JP3224538B2 - 蛍光プローブとしての蛍光性ポルフィリン、および蛍光性フタロシアニン―ポリエチレングリコール、ポリオール、およびサッカライド誘導体 - Google Patents
蛍光プローブとしての蛍光性ポルフィリン、および蛍光性フタロシアニン―ポリエチレングリコール、ポリオール、およびサッカライド誘導体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はイムノアッセイで有用な蛍光標識として有用
なマーカー成分、蛍光プローブおよびかかるマーカー成
分およびプローブの製法に関する。
なマーカー成分、蛍光プローブおよびかかるマーカー成
分およびプローブの製法に関する。
発明の背景 本明細書中で引用する出版物および他の文献は参考と
してここに一体化させ、以下明細書中で何回か引用し、
請求の範囲の直前に添付参考文献に各々集めてある。
してここに一体化させ、以下明細書中で何回か引用し、
請求の範囲の直前に添付参考文献に各々集めてある。
溶液中の少量物質の検出は蛍光標識法によって達成で
きる。例えば、ヒト血清中の分析対象の検出は時間分解
蛍光イムノアッセイまたは蛍光偏光イムノアッセイによ
って達成されてきた（文献１〜３）。
きる。例えば、ヒト血清中の分析対象の検出は時間分解
蛍光イムノアッセイまたは蛍光偏光イムノアッセイによ
って達成されてきた（文献１〜３）。
プローブおよびイムノアッセイで蛍光標識として広範
に使用されてきた染料はフルオレセインイソチオシアナ
ートのごときフルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体
およびユーロピウムのごとき稀土類金属のキレートの誘
導体を包含する（文献５、７）。
に使用されてきた染料はフルオレセインイソチオシアナ
ートのごときフルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体
およびユーロピウムのごとき稀土類金属のキレートの誘
導体を包含する（文献５、７）。
染料のある種の物理的および化学的特性は、蛍光標識
としてその総じての利用性、例えば、ホモジーナス蛍光
イムノアッセイおよび／または分析対象の検出における
プローブを決定するのに貢献し得る。重要な特性は蛍光
強度、蛍光寿命、励起および発光波長最大値、偏光およ
び非特異的結合挙動を含む。
としてその総じての利用性、例えば、ホモジーナス蛍光
イムノアッセイおよび／または分析対象の検出における
プローブを決定するのに貢献し得る。重要な特性は蛍光
強度、蛍光寿命、励起および発光波長最大値、偏光およ
び非特異的結合挙動を含む。
（ａ）蛍光強度：（レーザー源からのごとき）光でプロ
ーブを励起するに際し生じる蛍光の強度。蛍光測定で用
いる溶媒の性質は所与のプローブの蛍光の強度に有意な
影響を与え得る。生物学的緩衝液のごとき水性溶媒系の
使用は、イムノアッセイのごとき適用において便宜で恐
らくは重要なものである。これらの溶媒中でのプローブ
の自己凝集は実質的にその蛍光強度を減衰させかねな
い。
ーブを励起するに際し生じる蛍光の強度。蛍光測定で用
いる溶媒の性質は所与のプローブの蛍光の強度に有意な
影響を与え得る。生物学的緩衝液のごとき水性溶媒系の
使用は、イムノアッセイのごとき適用において便宜で恐
らくは重要なものである。これらの溶媒中でのプローブ
の自己凝集は実質的にその蛍光強度を減衰させかねな
い。
（ｂ）励起および発光波長：効果的に蛍光を生じさせる
のに必要な光の波長および蛍光発光が起こる光の波長。
（蛍光発光は励起波長よりも長波長で起こる）。紫外
線、可視光線および赤外線（典型的には、約200ナノメ
ーターないし約1000ナノメーターの範囲の波長）は、染
料分子を励起し、それにより検出可能な蛍光を生じさせ
るのに潜在的に有用な波長であると考えられている。
（約200nmないし約500nmの範囲における）比較的短い波
長での励起に際して蛍光を発する、天然に存在する物質
が豊富なため、検出感度の改良は、約500nmを超える波
長、好ましくは約500nmないし約900nmのスペクトル範囲
の光による励起に際して蛍光を発する発蛍光団を有する
プローブを用いることによって達成され得る。
のに必要な光の波長および蛍光発光が起こる光の波長。
（蛍光発光は励起波長よりも長波長で起こる）。紫外
線、可視光線および赤外線（典型的には、約200ナノメ
ーターないし約1000ナノメーターの範囲の波長）は、染
料分子を励起し、それにより検出可能な蛍光を生じさせ
るのに潜在的に有用な波長であると考えられている。
（約200nmないし約500nmの範囲における）比較的短い波
長での励起に際して蛍光を発する、天然に存在する物質
が豊富なため、検出感度の改良は、約500nmを超える波
長、好ましくは約500nmないし約900nmのスペクトル範囲
の光による励起に際して蛍光を発する発蛍光団を有する
プローブを用いることによって達成され得る。
（ｃ）蛍光寿命および蛍光減衰時間： プローブによって生じる蛍光の寿命は、１ナノ秒から
数ミリ秒まで変わり得る。３ないし50ナノ秒の範囲の蛍
光寿命を呈するほとんどの有機染料は通常芳香族化合物
と呼ばれる一般的クラスの化合物に属し、ペルレンカル
ボン酸のごとき芳香族炭化水素誘導体およびフタロシア
ニンのごとき芳香族複素環化合物および天然に存在する
ポルフィリンによって例示される。これらの染料は特徴
的な蛍光寿命、すなわち、その間に光を発し、かつその
間にいずれの不活性化要因の不存在下でも蛍光強度がそ
の初期値の約37％（1/e）まで減少する、励起に続いて
の時間を有する。測定された蛍光減衰時間は、その間
に、蛍光強度の該37％（1/e）への減少が現実の状況下
で観察される時間である。特定の化合物の測定減衰時間
は溶媒に依存し得る。不活性化を最小化する状況下にお
いて、測定減衰時間は蛍光寿命に到達し得る。蛍光偏光
イムノアッセイのごときアッセイで用いるのに適するに
は、プローブの測定蛍光減衰時間（および必ず蛍光寿命
もまた）適当な長さでなければならない（少なくとも約
２ナノ秒、好ましくは約20ナノ秒のオーダー）。加え
て、蛍光減衰時間が延長されたプローブにより、血清を
含有する試料の自然蛍光バックグラウンドに対する信号
の検出の改良が可能となる。
数ミリ秒まで変わり得る。３ないし50ナノ秒の範囲の蛍
光寿命を呈するほとんどの有機染料は通常芳香族化合物
と呼ばれる一般的クラスの化合物に属し、ペルレンカル
ボン酸のごとき芳香族炭化水素誘導体およびフタロシア
ニンのごとき芳香族複素環化合物および天然に存在する
ポルフィリンによって例示される。これらの染料は特徴
的な蛍光寿命、すなわち、その間に光を発し、かつその
間にいずれの不活性化要因の不存在下でも蛍光強度がそ
の初期値の約37％（1/e）まで減少する、励起に続いて
の時間を有する。測定された蛍光減衰時間は、その間
に、蛍光強度の該37％（1/e）への減少が現実の状況下
で観察される時間である。特定の化合物の測定減衰時間
は溶媒に依存し得る。不活性化を最小化する状況下にお
いて、測定減衰時間は蛍光寿命に到達し得る。蛍光偏光
イムノアッセイのごときアッセイで用いるのに適するに
は、プローブの測定蛍光減衰時間（および必ず蛍光寿命
もまた）適当な長さでなければならない（少なくとも約
２ナノ秒、好ましくは約20ナノ秒のオーダー）。加え
て、蛍光減衰時間が延長されたプローブにより、血清を
含有する試料の自然蛍光バックグラウンドに対する信号
の検出の改良が可能となる。
（ｄ）蛍光偏光：溶液中の蛍光物質を偏光で励起する場
合、それは蛍光として部分的に偏光された光を発する。
蛍光の偏光度は測定でき、発蛍光団の分子容量に関係す
る。この関係を用いて、比較的大きい抗体に対するハプ
テンとして供される小蛍光プローブの結合度を決定でき
る。
合、それは蛍光として部分的に偏光された光を発する。
蛍光の偏光度は測定でき、発蛍光団の分子容量に関係す
る。この関係を用いて、比較的大きい抗体に対するハプ
テンとして供される小蛍光プローブの結合度を決定でき
る。
（ｅ）非特異的結合：ヒト血清アルブミン（分子量約70
000）のごとき大きな蛋白質分子の存在下で溶液中に結
合しないで残るプローブの能力。溶液中の蛋白質のごと
き比較的大きな（高分子量の）マクロ分子に対する小さ
な（低分子量の）染料分子の非特異的結合が観察されて
いる（文献14）。蛍光プローブと生物学的マクロ分子の
間のこの非共有結合的会合の生起は、プローブ−マクロ
分子複合体の蛍光挙動に現れる。一般に、蛍光偏光が影
響される。ホモジーナス蛍光イムノアッセイのごとき適
用においては、生物学的マクロ分子に対するプローブの
非特異的結合が、もし排除されないのなら、最小に保持
されることが重要である。
000）のごとき大きな蛋白質分子の存在下で溶液中に結
合しないで残るプローブの能力。溶液中の蛋白質のごと
き比較的大きな（高分子量の）マクロ分子に対する小さ
な（低分子量の）染料分子の非特異的結合が観察されて
いる（文献14）。蛍光プローブと生物学的マクロ分子の
間のこの非共有結合的会合の生起は、プローブ−マクロ
分子複合体の蛍光挙動に現れる。一般に、蛍光偏光が影
響される。ホモジーナス蛍光イムノアッセイのごとき適
用においては、生物学的マクロ分子に対するプローブの
非特異的結合が、もし排除されないのなら、最小に保持
されることが重要である。
イムノアッセイにおける非特異的結合は、特に血清試
料が関与する場合は、常にやっかいな問題であった。非
特異的結合によって引き起こされる困難を克服するため
に、過去の研究者は、ドデシル硫酸ナトリウムのごとき
種々の界面活性剤およびトリクロロ酢酸カリウムのごと
きカオトロピックイオンの添加に注目し、あるいはスル
ホサリチル酸のごとき蛋白沈澱剤での血清蛋白質の沈
澱、続いての該沈澱を取り除くための遠心または濾過の
ごとき分離工程に注目してきた。
料が関与する場合は、常にやっかいな問題であった。非
特異的結合によって引き起こされる困難を克服するため
に、過去の研究者は、ドデシル硫酸ナトリウムのごとき
種々の界面活性剤およびトリクロロ酢酸カリウムのごと
きカオトロピックイオンの添加に注目し、あるいはスル
ホサリチル酸のごとき蛋白沈澱剤での血清蛋白質の沈
澱、続いての該沈澱を取り除くための遠心または濾過の
ごとき分離工程に注目してきた。
分離工程は非特異的結合の問題を解決するものの、該
アッセイを時間ばかり費し、コスト高で、自動化が困難
なものとする。また、言及されている種々の添加剤は、
非特異的結合におけるのみならず、抗体による特異的結
合において種々の程度に、常に干渉する。この効果は十
分予測されたものである。というのは、特異的および非
特異的結合における相互作用のタイプは同一、つまり静
電気的、水素結合および疎水的相互作用だからである。
よって、これらの方法は満足すべきものではなく、いく
らか異なる効果が予測され得る最良のものである。
アッセイを時間ばかり費し、コスト高で、自動化が困難
なものとする。また、言及されている種々の添加剤は、
非特異的結合におけるのみならず、抗体による特異的結
合において種々の程度に、常に干渉する。この効果は十
分予測されたものである。というのは、特異的および非
特異的結合における相互作用のタイプは同一、つまり静
電気的、水素結合および疎水的相互作用だからである。
よって、これらの方法は満足すべきものではなく、いく
らか異なる効果が予測され得る最良のものである。
血清の非特異的結合のほとんどは血清アルブミンの存
在によるものである。この蛋白質はいくつかの特別な機
能を有しており、その中には、脂肪酸およびステロイド
ホルモンのごとき種々の有機代謝物の担持があり、加え
て、それは、経口的に摂取されたあるいは注射によって
摂取された他の物質を担持する。血清アルブミンの構造
はこの機能に対していくらかユニークに適合しており、
in vitroでテストした場合、数千までの分子量のほとん
どすべてのタイプの分子に結合することが示され得る。
在によるものである。この蛋白質はいくつかの特別な機
能を有しており、その中には、脂肪酸およびステロイド
ホルモンのごとき種々の有機代謝物の担持があり、加え
て、それは、経口的に摂取されたあるいは注射によって
摂取された他の物質を担持する。血清アルブミンの構造
はこの機能に対していくらかユニークに適合しており、
in vitroでテストした場合、数千までの分子量のほとん
どすべてのタイプの分子に結合することが示され得る。
有機染料、特に芳香族および／または多環構造を持つ
ものは、水性溶液では溶解度が制限される可能性があ
り、水性溶媒中では凝集し得る（文献４）。疎水性であ
る蛍光染料は、例えば、当該染料または染料前駆体のス
ルホン化によって、水中における溶解性を促進するため
に修飾することができる（文献６）。一般に、有機分子
が水中で限定的溶解度を有する場合、溶解度の改善は、
有機分子を１またはそれを超える水可溶化基に化学的に
結合させることによって達成できる。かかる基のさらな
る例はホスフェート、カルボキシレートおよび第４級ア
ンモニウム、ならびにリン酸ナトリウムおよびカリウム
およびハロゲン化アンモニウムのごときその塩である。
ものは、水性溶液では溶解度が制限される可能性があ
り、水性溶媒中では凝集し得る（文献４）。疎水性であ
る蛍光染料は、例えば、当該染料または染料前駆体のス
ルホン化によって、水中における溶解性を促進するため
に修飾することができる（文献６）。一般に、有機分子
が水中で限定的溶解度を有する場合、溶解度の改善は、
有機分子を１またはそれを超える水可溶化基に化学的に
結合させることによって達成できる。かかる基のさらな
る例はホスフェート、カルボキシレートおよび第４級ア
ンモニウム、ならびにリン酸ナトリウムおよびカリウム
およびハロゲン化アンモニウムのごときその塩である。
ポルフィリンおよびフタロシアニン誘導体は発蛍光団
として有用であり、有機溶媒中で良好な蛍光挙動を示
す。しかしながら、誘導体化されていないポリフィリン
およびフタロシアニン化合物は本質的に水不溶性であ
り、かくして、水性溶液中で高度に凝集し、低い蛍光強
度を示す。スルホネート、第４級アンモニウム、カルボ
キシレート等のごとき可溶化基を付着させることによる
ポリフィリンおよびフタロシアニン化合物の修飾はこれ
らの化合物の水溶解度を改善してきた。しかしながら、
誘導体化したポリフィリンおよびフタロシアニンは、し
ばしば、有機溶媒中とは反対に、水性溶液中での蛍光強
度は実質的に弱まる。加えて、水溶性誘導体は、イムノ
アッセイにおける有用性を制限するヒト血清の成分に対
して非特異的に密接に結合することが判明している。
として有用であり、有機溶媒中で良好な蛍光挙動を示
す。しかしながら、誘導体化されていないポリフィリン
およびフタロシアニン化合物は本質的に水不溶性であ
り、かくして、水性溶液中で高度に凝集し、低い蛍光強
度を示す。スルホネート、第４級アンモニウム、カルボ
キシレート等のごとき可溶化基を付着させることによる
ポリフィリンおよびフタロシアニン化合物の修飾はこれ
らの化合物の水溶解度を改善してきた。しかしながら、
誘導体化したポリフィリンおよびフタロシアニンは、し
ばしば、有機溶媒中とは反対に、水性溶液中での蛍光強
度は実質的に弱まる。加えて、水溶性誘導体は、イムノ
アッセイにおける有用性を制限するヒト血清の成分に対
して非特異的に密接に結合することが判明している。
フタロシアニンおよびポリフィリン誘導体は腫瘍治療
の分野での適用が見い出されている（文献８、９）。こ
れらの化合物の水溶性誘導体が調製されている。例え
ば、金属化およびスルホン化合フタロシアニン、ヒドロ
キシアルキニウム・フタロシアニンテトラスルホン酸は
水性溶液中で実質的にモノマーであり、水中で効果的に
蛍光を生じる（文献10、16）。しかしながら、例外な
