JP3234226B2

JP3234226B2 - ストレプトキナーゼ基剤のワクチン

Info

Publication number: JP3234226B2
Application number: JP51230693A
Authority: JP
Inventors: リー，ジェームズ・アンドリュー
Original assignee: ファイザー・インコーポレイテッド
Priority date: 1992-01-17
Filing date: 1993-01-18
Publication date: 2001-12-04
Anticipated expiration: 2016-12-04
Also published as: GR3036369T3; AU3360193A; AU673344B2; CA2128247A1; ES2158857T3; DE69330246D1; WO1993014209A1; EP0623170A1; DK0623170T3; PT623170E; EP0623170B1; ATE201448T1; GB9201013D0; DE69330246T2; US5840315A; JPH07504166A; CA2128247C

Description

【発明の詳細な説明】本発明は病原体により引き起こされる疾患に対する予
防接種に、さらに詳しくは乳房炎に対する予防接種に関
する。

ウシ乳房において臨床性乳房炎を起こすには、分泌物
中への除去を回避するに十分な速度にて腺内で細菌を増
殖させるか、または正常な分泌および／または小管組織
を集落形成させなければならない。よりビルレントな菌
株の細菌は、多数の多形核白血球が存在するにもかかわ
らず、貪食性殺作用に抵抗する。ある種の細菌は、疾患
の病理発生にて役割のある、溶血性および／または細胞
溶解性トキシンを産生することが知られている。

今日まで、臨床性乳房炎の乳腺を保護するためのワク
チンは、（オプソニン抗体の産生によって）より効果的
な細菌の貪食作用および殺菌作用を促進しようとするも
のであるか、または（中和抗体の産生によって）毒性産
物を失活させようとするものであった。

ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uber
is）がウシ乳房炎の一般的病因であり、英国における臨
床ケースのうちの約20％に関与している（ブランレイお
よびドッド（BramleyおよびDodd）1984）。この微生物
の泌乳乳腺に感染する能力は、分泌物中にて増殖し、ウ
シ好中球による貪食作用を回避する能力に依存する（リ
ー（Leigh）ら,1990）。

牛乳中にある窒素の大部分は蛋白質の形態にて存在し
（アストン（Aston）,1975）、蛋白質分解作用がないと
きは、乳汁中における細菌増殖は遊離アミノ酸の欠如に
よって制限される。このことは、乳酸性ストレプトコッ
カスが、乳汁中における増殖について細胞外カゼイン分
解性プロテイナーゼに依存することにより顕著である
（ミルスおよびトーマス（MillsおよびThomas）198
1）。乳房炎乳汁中における細菌増殖能は、カゼイン分
解性酵素であるプラスミンの存在により高められる（マ
ーシャルおよびブランレイ（MarshallおよびBramley）1
984）。プラスミノーゲンのプラスミンへの変換は、血
漿および動物組織中に存在することが知られているプラ
スミノーゲン・アクチベーターを必要とする（コレン
（Collen）1980）。ある種のストレプトコッカスは、プ
ラスミノーゲンをプラスミンに活性化するストレプトキ
ナーゼの産生能を有するが、従来より、ウシプラスミノ
ーゲンを活性化するストレプトキナーゼは単離されいて
いない。

本発明は一の態様において、脊椎動物における疾患を
治療または予防するのに用いるためのワクチンを提供す
る。このワクチンは抗原体（antigenic entity）と担体
とからなり、該ワクチンで脊椎動物を予防接種した後に
は、その抗原体は、直接的または間接的に、脊椎動物に
おける蛋白質を分解させ、該蛋白質分解が病原体の増殖
を強化する、病原体に由来の因子を阻害する抗体を生成
する免疫応答を生じさせる。

病原体由来の因子を「阻害」する抗体は、脊椎動物性
蛋白質の分解の原因となる、該因子の能力を有用な程度
まで減少させるものである。個々の抗体と該因子の分子
の間にある所定の相互作用について、その能力をゼロに
まで減少させることが好ましい。適当には、該因子が作
用する環境中に抗体を分泌させる。かくして、乳房炎に
対するワクチンの場合、抗体を乳汁中に分泌させなけれ
ばならない。

ストレプトコッカスは、ある種のデンタルケアーに関
与しており、かくして、デンタルケアーの場合には、抗
体を唾液中に分泌させるかまたは口の歯肉および内層に
付随する粘膜中に存在させなければならない。

抗原体をワクチンに処方するための適当な担体および
アジュバント等が知られている。

医薬上許容される担体は、例えば、抗原体を脊椎動物
に導入するためのビヒクルとしての使用に適する液体培
地である。そのような担体として、例えば、セイライン
溶液が挙げられる。抗原体は溶液中にあってもよく、ま
たは固体として担体中に懸濁させてもよい。

ワクチン処方はまた、免疫応答を刺激し、それにより
ワクチンの効果を強化するためのアジュバントからなっ
ていてもよい。本発明において用いるのに都合のよいア
ジュバントは、例えば、水酸化アルミニウムおよびリン
酸アルミニウムを包含する。

本発明のワクチンは、経口および非経口（例、皮下お
よび筋肉内）注射を包含する、ワクチン投与のいずれか
都合のよい方法により投与してもよい。治療はワクチン
を一回投与するか、または一定の期間にわたって複数回
投与することからなる。

疾患の「治療または予防」とは、現存するまたは将来
的に生じる疾患を有用な程度まで改善することを意味す
るものであり、炎症を有用な程度まで減少させることを
包含する。

第二の態様によれば、本発明は、脊椎動物を前記のワ
クチンで予防接種することからなる、脊椎動物における
疾患の治療または予防方法を提供する。

本発明に係るワクチンおよび方法は、遊離アミノ酸が
生成されないように、宿主における蛋白質の分解の直接
的または間接的な原因である病原体由来の因子を阻害す
ることで作用し、それで、病原体は疾患を持続するのに
十分迅速に増殖できないと考えられる。

