新たにＩ型糖尿病であると診断
されたうちの約70％に1:128までの力価で陽性である。G
AD抗体は早期の患者の81％に存在することが見出された
が、一方インスリンの自己抗体は新たにＩ型糖尿病と診
断されたものの約40％に検出可能である。疾患のプロセ
スを監視する際には、１種以上のマーカーを使うことが
有利のようである。

糖尿病と神経学的障害が臨床で同時に発生することは
糖尿病動物モデルにもみられる。本発明の発明者らの研
究所に用いた心筋炎ウイルス（EMC−Ｍ）株はBALB/C/BO
Mマウスの約1/3に糖尿病を発生させ、かつ90％に不全麻
痺を起こす。スルファチドに対しては共通の抗原として
注意しなければならないが、その病原として重要である
という問題はまだ取上げられていない。

発明の要約 上記の証拠は、硫酸化糖脂質、特にガラクトース−３
−Ｏ−サルフェートを含有する硫酸化糖脂質、さらに詳
しくはガラクトシルセラミド−３−サルフェート、ラク
トシルセラミド−３−サルフェートおよびセミノリヒド
が、糖尿病および関連合併症の発生に関与している島細
胞抗体（ICA）を生成させる抗原であり、かつSulph Iが
かようなICAとして代表的なものであることを示唆して
いる。

したがって、本発明には、個体の糖尿病前症、糖尿病
および／または関連合併症の予防と治療に用いる前記硫
酸化糖脂質とその特異的キャッチャー（抗体類またはレ
クチン類）が含まれている。

このような治療法は、通常の補充療法（インスリンま
たはインスリンの産生を刺激する物質）と解すべきでは
なく、β細胞の破壊を停止させるかもしくはβ細胞の再
生を改善するか、または糖尿病とともに併発することが
多い合併症の発生を予防するために行うステップと解す
べきである。

硫酸化糖脂質類は、例えば個体に対して周産期に投与
することによって、個体内に前記のような抗原に対する
耐性を誘発することによって、前記個体の糖尿病前症、
糖尿病および／または関連合併症を予防するのに用いる
ことができる。その原理は、誕生に近い時期に個体に抗
原を与えることによって、個体の免疫系はその抗体が生
体自体に属していると認識して生体にその抗原に対する
耐性を発生させるという原理である。

また硫酸化糖脂質類は、個体中に、抗原の硫酸化糖脂
質を認識するリンパ球に対する抗体またはサプレッサー
細胞もしくは調節細胞を生成させることによって、前記
個体の糖尿病前症、糖尿病および／または関連合併症を
予防または治療するのに用いることができる。このこと
は、例えばリンパ球を個体から取出し、そのリンパ球を
生体外で硫酸化糖脂質と接触させて、リンパ球にこの抗
原を認識させ、そのリンパ球に放射線を照射してその細
胞毒性を阻止し、次いで（ａ）リンパ球を個体に戻し、
この抗原と反応性のリンパ球に対するサプレッサー細胞
もしくは調節細胞または抗体を生成させるか、または
（ｂ）そのリンパ球を他の哺乳類に非経口投与し、該動
物内にこの抗原と反応性のリンパ球に対する抗体を生成
させ、次いで抗体を含有する血清を前記哺乳類から単離
して、その血清を個体に投与することによって実施する
ことができる。

さらに硫酸化糖質類は、個体の血液流から抗原の硫酸
化糖脂質を認識する抗体および／またはリンパ球を除く
ことによって、個体の糖尿病前症、糖尿病および／また
は関連合併症を予防もしくは治療するのに用いることが
できる。このことは、例えば個体の血液流を、固定化さ
れた硫酸化糖脂質と接触させて、抗原の硫酸化糖脂質を
認識する抗体および／またはリンパ球を個体から除くこ
とによって実施することができる。