く、これらの前記した発蛍光団はヒト血清アルブミンの
ごとき溶液成分に非特異的に結合する強い蛍光を保持し
ている。
の分野での適用が見い出されている（文献８、９）。こ
れらの化合物の水溶性誘導体が調製されている。例え
ば、金属化およびスルホン化合フタロシアニン、ヒドロ
キシアルキニウム・フタロシアニンテトラスルホン酸は
水性溶液中で実質的にモノマーであり、水中で効果的に
蛍光を生じる（文献10、16）。しかしながら、例外な
く、これらの前記した発蛍光団はヒト血清アルブミンの
ごとき溶液成分に非特異的に結合する強い蛍光を保持し
ている。
発明の概要 本発明は、可溶化ポリオキシヒドロカルビル部位に連
結した発蛍光団よりなることを特徴とする検出可能に標
識されたマーカー成分およびこれらのマーカー成分の製
法に指向される。また、本発明は、これらのマーカー成
分を蛍光またはリン光標識として用いる検出可能に標識
されたプローブに指向される。
結した発蛍光団よりなることを特徴とする検出可能に標
識されたマーカー成分およびこれらのマーカー成分の製
法に指向される。また、本発明は、これらのマーカー成
分を蛍光またはリン光標識として用いる検出可能に標識
されたプローブに指向される。
本発明のマーカー成分は、特に、水性溶液中において
分析対象を検出するためのアッセイで用いる検出可能な
標識として適当でる。これらのマーカー成分は蛍光プロ
ーブにおける取り込み用の蛍光標識として有用である。
これらのマーカー成分のいくつかはリン光標識として有
用である。また、これらの成分はin vivo画像形成で用
いる薬剤用の標識として、またin vivo腫瘍治療で用い
る薬剤用の標識としても有用である。
分析対象を検出するためのアッセイで用いる検出可能な
標識として適当でる。これらのマーカー成分は蛍光プロ
ーブにおける取り込み用の蛍光標識として有用である。
これらのマーカー成分のいくつかはリン光標識として有
用である。また、これらの成分はin vivo画像形成で用
いる薬剤用の標識として、またin vivo腫瘍治療で用い
る薬剤用の標識としても有用である。
本発明により、少なくとも１つの可溶化ポリオキシヒ
ドロカルビル部位に連結した発蛍光団部位よりなるマー
カー成分が提供される。好ましくは、これらのマーカー
成分は、約１ないし18の可溶化部位、より好ましくは約
２ないし６の可溶化部位よりなる。これらのマーカー成
分は水性溶液中における減少した凝集を示す。これらの
マーカー成分はヒト血清アルブミン（「HSA」）のごと
きヒト血清の成分に対する非特異的結合の減少を示す。
また、これらのマーカー成分は測定蛍光減衰時間の延長
を示す。
ドロカルビル部位に連結した発蛍光団部位よりなるマー
カー成分が提供される。好ましくは、これらのマーカー
成分は、約１ないし18の可溶化部位、より好ましくは約
２ないし６の可溶化部位よりなる。これらのマーカー成
分は水性溶液中における減少した凝集を示す。これらの
マーカー成分はヒト血清アルブミン（「HSA」）のごと
きヒト血清の成分に対する非特異的結合の減少を示す。
また、これらのマーカー成分は測定蛍光減衰時間の延長
を示す。
これらのマーカー成分は、有利には、水性溶液に適合
し、高蛍光強度を含めた都合良い蛍光特性を示し、溶液
中においてマクロ分子に対して非特異的結合の減少を示
す。
し、高蛍光強度を含めた都合良い蛍光特性を示し、溶液
中においてマクロ分子に対して非特異的結合の減少を示
す。
従って、一般に、その波長が約200ないし約1000ナノ
メーターの範囲内、好ましくは約600ないし800ナノメー
ターの範囲内にある光での励起に際して蛍光を効果的に
発する発蛍光団が好ましい。
メーターの範囲内、好ましくは約600ないし800ナノメー
ターの範囲内にある光での励起に際して蛍光を効果的に
発する発蛍光団が好ましい。
適当な発蛍光団は、バックグラウンド蛍光を最小化す
るために（試料中に存在する蛋白質のごとき）他の溶液
成分の励起および発光最大値から区別できる波長にて吸
光しおよび／または発光するものを包含する。
るために（試料中に存在する蛋白質のごとき）他の溶液
成分の励起および発光最大値から区別できる波長にて吸
光しおよび／または発光するものを包含する。
これらのマーカー成分は、生物学的流動体の試料を用
いるアッセイで特に有用であり、その使用には、他の試
料成分の雰囲気蛍光からの干渉を減少させる少なくとも
約500ナノメーターの励起および／または発光波長を有
する発蛍光団が好ましい。血清のごときいくつかの試料
は、500nm未満の励起波長を用いる場合、フラビン、フ
ラボ蛋白質、NADH等からのかなりの干渉バックグラウン
ド蛍光を呈する。また、好ましい発蛍光団は高度の蛍光
偏光、好ましくは、観察可能な偏光についての理論的最
大値の約10％以上を呈する。蛍光偏光イムノアッセイの
ごときある種の適用については、好ましい発蛍光団は、
約１ナノ秒ないし約50ナノ秒の範囲、好ましくは約５な
いし約20ナノ秒の範囲の測定蛍光減衰時間によって特徴
付けることもできる。リン光標識としての使用のごとき
他の適用については、さらに長い減衰時間を有する発蛍
光団を使用することができる。
いるアッセイで特に有用であり、その使用には、他の試
料成分の雰囲気蛍光からの干渉を減少させる少なくとも
約500ナノメーターの励起および／または発光波長を有
する発蛍光団が好ましい。血清のごときいくつかの試料
は、500nm未満の励起波長を用いる場合、フラビン、フ
ラボ蛋白質、NADH等からのかなりの干渉バックグラウン
ド蛍光を呈する。また、好ましい発蛍光団は高度の蛍光
偏光、好ましくは、観察可能な偏光についての理論的最
大値の約10％以上を呈する。蛍光偏光イムノアッセイの
ごときある種の適用については、好ましい発蛍光団は、
約１ナノ秒ないし約50ナノ秒の範囲、好ましくは約５な
いし約20ナノ秒の範囲の測定蛍光減衰時間によって特徴
付けることもできる。リン光標識としての使用のごとき
他の適用については、さらに長い減衰時間を有する発蛍
光団を使用することができる。
実質的に平面のルミネッセンス分子構造よりなる発蛍
光団が適当である。
光団が適当である。
好ましい発蛍光団部位の１のクラスは、好ましくは＋
３または＋４の酸化状態である中心原子に配位した実質
的に平面の大環状多座配位子よりなる。中心原子につき
好ましい元素はケイ素、アルミニウム、ゲルマニウム、
スズ、リン等を含み；特に好ましいのはアルミニウム、
ケイ素、およびゲルマニウムである。特に好ましい発蛍
光団は、中心原子またはイオンとで配位錯体を形成する
大環状多座配位子よりなる。この原子またはイオンのさ
らなる配位部位は、少なくとも１つの可溶化ポリオキシ
ヒドロカルビル部位によって占められていてもよい。好
ましいイオンは、小さなイオンであり、従って、スピン
−軌道カップリングによって、大環状配位子の蛍光を減
じないアルミニウム（III）、ケイ素（IV）、およびゲ
ルマニウム（IV）を含む。特に好ましい原子は、＋４の
酸化状態で、大環状配位子に加えて２の配位子を含有す
る八面体配位錯体を形成するケイ素のごとき原子であ
る。驚くべきことに、蛍光性八面体配位錯体のアクシャ
ル（トランス）配位子として作用する２つの適当に選択
された可溶化基を有するマーカー成分はヒト血清アルブ
ミンおよび他の溶液成分に対し減少したあるいは検出不
可能な非特異的結合を示す。
３または＋４の酸化状態である中心原子に配位した実質
的に平面の大環状多座配位子よりなる。中心原子につき
好ましい元素はケイ素、アルミニウム、ゲルマニウム、
スズ、リン等を含み；特に好ましいのはアルミニウム、
ケイ素、およびゲルマニウムである。特に好ましい発蛍
光団は、中心原子またはイオンとで配位錯体を形成する
大環状多座配位子よりなる。この原子またはイオンのさ
らなる配位部位は、少なくとも１つの可溶化ポリオキシ
ヒドロカルビル部位によって占められていてもよい。好
ましいイオンは、小さなイオンであり、従って、スピン
−軌道カップリングによって、大環状配位子の蛍光を減
じないアルミニウム（III）、ケイ素（IV）、およびゲ
ルマニウム（IV）を含む。特に好ましい原子は、＋４の
酸化状態で、大環状配位子に加えて２の配位子を含有す
る八面体配位錯体を形成するケイ素のごとき原子であ
る。驚くべきことに、蛍光性八面体配位錯体のアクシャ
ル（トランス）配位子として作用する２つの適当に選択
された可溶化基を有するマーカー成分はヒト血清アルブ
ミンおよび他の溶液成分に対し減少したあるいは検出不
可能な非特異的結合を示す。
かくして、効果的に蛍光を生じる発蛍光団、すなわ
ち、適当な波長における高吸光性および高蛍光量子収量
によって特徴付けられる発蛍光団出が好ましい。ある種
の適用については、好ましい発蛍光団は少なくとも２ナ
ノ秒のオーダーの測定蛍光減衰時間を有し、高度の蛍光
偏光を呈する。
ち、適当な波長における高吸光性および高蛍光量子収量
によって特徴付けられる発蛍光団出が好ましい。ある種
の適用については、好ましい発蛍光団は少なくとも２ナ
ノ秒のオーダーの測定蛍光減衰時間を有し、高度の蛍光
偏光を呈する。
好ましい可溶化ポリオキシヒドロカルビル部位は、グ
ルコース、スクロース、マルトトリオース等のごとき水
溶性炭化水素；グルコン酸およびマンニトールおよびオ
リゴサッカライドのごとき水溶性炭水化物誘導体；ポリ
リシンのごときポリペプチドおよび天然に存在する蛋白
質；およびポリビニルピロリドン、ポリ（ビニルアルコ
ール）、ポリ（エチレンイミン）、ポリアクリル酸、ポ
リアクリルアミドのごとき水溶性ポリマー、PluronicTM
（プロピレンオキシドコポリマー、BASFから入手可能）
およびTetronicTM（BASF）ポリオール界面活性剤のごと
きエチレンオキシドコポリマー；およびポリ（エチレン
グルコール）メチルエーテル、アミン−末端ポリ（エチ
レングリコール）、ポリ（エチレングリコール）ケイ素
由来エステル等のごとき水溶性ポリオキシアルキレンポ
リマー、特にポリ（エチレングリコール）（［PEG」）
およびポリ（エチレングリコール）誘導体を含めたポリ
エーテルを包含する。
ルコース、スクロース、マルトトリオース等のごとき水
溶性炭化水素；グルコン酸およびマンニトールおよびオ
リゴサッカライドのごとき水溶性炭水化物誘導体；ポリ
リシンのごときポリペプチドおよび天然に存在する蛋白
質；およびポリビニルピロリドン、ポリ（ビニルアルコ
ール）、ポリ（エチレンイミン）、ポリアクリル酸、ポ
リアクリルアミドのごとき水溶性ポリマー、PluronicTM
（プロピレンオキシドコポリマー、BASFから入手可能）
およびTetronicTM（BASF）ポリオール界面活性剤のごと
きエチレンオキシドコポリマー；およびポリ（エチレン
グルコール）メチルエーテル、アミン−末端ポリ（エチ
レングリコール）、ポリ（エチレングリコール）ケイ素
由来エステル等のごとき水溶性ポリオキシアルキレンポ
リマー、特にポリ（エチレングリコール）（［PEG」）
およびポリ（エチレングリコール）誘導体を含めたポリ
エーテルを包含する。
本発明の１の態様において、少なくとも１つの可溶化
ポリオキシヒドロカルビル部位を発蛍光団部位に、大環
によってキレート結合された中心原子にまたは間接的に
該大環それ自身のいずれかに付着させる。好ましくは、
１ないし約18の可溶化基を発蛍光団に連結し、より好ま
しくは約２ないし約６の可溶化基を発蛍光団部位に付着
させる。
ポリオキシヒドロカルビル部位を発蛍光団部位に、大環
によってキレート結合された中心原子にまたは間接的に
該大環それ自身のいずれかに付着させる。好ましくは、
１ないし約18の可溶化基を発蛍光団に連結し、より好ま
しくは約２ないし約６の可溶化基を発蛍光団部位に付着
させる。
もう１つの態様において、本発明は、可溶化ポリオキ
シヒドロカルビル部位が、中心原子の配位部位を占める
配位子よりなるマーカー成分に指向される。この原子の
さらなる配位部位は蛍光（多座）配位子によって占めら
れる。例えば、発蛍光団が、その内部窒素原子が中心原
子の配位部位を占めるポリフィリンまたはアザポルフィ
リンのごとき実質的に平面の大環状配位子よりなる場
合、可溶化部位は、また、中心原子の残存する配位部位
を占める配位子として作用する。かくして、可溶化部位
は、大環の平面に対して空間的に実質的に垂直であるよ
うに配位する。
シヒドロカルビル部位が、中心原子の配位部位を占める
配位子よりなるマーカー成分に指向される。この原子の
さらなる配位部位は蛍光（多座）配位子によって占めら
れる。例えば、発蛍光団が、その内部窒素原子が中心原
子の配位部位を占めるポリフィリンまたはアザポルフィ
リンのごとき実質的に平面の大環状配位子よりなる場
合、可溶化部位は、また、中心原子の残存する配位部位
を占める配位子として作用する。かくして、可溶化部位
は、大環の平面に対して空間的に実質的に垂直であるよ
うに配位する。
これらのマーカー成分は、分析対象、抗原、抗体また
は他の分子を標識するための標識として使用することが
できる。これらのマーカー成分は、所望により、マーカ
ー成分が分析対象、抗原、抗体または他の分子に連結す
るのを可能とするリンカーアームを包含するように官能
化することもできる。この目的に適した広範囲なリンカ
ーアームが記載されている（文献17）。
は他の分子を標識するための標識として使用することが
できる。これらのマーカー成分は、所望により、マーカ
ー成分が分析対象、抗原、抗体または他の分子に連結す
るのを可能とするリンカーアームを包含するように官能
化することもできる。この目的に適した広範囲なリンカ
ーアームが記載されている（文献17）。
かくして、本発明は、蛍光標識として働き、蛍光プロ
ーブで有用であり、およびヒト血清アルブミンに対する
非特異的結合が減少し、水性溶液中における高蛍光強度
および凝集の減少を含めた溶媒感受性の減少；雰囲気蛍
光からの干渉を最小化する励起および／または発光波長
最大値；およびバックグラウンド蛍光および散乱からの
干渉を最小化する蛍光寿命を持つ有利な特性を有するマ
ーカー成分を提供する。
ーブで有用であり、およびヒト血清アルブミンに対する
非特異的結合が減少し、水性溶液中における高蛍光強度
および凝集の減少を含めた溶媒感受性の減少；雰囲気蛍
光からの干渉を最小化する励起および／または発光波長
最大値；およびバックグラウンド蛍光および散乱からの
干渉を最小化する蛍光寿命を持つ有利な特性を有するマ
ーカー成分を提供する。
定義： 本明細書中で用いる以下の用語は、特に断りのない限
り、以下の意味を有する。
り、以下の意味を有する。
「分析対象」なる語は、化合物またはアッセイで測定
すべき化合物をいい、レセプターが天然に存在しまたは
調製できる、モノ−またはポリエピトープ、抗原または
ハプテンであるいずれの化合物でもよく、少なくとも１
つの通常のエピトープ部位またはレセプターを占める単
一または複数の化合物でもよい。
すべき化合物をいい、レセプターが天然に存在しまたは
調製できる、モノ−またはポリエピトープ、抗原または
ハプテンであるいずれの化合物でもよく、少なくとも１
つの通常のエピトープ部位またはレセプターを占める単
一または複数の化合物でもよい。
「アクシャル配位子」とは、大環状配位子と一緒に、
配位錯体を形成する置換基をいう。該アクシャル配位子
は、大環状配位子によって示される面に対して垂直に存
在する。
配位錯体を形成する置換基をいう。該アクシャル配位子
は、大環状配位子によって示される面に対して垂直に存
在する。
「蛍光プローブ」なる語は、注目する物質の存在を測
定しおよび／またはそれを定量するための蛍光イムノア
ッセイのごときアッセイで用いる分析対象、抗原、ハプ
テン、抗体または他の分子に結合し、あるいは直接また
はリンカーアームを介してそれに配位する発蛍光団部位
よりなるマーカー成分をいう。