その因子は、直接的または間接的に乳汁中のプラスミ
ノーゲンを活性化し、乳汁蛋白質の蛋白質分解を生じさ
せる。乳房炎に拮抗する予防接種の場合には、その因子
は乳汁中のプラスミノーゲンの活性化能を有する細菌ス
トレプトキナーゼである。適当には、該因子はストレプ
トコッカス・ウベリスにより産生されるストレプトキナ
ーゼである。しかし、他のストレプトコッカスに由来の
ストレプトキナーゼもまた、乳汁中のプラスミノーゲン
を活性化する。例えば、ストレプトコッカス・ディスガ
ラクチエ（Streptococcus dysgalactiae）により産生さ
れるストレプトキナーゼが適当なプラスミノーゲン・ア
クチベーターである。また、該因子は乳汁蛋白質の加水
分解発現能を有する細菌プロテアーゼ、例えばスタフィ
ロコッカス・アウレウス・プロテアーゼ（Staphylococc
us aureus protease）であってもよく、そのうちの多く
のものは報告されている（参考文献参照）。

本発明のワクチンは、前記の病原体因子に関する免疫
応答阻害を生じさせるいずれかの物質からなる。該物質
は完全な未変性因子である必要はない。抗原性フラグメ
ント、特に、親水性プロットにより親水性であると同定
されたものを用いてもよく、機能的に不活性である、す
なわち、宿主の蛋白質の分解を生じさせないが、該因子
に対する阻害抗体を産するのに用いることができる因子
の修飾形であってもよい。

したがって、本発明の抗原体が、蛋白質、好ましくは
細菌プロテアーゼ、さらに好ましくはストレプトキナー
ゼである場合、該用語は、特に、未変性蛋白質の機能を
欠いている該蛋白質またはその変異形と結合する抗体を
生成するのに有用な蛋白質のいずれの変異株およびフラ
グメントをも包含する。そのような変異株およびフラグ
メントは、通常、少なくとも５個の連続したアミノ酸か
らなる最低１個の領域を有し、それは該蛋白質のその最
も対応する５個またはそれ以上の連続したアミノ酸領域
と少なくとも90％の相同性を有する。

本発明の抗原ポリペプチドは、公知蛋白質修飾法によ
り修飾できることは当業者であれば理解するであろう。
これらは、出展明示により本明細書の一部とする、米国
特許第4,302,386号（1991年11月24日、スティーブンス
（Stevens）に付与）に開示されている方法を包含す
る。そのような変法は抗原の免疫原性を強化するか、ま
たはそのような免疫原性について効果を有しないかもし
れない。例えば、２ないし３個のアミノ酸残基を変形し
てもよい。また、本発明の抗原体は、その免疫原性に必
須でない、１またはそれ以上のアミノ酸配列を含有して
もよい。不必要な配列は当該分野における周知方法によ
り除去できる。例えば、該配列はトリプシンまたはパパ
インのような酵素または関連する蛋白質分解酵素を用い
る制限された蛋白質分解消化を介して除去できる。

別法として、蛋白質の抗原部分に相当するポリペプチ
ドはその分野における周知方法により化学的に合成でき
る。これらは、出展明示により本明細書の一部とする、
米国特許第4,290,944号（1981年９月22日付けでゴール
ドバーグ（Goldberg）に付与）に開示の方法を包含す
る。

ペプチドは、ルー（Lu）らにより、（1981）ジャーナ
ル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J.Org.Che
m.）46,3433およびその中にある参考文献に開示されて
いる固相ペプチド合成のFmoc−ポリアミド法により合成
できる。一時的なＮ−アミノ基保護は９−フルオレニル
メチルオキシカルボニル（Fmoc）基により付与される。
この塩基高不安定性保護基の繰返し切断は、N,N−ジメ
チルホルムアミド中20％ピペリジンを用いてなされる。
側鎖官能性はそのブチルエーテル（セリン、トレオニン
およびチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン
酸およびアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボ
ニル誘導体（リシンおよびヒスチジンの場合）、トリチ
ル誘導体（システインの場合）および４−メトキシ−2,
3,6−トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニ
ンの場合）として保護できる。グルタミンまたはアスパ
ラギンがＣ−末端残基である場合、側鎖アミド官能性の
保護については、4,4′−ジメトキシベンズヒドリル基
の使用でなされる。固相支持体は、３種のモノマー、ジ
メチルアクリルアミド（骨格−モノマー）、ビスアクリ
ロイルエチレンジアミン（架橋剤）およびアクリロイル
サルコシンメチルエステル（官能基導入剤）からなるポ
リジメチルアクリルアミドポリマーを基礎とする。用い
るペプチド−樹脂の切断可能な架橋剤は、酸不安定性４
−ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸誘導体である。す
べてのアミノ酸誘導体は、アスパラギンおよびグルタミ
ンを除いて、その予備形成された対称無水誘導体として
加えられ、それらを逆N,N−ジシクロヘキシル−カルボ
ジイミド/1−ヒドロキシベンゾトリアゾール媒介カップ
リング操作を用いて加える。すべてのカップリングおよ
び脱保護反応を、ニンヒドリン、トリニトロベンゼン・
スルホン酸またはイソチン試験操作を用いてモニターす
る。合成完了後、50％スカベンジャー混合物含有の95％
トリフルオロ酢酸で処理することにより、ペプチドを樹
脂支持体より切断し、側鎖保護基を同時に除去する。通
常用いるスカベンジャーは、エタンジチオール、フェノ
ール、アニソールおよび水であり、その的確な選択は合
成されるペプチドの構成アミノ酸に依存する。トリフル
オロ酢酸を真空下での蒸発により除去し、その後、ジエ
チルエーテルでトリチュレートして粗ペプチドを得る。
存在するいずれのスカベンジャーも簡単な抽出操作によ
り除去され、水相を凍結乾燥に付した後、スカベンジャ
ー不含の粗ペプチドを得る。ペプチド合成用試薬は、一
般に、英国、ノッティンガムNG7 2QJ、カルバイオケム
−ノババイオケム（UK）リミテッド（Calbiochem−Nova
biochem（UK）Ltd）より入手可能である。精製は、サイ
ズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィーおよび（主に）逆相高性能液体クロマトグラフィー
のような技法のいずれか１つまたは組み合わせにより行
うことができる。ペプチド分析は、薄層クロマトグラフ
ィー、逆相高性能液体クロマトグラフィー、酸加水分解
後のアミノ酸分析、および高速原子衝撃（FAB）質量分
析法により実施することができる。