前記糖脂質のキャッチャーおよび特に糖脂質に対する
抗体も、個体中に抗抗体を生成することによって個体の
糖尿病前症、糖尿病および／または関連合併症を予防ま
たは治療するのに使用することができる。このことは例
えば、硫酸化糖脂質に対する抗体を非経口で、（ａ）前
記個体に抗抗体を生成するのに充分な量で前記個体に投
与するか、または（ｂ）他の哺乳類に抗抗体を生成させ
るために前記哺乳類に投与し、次いで抗抗体を含有する
血清を前記哺乳類から単離し、次いでその血清を個体に
投与することによって実施できる。

さらに本発明には、個体中の、糖尿病前症、糖尿病お
よび関連合併症に関連する島細胞抗体（ICA）などの抗
体の検出および任意に定量を行う抗原−抗体検定法の抗
原としての硫酸化糖脂質類、特にガラクトース−３−Ｏ
−サルフェート部分を含有する硫酸化糖脂質の用途が含
まれる。この抗原−抗体検定法は個体から採取した体液
の試料について実施されるが、通常利用される抗原−抗
体検定法の例としては、ELISA法、放射線免疫検定法、
向流電気泳動法および免疫蛍光法がある。

個体中の、糖尿病前症、糖尿病および関連合併症に関
連するICAなどの抗体の検出と定量は前記個体が糖尿病
を起こす危険性を評価するのに役立ち、個体中のICAな
どの関連抗体を繰返し定量することは上記の危険の発生
を監視するのに用いることができる。同様に、すでに糖
尿病前症または糖尿病および恐らく関連合併症にかかっ
ている個体のICAなどの関連抗体を繰返し定量すること
は、上記疾患および／または関連合併症の発現を監視す
るのに利用するか、または上記疾患および／または関連
合併症を治療した結果を監視するのに利用することがで
きる。

最後に、本発明には、膵臓標本の組織学的もしくは細
胞学的染色によってランゲルハンス島の細胞を検出する
ために、硫酸化糖脂質特にガラクトース−３−Ｏ−サル
フェート部分を有する硫酸化糖脂質に対するキャッチャ
ーの用途が含まれる。

上記の方法は、膵臓組織の標本中のランゲルハンス島
および膵臓細胞画分中の単離された島細胞を検出する非
常に簡便で信頼性がある方法であることを本発明の発明
者が見出したのである。膵臓細胞片の組織学的染色およ
び単離された細胞画分の細胞学的染色の実施例は下記実
施例１に示す。

図面の簡単な説明 図面は写真を複写したものである。

図１は実施例１の原料と方法の項に記載したAPAAP法
を用いたルイスラット由来の膵臓のランゲルハンス島
の、抗スルファチドモノクローナル抗体Sulph Iによる
ラベリングを示す。

図２は、実施例１の原料と方法の項に記載の免疫蛍光
法を利用した、Sulph IとFITCの接合体による、ルイス
ラット由来の単離された島細胞のβ細胞画分のラベリン
グを示す。細胞の、斑点を有する明るい表面蛍光が見ら
れる。

図３は図２と同じラベリングを示すが島細胞の非β細
胞の画分のラベリングを示す。Sulph Iで染色した後の
蛍光の強度はβ細胞と非β細胞については等しいようで
ある。

図４は、薄層プレートにクロマトグラフされた、新た
にＩ型糖尿病であると診断された患者由来の血漿で免疫
染色されたスルファチドを示す。血漿の希釈率はそれぞ
れ1:100,1:400,1:800,1:1600,1:3200および1:6400であ
る。プレートに用いたスルファチドの量は500pmolであ
った。このクロマトグラフィーと免疫染色の詳細な説明
は原料と方法の項に示す。

図５はSulph Iで染色された膵臓の切片である。元の
倍率は×66である。図5aはルイスラット由来のものであ
る。図5bはブタ由来のものである。5cはマカカ・ファシ
クラリス（Macaca facicularis）種のサル由来のもので
ある。