定しおよび／またはそれを定量するための蛍光イムノア
ッセイのごときアッセイで用いる分析対象、抗原、ハプ
テン、抗体または他の分子に結合し、あるいは直接また
はリンカーアームを介してそれに配位する発蛍光団部位
よりなるマーカー成分をいう。
「溶媒感受性」なる語は、用いる溶媒系に応じた分子
の蛍光挙動の変化をいい、最も顕著には（DMFのごと
き）有機溶媒と比較した水性溶液における蛍光挙動の差
異をいう。DMFのごとき有機溶媒中で高蛍光強度を呈す
る多くの発蛍光団は水性溶液中では実質的に減少した蛍
光強度を示す。
の蛍光挙動の変化をいい、最も顕著には（DMFのごと
き）有機溶媒と比較した水性溶液における蛍光挙動の差
異をいう。DMFのごとき有機溶媒中で高蛍光強度を呈す
る多くの発蛍光団は水性溶液中では実質的に減少した蛍
光強度を示す。
化合物の量子収量または量子効果は吸収されたエネル
ギー量子当たりの発せられた合計量子の比である。
ギー量子当たりの発せられた合計量子の比である。
Φの値が大きくなれば、化合物の蛍光は大きくなる。
蛍光強度は試料濃度および励起放射に関係する。特定
の染料の蛍光強度はその特徴的な光吸収率（吸光係数）
および蛍光量子効率、ならびに環境因子に関係付けられ
る。
の染料の蛍光強度はその特徴的な光吸収率（吸光係数）
および蛍光量子効率、ならびに環境因子に関係付けられ
る。
「特異的結合対」なる語は２つの異なる分子（または
組成体）をいい、該分子のうち１つは表面上または窪み
中に、他の分子または他の分子を含めた分子複合体の特
定の空間的および極性的組織を特異的に認識しそれに結
合する領域を有する。
組成体）をいい、該分子のうち１つは表面上または窪み
中に、他の分子または他の分子を含めた分子複合体の特
定の空間的および極性的組織を特異的に認識しそれに結
合する領域を有する。
「結合パートナー」なる語は、特定の分子または分子
複合体を特異的に認識でき、あるいは特定の分子または
分子複合体によって認識される分子または分子複合体を
いい、その特定の分子または分子複合体とで特異的な結
合対を形成する。
複合体を特異的に認識でき、あるいは特定の分子または
分子複合体によって認識される分子または分子複合体を
いい、その特定の分子または分子複合体とで特異的な結
合対を形成する。
図面の簡単な記載 図１は実施例により調製した化合物ＩないしIIIの構
造を示す。
造を示す。
発明の詳細な記載 I.好ましいマーカー成分 １の態様において、本発明は、発蛍光団部位が大環状
蛍光染料化合物よりなるマーカー成分に指向される。芳
香族π電子系を有する染料化合物が好ましい。好ましく
は、これらの染料化合物は実質的に平面状である。所望
により、これらの染料化合物は、中心原子に配位する多
座配位子として作用するものでもよい。適当な中心原子
は、かかる大環状多座配位子とで安定な配位錯体を形成
できる元素を包含する。
蛍光染料化合物よりなるマーカー成分に指向される。芳
香族π電子系を有する染料化合物が好ましい。好ましく
は、これらの染料化合物は実質的に平面状である。所望
により、これらの染料化合物は、中心原子に配位する多
座配位子として作用するものでもよい。適当な中心原子
は、かかる大環状多座配位子とで安定な配位錯体を形成
できる元素を包含する。
本発明の１つの態様において、少なくとも１つの可溶
化ポリオキシヒドロカルビル部位は、直接的に大環に対
する発蛍光団部位に連結している。１ないし約18の可溶
化部位の、好ましくは発蛍光団部位当たり２またはそれ
を超える可溶化ポリオキシヒドロカルビル部位を有する
マーカー成分が好ましく、発蛍光団部位当たり約２ない
し約６の可溶化部位を有するものが特に好ましい。
化ポリオキシヒドロカルビル部位は、直接的に大環に対
する発蛍光団部位に連結している。１ないし約18の可溶
化部位の、好ましくは発蛍光団部位当たり２またはそれ
を超える可溶化ポリオキシヒドロカルビル部位を有する
マーカー成分が好ましく、発蛍光団部位当たり約２ない
し約６の可溶化部位を有するものが特に好ましい。
もう１つの態様において、大環が中心原子にキレート
結合する場合、可溶化ポリオキシヒドロカルビル部位は
アクシャル配位子として中心原子に配位する。２のアク
シャル配位子として２の可溶化部位を有するマーカー成
分が好ましい。
結合する場合、可溶化ポリオキシヒドロカルビル部位は
アクシャル配位子として中心原子に配位する。２のアク
シャル配位子として２の可溶化部位を有するマーカー成
分が好ましい。
A.好ましい発蛍光団部位 好ましい発蛍光団部位は、（ａ）少なくとも約1000、
好ましくは50000を超える高吸光係数；（ｂ）アッセイ
を行うべき試料中の成分の天然蛍光からの干渉が最小化
されるように十分に長い励起および発光波長最大値；お
よび（ｃ）高蛍光強度を有する蛍光染料を包含する。あ
る種の適用では、これらの発蛍光団は（ｄ）バックグラ
ウンド蛍光および散乱を超える発光された光の正確な測
定を可能とする十分に長い測定蛍光減衰時間（少なくと
も約２、好ましくは少なくとも約10ナノ秒）を示すのが
好ましいであろう。
好ましくは50000を超える高吸光係数；（ｂ）アッセイ
を行うべき試料中の成分の天然蛍光からの干渉が最小化
されるように十分に長い励起および発光波長最大値；お
よび（ｃ）高蛍光強度を有する蛍光染料を包含する。あ
る種の適用では、これらの発蛍光団は（ｄ）バックグラ
ウンド蛍光および散乱を超える発光された光の正確な測
定を可能とする十分に長い測定蛍光減衰時間（少なくと
も約２、好ましくは少なくとも約10ナノ秒）を示すのが
好ましいであろう。
適当な励起波長は、約200nmないし約1000nm、好まし
くは約500nmないし約900nm、より好ましくは約650nmな
いし約800nmの範囲である。これらの波長は、部分的に
は、蛍光を発し検出するために使用する電気的トランジ
ューサー（すなわち、レーザー源および光電子増倍管）
の物理的特性のため、特に好ましい。
くは約500nmないし約900nm、より好ましくは約650nmな
いし約800nmの範囲である。これらの波長は、部分的に
は、蛍光を発し検出するために使用する電気的トランジ
ューサー（すなわち、レーザー源および光電子増倍管）
の物理的特性のため、特に好ましい。
蛍光偏光イムノアッセイのごときある種の適用では、
発蛍光団は、約２ナノ秒ないし約50ナノ秒、より好まし
くは約10ないし約20ナノ秒の範囲の測定蛍光減衰時間を
有する。約20ナノ秒の蛍光寿命が特に好ましい。
発蛍光団は、約２ナノ秒ないし約50ナノ秒、より好まし
くは約10ないし約20ナノ秒の範囲の測定蛍光減衰時間を
有する。約20ナノ秒の蛍光寿命が特に好ましい。
本発明のもう１つの態様において、少なくとも約20n
m、好ましくは約50nmを超えるストークス・シフトを有
する発蛍光団が好ましい。
m、好ましくは約50nmを超えるストークス・シフトを有
する発蛍光団が好ましい。
注目すべきは、本発明の１つの態様において、好まし
い発蛍光団は大環状蛍光染料化合物、特に芳香族π電子
系を有する化合物を包含する。これらの染料化合物は、
錯化中心原子にキレート結合する大環状多座配位子とし
て作用する。かくして、これらの好ましい発蛍光団部位
は錯化中心イオンまたは原子に配位した実質的に平面状
の大環状多座配位子よりなり得る。好ましい元素はアル
ミニウム、リン、および第IV B族元素、例えば、ケイ
素、ゲルマニウムおよびスズを包含する。かかる好まし
い発蛍光団は、アクシャル配位子としての可溶化ポリオ
キシヒドロカルビル部位と配位できる中心原子に配位し
た実質的に平面状の大環状多座配位子を包含する。かか
る好ましい元素はアルミニウム、ケイ素およびゲルマニ
ウムを包含する。特に好ましいのはケイ素およびゲルマ
ニウムのごとき元素であり、トランス（アクシャル）配
位で、すなわち、平面状大環状配位子のいずれか側でそ
れに直角に、２個の配位子を含有する八面体配位錯体を
形成し得る。驚くべきことに、発蛍光団部位の中心原子
に対するアクシャル配位子として２個の可溶化部位を有
するマーカー成分は生物学的マクロ分子に対する非特異
的結合が特に減少していることが判明した。
い発蛍光団は大環状蛍光染料化合物、特に芳香族π電子
系を有する化合物を包含する。これらの染料化合物は、
錯化中心原子にキレート結合する大環状多座配位子とし
て作用する。かくして、これらの好ましい発蛍光団部位
は錯化中心イオンまたは原子に配位した実質的に平面状
の大環状多座配位子よりなり得る。好ましい元素はアル
ミニウム、リン、および第IV B族元素、例えば、ケイ
素、ゲルマニウムおよびスズを包含する。かかる好まし
い発蛍光団は、アクシャル配位子としての可溶化ポリオ
キシヒドロカルビル部位と配位できる中心原子に配位し
た実質的に平面状の大環状多座配位子を包含する。かか
る好ましい元素はアルミニウム、ケイ素およびゲルマニ
ウムを包含する。特に好ましいのはケイ素およびゲルマ
ニウムのごとき元素であり、トランス（アクシャル）配
位で、すなわち、平面状大環状配位子のいずれか側でそ
れに直角に、２個の配位子を含有する八面体配位錯体を
形成し得る。驚くべきことに、発蛍光団部位の中心原子
に対するアクシャル配位子として２個の可溶化部位を有
するマーカー成分は生物学的マクロ分子に対する非特異
的結合が特に減少していることが判明した。
特に好ましい発蛍光団は、大環状多座の含窒素配位子
よりなる化合物を包含する。それらは前記好ましい特徴
のほとんどを備えるという事実に鑑みると、特に好まし
いクラスの発蛍光団は、ポリフィリン誘導体および１な
いし４個のメソーアザ架橋を有する（すなわち、少なく
とも１個の架橋炭素原子が窒素原子で置き換えられてい
る）アザポリフィリン誘導体よりなる。アザポルフィリ
ン誘導体はモノ−、ジ−およびトリアザポルフィリンお
よびポルフィリラジンの誘導体を包含する。これらの大
環は、所望により、縮合芳香族環を包含してもよく、か
くして、該アザポリフィリン誘導体は、例えば、フタロ
シアニン、ベンゾトリアザポルフィリンおよびナフトシ
アニン誘導体を包含し得る。これらの染料の調製および
蛍光特性は公知であり（例えば、文献11、12、15参
照）、これらの化合物の多くは商業的に入手可能であ
る。
よりなる化合物を包含する。それらは前記好ましい特徴
のほとんどを備えるという事実に鑑みると、特に好まし
いクラスの発蛍光団は、ポリフィリン誘導体および１な
いし４個のメソーアザ架橋を有する（すなわち、少なく
とも１個の架橋炭素原子が窒素原子で置き換えられてい
る）アザポリフィリン誘導体よりなる。アザポルフィリ
ン誘導体はモノ−、ジ−およびトリアザポルフィリンお
よびポルフィリラジンの誘導体を包含する。これらの大
環は、所望により、縮合芳香族環を包含してもよく、か
くして、該アザポリフィリン誘導体は、例えば、フタロ
シアニン、ベンゾトリアザポルフィリンおよびナフトシ
アニン誘導体を包含し得る。これらの染料の調製および
蛍光特性は公知であり（例えば、文献11、12、15参
照）、これらの化合物の多くは商業的に入手可能であ
る。
好ましいポルフィリンおよびアザポリフィリン誘導体
は以下のものおよびその誘導体を包含する：ヘマトポル
フィリン、デューテロポルフィリン、テトラ−４−カル
ボキシフェニルポルフィリン、ヒドロキシアルミニウム
・テトラカルボキシフタロシアニン、ヒドロキシアルミ
ニウム・アミノフタロシアニン、ヒドロキシアルミニウ
ム・テトラアミノフタロシアニン、テトラベンゾトリア
ザポルフィリン、テトラベンゾジアザポルフィリン、テ
トラベンゾモノアザポルフィリン、1,2−ナフタロシア
ニン、2,3−ナフタロシアニン、トリベンゾテトラアザ
ポルフィリン、クロロアルミニウム・オクタクロロフタ
ロシアニン、ジヒドロキシケイ素・フタロシアニン、ジ
ヒドロキシベルマニウム・フタロシアニン等。
は以下のものおよびその誘導体を包含する：ヘマトポル
フィリン、デューテロポルフィリン、テトラ−４−カル
ボキシフェニルポルフィリン、ヒドロキシアルミニウム
・テトラカルボキシフタロシアニン、ヒドロキシアルミ
ニウム・アミノフタロシアニン、ヒドロキシアルミニウ
ム・テトラアミノフタロシアニン、テトラベンゾトリア
ザポルフィリン、テトラベンゾジアザポルフィリン、テ
トラベンゾモノアザポルフィリン、1,2−ナフタロシア
ニン、2,3−ナフタロシアニン、トリベンゾテトラアザ
ポルフィリン、クロロアルミニウム・オクタクロロフタ
ロシアニン、ジヒドロキシケイ素・フタロシアニン、ジ
ヒドロキシベルマニウム・フタロシアニン等。
蛍光偏光アッセイのごときある種の適用では、高度の
偏光を呈するアザポルフィリン誘導体、すなわち、強く
偏光を発するものが好ましい。これらの適用では、低度
の対称性を有する、好ましくはD4hよりも低い対称性を
有する大環が好ましい。１の好ましい基は少なくとも１
個の縮合芳香族環を有する大環を包含する。かくして、
好ましい大環は、結果として対称性が減少する位置に縮
合芳香族環を有するアザポルフィリン誘導体および2,3
−ジシアノフタロシアニンのごとき非対称的に置換され
たアザポルフィリン誘導体を包含する。好ましいクラス
のアザポルフィリン誘導体は、好ましくはD4h対称性よ
りも低い対称性を有するモノアザポルフィリン、ジアザ
ポルフィリンおよびトリアザポルフィリン誘導体を包含
する。
偏光を呈するアザポルフィリン誘導体、すなわち、強く
偏光を発するものが好ましい。これらの適用では、低度
の対称性を有する、好ましくはD4hよりも低い対称性を
有する大環が好ましい。１の好ましい基は少なくとも１
個の縮合芳香族環を有する大環を包含する。かくして、
好ましい大環は、結果として対称性が減少する位置に縮
合芳香族環を有するアザポルフィリン誘導体および2,3
−ジシアノフタロシアニンのごとき非対称的に置換され
たアザポルフィリン誘導体を包含する。好ましいクラス
のアザポルフィリン誘導体は、好ましくはD4h対称性よ
りも低い対称性を有するモノアザポルフィリン、ジアザ
ポルフィリンおよびトリアザポルフィリン誘導体を包含
する。
B.好ましい可溶化ポルオキシヒドロカルビル部位 好ましい可溶化ポリオキシヒドロカルビル部位はグル
コース、スクロース、マルトトリオース等のごとき水溶
性炭水化物；グルコン酸およびマンニトール、およびオ
ルゴサッカライドのごとき水溶性炭水化物誘導体；ポリ
リシンのごときポリペプチドおよび天然に存在する蛋白
質；ポリビニルピロリドン、ポリ（ビニルアルコー
ル）、ポリ（エチレンイミン）、ポリアクリル酸、ポリ
アクリルアミドのごとき水溶性ポリマー、Pluronic
TM（プロピレンオキシドコポリマー、BASFから入手可
能）およびTetronicTM（BASF）ポリオール界面活性剤の
ごときエチレンオキシドコポリマー、特に、ポリ（エチ
レングリコール）を含めた他のポリオキシアルキレンの
ごときポリエーテル、あるいは他の水溶性混合オキシア
ルキレンポリマー等を包含する。
コース、スクロース、マルトトリオース等のごとき水溶
性炭水化物；グルコン酸およびマンニトール、およびオ
ルゴサッカライドのごとき水溶性炭水化物誘導体；ポリ
リシンのごときポリペプチドおよび天然に存在する蛋白
質；ポリビニルピロリドン、ポリ（ビニルアルコー
ル）、ポリ（エチレンイミン）、ポリアクリル酸、ポリ
アクリルアミドのごとき水溶性ポリマー、Pluronic
TM（プロピレンオキシドコポリマー、BASFから入手可
能）およびTetronicTM（BASF）ポリオール界面活性剤の
ごときエチレンオキシドコポリマー、特に、ポリ（エチ
レングリコール）を含めた他のポリオキシアルキレンの
ごときポリエーテル、あるいは他の水溶性混合オキシア
ルキレンポリマー等を包含する。
特に好ましいクラスの可溶化ポリオキシヒドロカルビ
ル部位は、ポリ（エチレングリコール）（PEG）、なら
びにポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテルの
ごときポリ（エチレングリコール）メチルエーテルを含
めたポリ（エチレングリコール）誘導体よりなる。他の
適当なPEG誘導体は、所望により、ウレイドリンカーを
有していてもよいPEG−ケイ素由来エーテルを包含する
（実施例４および６参照）。これらのポリマーの多くは
多様な分子量にて商業的に入手可能であり；他は、便宜
には、官能化シロキサン部位へのアミノPEGのカップリ
ングによるごとく、商業的に入手可能な物質から調製で
きる（実施例５参照）。別法として、大環状配位子の中
心原子に連結したＮ−（カルボキシイミダゾ）アミノ−
プロピルジメチルシリルエーテルにアミノ−末端PEGを
カップリングさせることもできる。
ル部位は、ポリ（エチレングリコール）（PEG）、なら
びにポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテルの
ごときポリ（エチレングリコール）メチルエーテルを含
めたポリ（エチレングリコール）誘導体よりなる。他の
適当なPEG誘導体は、所望により、ウレイドリンカーを
有していてもよいPEG−ケイ素由来エーテルを包含する
（実施例４および６参照）。これらのポリマーの多くは
多様な分子量にて商業的に入手可能であり；他は、便宜
には、官能化シロキサン部位へのアミノPEGのカップリ
ングによるごとく、商業的に入手可能な物質から調製で
きる（実施例５参照）。別法として、大環状配位子の中
心原子に連結したＮ−（カルボキシイミダゾ）アミノ−
プロピルジメチルシリルエーテルにアミノ−末端PEGを
カップリングさせることもできる。
発蛍光団に連結させると、これらの可溶化ポリオキシ
ヒドロカルビル部位は、測定蛍光減衰時間の改善、およ
び蛍光強度の改善と共に、水性溶液中における溶解度の
特に有利な性質を与える。さらに、得られたマーカー成
分は水溶性であり、非特異的結合の減少、特に、分子の
水への溶解度を増大させるためにスルホネートのごとき
基で官能化したある種の発蛍光団、特にポルフィリンま
たはフタロシアニン染料で従前問題となっていた血清ア
ルブミンへの結合の減少を示す。発蛍光団またはマーカ
ー成分の非特異的結合は、結果として、イムノアッセイ
に正確性を付与する。PEGに連結した発蛍光団よりなる
これらのマーカー成分もまた水性溶液中における蛍光強
度の改善を示す。
ヒドロカルビル部位は、測定蛍光減衰時間の改善、およ
び蛍光強度の改善と共に、水性溶液中における溶解度の
特に有利な性質を与える。さらに、得られたマーカー成
分は水溶性であり、非特異的結合の減少、特に、分子の
水への溶解度を増大させるためにスルホネートのごとき
基で官能化したある種の発蛍光団、特にポルフィリンま
たはフタロシアニン染料で従前問題となっていた血清ア
ルブミンへの結合の減少を示す。発蛍光団またはマーカ
ー成分の非特異的結合は、結果として、イムノアッセイ
に正確性を付与する。PEGに連結した発蛍光団よりなる
これらのマーカー成分もまた水性溶液中における蛍光強
度の改善を示す。
適当なPEGは約200ないし約2000またはそれ以上の分子
量で変化させ得る。特定の分子量の選択は、選択した特
定の発蛍光団およびその分子量および疎水性の程度、な
らびにマーカー成分を使用すべき特定の適用に依存して
行う。
量で変化させ得る。特定の分子量の選択は、選択した特
定の発蛍光団およびその分子量および疎水性の程度、な
らびにマーカー成分を使用すべき特定の適用に依存して
行う。
II.マーカー成分の調製 A.大環状発蛍光団に連結した可溶化ポリオキシヒドロカ
ルビルを有するマーカー成分の調製 大環状発蛍光団に連結した可溶化ポリオキシヒドロカ
ルビル部位を少なくとも１個有するマーカー成分の調製
を実施例１に記載する。
ルビルを有するマーカー成分の調製 大環状発蛍光団に連結した可溶化ポリオキシヒドロカ
ルビル部位を少なくとも１個有するマーカー成分の調製
を実施例１に記載する。
B.発蛍光団としてのポリフィリンおよびアザポルフィリ
ン誘導体ならびにアクシャル配位子としての付着した可
溶化部位を有するマーカー成分の調製 中心原子にキレート結合する大環状配位子として働く
ポルフィリンおよびアザポルフィリン（「Mcl」）誘導
体の調製を以下に記載する。中心原子は大環状配位子お
よび少なくとも１個のさらなる配位子を共に含有する配
位錯体を形成できる。金属原子に配位した基（または配
位子）の交換を含めた反応は通常配位子交換反応と呼ば
れる。この意味において、配位子は、大環状錯体の中心
原子に付着した基と定義される。この中心原子はアルミ
ニウムのごとき金属、あるいはケイ素のごとき高共有結
合特性を有する結合を形成できる原子であり得る。かく
して、配位子交換反応においては、中心原子は非金属、
炭素でさえあり得る。「配位子交換反応」についての一
般的経路は以下の通りである： Mcl−CA−配位子＋配位子２＝Mcl−CA−配位子２＋配位子１ ここに、Mclは大環状配位子を表し、CAは中心原子を表
す。
ン誘導体ならびにアクシャル配位子としての付着した可
溶化部位を有するマーカー成分の調製 中心原子にキレート結合する大環状配位子として働く
ポルフィリンおよびアザポルフィリン（「Mcl」）誘導
体の調製を以下に記載する。中心原子は大環状配位子お
よび少なくとも１個のさらなる配位子を共に含有する配
位錯体を形成できる。金属原子に配位した基（または配
位子）の交換を含めた反応は通常配位子交換反応と呼ば
れる。この意味において、配位子は、大環状錯体の中心
原子に付着した基と定義される。この中心原子はアルミ
ニウムのごとき金属、あるいはケイ素のごとき高共有結
合特性を有する結合を形成できる原子であり得る。かく
して、配位子交換反応においては、中心原子は非金属、
炭素でさえあり得る。「配位子交換反応」についての一
般的経路は以下の通りである： Mcl−CA−配位子＋配位子２＝Mcl−CA−配位子２＋配位子１ ここに、Mclは大環状配位子を表し、CAは中心原子を表
す。
この配位子−交換タイプの反応は広範囲に研究されて
きた（例えば、文献13、15参照）。
きた（例えば、文献13、15参照）。
本発明者らは、かかる反応は、有利には、アクシャル
配位子としての１または２の可溶化ポリオキシヒドロカ
ルビル部位の取り込みを可能とすることを見い出した。
配位子としての１または２の可溶化ポリオキシヒドロカ
ルビル部位の取り込みを可能とすることを見い出した。
III.利用性 本発明のマーカー成分は蛍光イムノアッセイのごとき
用途での蛍光プローブ用の蛍光標識として有用である。
また、これらのマーカー成分は、分離アッセイ用の標識
およびイムノアッセイにおけるリン光標識としても有用
である。これらのマーカープローブはin vivo画像形成
およびin vivo腫瘍治療用の標識としても有用である。
用途での蛍光プローブ用の蛍光標識として有用である。
また、これらのマーカー成分は、分離アッセイ用の標識
およびイムノアッセイにおけるリン光標識としても有用
である。これらのマーカープローブはin vivo画像形成
およびin vivo腫瘍治療用の標識としても有用である。
これらのマーカー成分は、有利には、蛍光偏光イムノ
アッセイを含めた通常の蛍光イムノアッセイにおける蛍
光標識として用いことができる。そのように使用する場
合、これらのマーカー成分は特異的結合対の１のメンバ
ー（「標識化結合パートナー」）またはかかるメンバー
のアナログに連結し得る。マーカー成分はそれに直接付
着または結合し、あるいはリンカーアームを介して付着
または結合し得る。
アッセイを含めた通常の蛍光イムノアッセイにおける蛍
光標識として用いことができる。そのように使用する場
合、これらのマーカー成分は特異的結合対の１のメンバ
ー（「標識化結合パートナー」）またはかかるメンバー
のアナログに連結し得る。マーカー成分はそれに直接付
着または結合し、あるいはリンカーアームを介して付着
または結合し得る。
これらの標識化結合パートナーは、分析対象または分
析対象結合パートナーにつき競合が関与するアッセイの
ごとき種々の様式を有するアッセイで有用であり、ホモ
ジーナスまたはヘテロジーナスアッセイいずれでも用い
ることができる。
析対象結合パートナーにつき競合が関与するアッセイの
ごとき種々の様式を有するアッセイで有用であり、ホモ
ジーナスまたはヘテロジーナスアッセイいずれでも用い
ることができる。
水性溶液における凝集からの有利な解放ならびに血清
成分および他の生物学的マクロ子への非特異的結合の欠
如と組み合わせた（検出可能な凝集を示さない）溶媒感
受性の欠如を考慮すると、これらのマーカーは特に血清
のごとき生物学的流動体を含む試料中の分析対象を検出
するアッセイで用いるのに特に適する。かくして、これ
らのマーカー成分は、血清成分による非特異的結合が、
その正確性および精密性双方に影響するところのアッセ
イの感度を厳格に解決する、溶液中における分析対象を
検出する蛍光プローブについての標識として使用でき
る。
成分および他の生物学的マクロ子への非特異的結合の欠
如と組み合わせた（検出可能な凝集を示さない）溶媒感
受性の欠如を考慮すると、これらのマーカーは特に血清
のごとき生物学的流動体を含む試料中の分析対象を検出
するアッセイで用いるのに特に適する。かくして、これ
らのマーカー成分は、血清成分による非特異的結合が、
その正確性および精密性双方に影響するところのアッセ
イの感度を厳格に解決する、溶液中における分析対象を
検出する蛍光プローブについての標識として使用でき
る。
別法として、これらのマーカー成分はin vivo画像形
成についての薬剤として用いることもできる。画像形成
剤として用いる場合、これらのマーカー成分を特異的結
合対の１のメンバーに結合させて標識化結合パートナー
を得る。該標識化パートナーは動物に導入される。特異
的結合対の他のメンバーが存在すると、標識化結合パー
トナーはそれに結合し、マーカー成分によって生じる信
号を測定することができ、その位置は同定できる。
成についての薬剤として用いることもできる。画像形成
剤として用いる場合、これらのマーカー成分を特異的結
合対の１のメンバーに結合させて標識化結合パートナー
を得る。該標識化パートナーは動物に導入される。特異
的結合対の他のメンバーが存在すると、標識化結合パー
トナーはそれに結合し、マーカー成分によって生じる信
号を測定することができ、その位置は同定できる。
また、これらのマーカー成分はin vivo腫瘍治療で用
いることもできる。例えば、光力学治療は光増感剤とし
てのマーカー成分の使用を含む。マーカー成分（蛍光標
識）は、腫瘍細胞の成分を特異的に認識しそれに結合し
得る結合パートナーに連結する。光による励起後におけ
る結合したマーカー成分複合体からの局在蛍光発光は腫
瘍細胞に対して選択的な障害および／または破壊を引き
起こす。
いることもできる。例えば、光力学治療は光増感剤とし
てのマーカー成分の使用を含む。マーカー成分（蛍光標
識）は、腫瘍細胞の成分を特異的に認識しそれに結合し
得る結合パートナーに連結する。光による励起後におけ
る結合したマーカー成分複合体からの局在蛍光発光は腫
瘍細胞に対して選択的な障害および／または破壊を引き
起こす。
本発明を理解するのを助力するにおいて、一連の実験
の結果を記載する以下の実施例が含まれる。本発明に関
する以下の実施例は、勿論、本発明を制限するものと解
釈されるべきではなく、当業者の範囲内にあるであろ
う、公知でないあるいは後で展開される本発明のかかる
変形は、本明細書中で記載し後に特許請求するごとく、
本発明の範囲内にあるものと考えられる。
の結果を記載する以下の実施例が含まれる。本発明に関
する以下の実施例は、勿論、本発明を制限するものと解
釈されるべきではなく、当業者の範囲内にあるであろ
う、公知でないあるいは後で展開される本発明のかかる
変形は、本明細書中で記載し後に特許請求するごとく、
本発明の範囲内にあるものと考えられる。
実施例 実施例１ ポルフィリン誘導体マーカー成分の調製 デューテロポルフィリンIXはポルフィリン・プロダク
ツ（Porphyrin Products）（ローガン、ユタ州）から購
入した。ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリンIX、
N,Nジメチルホルムアミド（DMF）、ジシクロヘキシルカ
ルビジイミド（DCC）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール（HOBT）、および４−ジメチルアミノピリジン（DM
AP）は、アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Aldric
h Chemical Co.）（ミルウォーキー、ウィスコンシン
州）から購入した。フタロシアニン誘導体の合成に使用
したすべての化学薬品は、テトラベンゾトリアザポルフ
ィン誘導体を含めて、アルドリッチ（Aldrich）から購
入した。アミン末端ポリエチレングリコール（PEG−N
H2）およびフタロシアニン誘導体は、公表されている手
順（参考文献18）に従って合成した。
ツ（Porphyrin Products）（ローガン、ユタ州）から購
入した。ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリンIX、
N,Nジメチルホルムアミド（DMF）、ジシクロヘキシルカ
ルビジイミド（DCC）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール（HOBT）、および４−ジメチルアミノピリジン（DM
AP）は、アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Aldric
h Chemical Co.）（ミルウォーキー、ウィスコンシン
州）から購入した。フタロシアニン誘導体の合成に使用
したすべての化学薬品は、テトラベンゾトリアザポルフ
ィン誘導体を含めて、アルドリッチ（Aldrich）から購
入した。アミン末端ポリエチレングリコール（PEG−N
H2）およびフタロシアニン誘導体は、公表されている手
順（参考文献18）に従って合成した。
A.HOBT（0.02mmol）、PEG−NH2（0.02mmol、MW＝2000）
の入ったフラスコに、ヘマトポルフィリン（0.01mmol）
を入れた。DMF（0.4ml）を添加し、得られた溶液を、DC
C（0.025mmol）を一度に添加しながら、15℃で撹拌し
た。撹拌は15℃で12時間続けた。このとき、溶媒を減圧
下で除去した。水に自由に溶ける粗生成物は、クロマト
グラフィー、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーに
よって精製した。ヘマトポルフィリンビス−ポリエチレ
ングリコールアミドの収率は80〜100％であった。
の入ったフラスコに、ヘマトポルフィリン（0.01mmol）
を入れた。DMF（0.4ml）を添加し、得られた溶液を、DC
C（0.025mmol）を一度に添加しながら、15℃で撹拌し
た。撹拌は15℃で12時間続けた。このとき、溶媒を減圧
下で除去した。水に自由に溶ける粗生成物は、クロマト
グラフィー、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーに
よって精製した。ヘマトポルフィリンビス−ポリエチレ
ングリコールアミドの収率は80〜100％であった。
B.DMF（0.4ml）の入ったフラスコに、デューテロポルフ
ィリン（0.01mmol）を入れた。カルボニルジイミダゾー
ル0.02mmolを一度に添加しながら、この混合物を25℃で
撹拌した。25℃で２時間撹拌した後、マンニトール（0.