かくして、本発明の抗原体が蛋白質である場合、これ
は一連の修飾ポリペプチド、例えば本発明の範囲内にあ
る起源、構造および免疫原性の共通の要素を有する原蛋
白質の合成的に誘導されたポリペプチドまたはフラグメ
ントを包含する。

通常、本発明のワクチンで免疫処置するほうが望まし
いが、その因子に対する抗体を宿主に投与して受動免疫
性を付与してもよい。

第三の態様によれば、本発明は、乳汁中にて哺乳動物
プラスミノーゲン活性化能を有するストレプトキナーゼ
を提供する。好ましくは、該ストレプトキナーゼは、ス
トレプトコッカス・ウベリスにより産生されるストレプ
トキナーゼと同一であるか、または実質的に同一であ
る。

第四の態様は、配列が天然で見いだされるゲノム配列
の少なくとも大部分より単離されるストレプトキナーゼ
をコードする核酸配列を提供するものである。換言すれ
ば、該核酸配列はそれが従来存在している形態で特許請
求されるものではない。かくして、本発明の核酸配列
は、配列がプラスミドのような細菌ベクター中に、また
はバクテリオファージにより匿われていてもよいウイル
スベクター中にてクローンされた際の核酸配列を包含す
る；ただし、そのようなクローンは関連した染色体のDN
Aライブラリーを構築するクローンとは分離状態にあ
る。

当該分野における周知方法を用いることによりストレ
プトキナーゼのアミノ酸配列からストレプトキナーゼを
コードする核酸配列を得ることが可能である。蛋白質由
来のアミノ酸配列鎖を用いることにより、公知方法に従
って、蛋白質をコードするmRNAおよびDNAを雑種形成す
る特異的DNAプローブを合成できる。

遺伝子は、通常、その発現を支配するプロモーターお
よび／または他の発現調節配列からなり、イントロンを
含んでいてもよく、またはコーディング配列、例えばcD
NA配列のみからなっていてもよい。

核酸配列は、（ｉ）遺伝子によりコードされる蛋白質
に特異的に結合する抗体を製造するのに用いることがで
きる蛋白質またはそのフラグメントを産生するのに使用
できるか、または（ii）遺伝子または前記定義の型
（ｉ）の変異に対応するアンチセンス（antisense）配
列であるいずれの変異も包含する。例えば、最初のコド
ンと同一のアミノ酸（ｓ）をコードする異なるコドンを
代わりに用いることができる。また、置換コドンは、蛋
白質の活性および免疫原性に影響を与えないか、または
その活性または免疫原性を改善する異なるアミノ酸をコ
ードしてもよい。例えば、部位−定方向変異誘発または
他の技法を用いて、出展明示により本願明細書の一部と
する、ボトスタインおよびショートル（Botsteinおよび
Shortle），「ストラティージックス・アンド・アプリ
ケーションズ・オブ・イン・ビトロ・ミュータゲネシス
（Strategies and Applications of In Vitro Mutagene
sis）」，サイエンス（Science）,229:193−1210（198
5）に記載されているように、置換、挿入、欠失および
転移のような単一または複数の変異をクリエートでき
る。このような修飾遺伝子は、公知技法を本明細書中に
含まれる教示に適用することにより得ることができるた
め、このような修飾遺伝子も特許請求した核酸配列の範
囲内にある。

さらには、その遺伝子配列（またはそのフラグメン
ト）を用い、厳重な条件下、それと雑種形成している他
のDNA配列を恵ることができる。このようなDNAはいずれ
のゲノムDNAも包含する。したがって、本発明の遺伝子
は、本発明の遺伝子と、少なくとも55％、好ましくは60
％、最も好ましくは70％の相同性を示すDNAを包含す
る。ただし、このような相同性DNAは前記のような病原
体因子に関連する阻害免疫応答の原因となる蛋白質をコ
ードするものである。

遺伝子の「変異」は、たとえ２つの遺伝子の間の相同
性が全体としてそれほどないとしても、相対的に短い鎖
（例、20〜50ヌクレオチド）が、本発明の遺伝子の対応
する鎖と高度の相同性（少なくとも50％、好ましくは少
なくとも90または95％）を有する遺伝子を包含する。こ
れは、蛋白質の一般的構成が異なっている場合であって
も、重要な活性または結合部位は分割できるからであ
る。

以後、「遺伝子」なる語はこのようなすべての変異お
よびフラグメントを包含するのに用いる。

適当な発現配列に含まれる際の、遺伝子またはその変
異を用い、本発明に従って用いることができる抗原蛋白
質またはそのフラグメントを製造することができる。

第五の態様において、本発明は、適当な宿主細胞中の
対応する核酸配列を発現することによる、またはアミノ
酸合成による、蛋白質の産生方法を提供する。

したがって、本明細書中の教示を考慮して適宜修飾し
た公知技法に従って、本発明の核酸を用いて発現ベクタ
ーを構築し、ついでそれを用いて、本発明の抗原性ポリ
ペプチドの発現および生成用の適当な宿主細胞を形質転
換させる。このような技法は、1984年４月３日付けでル
ター（Rutter）らに付与された米国特許第4,440,859
号、1985年７月23日付けでワイズマン（Weissman）に付
与された第4,530,901号、1986年４月15日付けでクロー
ル（Crowl）に付与された第4,582,800号、1987年６月30
日付けでマーク（Mark）らに付与された第4,677,063
号、1987年７月７日付けでゲーゼル（Goeddel）に付与
された第4,678,751号、1987年11月３日付けでイタクラ
（Itakura）らに付与された第4,704,362号、1987年12月
１日付けでミューレイ（Murray）に付与された第4,710,
463号、1988年７月12日付けでトール・ジュニア（Tool
e,Jr.）らに付与された第4,757,006号、1988年８月23日
付けでゲーゼル（Goeddel）らに付与された第4,766,075
号および1989年３月７日付けでストーカー（Stalker）
に付与された第4,810,648号に開示されている技法を包
含する。これらすべての文献を出展明示により本明細書
の一部とする。