図６は15nmのコロイド金でラベルしたβ顆粒（矢印）
を示す電子顕微鏡写真である。元の倍率は×25,000であ
る。

図７はSulph Iで染色された腎臓の切片である。図7a
はマカカ・ファシクラリス種サル由来のものであり（元
の倍率×80）、矢印は明確な着色していない構造として
見られる細管基底膜を示す。図7bは非糖尿病BBラット由
来のものである（×132）。図7cは糖尿病BBラット由来
のもの（×132）であるが糸球体間質の染色は矢印で示
してある。図7dは糖尿病でないヒト由来のものである
（×50）が、糸球体は矢印で示してある。図7eはNIDDM
のヒト由来のものである（×50）。図7fはIDDMのヒト由
来のものであるが（×66）、糸球体間質の染色は矢印で
示してある。

実施例１ 原料と方法 Sulph I抗体 Sulph I抗体は、サルモネラ・ミネソタの細菌膜でコ
ートしたスルファチドを用いてBALB/Cマウスを免疫化す
ることによって予め製造した（Fredmanらの前記文
献）。次にマウス骨髄腫細胞を融合させて抗スルファチ
ド抗体を産生するハイブリドーマを得た。その抗体のサ
ブクラスはIgG1である。

組織の起源 自発的に糖尿病になるBBラット（Ｍllegaad,L1,Ske
nsved,デンマーク）の非糖尿病成熟ラットとNODマウス
（E.Leiter,Bar Harbor,ME由来のBartholin Institute
のコロニー）、またルイスラット（Mollegaard）、およ
びBALB/Cマウス（Bomholtgaad,Ry,デンマーク）由来の
被検膵臓組織を使用した。

免疫蛍光顕微鏡による試験 凍結組織切片（厚さ５μｍ）をアセトン中20℃で５分
間固定し、次に洗浄してから、1:100に希釈したSulph I
ととともに60分間インキュベートした。コンジュゲート
として、1:30に希釈して30分間インキュベートしたFITC
標識ウサギ抗マウス免疫グロブリン（F261,DaKo,Glostr
up,デンマーク）を用いた。スライドグラスは、ｐ−フ
ェニレンジアミンを含有するPBSグリセリン緩衝液でカ
バースリップして（Johnson,G.D.およびAraujo,G.M.C.
N.,J.Immunol.Methods,43巻、349頁、1981年）、Polyva
r,Reichert−Jung顕微鏡を用いて免疫蛍光法で測定し
た。

アルカリホスファターゼ抗アルカリホスファターゼ（AP
AAP）法 パラフィンの切片を、0.05Mトリス緩衝液（pH7.6）中
0.1％プロテアーゼ（Ｐ−8038,Sigma社，米国，ミズー
リ州，セントルイス）で10分間室温にて前処理を行い、
水道水および0.05Mトリス緩衝液pH7.4（TBS）で５分間
すすぎ次いで希釈していないウサギ血清（DaKo）ととも
に５分間インキュベートした。洗浄後、切片を、TBSで
1:50に希釈したSulph Iとともに60分間インキューベー
トした。第２層として、TBSで1:50に希釈し30分間イン
キュベートしたウサギ抗マウス免疫グロブリン（Z259,D
aKo）を用いた。TBS中で５分間すすいだ後、切片を、TB
Sで1:100に希釈したAPAAP−Komplex（APAAP,DaKo）とと
もに30分間インキュベートした。TBS中で短時間すす
ぎ、続いて酵素基質〔2mgのNaphtol−AS−MX リン酸二
ナトリウム（Sigma社）、2.4mgのLavamisol、および10m
gのFast Red TR Salt（Ｆ−1500,Sigma社）を含有する1
0mlの0.1M TBS pH8.2〕とともに20℃にて30分間インキ
ュベートした。得られた切片をメーヤーヘマトキシリン
で１分間、対比染色を行い次いで水道水中に５分間入れ
ておいてから、カバースリットをAquamount（BDH,Poole
英国）で固定した。