2mmol）を添加し、この混合物を90℃で４時間撹拌し
た。反応混合物を室温に冷却した。次いで、溶媒を減圧
下で除去し、水溶性である粗生成物をクロマトグラフィ
ーによって精製した。デューテロポルフィリンエステル
の収率は40〜80％であった。
ィリン（0.01mmol）を入れた。カルボニルジイミダゾー
ル0.02mmolを一度に添加しながら、この混合物を25℃で
撹拌した。25℃で２時間撹拌した後、マンニトール（0.
2mmol）を添加し、この混合物を90℃で４時間撹拌し
た。反応混合物を室温に冷却した。次いで、溶媒を減圧
下で除去し、水溶性である粗生成物をクロマトグラフィ
ーによって精製した。デューテロポルフィリンエステル
の収率は40〜80％であった。
C.ヒドロキシアルミニウム−テトラアミノフタロシアニ
ン（0.01mmol）を、無水コハク酸（0.08mmol）と共に、
フラスコに入れた。ピリジン（0.1ml）およびDMF（0.5m
l）を添加し、この混合物を蒸気浴上で20分間加熱し
た。室温に冷却した後、反応混合物を50％HClで酸性に
し、イソプロピルアルコール（8ml）で希釈し、沈殿物
を集め、イソプロピルアルコールで洗浄し、乾燥させ
た。ヒドロキシアルミニウム−テトラコハク酸アミドフ
タロシアニンの収率は90％であった。ポリエチレングリ
コールモノメチルエーテル（0.01mmol、MW＝750）、DCC
（0.1mmol）、DMAP（0.04mmol）、およびDMF（1.0ml）
の入ったフラスコに、ヒドロキシアルミニウム−テトラ
コハク酸アミドフタロシアニン（0.01mmol）を入れた。
この混合物を20℃で20時間撹拌した。このとき、溶媒を
減圧下で除去し、水溶性の生成物をクロマトグラフィー
によって精製した。対応するテトラ−エステルの収率は
70〜90％であった。
ン（0.01mmol）を、無水コハク酸（0.08mmol）と共に、
フラスコに入れた。ピリジン（0.1ml）およびDMF（0.5m
l）を添加し、この混合物を蒸気浴上で20分間加熱し
た。室温に冷却した後、反応混合物を50％HClで酸性に
し、イソプロピルアルコール（8ml）で希釈し、沈殿物
を集め、イソプロピルアルコールで洗浄し、乾燥させ
た。ヒドロキシアルミニウム−テトラコハク酸アミドフ
タロシアニンの収率は90％であった。ポリエチレングリ
コールモノメチルエーテル（0.01mmol、MW＝750）、DCC
（0.1mmol）、DMAP（0.04mmol）、およびDMF（1.0ml）
の入ったフラスコに、ヒドロキシアルミニウム−テトラ
コハク酸アミドフタロシアニン（0.01mmol）を入れた。
この混合物を20℃で20時間撹拌した。このとき、溶媒を
減圧下で除去し、水溶性の生成物をクロマトグラフィー
によって精製した。対応するテトラ−エステルの収率は
70〜90％であった。
D.乾燥DMF（2ml）中にヘマトポルフィリンIX（2mg）お
よびカルボニルジイミダゾール（2mg）を含む溶液を40
℃で0.5時間撹拌した。このとき、ポリエチレングリコ
ール（M.W.4000、200mg）を添加し、この溶液をさらに
４時間かけて100℃に加熱する。非常に水溶性の生成物
はヘマトポルフィリンIXジ（ポリエチレングリコール）
エステルであり、好ましい溶液特性および溶液蛍光特性
を示した。
よびカルボニルジイミダゾール（2mg）を含む溶液を40
℃で0.5時間撹拌した。このとき、ポリエチレングリコ
ール（M.W.4000、200mg）を添加し、この溶液をさらに
４時間かけて100℃に加熱する。非常に水溶性の生成物
はヘマトポルフィリンIXジ（ポリエチレングリコール）
エステルであり、好ましい溶液特性および溶液蛍光特性
を示した。
実施例２ 血清アルブミンへの非特異的な結合が偏光に及ぼす影響 測定可能な偏光は、血清アルブミンなどの非常に大き
な分子に色素を結合させるか、あるいは粘稠な溶媒を使
用することによって、誘起することができる。
な分子に色素を結合させるか、あるいは粘稠な溶媒を使
用することによって、誘起することができる。
様々なポルフィリン誘導体について、記載量のヒト血
清アルブミン（HSA）溶液の存在下で、HSAの非存在下
（緩衝液だけの中）で、あるいはグリセリン中で、偏光
率を測定した。ポルフィリン誘導体のいくつかは、記載
されている場合には、可溶化ポリオキシヒドロカルビル
部分に共有結合させた。
清アルブミン（HSA）溶液の存在下で、HSAの非存在下
（緩衝液だけの中）で、あるいはグリセリン中で、偏光
率を測定した。ポルフィリン誘導体のいくつかは、記載
されている場合には、可溶化ポリオキシヒドロカルビル
部分に共有結合させた。
ポルフィリン誘導体がHSAに非特異的に結合すると、
偏光率が食塩加リン酸アジド緩衝液（「SAP」）だけの
中のポルフィリンを越えて増大する。SAP中における偏
光は期待されない。
偏光率が食塩加リン酸アジド緩衝液（「SAP」）だけの
中のポルフィリンを越えて増大する。SAP中における偏
光は期待されない。
各試料は、濃度が約１×10-4モル／リットルの溶液で
あった。励起は、３台の様々な窒素ポンプレーザ（10〜
50マイクロジュール／パルス）を備え、350nmから820nm
まで（約625nmに設定）、パルス幅は600psから5nsまで
連続的に調節可能なレーザ源を用いて行った。蛍光強度
は時間の関数として測定した。垂直成分および平行成分
の偏光は別々に記録した。ポルフィリン誘導体は一般に
中程度の偏光を示すので、これらのポルフィリン誘導体
について、偏光は０（非偏光）から約0.2（完全偏光）
まで変化しうる商として表した。観察可能な偏光を生ず
るのに至適な条件下で至適な偏光を示す溶液中における
分子の偏光商は0.5であろう。
あった。励起は、３台の様々な窒素ポンプレーザ（10〜
50マイクロジュール／パルス）を備え、350nmから820nm
まで（約625nmに設定）、パルス幅は600psから5nsまで
連続的に調節可能なレーザ源を用いて行った。蛍光強度
は時間の関数として測定した。垂直成分および平行成分
の偏光は別々に記録した。ポルフィリン誘導体は一般に
中程度の偏光を示すので、これらのポルフィリン誘導体
について、偏光は０（非偏光）から約0.2（完全偏光）
まで変化しうる商として表した。観察可能な偏光を生ず
るのに至適な条件下で至適な偏光を示す溶液中における
分子の偏光商は0.5であろう。
ヘマトポルフィリンIX（「HP」）およびプロトポルフ
ィリンIX（「PP」）はアルドリッチ（Aldrich）から得
た。デューテロポルフィリンIXジスルホン酸ナトリウム
塩「（DP−（SO3）２」）はポルフィリン・プロダクツ
（Porphyrin Products）（ローガン、ユタ州）から得
た。
ィリンIX（「PP」）はアルドリッチ（Aldrich）から得
た。デューテロポルフィリンIXジスルホン酸ナトリウム
塩「（DP−（SO3）２」）はポルフィリン・プロダクツ
（Porphyrin Products）（ローガン、ユタ州）から得
た。
ポリフィリン誘導体と、スクロース、マンニトール、
マルトトリオースとのジエステル、またはポリエチレン
グリコールモノメチルエーテル（「PEG」★／）とのジ
エステルは、実施例１に記載の方法に従って調製した。
使用したHSA溶液は５重量％HSAの原料水溶液であった。
DMFはN,N−ジメチルホルムアミドである。
マルトトリオースとのジエステル、またはポリエチレン
グリコールモノメチルエーテル（「PEG」★／）とのジ
エステルは、実施例１に記載の方法に従って調製した。
使用したHSA溶液は５重量％HSAの原料水溶液であった。
DMFはN,N−ジメチルホルムアミドである。
結果を表Ｉにまとめて示す。
★/PEGに続く数字は大体の分子量を示す。
実施例３ フタロシアニン誘導体マーカー成分の調製 クロロアルミニウムフタロシアニン（アルドリッチ・
ケミカル・カンパニー（Aldrich Chemical Co.））およ
びジクロロケイ素フタロシアニン（アルドリッチ・ケミ
カル・カンパニー（Aldrich Chemical Co.））は、常法
（参考文献12）に従って、それぞれ対応するヒドロキシ
化合物：ヒドロキシアルミニウムフタロシアニンおよび
ジヒドロキシシリコンフタロシアニンに加水分解され
た。
ケミカル・カンパニー（Aldrich Chemical Co.））およ
びジクロロケイ素フタロシアニン（アルドリッチ・ケミ
カル・カンパニー（Aldrich Chemical Co.））は、常法
（参考文献12）に従って、それぞれ対応するヒドロキシ
化合物：ヒドロキシアルミニウムフタロシアニンおよび
ジヒドロキシシリコンフタロシアニンに加水分解され
た。
A.ビス−ポリエチレングリコールケイ素フタロシアニン
の調製 フラスコに、ジヒドロキシシリコンフタロシアニン
（0.02mmol）、ポリエチレングリコールモノメチルエー
テル（分子量2000ダルトン、0.02mmol）およびラウリル
酸（0.02mmol）を入れた。この混合物を徐々に220℃に
加熱した。反応混合物をその温度で１時間維持した。
の調製 フラスコに、ジヒドロキシシリコンフタロシアニン
（0.02mmol）、ポリエチレングリコールモノメチルエー
テル（分子量2000ダルトン、0.02mmol）およびラウリル
酸（0.02mmol）を入れた。この混合物を徐々に220℃に
加熱した。反応混合物をその温度で１時間維持した。
暗青色の反応混合物を室温に冷却し、次いでサイズ排
除クロマトグラフィーカラムに直接かけた。非常に水溶
性のビス−ポリエチレングリコールケイ素フタロシアニ
ンを約90％の収率で得た。
除クロマトグラフィーカラムに直接かけた。非常に水溶
性のビス−ポリエチレングリコールケイ素フタロシアニ
ンを約90％の収率で得た。
この生成物は、水中または生物学的もしくは生理学的
緩衝液中で至適な蛍光を示した。その生物学的リン酸緩
衝液中での蛍光偏光および蛍光強度は、ヒト血清（３％
v/v）の存在によって影響を受けなかった。この生成物
の血清成分への非特異的な結合は検出されなかった。
緩衝液中で至適な蛍光を示した。その生物学的リン酸緩
衝液中での蛍光偏光および蛍光強度は、ヒト血清（３％
v/v）の存在によって影響を受けなかった。この生成物
の血清成分への非特異的な結合は検出されなかった。
B.ポリエチレングリコールアルミニウムフタロシアニン
の調製 フラスコに、ヒドロキシアルミニウムフタロシアニン
（0.02mmol）、ポリエチレングリコール（分子量2000ダ
ルトン、0.4mmol）およびラウリル酸（0.02mmol）を入
れた。この混合物を１時間かけて約250〜280℃に加熱し
た。冷却後、反応混合物をクロマトグラフィーカラムに
かけた。ポリエチレングリコールアルミニウムフタロシ
アニンの収率は約70％であった。
の調製 フラスコに、ヒドロキシアルミニウムフタロシアニン
（0.02mmol）、ポリエチレングリコール（分子量2000ダ
ルトン、0.4mmol）およびラウリル酸（0.02mmol）を入
れた。この混合物を１時間かけて約250〜280℃に加熱し
た。冷却後、反応混合物をクロマトグラフィーカラムに
かけた。ポリエチレングリコールアルミニウムフタロシ
アニンの収率は約70％であった。
この生成物は、非常に水溶性であったが、その可視光
吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルから明示されるよ
うに、若干の凝集性を示した。この物質（濃度１×10-6
M、励起波長690nm）の水中または生物学的緩衝液中にお
ける蛍光強度は、ヒト血清（３％v/v）の添加によっ
て、その本来の値の150％以上に増大した。さらに、検
出可能な蛍光の偏光は、ヒト血清を試料へ添加するによ
って生じた。これらの結果は、この生成物がヒト血清中
に存在する巨大分子に対して何らかの非特異的な結合を
行っていることを示した。
吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルから明示されるよ
うに、若干の凝集性を示した。この物質（濃度１×10-6
M、励起波長690nm）の水中または生物学的緩衝液中にお
ける蛍光強度は、ヒト血清（３％v/v）の添加によっ
て、その本来の値の150％以上に増大した。さらに、検
出可能な蛍光の偏光は、ヒト血清を試料へ添加するによ
って生じた。これらの結果は、この生成物がヒト血清中
に存在する巨大分子に対して何らかの非特異的な結合を
行っていることを示した。
実施例４ 水溶性ビス−ポリエチレングリコールケイ素フタロシア
ニンの調製 クロロプロピルジメチルクロロシランは、ペトラッチ
・システムズ（Petrarch Systems）から購入した。
ニンの調製 クロロプロピルジメチルクロロシランは、ペトラッチ
・システムズ（Petrarch Systems）から購入した。
ジヒドロキシケイ素フタロシアニン（0.16mmol）、イ
ミダゾール（0.7mmol）、および乾燥DMF（1ml）をフラ
スコに入れ、空気中の水分を排除するように注意しつ
つ、クロロプロピルジメチルクロロシラン（0.7mmol）
を滴下して添加しながら、20℃で撹拌した。20℃で20時
間撹拌し続けた。
ミダゾール（0.7mmol）、および乾燥DMF（1ml）をフラ
スコに入れ、空気中の水分を排除するように注意しつ
つ、クロロプロピルジメチルクロロシラン（0.7mmol）
を滴下して添加しながら、20℃で撹拌した。20℃で20時
間撹拌し続けた。
このとき、減圧下で溶媒を除去し、生成物をシリカゲ
ルクロマトグラフィーカラムにかけた。CH2Cl2−ヘキサ
ン（1:1）で溶出すると、単一の主要な着色画分、SiPc
［OSi（CH3）2CH2CH2CH2Cl］２（化合物Ｉ）が得られ
た。
ルクロマトグラフィーカラムにかけた。CH2Cl2−ヘキサ
ン（1:1）で溶出すると、単一の主要な着色画分、SiPc
［OSi（CH3）2CH2CH2CH2Cl］２（化合物Ｉ）が得られ
た。
化合物ＩのNMRスペクトルはゼネラル・エレクトリッ
ク（General Electric）のQE−300分光計で記録した。N
MR（CDCl3）：δ9.65（ｍ、芳香族、4H）、δ8.45
（ｍ、芳香族、4H）、δ2.1（ｔ、CH2−Cl、2H）、δ0.