本発明の遺伝子は、適当な宿主に導入するために、広
範な他のDNA配列に結合させてもよい。伴DNAは、宿主の
特性、DNAを宿主に導入する方法、およびエピゾーム維
持または組込みが望ましいかどうかに依存する。

一般に、好ましくはcDNAのような遺伝子を、発現用の
適当な配向および的確なリーディングフレームにて、プ
ラスミドのような発現ベクター中に挿入する。必要なら
ば、DNAを、所望の宿主によって認識される適当な転写
および翻訳制御調整ヌクレオチド配列に連結させてもよ
いが、このような調整は、一般に、発現ベクターで利用
できる。その場合、ベクターは、標準技法を介して宿主
中に導入する。一般に、すべてではないが、宿主は該ベ
クターによって形質転換される。したがって、宿主細胞
を形質転換するように選択することが必要であろう。一
の選択技法として、抗生物質抵抗性のような、形質転換
された細胞にて選択可能な特性をコードする、必須の調
整エレメントを有する、DNA配列を発現ベクター中に組
み入れることが挙げられる。また、このような選択可能
な特性についての遺伝子は別のベクター上にあってもよ
く、それを用いて所望の宿主細胞を共同形質転換でき
る。

ついで、本発明の組換え型DNAにより形質転換された
宿主細胞を、ポリペプチドを発現させるに十分な時間か
つ本明細書の教示を考慮して当業者に公知の適当な条件
下で培養し、そして回収できる。

細菌（例、イー・コリ（E.Coli）およびバシラス・サ
ブチリス（Bacillus subtilis））、酵母（例、サッカ
ロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e））、線状真菌（例、アスペルギルス（Aspergillu
s））、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を包含する
多くの発現系が知られている。

レプリコン、例えば原核レプリコンを含有するそれら
のベクターはまた、適当なプロモーター、例えばそれで
形質転換される、イー・コリのような細菌宿主細胞中の
遺伝子の発現（転写および翻訳）の定方向能を有する原
核プロモーターを含有できる。

プロモーターは、RNAポリメラーゼの結合および転写
を生じさせるDNA配列により形成される発現調整エレメ
ントである。典型的な細菌宿主と適合するプロモーター
配列は、典型的には、本発明のDNAセグメント挿入用の
都合のよい制限部位を含有するプラスミドベクターにて
提供される。

典型的な原核ベクタープラスミドは、バイオラド・ラ
ボラトリース（Biorad Laboratories）（米国、カリフ
ォルニア州、リッチモンド）より入手可能なpUC8、pUC
9、pBR322およびpBR329であり、米国、ニュージャージ
ー州、ピスカタウェイ、ファーマシア（Pharmacis）よ
り入手可能なpPLおよびpKK223である。

相補的付着末端を介してDNAをベクターに操作的に連
結するための種々の方法が開発されている。例えば、相
補的ホモポリマー系をDNAセグメントに加え、ベクターD
NAに挿入することができる。ついで、該ベクターおよび
DNAセグメントを相補的ホモポリマー末端の間の水素結
合により接合させ、組換え型DNA分子を形成させる。

１またはそれ以上の制限部位を含有する合成リンカー
は、DNAセグメントをベクターに接合する別法を提供す
る。前記のように、エンドヌクレアーゼ制限消化により
生成されるDNAセグメントを、バクテリオファージT4DNA
ポリメラーゼまたはイー・コリDNAポリメラーゼＩ、突
出する３′,5′−エキソヌクレオチド分解活性を有する
３′−単鎖末端を除去し、重合活性を有するくぼみ３′
−末端を充足する酵素で処理する。

したがって、これらの活性の組み合わせは、鈍端DNA
セグメントを生成する。ついで、該鈍端セグメントを、
バクテリオファージT4DNAリガーゼのような鈍端DNA分子
の連結を触媒し得る酵素の存在下、多量のリンカー分子
と一緒にインキュベートする。すなわち、該反応の生成
物は、その末端にポリマーリンカー配列を有するDNAセ
グメントである。ついで、これらのDNAセグメントを適
当な制限酵素で切断し、該DNAセグメントと適合する末
端を生成する、酵素で切断した発現ベクターに連結す
る。

種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リ
ンカーはインターナショナル・バイオテクノロジーズ・
インコーポレイテッド（International Biotechnologie
s Inc.），米国、コロラド州、ニューヘイブンを包含す
る多くの供給源から入手できる。

本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドベクター構
築体で形質転換された宿主細胞に関する。該宿主細胞
は、原核または真核性のいずれかとすることができる。
細菌細菌は原核宿主細胞であることが好ましく、典型的
には、例えば、イー・コリ株DH5（米国、メリーランド
州、ベテスダ、ベテスダ・リサーチ・ラボラトリース
（Bethesda Reearch Laboratories）から入手可能）お
よびRP1（米国、メリーランド州、ロックビルのアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（American t
ype Culture Collection）（ATCC）（No.ATCC31343）か
ら入手可能）のようなイー・コリ株である。好ましい真
核宿主細胞は、酵母および哺乳動物細胞、好ましくはマ
ウス、ラット、サルまたはヒト繊維芽細胞株からのよう
な脊椎動物細胞である。好ましい真核宿主細胞は、ATCC
からCCL61として入手可能なチャイニーズ・ハムスター
・オバリー（CHO）細胞およびATCCからCRL1658として入
手可能なNIHスイス・マウス・胎内細胞NIH/3T3を包含す
る。