島細胞の単離 約10週齢の雄のルイスラットからランゲルハンス島を
滅菌条件下、コラゲナーゼ消化法で単離した。簡単に述
べれば、コラゲナーゼ（Sigma社）とDNアーゼ（Worthin
gton,米国，ニュージャージー州，フリーホールド）の
混合物を、動物を殺してから直ちに膵管に注射した。膵
臓を取出し、37℃の水浴中で６分間づつ２回はげしく振
盪した（200ストローク／分、5cmストローク長）。洗浄
し吸引した後組織を“Ficoll"勾配液（Pharmacia社，ス
エーデン，アプサラ;13.0,19.5,21.5および24.0w/v％）
を用いて、800Gにて10分間遠心分離した。ランゲルハン
ス島は19.5％と21.5％の間の境界層に見出され、３回洗
浄した後、残りの外分泌組織をピペットを用いて、立体
顕微鏡の下に取出した。ランゲルハンス島を、20mM HEP
ES緩衝液、10％ウシ胎仔血清、2mM 1−グルタミン、4mM
NaHCO₃、0.5％ペニシリン−ストレプトマイシン（1000
0IU/ml/10000μg/ml,Gibco,英国，プレイズリー）を含
有するRMMI−1640中に再検濁させ、pH7.35に調節し、４
℃で一夜インキュベートした。翌日、ランゲルハンス島
をDispase（Boehringer Mannheim,ドイツ，マンハイ
ム）とともに５分×３ 37℃でインキュベートし、吸引
を繰返して島細胞を分離した。

蛍光発色セルソーター（FACS）を用いる島細胞の選別 島細胞選別は70mノズルチップ（nozzletip）で作動す
るFACStar Plus（Becton Dickinson社，米国，カリフォ
ルニア州，マウンティン・ビュー）で行った。自己蛍光
（autofluorescence）を488nmで励起し515〜545nmで検
出した。２つの母集団が容易に目視可能であり（Van de
WinkelおよびPipeleers,1983年）、その１つは97.8％
±1.5％（Ｎ＝５）の内分泌の非β細胞を含有する低蛍
光で低分散の画分（Low−scatter fraction）であり、
もう一つは96.7％±2.6％（Ｎ＝５）のβ細胞を含有す
る高蛍光で高分散の画分である。選別の特性は電子顕微
鏡で検査した。汚染細胞の種類は外分泌細胞、間質細胞
またはリンパ球であった。本発明の発明者らのFACSを用
いて上記の方法で選別された島細胞のサブセットをイン
キュベートした後、上澄み液中のホルモンを測定したと
ころ、非β細胞フラクションについて、産生されたホル
モンの52.9％がグルカゴン（27.6％の膵臓ポリペプチ
ド、12.5％のソマトスタチンおよび6.9％インスリン）
であることが分かり、さらに、この画分の外分泌細胞の
大部分がα細胞であることを示した。この選別によっ
て、一般に、非β細胞の母集団からは２×10⁵の細胞が
得られ、β細胞の母集団からは６×10⁵の細胞が得られ
た。選別された細胞は形態学的に良好に保存されてい
た。

抗体のラベリング ラベリングを行う前に、細胞は上記のようにRPMI−16
40培地中で37℃にて90分間インキュベートした。次に10
⁵の細胞を含有する培地100μｌを、1:100の比率で希釈
したSulph Iで、０℃にて30分間染色した。FITCでラベ
ルしたウサギ抗マウス免疫グロブリン（F261,DaKo）を
1:40の比率で希釈し０℃で30分間インキュベートしたも
のをコンジュゲートとして使用した。

抗体でラベルした細胞の分析 FACSによる分析を行うため、各母集団と各ラベリング
したものの2000の細胞を試験した。無関係の抗CD8モノ
クローナル抗体（DaKo−T8,DaKo）と第２層抗体ととも
にインキュベートした後測定したバックグランド蛍光の
部分を、対応してSulph Iでラベルした試料で検出した
蛍光の部分から差引いた。得られた結果を、計数された
細胞の全数の陽性細胞の百分率として示した。

顕微鏡試験を行うために、細胞を１％ホルムアルデヒ
ド液で固定した。100個の細胞を含有する１滴をのせ
て、単細胞のスライドを調製し、空気流で乾燥し、蒸留
水で洗浄し次いで再度乾燥した。“Entellan"（Merck
社，ドイツ ダルムシュタット）を固定剤（mounting m
edium）として使用した。そのカバーガラスで、スライ
ドガラスは４℃で数日間保存することができた。乾燥環
境のためごくわずか退色が起こった。