85（ｍ、CH2、2H）、δ2.09（ｍ、CH2−Si、2H）、δ2.
85（ｓ、CH3、6H）。
ク（General Electric）のQE−300分光計で記録した。N
MR（CDCl3）：δ9.65（ｍ、芳香族、4H）、δ8.45
（ｍ、芳香族、4H）、δ2.1（ｔ、CH2−Cl、2H）、δ0.
85（ｍ、CH2、2H）、δ2.09（ｍ、CH2−Si、2H）、δ2.
85（ｓ、CH3、6H）。
A.アミン末端ポリエチレングリコール、MW2000（0.2mmo
l）、ヨウ化ナトリウム（0.01mmol）およびDMF（1ml）
の入ったフラスコに、化合物Ｉ（0.01mmol）を入れ、こ
の混合物を90℃で15時間加熱撹拌した。減圧下で溶媒を
除去すると、粘稠な青い液体が得られ、この液体をクロ
マトグラフィーで精製した。この生成物、SiPc［OSi（C
H3）2CH2CH2CH2NH−PEG］２は非常に水溶性であり、水
溶液中で強い蛍光を示した。生物学的緩衝液中における
溶液状態のこの物質の蛍光は、ヒト血清アルブミン（３
容量％）の添加によって影響を受けなかった。
l）、ヨウ化ナトリウム（0.01mmol）およびDMF（1ml）
の入ったフラスコに、化合物Ｉ（0.01mmol）を入れ、こ
の混合物を90℃で15時間加熱撹拌した。減圧下で溶媒を
除去すると、粘稠な青い液体が得られ、この液体をクロ
マトグラフィーで精製した。この生成物、SiPc［OSi（C
H3）2CH2CH2CH2NH−PEG］２は非常に水溶性であり、水
溶液中で強い蛍光を示した。生物学的緩衝液中における
溶液状態のこの物質の蛍光は、ヒト血清アルブミン（３
容量％）の添加によって影響を受けなかった。
B.アミン末端ポリエチレングリコール、MW600（0.2mmo
l）、ヨウ化ナトリウム（0.01mmol）およびDMF（1ml）
の入ったフラスコに、化合物Ｉ（0.01mmol）を入れ、こ
の混合物を90℃で約15時間加熱撹拌する。減圧下で溶媒
を除去すると、粘稠な青い液体が得られ、この液体をク
ロマトグラフィーで精製する。
l）、ヨウ化ナトリウム（0.01mmol）およびDMF（1ml）
の入ったフラスコに、化合物Ｉ（0.01mmol）を入れ、こ
の混合物を90℃で約15時間加熱撹拌する。減圧下で溶媒
を除去すると、粘稠な青い液体が得られ、この液体をク
ロマトグラフィーで精製する。
実施例５ 水溶性ビス−ポリエチレングリコールケイ素フタロシア
ニンの調製 A.フタロシアニナト−ビス−［３−（1H−イミダゾール
−１−イルカルボニル）アミノプロピルジメチルシラノ
ラト］ケイ素（化合物II）の調製 フラスコに、ジヒドロキシケイ素フタロシアニン（10
0mg）、イミダゾール（150mg）、およびDMF（2.0ml）を
入れた。イソシアナトプロピルジメチルクロロシラン
（0.150ml）を１分間かけて添加しながら、フラスコの
内容物を撹拌した。水分を排除するためにフラスコを密
閉し、反応混合物を室温で30時間撹拌した。
ニンの調製 A.フタロシアニナト−ビス−［３−（1H−イミダゾール
−１−イルカルボニル）アミノプロピルジメチルシラノ
ラト］ケイ素（化合物II）の調製 フラスコに、ジヒドロキシケイ素フタロシアニン（10
0mg）、イミダゾール（150mg）、およびDMF（2.0ml）を
入れた。イソシアナトプロピルジメチルクロロシラン
（0.150ml）を１分間かけて添加しながら、フラスコの
内容物を撹拌した。水分を排除するためにフラスコを密
閉し、反応混合物を室温で30時間撹拌した。
フラスコを開放し、その内容物をメタノールで5mlに
希釈した。ロータリーエバポレーターによって高真空下
で溶媒を除去すると、残渣が残り、この残渣をトルエン
および230〜400メッシュのシリカゲル（イー・エム・サ
イエンス（EM Science））を用いて調製したシリカゲル
クロマトグラフィーカラムに移した。トルエン：イソプ
ロパノール（85:15）で溶出すると、深青色の画分が分
離し、この画分を集めた。溶媒を除去すると、結晶性固
体が残った。プロトンNMR（CDCl3）：δ−2.84（ｓ、12
H）、δ−2.10（ｔ、4H）、δ−1.10（ｍ、4H）、δ1.9
（ｍ、4H）、δ7.23（ｍ、4H）、δ8.02（ｓ、2H）、δ
8.30（ｍ、8H）、δ9.62（ｍ、8H）。
希釈した。ロータリーエバポレーターによって高真空下
で溶媒を除去すると、残渣が残り、この残渣をトルエン
および230〜400メッシュのシリカゲル（イー・エム・サ
イエンス（EM Science））を用いて調製したシリカゲル
クロマトグラフィーカラムに移した。トルエン：イソプ
ロパノール（85:15）で溶出すると、深青色の画分が分
離し、この画分を集めた。溶媒を除去すると、結晶性固
体が残った。プロトンNMR（CDCl3）：δ−2.84（ｓ、12
H）、δ−2.10（ｔ、4H）、δ−1.10（ｍ、4H）、δ1.9
（ｍ、4H）、δ7.23（ｍ、4H）、δ8.02（ｓ、2H）、δ
8.30（ｍ、8H）、δ9.62（ｍ、8H）。
B.化合物IIとアミン末端PEG（化合物III）との反応 上記の工程Ａで得られた反応性中間体（10mg）を、ア
ミン末端ポリエチレングリコール（MW−2000、50mg）お
よびメタノール（3ml）と共に、フラスコに入れ、この
混合物を１時間還流した。溶媒を除去すると、青色の油
状物が残り、この油状物を、80％メタノールを溶離液と
するC18固定相を用いたHPLCによって精製した。この物
質の収率は、出発物質のジヒドロキシケイ素フタロシア
ニンに基づいて40〜70％であった。精製物は、メタノー
ルやジメチルホルムアミドなどの有機溶媒中だけでな
く、水溶液中で強い蛍光（675nmで蛍光を励起）を示し
た。この化合物は、その構造が図１の化合物IIIについ
て示すものであると同定された。
ミン末端ポリエチレングリコール（MW−2000、50mg）お
よびメタノール（3ml）と共に、フラスコに入れ、この
混合物を１時間還流した。溶媒を除去すると、青色の油
状物が残り、この油状物を、80％メタノールを溶離液と
するC18固定相を用いたHPLCによって精製した。この物
質の収率は、出発物質のジヒドロキシケイ素フタロシア
ニンに基づいて40〜70％であった。精製物は、メタノー
ルやジメチルホルムアミドなどの有機溶媒中だけでな
く、水溶液中で強い蛍光（675nmで蛍光を励起）を示し
た。この化合物は、その構造が図１の化合物IIIについ
て示すものであると同定された。
実施例６ 蛍光偏光イムノアッセイのプローブとして有用なフタロ
シアニン誘導体の調製 A.ジイミノイソインドリンの調製 還流冷却器およびガス導入管を備えた３ツ口の100ml
丸底フラスコに、フタロニトリル（12.8g）およびメタ
ノール（50ml）を入れ、アンモニアガスを徐々に導入し
ながら、この混合物を撹拌した。反応混合物がアンモニ
ア源に流入するのを防止するために、インライン補集器
を用いた。反応混合物がアンモニアで飽和したと思われ
た後、0.33gの乾燥カリウム第３ブトキシドを撹拌しな
がら添加した。
シアニン誘導体の調製 A.ジイミノイソインドリンの調製 還流冷却器およびガス導入管を備えた３ツ口の100ml
丸底フラスコに、フタロニトリル（12.8g）およびメタ
ノール（50ml）を入れ、アンモニアガスを徐々に導入し
ながら、この混合物を撹拌した。反応混合物がアンモニ
ア源に流入するのを防止するために、インライン補集器
を用いた。反応混合物がアンモニアで飽和したと思われ
た後、0.33gの乾燥カリウム第３ブトキシドを撹拌しな
がら添加した。
撹拌を続け、アンモニアを続けて導入しながら、反応
混合物を３時間加熱還流した。ガス導入口が結晶性生成
物で汚染されないように注意した。還流期間の最後に、
淡緑色の固形物が形成した。この固形物を濾過によって
集め、少量の冷（４℃）メタノールで洗浄した。（この
化合物はメタノールにかなり溶解する）。この物質は、
乾燥させた後、さらに精製することなく、次の工程に用
いた。収量は7g（約50％）であった。
混合物を３時間加熱還流した。ガス導入口が結晶性生成
物で汚染されないように注意した。還流期間の最後に、
淡緑色の固形物が形成した。この固形物を濾過によって
集め、少量の冷（４℃）メタノールで洗浄した。（この
化合物はメタノールにかなり溶解する）。この物質は、
乾燥させた後、さらに精製することなく、次の工程に用
いた。収量は7g（約50％）であった。
B.ジシアノジイミンイソインドリンの調製 還流冷却器およびガス導入管を備えた３ツ口の100ml
丸底フラスコ中のメタノール（10ml）に、1,2,4,5−テ
トラシアノベンゼン（パルツ＆バウアー（Pfaltz ＆ Ba
uer）、0.5g、2.8mmol）を懸濁した。外部から冷却する
ことなく、アンモニアガスを速やかに導入しながら、こ
の混合物を25℃で撹拌した。アンモニアを導入した最初
の２分間に、反応混合物の温度は50℃より高く上昇し、
懸濁した固形物は完全に溶解した。５分以内に、沈殿が
形成し始めた。アンモニアを徐々に導入しながら、40〜
50℃で１時間撹拌し続けた。沈殿した固形物を濾過によ
って集め、メタノールで洗浄し、乾燥させた。この生成
物はメタノールへの溶解度が非常に低かった。
丸底フラスコ中のメタノール（10ml）に、1,2,4,5−テ
トラシアノベンゼン（パルツ＆バウアー（Pfaltz ＆ Ba
uer）、0.5g、2.8mmol）を懸濁した。外部から冷却する
ことなく、アンモニアガスを速やかに導入しながら、こ
の混合物を25℃で撹拌した。アンモニアを導入した最初
の２分間に、反応混合物の温度は50℃より高く上昇し、
懸濁した固形物は完全に溶解した。５分以内に、沈殿が
形成し始めた。アンモニアを徐々に導入しながら、40〜
50℃で１時間撹拌し続けた。沈殿した固形物を濾過によ
って集め、メタノールで洗浄し、乾燥させた。この生成
物はメタノールへの溶解度が非常に低かった。
C.ジシアノケイ素フタロシアニンジクロリド（化合物
Ｖ）の調製 乾燥した50ml丸底フラスコに、ジイミノイソインドリ
ン（1.0g、6.9mmol）およびキノリン（フルカ（Fluk
a）、20ml）と共に、ジシアノジイミノイソインドリン
（350mg、1.8mmol）を入れた。シリコンテトラクロリド
（アルドリッチ（Aldrich）、2.0ml、18mmol）を１分間
にわたって滴下して添加しながら、この混合物を25℃で
撹拌した。次いで、このフラスコに（テフロンテープを
用いて）還流冷却器および塩化カルシウム乾燥管を取り
付け、25℃で１分間撹拌した。
Ｖ）の調製 乾燥した50ml丸底フラスコに、ジイミノイソインドリ
ン（1.0g、6.9mmol）およびキノリン（フルカ（Fluk
a）、20ml）と共に、ジシアノジイミノイソインドリン
（350mg、1.8mmol）を入れた。シリコンテトラクロリド
（アルドリッチ（Aldrich）、2.0ml、18mmol）を１分間
にわたって滴下して添加しながら、この混合物を25℃で
撹拌した。次いで、このフラスコに（テフロンテープを
用いて）還流冷却器および塩化カルシウム乾燥管を取り
付け、25℃で１分間撹拌した。
このとき、反応フラスコを180〜185℃に維持した大き
な油浴中に入れ、効果的な磁気撹拌を30分間続けた。次
いで、油浴を取り除き、フラスコの内容物を室温に冷却
した。
な油浴中に入れ、効果的な磁気撹拌を30分間続けた。次
いで、油浴を取り除き、フラスコの内容物を室温に冷却
した。
暗色の反応混合物を注意深く水（5ml）で処理し、次
いで45mlの30％HCl溶液で希釈した。得られた暗色の沈
殿を、10cmのブフナー漏斗を用いた濾過によって集め
た。水で洗浄し、次いでアセトンで洗浄し、得られた青
色の固形物（１グラム）を風乾した後、さらに精製する
ことなく、次の反応工程に用いた。
いで45mlの30％HCl溶液で希釈した。得られた暗色の沈
殿を、10cmのブフナー漏斗を用いた濾過によって集め
た。水で洗浄し、次いでアセトンで洗浄し、得られた青
色の固形物（１グラム）を風乾した後、さらに精製する
ことなく、次の反応工程に用いた。
D.ジシアノケイ素フタロシアニンジクロリド（化合物V
I）の加水分解 撹拌子および6mlの濃硫酸の入ったフラスコに、工程
（Ｃ）で得られた粗製のジシアノフタロシアニン（１グ
ラム）を入れ、50℃で一晩撹拌した。次いで、この混合
物を注意深く、4mlの水で希釈し、さらに20時間かけて1
00〜100℃に加熱した。冷却し、水（20ml）で希釈する
と、青色の沈殿物が得られ、これを濾過によって集め、
水で洗浄した。次いで、この固形物を、撹拌子および20
mlの1.0M炭酸カリウム溶液と共に、フラスコに移し、撹
拌し、１時間加熱還流した。次いで、この懸濁液を濃HC
lで徐々し注意深く酸性にし、次いで濾過し、得られた
固形物を水およびアセトンで洗浄し、デシケーター中で