適当な細胞宿主の本発明のDNA構築体を用いる形質転
換は、典型的には、用いるベクターの型に依存して周知
方法により達成される。原核宿主細胞の形質転換に関し
ては、例えば、コーエン（Cohen）ら、プロシーディン
グス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA,69:2110（1972）；お
よびサンブロック（Sambrook）ら、モレキュラー・クロ
ーニング，ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular
Cloning,A Laboratory Manual），コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー，コールド・スプリング・
ハーバー,NY（1989）参照。酵母細胞の形質転換が、シ
ェルマン（Sherman）ら、メソッド・イン・イースト・
ジェネティックス，ア・ラボラトリー・マニュアル（Me
thods In Yeast Genetics,A Laboratory Manual），コ
ールド・スプリング・ハーバー,NY（1986）に記載され
ている。ベッグス（Beggs），ネイチャー（Nature）,27
5:104−109（1978）の方法もまた有用である。脊椎動物
細胞を、rDNA含有のレトロウイルスベクターで形質転換
することに関しては、例えば、ソルゲ（Sorge）ら、モ
レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Ce
ll.Biol.）,4:1730−37（1984）；グラハム（Graham）
ら、ウイロロジー（Virol.）,52:456（1973）；および
ウィグラー（Wigler）ら、プロシーディングス・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシスUSA,76:1
373−76（1979）参照。

形質転換に成功した細胞、すなわち本発明のDNA構築
含有の細胞は、周知方法により同定できる。例えば、本
発明の発現構築体を導入した結果得られた細胞を増殖さ
せ、本発明の蛋白質を産生できる。細胞を収穫し、溶解
し、そのDNA含量をサザン（Southern）により、ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Bio
l.）,98:503（1975）またはベレント（Berent）らによ
り、バイオテクノロジー（Biotech.）,3:208（1985）に
記載されているような方法を用いてDNAの存在について
試験することができる。また、上清中の蛋白質の存在
を、後記の抗体を用いて検出できる。

組換え型DNAの存在を直接的に検定することに加え
て、形質転換の成功は、組換え型DNAが蛋白質の発現を
方向付ける能力を有する場合、周知の免疫学的方法によ
り確認できる。例えば、発現ベクターで形質転換するこ
とに成功した細胞は、適当な抗原性を示す蛋白質を産生
する。形質転換されていると思われる細胞の試料を収穫
し、該蛋白質を適当な抗体を用いて検定する。

かくして、形質転換された宿主細胞自体に加えて、本
発明はまた、栄養培地中、それらの細胞の培養、好まし
くはモノクローナル（クローン的に同一の）培養、また
はモノクローナル培養に由来する培養も意図する。さら
に、該培養は蛋白質を含有していることが好ましい。

形質転換された宿主細胞を培養するのに有用な栄養培
地は当該分野において周知であり、数社より入手可能で
ある。

本発明の第六の態様は、宿主因子に対してワクチンを
接種した脊椎動物を提供することである。乳房炎に対す
る予防接種の場合、脊椎動物は、ブタ、ウシ、ヒツジま
たはウマのような乳房炎を患う傾向にあることが知られ
ている哺乳動物である。乳房炎は、通常、少なくともス
トレプトキナーゼが関連しない限りでは、中和免疫応答
を生じさせないため、少なくとも、本発明の方法（抗原
が細菌性ストレプトキナーゼに関連するものである）に
より乳房炎に対して予防接種されているこれらの哺乳動
物の場合、そのような哺乳動物は、中和抗ストレプトキ
ナーゼ抗体の存在により非予防接種哺乳動物（乳房炎を
患っている哺乳動物であっても）と区別できる。

本発明に係る乳房炎に対する予防接種は、乳房炎につ
いての公知療法と組み合わせて用いることができる。

本発明のワクチンおよび方法を特に乳房炎疾患に関し
て検討しかつ例示する。ワクチンの抗原体は原因微生物
であるストレプトコッカス・ウベリスにより産生される
ストレプトキナーゼまたは抗原的に同等なものである。
しかし、該発明は一般な原理に関するものであり、その
病原体の因子が宿主において蛋白質の分解を引き起こす
他の疾患にも適用できる。

栄養要求変異細菌はある種の必須アミノ酸を合成でき
ず、増殖させるためには該微生物用の培地にこれらのア
ミノ酸を供給しなければならない。乳汁中にあるアミノ
酸には３種の形態：遊離アミノ酸、非蛋白質ペプチド
（12％w/vのトリクロロ酢酸に可溶なものと定義）およ
びポリペプチドならびに蛋白質がある。アミノ酸の大部
分は、蛋白質の形態にて存在する。細菌は遊離アミノ酸
を容易に利用でき、ある場合には、スモールペプチドの
形態にてアミノ酸を用いることができる。しかし、高密
度の細菌増殖を達成するのに十分なアミノ酸を得るため
に、または蛋白質の形態でのみ存在する必須アミノ酸を
得るために、栄養要求変異細菌は、乳汁蛋白質の蛋白質
分解用の系を有していなければならない。

ストレプトコッカス・ウベリスは、化学的に限定した
培地における増殖実験により決定されるように、非常に
特異的なアミノ酸要求を有することが判明した。これら
の要求は、牛乳中、遊離形にて存在するアミノ酸では満
たされず、また牛乳中の非蛋白性の窒素の形態にて存在
するものによっても満たされない（アストン（Aston）1
975）。エス・ウベリスがウシ乳腺にて良好に増殖する
こと：乳腺中に注入された約300コロニー形成単位（cf
u）が、結果として、12時間後、乳汁1ml当たり約10⁵〜1
0⁷cfuを生じさせることが十分に確立されている。