試験結果 膵臓組織の組織学的試験 免疫蛍光法とAPAAP法を用いて、ランゲルハンス島がS
ulph Iによって明確にラベルされることが見出された
（図１）。種々のラットとマウスの系統由来の組織を染
色して類似の結果が得られた。すなわちBBラット、ルイ
スラット、NODマウスおよびBALB/Cマウス間に定性的な
差は見られなかったが、マウスから得られた組織はわず
かに弱く染色される傾向があった。島細胞の大部分は、
その細胞質が染色されおよびその多くはさらに核が染色
されるのがみとめられた。これらの細胞は主としてラン
ゲルハンス島の周縁に位置していた。いくつかのミニラ
ンゲルハンス島が導管細胞とともに染色されたが外分泌
細胞のラベリングは全く検出されなかった。1:1500まで
の希釈率のSulph Iを用いて島細胞が染色されること
が、免疫蛍光法によってみとめられ、技術的に優れた標
本を容易に得ることができた。このことはAPAAP法を用
いた場合は比較的困難であった。というのはホルマリン
固定液に長時間さらすとSulph Iに対する抗原性が破壊
されるからである。そして各種の酵素前処理を行っても
すべての場合について抗原決定基を露出させることはで
きなかった。

他の組織の組織学的試験 胸腺、脾臓、リンパ節、心臓、肝臓および副腎の他の
種類の組織は顕微鏡試験の結果ラベリングされないこと
が分かった。腎臓において、いくつかの細管細胞の細胞
質と、糸球体間質とが染色されているのがみとめられ
た。脳については、予想どおりにミエリンが明確に染色
された。

島細胞の細胞学的試験 β細胞画分と非β細胞画分の両者を免疫蛍光顕微鏡で
検査した結果、ほとんどすべての細胞がSulph IとFITC
コンジュゲートでラベルした後、明るい表面蛍光を示し
た。ごく少数のリンパ球様細胞が陰性であった。図２
（β細胞サブセット）および図３（非β細胞サブセッ
ト）から分かるように、染色は細胞表面を通じて散乱さ
れたが蛍光の強度は、β細胞および非β細胞については
等しいようである。

FACSでの試験によれば、β細胞画分の細胞の97.3±2.
2（SD）％と非β細胞画分の84.4±3.0（SD）％がSulph
Iでラベルされた。蛍光の平均チャネルは、等しい蛍光
強度を示す画分については同様であった。

実施例２ 原料と方法 患 者 患者は平均年齢が30.1±7.4（19〜54）歳〔±SD（範
囲）〕の35名の新たにＩ型糖尿病と診断されたヒトで構
成されていた。Ｉ型糖尿病の臨床診断は以下の基準に基
いている。すなわちグルコースのランダム血中濃度＞12
mM、著しいケトン尿症と糖尿である。インスリンによる
治療は診断の日に開始され、すべての患者が以後この治
療を続けた。患者は診断されてから4.0±3.2（０〜12）
日後に、抗スルファチド抗体について試験され、次いで
患者の内18名が、診断を受けてから平均187.1±19.5（1
56〜229）日後に第２回の試験を行った。

対 照 対照には、性別分布が等しい20〜60歳の献血者（Sahl
grens' Hospital,Gteborg,スエーデンおよびBartholi
n Institutet）由来の135個の血清または血漿が含まれ
ていた。その血清または血漿は採取されてから24時間以
内に凍結され分析されるまで−20℃に保持した。試料は
いずれも２箇月以上は凍結しなかった。

組織の起源 膵臓組織は10頭のルイスラットから得た。ラット腎臓
組織は10頭の成熟糖尿病BBラットと10頭の成熟非糖尿病
BBラットから得た。これらのラットはＭllegaad,Lill
e Skensved,デンマークから購入した。

ブタの組織はxx年齢の１頭の雌デンマークブタから得
た。

サルの組織はジャワ産の２〜５年齢のマカカ・ファシ
キュラリスサル由来のもので、これらのサルは筋肉生理
学の研究のために殺されたものであり、本発明の研究に
は付随的に用いられた。組織は殺してから直ちに取出し
た。