乾燥した。この物質（0.7グラム）は、さらに精製する
ことなく、次の工程に用いた。
I）の加水分解 撹拌子および6mlの濃硫酸の入ったフラスコに、工程
（Ｃ）で得られた粗製のジシアノフタロシアニン（１グ
ラム）を入れ、50℃で一晩撹拌した。次いで、この混合
物を注意深く、4mlの水で希釈し、さらに20時間かけて1
00〜100℃に加熱した。冷却し、水（20ml）で希釈する
と、青色の沈殿物が得られ、これを濾過によって集め、
水で洗浄した。次いで、この固形物を、撹拌子および20
mlの1.0M炭酸カリウム溶液と共に、フラスコに移し、撹
拌し、１時間加熱還流した。次いで、この懸濁液を濃HC
lで徐々し注意深く酸性にし、次いで濾過し、得られた
固形物を水およびアセトンで洗浄し、デシケーター中で
乾燥した。この物質（0.7グラム）は、さらに精製する
ことなく、次の工程に用いた。
E.2,3−ジカルボキシフタロシアニナト−ビス−［３−
（1H−イミダゾール−１−イルカルボニル）アミノプロ
ピルジメチルシラノラト］ケイ素（化合物VII）の調製 工程（Ｄ）で得られた粗製のケイ素フタロシアニンジ
ヒドロキシド（85mg）を、撹拌子およびイミダゾール
（160mg、2.3mmol）および1mlの乾燥DMFと共に、バイア
ルに入れた。この混合物を25℃で５分間撹拌し、次い
で、この撹拌混合物に、３−イソシアナトプロピルジメ
チルクロロシラン（ペトラルチ（Petrarch）、110μ
ｌ、0.68mmol）を0.5分間にわたって添加した。水分を
排除するために、このバイアルに蓋をして、25℃で20〜
40時間撹拌し続けた。（反応時間を40時間にすると、収
率が向上するようであった）。次いで、このバイアルを
開け、暗青色の混合物をメタノール（4ml）で希釈し、
＃545セライトで濾過して固形物を除去した。40℃に維
持した水浴を用いた高真空のロータリーエバポレーター
によって濾液を濃縮した。次いで、暗青色の残渣をシリ
カゲル（１〜3g）およびメタノール（5ml）でスラリー
にし、アスピレーターで減圧したロータリーエバポレー
ターによってメタノールを除去した。次いで、青色の残
渣をトルエンに懸濁し、15mlの23〜400メッシュのシリ
カゲル（イー・エム・サイエンス（EM Science））およ
びトルエンから調製したシリカゲルカラムに移した。こ
のカラムはトルエン中の50％メタノールで洗浄しておい
た。
（1H−イミダゾール−１−イルカルボニル）アミノプロ
ピルジメチルシラノラト］ケイ素（化合物VII）の調製 工程（Ｄ）で得られた粗製のケイ素フタロシアニンジ
ヒドロキシド（85mg）を、撹拌子およびイミダゾール
（160mg、2.3mmol）および1mlの乾燥DMFと共に、バイア
ルに入れた。この混合物を25℃で５分間撹拌し、次い
で、この撹拌混合物に、３−イソシアナトプロピルジメ
チルクロロシラン（ペトラルチ（Petrarch）、110μ
ｌ、0.68mmol）を0.5分間にわたって添加した。水分を
排除するために、このバイアルに蓋をして、25℃で20〜
40時間撹拌し続けた。（反応時間を40時間にすると、収
率が向上するようであった）。次いで、このバイアルを
開け、暗青色の混合物をメタノール（4ml）で希釈し、
＃545セライトで濾過して固形物を除去した。40℃に維
持した水浴を用いた高真空のロータリーエバポレーター
によって濾液を濃縮した。次いで、暗青色の残渣をシリ
カゲル（１〜3g）およびメタノール（5ml）でスラリー
にし、アスピレーターで減圧したロータリーエバポレー
ターによってメタノールを除去した。次いで、青色の残
渣をトルエンに懸濁し、15mlの23〜400メッシュのシリ
カゲル（イー・エム・サイエンス（EM Science））およ
びトルエンから調製したシリカゲルカラムに移した。こ
のカラムはトルエン中の50％メタノールで洗浄しておい
た。
溶媒中のメタノール含量を16％まで増加させて溶媒の
極性を増大させると、明確なバンドが移動するので、こ
のバンドを集めた。この物質は保存したが、さらに変換
するのに使用しなかった。
極性を増大させると、明確なバンドが移動するので、こ
のバンドを集めた。この物質は保存したが、さらに変換
するのに使用しなかった。
溶離液中のメタノール含量を30％まで徐々に増加させ
て溶媒の極性を増大させることによって、第２の青色の
バンドが移動するので、このバンドを30％メタノールの
20ml容量以内で集めた。この物質を丸底フラスコに移し
た。25℃にて高真空下のロータリーエバポレーターによ
って溶媒を除去すると、残渣が残り、この残渣は青色の
色素と共にかなりの量のイミダゾールを含んでいるよう
であった。この物質は、さらに精製することなく、次の
工程に用いた。化合物VIIの収量は約3mgであった。
て溶媒の極性を増大させることによって、第２の青色の
バンドが移動するので、このバンドを30％メタノールの
20ml容量以内で集めた。この物質を丸底フラスコに移し
た。25℃にて高真空下のロータリーエバポレーターによ
って溶媒を除去すると、残渣が残り、この残渣は青色の
色素と共にかなりの量のイミダゾールを含んでいるよう
であった。この物質は、さらに精製することなく、次の
工程に用いた。化合物VIIの収量は約3mgであった。
F.アミン末端ポリエチレングリコールの調製 ポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル（ア
ルドリッチ（Aldrich）、平均M.W.2000、10g、5mmol）
を、撹拌子および55mlのトルエンと共に、100mlの丸底
フラスコに入れた。このフラスコに経路の短い蒸留器具
を取り付け、加熱浴に浸けた。蒸留物がもはや濁らなく
なるまで、トルエンを760mmHgで徐々に蒸留した。これ
には、約15mlのトルエンを除去することが必要であっ
た。
ルドリッチ（Aldrich）、平均M.W.2000、10g、5mmol）
を、撹拌子および55mlのトルエンと共に、100mlの丸底
フラスコに入れた。このフラスコに経路の短い蒸留器具
を取り付け、加熱浴に浸けた。蒸留物がもはや濁らなく
なるまで、トルエンを760mmHgで徐々に蒸留した。これ
には、約15mlのトルエンを除去することが必要であっ
た。
比較的水を含まないPEG溶液を40℃に冷却した。この
温度を維持し、カルボニルジイミダゾール（アルドリッ
チ（Aldrich）、1.2g、7.5mmol）を撹拌溶液に一度に添
加した。空気中の水分から保護した状態にて、30〜40℃
で一晩撹拌し続けた。
温度を維持し、カルボニルジイミダゾール（アルドリッ
チ（Aldrich）、1.2g、7.5mmol）を撹拌溶液に一度に添
加した。空気中の水分から保護した状態にて、30〜40℃
で一晩撹拌し続けた。
次いで、水（100μｌ、3.75mmol）を反応混合物に添
加し、CO2ガスの発生がもはや観察されなくなるまで
（約15分間）、効果的な磁気撹拌を続けた。トルエンの
大部分を30℃にて高真空下のロータリーエバポレーター
によって除去すると、粘稠な無色の油状物が残った。こ
の物質をイソプロパノール（20ml）で希釈し、イソプロ
パノール（15ml）中における1,2エチレンジアミン（フ
ルカ（Fluka）、6.7ml、1000mmol）の撹拌溶液に５分間
にわたって添加した。添加が完了した後、透明な溶液を
40℃で４時間維持した。
加し、CO2ガスの発生がもはや観察されなくなるまで
（約15分間）、効果的な磁気撹拌を続けた。トルエンの
大部分を30℃にて高真空下のロータリーエバポレーター
によって除去すると、粘稠な無色の油状物が残った。こ
の物質をイソプロパノール（20ml）で希釈し、イソプロ
パノール（15ml）中における1,2エチレンジアミン（フ
ルカ（Fluka）、6.7ml、1000mmol）の撹拌溶液に５分間
にわたって添加した。添加が完了した後、透明な溶液を
40℃で４時間維持した。
このとき、イソプロパノール（150ml）を反応混合物
に添加した。この希釈溶液を４℃で一晩放置すると、多
量の白色結晶が形成した。この固形物を10cmのブフナー
漏斗で集め、続いてイソプロパノールから再結晶した。
に添加した。この希釈溶液を４℃で一晩放置すると、多
量の白色結晶が形成した。この固形物を10cmのブフナー
漏斗で集め、続いてイソプロパノールから再結晶した。
高真空下、硫酸上で乾燥させると、試薬として用いる
のに適した７グラムの粗製アミンが得られた。生成物の
構造はIRによって確認した。
のに適した７グラムの粗製アミンが得られた。生成物の
構造はIRによって確認した。
上で概説したように調製したポリエチレングリコール
アミンのアミン含量は、以下の方法によって、＞70モル
％であることがわかった： メタノール中におけるアミンの10％溶液の25mlを、TH
F中における無水マレイン酸の６％溶液の同量と反応さ
せた。反応混合物を25℃で0.5時間放置し、次いでメタ
ノールで1.0mlに希釈した。この最終溶液の５μｌ既知
量を、水中の30％メタノールを初期移動相として用いた
分析用RP18逆相HPLCカラムに注入した。ｎ−プロピルア
ミンを内部標準として用いると、UV吸収性アシルPEG誘
導体の正確な定量が可能であったが、この誘導体は80％
メタノールで溶出し、254nmで検出した。
アミンのアミン含量は、以下の方法によって、＞70モル
％であることがわかった： メタノール中におけるアミンの10％溶液の25mlを、TH
F中における無水マレイン酸の６％溶液の同量と反応さ
せた。反応混合物を25℃で0.5時間放置し、次いでメタ
ノールで1.0mlに希釈した。この最終溶液の５μｌ既知
量を、水中の30％メタノールを初期移動相として用いた
分析用RP18逆相HPLCカラムに注入した。ｎ−プロピルア
ミンを内部標準として用いると、UV吸収性アシルPEG誘
導体の正確な定量が可能であったが、この誘導体は80％
メタノールで溶出し、254nmで検出した。
アミン末端PEGの赤外スペクトル分析も、生成物の収
率を推定する便利な手段を与えることができる。
率を推定する便利な手段を与えることができる。
G.化合物VIIとアミン末端ポリエチレングリコール（化
合物VIII）との反応 シリカゲル上でのクロマトグラフィーによって部分的
に精製された形で得られた工程（Ｅ）の生成物（化合物
VII）（3mg、５×10-3mmol）をメタノール（1ml）に溶
解した。アミン末端のPEG（工程（Ｆ）の生成物、100m
g、５×10-2mmol）を添加しながら、この混合物を撹拌
した。得られた深青色の溶液を１時間加熱還流した。
合物VIII）との反応 シリカゲル上でのクロマトグラフィーによって部分的
に精製された形で得られた工程（Ｅ）の生成物（化合物
VII）（3mg、５×10-3mmol）をメタノール（1ml）に溶
解した。アミン末端のPEG（工程（Ｆ）の生成物、100m
g、５×10-2mmol）を添加しながら、この混合物を撹拌
した。得られた深青色の溶液を１時間加熱還流した。
25℃にてアスピレーターの減圧下でメタノールを除去
すると、粘稠な青色の油状物が残り、この油状物を水中
（0.5ml）に取り、少量（10ml湿潤容量）のDEAEセファ
デックス陰イオン交換カラム（ファーマシア（Pharmaci
a）、3.5meq/g、40〜120ミクロン、塩基型＜1M K2CO3）
にかけた。水溶性の青色色素はカラムによって定量的に
保持された。このカラムを水（15ml）で洗浄し、次いで
青色色素を、15％酢酸水溶液の10〜20mlによって、70％
より高い収率で溶出した。
すると、粘稠な青色の油状物が残り、この油状物を水中
（0.5ml）に取り、少量（10ml湿潤容量）のDEAEセファ
デックス陰イオン交換カラム（ファーマシア（Pharmaci
a）、3.5meq/g、40〜120ミクロン、塩基型＜1M K2CO3）
にかけた。水溶性の青色色素はカラムによって定量的に
保持された。このカラムを水（15ml）で洗浄し、次いで
青色色素を、15％酢酸水溶液の10〜20mlによって、70％
より高い収率で溶出した。
高真空下で水および酢酸を除去し、青色の残渣を少量
のメタノールに取り、C18逆相半分取HPLCカラムにかけ
た。主生成物は、675nmで単一ピークとして検出され、
（0.6％酢酸を含む）80％水性メタノールで溶出した
が、この主生成物はカラムから回収された物質の合計の
約50％を占めた。主生成物を含む画分を合わせて、溶媒
を高真空下で除去すると、青色の残渣が残った。（約0.
5mg、10-7mmol）。
のメタノールに取り、C18逆相半分取HPLCカラムにかけ
た。主生成物は、675nmで単一ピークとして検出され、
（0.6％酢酸を含む）80％水性メタノールで溶出した
が、この主生成物はカラムから回収された物質の合計の
約50％を占めた。主生成物を含む画分を合わせて、溶媒
を高真空下で除去すると、青色の残渣が残った。（約0.