本発明に係る、ここで抗原体が細菌性ストレプトキナ
ーゼに関するものであるワクチンおよび方法は、宿主の
プラスミノーゲンが活性化されず、したがって遊離アミ
ノ酸が乳汁中に生成されないように、細菌性ストレプト
キナーゼを阻害することで作用し、それによって、細菌
の増殖が十分迅速に阻害され、疾患が持続されないと考
えられる。

該ワクチンは、ストレプトコッカス・ウベリス・スト
レプトキナーゼの実質的に純粋なまたは非純粋な調製物
からなる。さらに、失活形態のストレプトキナーゼを含
有する調製物からなっていてもよい。

エス・ウベリス・ストレプトキナーゼ、または他のプ
ラスミノーゲン活性化因子あるいは細菌性プロテアーゼ
が、乳房炎に対するワクチンとして適当であることが判
明し、ワクチンとして用いる場合、種々の異なる経路に
より投与できる。乳腺の分泌液中、十分な抗体を産生
し、細菌誘発の蛋白質分解を中和するようにワクチンを
投与する。このことは、細菌による感染に対する乳腺の
保護を促進する。

エス・ウベリスにより産生されるストレプトキナーゼ
は、ウシ、ウマおよびヒツジプラスミノーゲンの活性化
能を有する。該ストレプトキナーゼは硫酸アンモニウム
沈降法、つづいて分子排除クロマトグラフィーによりエ
ス・ウベリスの培養濾液より製造できる。エス・ウベリ
スはプラスミノーゲン活性化活性を有する単一の蛋白質
を産生する。天然分子の分子量は約57kDであり、それに
対してSDS PAGEにより精製された蛋白質の分子量は29kD
である。これは、天然分子が29kDのサブユニットの二量
体からなり、SDSおよび２−メルカプトエタノールの存
在下、電気泳動の間に解離することを示唆している。

天然分子量は、ランスフィールド（Lancefield）Ａ群
ストレプトコッカス（46.7kD）またはランスフィールド
Ｃ群ストレプトコッカス（47.2kD）由来のストレプトキ
ナーゼについて観察される分子量と異なる。しかし、こ
れらの分子は共に、モノマー構造として存在し、SDS PA
GEの間に解離していない（ファング（Huang）ら、198
9）。スタフィロキナーゼ、スタフィロコッカス・アウ
レウス由来のプラスミノーゲン・アクチベーターは、23
kD（ジャクソンおよびタング（JacksonおよびTang）,19
82）と15.3kD（サコ（Sako）ら,1982）の間のサブユニ
ットの分子量を有し、活性用の二量体構造を必要とする
ことが示されている（ジャクソンら,1981）。この分子
がウシプラスミノーゲンを活性化するとは示されておら
ず、ウシ乳腺に感染するスタフィロコッカス・アウレウ
ス株中に存在するとは考えられない。

ストレプトコッカス・ウベリス・ストレプトキナーゼ
は、分子上に同様の抗原部位があることを反映して、他
のストレプトコッカス由来のストレプトキナーゼが産生
する抗血清とある種の免疫学的交差反応を示す。

本発明のさらなる態様は、乳汁中にて蛋白質分解を生
じさせる方法であって、ストレプトキナーゼを乳汁に添
加し、それによってストレプトキナーゼがプラスミノー
ゲンをカゼイン分解蛋白質プラスミンに活性化すること
からなる方法を提供する。

スイス型チーズ熟成におけるプラスミンの重要性が説
明されている（オルリカイネンおよびキベラ（Ollikain
enおよびKivela）1989）。スイス型チーズの熟成の間の
蛋白質分解の研究において、プラスミンのよるβ−カゼ
インの加水分解および該加水分解生成物、＿−カゼイン
およびプロテアーゼ−ペプトンがスイス型チーズの典型
であることが判明した。＿−カゼインおよびプロテアー
ゼ−ペプトンの産生はプラスミン活性であることを示し
ており、プラスミンがスイス型チーズ熟成についての重
要な、必須の酵素であると結論付けられる。したがっ
て、最終製品の風味がペプチド、アミノ産およびそれら
の誘導体に依存するチーズ熟成工程にてストレプトキナ
ーゼの潜在的な役割がある。

ストレプトキナーゼの別の使用の可能性は、活性化に
対して敏感であるプラスミノーゲンを有する種におい
て、繊維素溶解剤として用いることである。他のストレ
プトキナーゼが、通常、血栓崩壊障害を患っている患者
にて、この処置のために用いられる。

以下の実施例は、添付図面に関して、本発明の好まし
い態様を、制限することなく説明する。

第１図はストレプトコッカス・ウベリスの培養濾液か
らの硫酸アンモニウム沈降蛋白質の溶出特性を示す。

第２図は分子排除クロマトグラフィーによる硫酸アン
モニウム沈降蛋白質と高ストレプトキナーゼ活性フラク
ションの分離を示す。硫酸アンモニウム沈降蛋白質
（１）。低純度のフラクション（２）。高純度のフラク
ション（３）。天然分子量180、116、84、58、48.5、3
6.5および26.6kDを有する予備染色した分子量標品（シ
グマ）（４）。

第３図は、ウシ・プラスミノーゲンのある場合、ない
場合のストレプトコッカス・ウベリスによる乳汁蛋白質
の加水分解を示す。ストレプトコッカス・ウベリス株01
40J（ＡおよびＢ）を、ウシ・プラスミノーゲンの存在
（Ａ）および不存在（Ｂ）下、脱脂乳含有のアガロース
と共に重層させた。