ヒト腎臓被検体は本研究とは無関係の臨床指標を得る
ために採取した腎臓生検試料から得た。糖尿病でない生
検試料はわずかに動脈高血圧症を有する（180/100mmH
g）１名の39歳の女性から得た。II型糖尿病（NIDDM）に
かかっている１名の62歳の女性由来の生検試料はタンパ
ク尿の指標のために採取したものであり、一方Ｉ型糖尿
病（IDDM）にかかっている１名の23歳の女性患者由来の
生検試料は糖尿腎症のために採取したものである。腎臓
生検試料は前述のようにして得た。

Sulph I抗体 使用される抗体Sulph Iは、サルモネラ・ミネソタ種
の細菌の膜でコートしたスルファチドでBALB/Cマウスを
免疫化することによって予め製造した。次いでマウス骨
髄腫細胞と融合させて抗サルファチド抗体を産生するハ
イブリドーマを得た。この抗体のサブクラスはIgG1であ
る。それはスルファチド（３′−スルホガラクトシルセ
ラミド）およびこれと密接に関連した構造のスルホラク
トシルセラミドならびにセミノリピドと反応する。

組織学的な方法 アルカリホスファターゼ抗アルカリホスファターゼ
（APAAP）法を使用した。凍結した組織片（厚さ５μ
ｍ）をアセトン中で20℃にて５分間固定し、洗浄後、ト
リス緩衝塩水（TBS）で1:100の比率で希釈したSulph I
とともに60分間インキュベートした。第２層として、TB
Sを用い1:50の比率で希釈し30分間インキュベートした
ウサギ抗マウス免疫グロブリン（Z259,DaKo,Glostrup,
デンマーク）を用いた。TBS中で５分間すすいだ後、上
記切片を、TBSにて1:100の比率で希釈した。APAAP複合
体（APAAP,DaKo）とともに30分間インキュベートした。
TBS中で短時間すすいだ後、酵素基質〔2mgのナフトール
−AS−MXリン酸二ナトリウム（Sigma社，米国，ミズー
リ州，セントルイス）、2.4mg Levamisol、および10mg
ファーストレッドTRソルト（Ｆ−1500,Sigma社）を含有
する10mlの0.1M TBS,pH8.2〕とともに20℃にて30分間イ
ンキュベートした。切片をメーヤーヘマトキシリン中で
１分間対比染色を行い、水道水中に５分間おいた後、カ
バースリップを、Aquamount（BDH,Poole,英国）を用い
て固定した。

電子顕微鏡法 ラット膵臓組織の試料（＜1mm³）を、３％パラホルム
アルデヒドと0.2％グルタルアルデヒドの混合物中で1.5
時間固定した。カコジレート緩衝液pH7.3中で洗浄し70
％アルコール中で脱水した後、切片を、LR−White（Bio
−Rad,ワットフォード，米国）中に埋包した。ウルトラ
セクション（ultrasection）を1:1000の比率で希釈した
Sulph Iとともに40分間インキュベートした。ウサギ抗
マウス免疫グロブリン（F261,DaKo）とともにインキュ
ベートした後、切片を、コロイド金（10nm）（G386,DaK
o）を接合したブタ抗ウサギ免疫グロブリンとともに処
理した。試料は、洗浄して２％グルタルアルデヒド中で
５分間後固定した後、JEOL 100−Ｃ電子顕微鏡で検査し
た。対照は、一次抗体のインキュベーションを除いて同
様に処理した。