5mg、10-7mmol）。
NMR（DCCl3:δ−2.85（５、12H）、δ−2.29（ｍ、4
H）、δ−1.30（ｍ、4H）、δ1.80（ｍ、4H）、δ3.6
（br.s、300〜400H）、δ8.39（ｍ、6H）、δ9.68
（ｍ、6H）、δ10.56（Ｓ、2H）。注：試料はすでにD2O
に溶解されていたので、酸性の生成物RCOOHは認められ
なかった。
H）、δ−1.30（ｍ、4H）、δ1.80（ｍ、4H）、δ3.6
（br.s、300〜400H）、δ8.39（ｍ、6H）、δ9.68
（ｍ、6H）、δ10.56（Ｓ、2H）。注：試料はすでにD2O
に溶解されていたので、酸性の生成物RCOOHは認められ
なかった。
実施例７ アミノジゴキシゲニンと化合物VIII−Ａジゴキシゲニン
プローブとの結合 実施例６の生成物（化合物VIII）を、３α，β−アミ
ノジゴキシゲニン（0.5mg、1.3×10-6mol）、１−ヒド
ロキシベンゾトリアゾール水和物（アルドリッチ（Aldr
ich）、0.5mg、5.7×10-6mol）および１−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩
（1mg、５×10-6mol）と共に、小さいフラスコに入れ
た。DMF（アルドリッチ（Aldrich）、HPLC用、4Aモレキ
ュラーシーブ上で保存、100μｌ）を反応フラスコに添
加し、フラスコの内容物を25℃で充分に撹拌し、次いで
４℃で一晩放置した。次いで、溶媒の大部分を窒素気流
下で蒸発させ、残渣を水中に取り、精製のために、分析
用RP18HPLCカラムにかけた。675nmで検出すると、単一
の主生成物（すなわち、単一の主ピーク）が現れたが、
この主生成物は生成物の混合物の70％より多くを占めて
いた。
プローブとの結合 実施例６の生成物（化合物VIII）を、３α，β−アミ
ノジゴキシゲニン（0.5mg、1.3×10-6mol）、１−ヒド
ロキシベンゾトリアゾール水和物（アルドリッチ（Aldr
ich）、0.5mg、5.7×10-6mol）および１−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩
（1mg、５×10-6mol）と共に、小さいフラスコに入れ
た。DMF（アルドリッチ（Aldrich）、HPLC用、4Aモレキ
ュラーシーブ上で保存、100μｌ）を反応フラスコに添
加し、フラスコの内容物を25℃で充分に撹拌し、次いで
４℃で一晩放置した。次いで、溶媒の大部分を窒素気流
下で蒸発させ、残渣を水中に取り、精製のために、分析
用RP18HPLCカラムにかけた。675nmで検出すると、単一
の主生成物（すなわち、単一の主ピーク）が現れたが、
この主生成物は生成物の混合物の70％より多くを占めて
いた。
この物質を含む画分を合わせて、リン酸緩衝液でpH7
にし、この媒質中における原料溶液として保存した。
にし、この媒質中における原料溶液として保存した。
この生成物は特定のジゴキシン抗体との免疫特異的な
反応を与えた。
反応を与えた。
文献目録 1. ティー・ヌゴー（T.Ngo）（編）；非放射性イムノ
アッセイ（Nonisotopic Immunoassay）；プレナム・プ
レス（Plenum Press）、ニューヨーク、187〜210頁（19
88年）。
アッセイ（Nonisotopic Immunoassay）；プレナム・プ
レス（Plenum Press）、ニューヨーク、187〜210頁（19
88年）。
2. エル・カプラン（L.Kaplan）ら（編）；ラジオイム
ノアッセイの非放射性代替法（Nonisotopic Alternativ
es to Radioimmunoassay）；マルセル・デッカー、イン
ク（Marcel Dekker、Inc.）、ニューヨーク、143〜170
頁（1981年）。
ノアッセイの非放射性代替法（Nonisotopic Alternativ
es to Radioimmunoassay）；マルセル・デッカー、イン
ク（Marcel Dekker、Inc.）、ニューヨーク、143〜170
頁（1981年）。
3. ダンドリンカー（Dandlinker）ら；「蛍光偏光イム
ノアッセイ（Fluorescence Polarization Immunoassa
y）．理論および実験方法（Theory and Experimental M
ethod）」；イムノケミストリー（Immunochemistry）、
10巻:219〜227頁（1973年）。
ノアッセイ（Fluorescence Polarization Immunoassa
y）．理論および実験方法（Theory and Experimental M
ethod）」；イムノケミストリー（Immunochemistry）、
10巻:219〜227頁（1973年）。
4. イー・ジョーンズ（E.Jones）ら（編）；溶液によ
る凝集法（Aggregation Processes in Solution）；エ
ルセビアー・サイエンティフィック（Elsevier Scienti
fic）、ニューヨーク、241〜308頁（1983年）。
る凝集法（Aggregation Processes in Solution）；エ
ルセビアー・サイエンティフィック（Elsevier Scienti
fic）、ニューヨーク、241〜308頁（1983年）。
5. イー・ソイニ（E.Soini）ら；蛍光イムノアッセイ
の現状（Fluoroimmunnoassay:Present Status）；クリ
ニカル・ケミストリー（Clinical Chemistry）、25巻:3
53〜61頁（1979年）。
の現状（Fluoroimmunnoassay:Present Status）；クリ
ニカル・ケミストリー（Clinical Chemistry）、25巻:3
53〜61頁（1979年）。
6. カーク・オスマー科学技術大事典（Kirk−Othmer E
ncyclopedia of Chemical Technology）；第３版、ジョ
ン・ワイリー・アンド・サンズ（John Wiley ＆ Son
s）、ニューヨーク、22巻、１〜45頁（「スルホン化（S
ulfonation）」）。
ncyclopedia of Chemical Technology）；第３版、ジョ
ン・ワイリー・アンド・サンズ（John Wiley ＆ Son
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7. ディー・テイラー（D.Taylor）（編）；生体臨床医
学における蛍光の応用（Applications of Fluorescence
in the Biomedical Sciences）；ライス、インク（Lis
s、Inc.）、ニューヨーク、３〜28頁（1985年）。
学における蛍光の応用（Applications of Fluorescence
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s、Inc.）、ニューヨーク、３〜28頁（1985年）。
8. ディー・ドリオン（D.Dorion）（編）；ポルフィリ
ンの局在化および腫瘍の治療（Porphyrin Localization
and Treatment of Tumors）；ライス、インク（Liss、
Inc.）、ニューヨーク（1983年）。
ンの局在化および腫瘍の治療（Porphyrin Localization
and Treatment of Tumors）；ライス、インク（Liss、
Inc.）、ニューヨーク（1983年）。
9. ダブリュー・チャン（W.Chan）ら；アルミニウムク
ロロスルホン化フタロシアニンに対する細胞の摂取、分
布および応答、抗腫瘍性の光増感剤（Cell Uptake,Dist
ribution and Response to Aluminium Chloro Sulphona
ted Phthalocyanine,a Potential Anti−Tumor Photose
nsitizer）；ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・キャ
ンサー（British Journal of Cancer）、53巻:255〜263
頁（1986年）。
ロロスルホン化フタロシアニンに対する細胞の摂取、分
布および応答、抗腫瘍性の光増感剤（Cell Uptake,Dist
ribution and Response to Aluminium Chloro Sulphona
ted Phthalocyanine,a Potential Anti−Tumor Photose
nsitizer）；ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・キャ
ンサー（British Journal of Cancer）、53巻:255〜263
頁（1986年）。
10.アイ・マッカビン（McCubbin）；数種の水溶性フタ
ロシアニンの光化学（Photochemistry of Some Water−
Soluble Phthalocyanines）；学位論文、ロンドン大学
（1985年）。
ロシアニンの光化学（Photochemistry of Some Water−
Soluble Phthalocyanines）；学位論文、ロンドン大学
（1985年）。
11.エフ・モーザー（F.Moser）；フタロシアニン化合物
（Phthalocyanine Compounds）；ラインホールド・パブ
リッシング・カンパニー（Reinhold Publishing C
o.）、ニューヨーク（1963年）。
（Phthalocyanine Compounds）；ラインホールド・パブ
リッシング・カンパニー（Reinhold Publishing C
o.）、ニューヨーク（1963年）。
12.ジー・ウィルキンソン（G.Wilkinson）（編）；配位
化学概論（Comprehensive Coordination Chemistry）；
パーガモン・プレス（Pergamon Press）、ニューヨー
ク、２巻、813〜898頁（1963年）。
化学概論（Comprehensive Coordination Chemistry）；
パーガモン・プレス（Pergamon Press）、ニューヨー
ク、２巻、813〜898頁（1963年）。
13.エイチ・エメレウス（H.Emeleus）ら（編）；無機お
よび放射化学における進歩（Advances in Inorganic an
d Radiochemistry）；アカデミック・プレス（Academic
Press）、ニューヨーク、７巻、41〜49頁（1965年）。
よび放射化学における進歩（Advances in Inorganic an
d Radiochemistry）；アカデミック・プレス（Academic
Press）、ニューヨーク、７巻、41〜49頁（1965年）。
14.ディー・グットマン（D.Guttman）ら；「血漿タンパ
クによる薬剤の結合（The Binding of Drugs by Plasma
Proteins）」；ジャーナル・オブ・ファーマシューテ
ィカル・サイエンシーズ（Journal of Pharmaceutical
Sciences）、57巻:903頁（1968年）。
クによる薬剤の結合（The Binding of Drugs by Plasma
Proteins）」；ジャーナル・オブ・ファーマシューテ
ィカル・サイエンシーズ（Journal of Pharmaceutical
Sciences）、57巻:903頁（1968年）。
15.エム・ハナック（M.Hanack）ら；「新種の一次元導
電体の合成および性質（Synthesis and Properties of
a New Kind of One−Dimensional Conductor）」ジャー
ナル・オブ・オルガノメタリック・ケミストリー（Jour
nal of Organometallic Chemistry）、204巻:315〜325
頁（1981年）。
電体の合成および性質（Synthesis and Properties of
a New Kind of One−Dimensional Conductor）」ジャー
ナル・オブ・オルガノメタリック・ケミストリー（Jour
nal of Organometallic Chemistry）、204巻:315〜325
頁（1981年）。
16.ジー・メルソン（G.Melson）（編）；大環状化合物
の配位化学（Coordination Chemistry of Macrocyclic
Compounds）；プレナム・プレス（Plenum Press）、ニ
ューヨーク、474〜477頁（1979年）。
の配位化学（Coordination Chemistry of Macrocyclic
Compounds）；プレナム・プレス（Plenum Press）、ニ
ューヨーク、474〜477頁（1979年）。
17.クッリッカ、エル・ジェイ（Kricka,L.J.］、配位子
−結合剤アッセイ：標識および分析的方法（Ligand−Bi
nder Assays:Labels and Analytical Stratagies）、15
〜51頁、（マルセル・デッカー、インク（Marcel Dekke
r,Inc.）、ニューヨーク、1985年）。
−結合剤アッセイ：標識および分析的方法（Ligand−Bi
nder Assays:Labels and Analytical Stratagies）、15
〜51頁、（マルセル・デッカー、インク（Marcel Dekke
r,Inc.）、ニューヨーク、1985年）。
18.ハリス、ジェイ・エム（Harris,J.M.）、「ポリエチ
レングリコール誘導体の実験室での合成（Laboratory S
ynthesis of Polyethylene Glycol Derivatives）」、
ジャーナル・オブ・マクロモレキュラー・サイエンス−
レビューズ・イン・マクロモレキュラー・ケミカル・フ
ィジックス（J..Macromol.Sci.−Rev.−Macromol.Chem.
Phys.）、C25（３）巻:325〜373頁（1985年）。
レングリコール誘導体の実験室での合成（Laboratory S
ynthesis of Polyethylene Glycol Derivatives）」、
ジャーナル・オブ・マクロモレキュラー・サイエンス−
レビューズ・イン・マクロモレキュラー・ケミカル・フ
ィジックス（J..Macromol.Sci.−Rev.−Macromol.Chem.
Phys.）、C25（３）巻:325〜373頁（1985年）。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 17/00 Ｃ０７Ｈ 17/00 23/00 23/00 (56)参考文献 特開 平１−275583（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−149390（ＪＰ，Ａ) Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．，112 （８），（1990），Ｐ．3086−3093 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/533 A61K 31/695 C07D 487/22 C07F 7/10 C07H 15/26 C07H 17/00 C07H 23/00
Claims (27)
- 【請求項１】少なくとも１つの可溶化ポリオキシヒドロ
カルビル部位にアクシャル配位子として配位した発蛍光
団を含み、かつ、ヒト血清の成分に対する非特異的結合
の減少を示す検出可能に標識されたマーカー成分。 - 【請求項２】前記可溶化ポリオキシヒドロカルビル部位
が、ポリエーテルポリオール、水溶性炭水化物、水溶性
炭水化物誘導体、または水溶性ポリマーである請求項１
記載のマーカー成分。 - 【請求項３】２またはそれ以上の可溶化ポリオキシヒド
ロカルビル部位を有する請求項２記載のマーカー成分。 - 【請求項４】発蛍光団１個あたり２〜６の可溶化ポリオ
キシヒドロカルビル部位を有する請求項３記載のマーカ
ー成分。 - 【請求項５】発蛍光団が実質的に平面的な発光分子構造
を有する請求項４記載のマーカー成分。 - 【請求項６】前記分子構造が実質的に平面的な共役π電
子系を含む請求項５記載のマーカー成分。 - 【請求項７】前記発蛍光団が窒素含有の大きい環を含む
請求項６記載のマーカー成分。 - 【請求項８】前記の大きい環が、ポルフィリン誘導体あ
るいは１個またはそれ以上の橋かけ炭素原子が窒素で置
き換えられているポルフィリン誘導体、コリン誘導体ま
たはサフィリン誘導体を含む請求項７記載のマーカー成
分。 - 【請求項９】可溶化部位がポリエチレングリコールまた
はポリエチレングリコール誘導体を含む請求項８記載の
マーカー成分。 - 【請求項１０】前記可溶化部位が200〜20,000の分子量
を有する請求項９記載のマーカー成分。 - 【請求項１１】前記の大きい環が中心原子に対して適当
な位置に配位されている請求項９記載のマーカー成分。 - 【請求項１２】前記の大きい環が、１〜４個の橋かけ炭
素原子が窒素で置き換えられているポルフィリン誘導体
を含む請求項11記載のマーカー成分。 - 【請求項１３】前記の大きい環がフタロシアニン誘導体
を含む請求項12記載のマーカー成分。 - 【請求項１４】前記中心原子がケイ素を含む請求項13記
載のマーカー成分。 - 【請求項１５】前記の大きい環が、吸収の偏光に平行な
発光の偏光を増強するように低い対称性を有する請求項
11記載のマーカー成分。 - 【請求項１６】前記の大きい環がD4hより低い対称性を
有する請求項12記載のマーカー成分。 - 【請求項１７】前記の大きい環が、１〜４個の橋かけ炭
素原子が窒素で置き換えられているポルフィリン誘導体
を含む請求項16記載のマーカー成分。 - 【請求項１８】前記の大きい環が少なくとも１個の縮合
芳香環を有する請求項17記載のマーカー成分。 - 【請求項１９】前記の大きい環が、モノアザポルフィリ
ン、ジアザポルフィリンまたはトリアザポルフィリンの
誘導体を含む請求項17記載のマーカー成分。 - 【請求項２０】前記の大きい環が少なくとも１個の縮合
芳香環を有する請求項19記載のマーカー成分。 - 【請求項２１】前記の大きい環が、少なくとも１個の縮
合芳香環を有し、１〜４個の橋かけ炭素原子が窒素で置
き換えられているポルフィリン誘導体を含む請求項16記
載のマーカー成分。 - 【請求項２２】特異的な結合対の一方のメンバーに連結
された請求項１、３、５、８、９、12、13、15、17、20
または21いずれか１項記載のマーカー成分を含む蛍光プ
ローブ。 - 【請求項２３】前記の特異的な結合対のメンバーが、前
記プローブに特異的な結合対を形成させることができる
少なくとも１個の立体的に寛容なマーカー成分結合部位
を有する請求項22記載の蛍光プローブ。 - 【請求項２４】式： 【化１】 で表わされる化合物を含むマーカー成分。
- 【請求項２５】特異的な結合対の一方のメンバーに連結
された請求項24記載のマーカー成分を含む蛍光プロー
ブ。 - 【請求項２６】前記の結合対のメンバーがジゴキシン誘
導体を含む請求項25記載の蛍光プローブ。 - 【請求項２７】以下の： ａ）請求項24記載の化合物を、３α，β−アミノジゴキ
シゲニン、１−ヒドロキシベンゾトリゾール水和物およ
び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカ
ルボジイミド塩酸塩と共に小さいフラスコに入れ； ｂ）DMFを上記反応フラスコに添加し、該フラスコの内
容物を25℃で充分に攪拌し、次いで、４℃で一晩放置
し； ｃ）溶媒の大部分を窒素気流下で蒸発させ； ｄ）該残渣を水に溶かし；次いで ｅ）それを分析用RP18HPLCカラムに負荷して精製し、67
5nmに検出される単一主生成物を含む画分を合わせるこ
と からなる工程によって得られる複合体からなる請求項26
記載の蛍光プローブ。
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