第４図は、ランスフィールドＣ群ストレプトコッカス
からのストレプトキナーゼまたはエス・ウベリス培養濾
液を用いてプラスミノーゲンを活性化した後のカゼイン
分解活性の検出を示す。ウェルは、ランスフィールドＣ
群ストレプトコッカスからのストレプトキナーゼ（カラ
ム１）、エス・ウベリス培養濾液（カラム２）またはリ
ン酸緩衝セイライン（カラム３）と、ヒト（Ｈ列）、ウ
サギ（Ｒ列）、ブタ（Ｐ列）、ウマ（Ｅ列）またはウシ
（Ｂ列）プラスミノーゲンの混合物を含有する。PBS標
識の列は、プラスミノーゲンの代わりにリン酸緩衝セイ
ラインを含有した。

第５図は、エス・ウベリス培養濾液の存在下、インキ
ュベートした後のウシ・プラスミノーゲンのSDS PAGEを
示す。リン酸緩衝セイライン（Ａ）、リン酸緩衝セイラ
イン（PBS）中、1/1000（Ｂ）、1/100（Ｃ）および1/10
（Ｄ）に希釈したエス・ウベリス培養濾液２μｌの存在
下にあるウシ・プラスミノーゲンの痕跡。矢印はプラス
ミン関連のポリペプチドの位置を示す。PBS中、1/5に希
釈した培養濾液の電気泳動によれば蛋白質バンドは検出
されなかった。数は既知分子量の蛋白質の位置を示す。

実施例1:培養濾液からのストレプトキナーゼの精製この研究を通して、ストレプトコッカス・ウベリス株
0140Jを用いた。この株は、英国、リーディング、シン
フィールド、ザ・ナショナル・インスティテュート・オ
ブ・デイリー・リサーチ（the National Institute of
Dairy Research）で、当初、ウシ乳房炎のものから単離
した。

細菌を、25％（w/v）グリセロール含有のトッド・ヒ
ューウィット培地（Todd Hewitt broth）（THB）中、−
20℃で貯蔵した。培養を、最初、トッド・ヒューウィッ
ト培地10ml中、37℃で18時間増殖させた。カゼイン水解
物（１％,w/v）およびグルコース（１％,w/v）含有の化
学的限定培地（ライおよびフィールド（LeighおよびFie
ld）1991）にこの培養を接種し（培地500ml中に10μ
ｌ）、37℃で18時間インキュベートした。遠心分離（1
0,000g;20分間）に付し、得られた上清を濾過（孔径0.4
5μｍ）することにより細胞を除去した。ナトリウムア
ジドを培養濾液に0.05％（w/v）の最終濃度まで加え
た。

培養濾液からのストレプトキナーゼの精製はまた、固
定化モノクローナル抗体を用いる、アフィニティー・ク
ロマトグラフィー系により達成できる（ハーロウ・イー
＆レイン・ディー（Harlow,E.＆Lane,D.）（1988）アン
チボディーズ，ア・ラボラトリー・マニュアル，コール
ド・スプリング・ハーバー（USA））。

培養濾液からの硫酸アンモニウム沈降、ゲル濾過および
ストレプトキナーゼ活性の検出ストレプトコッカス・ウベリス株0140Jを用いた。硫
酸アンモニウム飽和溶液を細胞不含培養濾液に38％（v/
v）の最終濃度まで加えた。混合物を４℃で20時間撹拌
し、得られた沈降物を濾過（孔径0.45μｍ）により収集
した。その沈降物を0.05％（w/v）ナトリウムアジド含
有の蒸留水100mlに再び溶解し、同希釈液2.0リットルに
対して24時間透析した。その透析物を10kD排除リミット
を有する膜（米国、マサチューセッツ州、フィルトロン
（Filtron））を用いる撹拌圧力セル（米国、マサチュ
ーセッツ州、アミコン（Amicon））中、10倍に濃縮し
た。

500mlの概算充填床容量を有する、セファデックス（S
ephadex）Ｇ−75（スウェーデン、ウプサラ、ファーマ
シア（Pharmacia））含有のカラム（28x1000mm）を、リ
ン酸緩衝セイライン（PBS）で４℃で平衡化した。硫酸
アンモニウム沈降、再溶解、透析、濃縮した約10mlの蛋
白質溶液を該カラムに加え、蛋白質を0.5〜1.0ml/分の
流速でPBSにて溶出させた。フラクション（10ml）を収
集し、各５μｌをウシ・プラスミノーゲン活性化活性に
ついて検定した。

予備実験は、ストレプトキナーゼ活性体が33〜38％飽
和濃度で硫酸アンモニウムにより細胞不含培養濾液から
沈降することを示した（データは示さない）。その後
は、2.5リットルの細胞不含培養濾液からストレプトキ
ナーゼを沈降させるのに38％の飽和濃度を用いた。沈降
物を、再び溶解し、透析し、ゲル濾過前に濃縮した。

ストレプトキナーゼ活性体が約57kDの見かけ上の分子
量を有する単活性ピークとしてＧ−75カラムから溶出し
た（第１図）。フラクション21および22（高純度ストレ
プトキナーゼ）をプールし、同様にフラクション19、2
0、23および24（低純度ストレプトキナーゼ）をプール
し、−70℃で貯蔵した。見かけ上の活性の喪失はなかっ
た。

ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（SDS PAGE）および蛋白質染色ストレプトキナーゼ活性を有するプールしたフラクシ
ョンの純度を、既述したSDS PAGEおよび蛋白質染色法を
用いて測定した。

再溶解し、透析し、濃縮した硫酸アンモニウム沈降物
は、100〜29kDの範囲の分子量を有する６種の蛋白質を
含有した。低純度フラクションは29kD蛋白質および微量
の他の蛋白質を含有し、それに対して高純度フラクショ
ンは29kDの分子量を有する単一のバンドのみを含有した
（第２図）。

実施例2:アガロース／脱脂乳重層によるプラスミノーゲ
ン活性化の検出ウサギ、ヒト、ヒツジ、ウマおよびウシ由来のプラス
ミノーゲンをシグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Ch
emical Co.）（英国、ドーセット州、プール）から入手
し、1.0単位/mlの最終濃度に滅菌蒸留水中にて復元し
た。さらに、ランスフィールドＣ群ストレプトコッカス
からのストレプトキナーゼをシグマ社から入手し、リン
酸緩衝セイライン（pH7.4）中、1mg/mlの濃度で復元し
た。プラスミノーゲンおよびストレプトキナーゼを−70
℃で貯蔵し、使用前に一度だけ解凍した。