血清学的検査 血清中の抗糖脂質抗体の検出を、最近報告された薄層
クロマトグラフィ（TLC）オーバーレイ（overlay）法で
行った。この検定に使用した糖脂質の抗原類^１は、ガン
グリオシドGM1,GD1a,GD1b,GT1bを含有する1mg湿潤重量 のヒトの脳およびLK1とHexLK1（それぞれSGPGおよびSGL
PGとも呼ぶ）を含有する10mg湿潤重量のヒト馬尾由来の
酸性糖脂質抽出物であった。使用した他の抗原は結晶の
スルファチド、GA1,3′−LM1およびガラクトシルセラミ
ドであり、各500pmolづつをプレート上に塗布した。糖
脂質の抗原を、TLC−プレート（Marchery−Nagel,Dre
n,ドイツ）上に5mmのレーンとして塗布し、クロロホル
ム／メタノール/0.25％KCl（50:40:10v/v）をクロマト
グラフィーの溶媒として用いた。そのプレートをポリイ
ソブチルメタクリレート中に浸漬し、次いで３％（w/
v）の乾燥牛乳をブロッキング剤として含有するトリス
緩衝液（0.05Mトリス−HCl,pH7.4,0.14M NaCl）中で前
インキュベートした。次にプレートを、３％の乾燥牛乳
を含有するトリス緩衝液で1:100以上の比率で希釈した
血清とともにインキュベートし、続いてアルカリホスフ
ァターゼ接合抗ヒトIgGまたはIgM抗体とともにインキュ
ベートした。捕捉された抗体は、プレートを５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（Sigma
社）とともにインキュベートすることによって視覚化し
た。その力価は、糖脂質抗原/Sの陽性染色が得られる最
高の血清希釈率として測定した（図１）。対照のうち10
％が、適用された抗原の大部分と検出可能な反応を行う
ことが見出された。ガングリオシドLM1に対する反応性
が対照の６％に認められ、かつLK1に対する反応性が血
清の１％にみとめられた（スルファチドについては試験
結果の項を参照）。

統計量 差の有意性はウィルコクソン検定法（Wilcoxon tes
t）で評価した。スピアマンの順位相間検定法（Spearma
n's rank correlation test）を用いて相関係数を計算
した。

試験結果 膵臓組織の試験 全被検動物において、Sulph Iは膵臓の外分泌部とは
反応しなかったがランゲルハンス島とだけ反応した。し
かしランゲルハンス島は非常に強く染色された（図5
a）。ランゲルハンス島の染色は均一であった。このこ
とはα細胞とβ細胞の両者がラベルされたことを示して
いる。図5aから分かるように、いくつもの単細胞の島と
他の小さな島が目視可能になった。

ブタ（図5b）とサル（図5c）の膵臓組織では、同じラ
ベリングのパターンが見られたがその染色は弱かった。

電気顕微鏡法 免疫金染色によって、金粒子がα細胞とβ細胞の両者
の分泌顆粒に集中することが分かった（図６）。さらに
数個の粒子が細胞質膜の外表面に位置していた。サイト
ゾル中に、偶然に分布したいくつかの粒子が存在し、時
にはミトコンドリア中に位置しているのは非特異的結合
であると解される。対照の切片は陰性であった。

腎臓組織の試験 図７は、Sulph Iで染色した異なる起源の腎臓の切片
を示す。

サルの腎臓（図7a）において、糸球体にはSulph.Iの
析出がないことが示されている。腎小体の周囲には、多
数の管状プロフィールが、一般的に、管状上皮細胞中で
のSulph Iの濃い顆粒染色によって認められる。その管
状基底膜は明らかに無色の構造体としてみとめられる。
ブタについて見られる写真はサルの腎臓についての写真
と完全に一致した。

臨床上健康（糖尿病ではない）のBBラットの腎臓（図
7b）において、不審な染色がキャピラリー内（endocapi
llary）空間（血漿タンパク質？）と多数の糸球体の糸
球体間質中にみられた。糸球体近接小動脈の壁および緻
密斑領域に非常に濃い（heavy）染色がみられた。また
細管系の他の部分、すなわちおそらくは遠位細管を示す
と思われる部分は通常どおりにSulph Iによってラベル
された。

糖尿病BBラットの腎臓では（図7c）、明確な顆粒染色
が糸球体間質の空間と、毛細血管わなの内皮下領域と
に、健康なBBラット（図7b）と同様にみとめられた。他
の場合には定性的な変化はなかった。また糖尿病ラット
の腎臓では、糸球体近接小動脈、少数の近位細管および
多数の遠位細管に非常に濃い染色がみられた。

糖尿病でないヒト腎臓（図7d）では、Sulph Iの顆粒
析出は糸球体には検出されなかったが、糸球体近接小動
脈と多数の管状プロフィールには検出された。そして管
状上皮細胞は染色されたがその基底膜は陰性であった。
NIDDMのヒトの患者の腎臓では（図7e）、糸球体は図7d
と同様にラベルされなかったが、他の部分は染色が比較
的濃く、多数の管状プロフィールでは明確であった。

図7fはヒトIDDM患者由来の腎臓切片のSulph Iによる
ラベリングを示す。糖尿病でないヒトの腎臓と同様に、
糸球体は、糸球体間質といくつかの毛細血管わなに顆粒
染色を示した。さらに、濃い染色が管状プロフィールに
みられまた遠位部にさらに顕著な染色がみられた。

他の組織の試験 予想どおりに神経組織にはSulph Iによって強く染色
された。ラットの肺、心臓、肝臓、副腎、脾臓、リンパ
節、胸腺の組織はSulph Iによってラベルされなかっ
た。

血清学的試験 スルファチド抗体について試験した結果を下記の表に
示す。診断時（第１回試験時）、Ｉ型糖尿病患者はすべ
て、1:1131の平均力価（範囲1:100〜1:3200）を有する
抗スルファチド抗体を示した。６箇月後の第二回試験時
には、やはり該患者はすべてが抗スルファチド抗体を示
しその平均力価は1:728（範囲1:100〜1:3200）であっ
た。対照のヒトの場合は11％だけが平均力価1:119（範
囲1:100〜1:400）の抗スルファチド抗体を示した。この
ように少数の抗体陽性の対照は非常に低い力価（弱陽
性）を示したので、スルファチド抗体陽性力価に対する
区別点（cut off point）を1:400力価に設定すると、対
照は陽性が０％であり、一方糖尿病患者は、診断時には
88％が陽性で、６箇月後は59％が抗体陽性であった。そ
の抗体はIgGであった。そしてIgMは検出されなかった。

患者の50％は３′−LM1に対する抗体を示し、患者の1
1％はGA1に対する抗体を示し、両者ともに大部分は力価
が1:100であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 15/10 Ａ６１Ｋ 37/46 (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 263，Ｎｏ．28，（1988）ｐ．14351− 14358 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 261，Ｎｏ．15，（1986）ｐ．6872− 6877 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，Ｖｏｌ251, Ｎｏ．１，（1988）ｐ．17−22 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/53 A61K 31/70 ADN A61K 38/36 A61K 39/395 C07H 15/04 C07H 15/10 ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】個体の糖尿病前症、糖尿病および関連合併
   症に関連する島細胞抗体（ICA）を検出し、そして所望
   によりさらに定量する方法であって、 （１）硫酸化糖脂質を抗原として試料に添加することに
   より、前記島細胞抗体と前記添加した抗原との間に抗原
   −抗体反応を可能にし；そして （２）結合した抗原を検出し、そして所望によりさらに
   定量する； ことを含んで成る方法。
2. 【請求項２】膵臓の標本の組織学的染色または細胞学的
   染色を行うことによって、ランゲルハンス島の細胞を検
   出する方法であって、 （１）硫酸化糖脂質のための特異的キャッチャーであっ
   て、レクチン及び前記硫酸化糖脂質に対する抗体から成
   る群から選択されたものを、膵臓標本に添加し；そして （２）前記膵臓標本に結合した特異的キャッチャーを、
   組織学的染色又は細胞学的染色により検出する； ことを含んで成る方法。
3. 【請求項３】前記硫酸化糖脂質がガラクトース−３−Ｏ
   −サルフェート成分を含んで成る、請求項１又は２に記
   載の方法。
4. 【請求項４】前記試料が、個体から採取した体液であ
   る、請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】前記硫酸化糖脂質が、ガラクトシルセラミ
   ド−３−サルフェート、ラクトシルセラミド−３−サル
   フェートおよびセミノリピドからなる群から選択される
   ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の
   方法。
6. 【請求項６】前記キャッチャーがモノクローナル抗体Su
   lph Iである請求項２又は３に記載の方法。