THB中で一夜培養し、トッド・ヒューウィット寒天上
に画線培養させ、37℃で18時間インキュベートした。単
離したコロニーのプレートを、NaCl（150mM）、トリス/
HCl（50mM、pH8.1）、オキソイド（Oxoid）脱脂乳（１
％v/v）およびウシ・プラスミノーゲン（10μg/ml）含
有の溶解アガロース（10μg/ml）10mlと共に重層させ、
37℃でインキュベートした。対照を、プラスミノーゲン
を除く以外、前記と同一の重層を用いて試験した。

エス・ウベリスの５種類の株（0140J、EF20、ST10、C
216、C197C）は、すべて、37℃で４時間以内に、脱脂
乳、ウシ・プラスミノーゲン、アガロースの重層中にて
カゼイン分解活性帯を生成した（第３図Ａ）。しかし、
この活性を示さない数種のエス・ウベリス株がある：こ
れらは、おそらく、ウシ乳腺についてのビルレントの減
少を示している。ウシ・プラスミノーゲンの不存在下に
ある重層において、単離したコロニーの回りに何ら帯は
検出できなかった（第３図Ｂ）。

実施例3:プラスミノーゲン活性化およびプラスミンの検
出等容量のプラスミノーゲン（種々の哺乳動物種からの
1.0単位/ml）とエス・ウベリス培養濾液またはランスフ
ィールドＣ群ストレプトコッカス由来のストレプトキナ
ーゼ（１μg/ml）を混合し、37℃で45分間インキュベー
トし、ついで、カゼイン分解活性を検出することによ
り、10μｌをプラスミンの存在について検定した。活性
を、37℃で24時間インキュベートした後の（プラスミノ
ーゲン不含の前記重層としての）脱脂乳アガロース中に
カットされたウェルからの拡散により検出した（第４
図）。

エス・ウベリス由来の培養濾液はウシおよびウマ・プ
ラスミノーゲンを活性化したが、後者での活性は、ウシ
・プラスミノーゲンを用いた場合の２時間と比較して、
脱脂乳アガロースで約18時間インキュベートした後での
み明らかであった。このことは、エス・ウベリス・スト
レプトキナーゼがこの基質について低活性であるかまた
は得られたプラスミン分子がウシ乳汁蛋白質に対して貧
活性であるかのいずれかを示唆する。エス・ウベリス培
養濾液はヒト、ウサギまたはブタのプラスミノーゲンを
活性化しなかった。対照的に、ランスフィールドＣ群ス
トレプトコッカス由来のストレプトキナーゼはヒト・プ
ラスミノーゲンを活性化し、ウマ・プラスミノーゲンに
対してわずかな活性を示したが、ウサギ、ウシまたはブ
タ細胞質からのプラスミノーゲンに対して全く活性を示
さなかった。エス・ウベリス培養濾液またはランスフィ
ールドＣ群ストレプトコッカスからのストレプトキナー
ゼはいずれも、プラスミノーゲンの不存在下でいずれの
カゼイン分解活性も示さなかった。

すなわち、エス・ウベリス培養濾液中にあるストレプ
トキナーゼ活性は、ブタ・プラスミノーゲンを活性化す
ると報告されている（エリスおよびアームストロング
（EllisおよびArmstrong）1971）ランスフィールドＥ群
ストレプトコッカスから単離されたものとは異なる活性
であった；エス・ウベリス培養濾液はこの分子を活性化
しなかった（第４図）。それはまたエス・エクイシミリ
ス（S.equisimilis）およびエス・ピオゲネス（S.pyoge
nes）からの類似活性とも異なった；それらは共にウシ
・プラスミノーゲンを活性化しないが、ヒト・プラスミ
ノーゲンを活性化した（カステリノ（Castellino）197
9,ウルフおよびメルツ（WulfおよびMertz）1969）。そ
れに対してエス・ウベリス由来のストレプトキナーゼは
ヒト・プラスミノーゲンを活性化しないが、ウシ・プラ
スミノーゲンを活性化した。これが、エス・ウベリスに
おけるプラスミノーゲン活性化活性の存在についての最
初の報告であり、ウシ・プラスミノーゲンを活性化する
ストレプトキナーゼについての最初の報告である。

実施例4:プラスミノーゲンのプラスミンへの変換ならび
にポリアクリルアミドゲル電気泳動および蛋白質染色に
よる検出ウシ・プラスミノーゲン（0.005単位／容量５μｌ）
を、エス・ウベリス培養濾液２μｌと混合し、37℃で１
時間インキュベートした。試料を等容量の試料−ドデシ
ル硫酸ナトリウム（0.01％w/v）および２−メルカプト
エタノール（0.2％v/v）含有の緩衝液と混合し、65℃で
５分間加熱した。蛋白質を電気泳動により分離し（レン
ムリ（Laemmli）1970）、オークレイ（Oakley）らの染
色法により検出した（第５図）。

この研究の間に用いたプラスミノーゲンは混入蛋白質
を含有した。供給人はプラスミンの混入が蛋白質全体の
５％以下であると主張する（英国、プール、シグマ・ケ
ミカル・コーポレーション（Sigma Chemical Co.））。
ウシ・プラスミノーゲンは91.2kDの見かけ上の分子量を
有し、これはこの蛋白質のアミノ酸配列に基づく概算分
子量と一致する（シャルラー（Schaller）ら、1985）。
プラスミノーゲンの活性化は、エス・ウベリス培養濾液
の1/10希釈により60分後に達成された（第５図）。これ
は、結果的に、別の蛋白質（48.5kD）と一緒に91.2kDの
蛋白質バンドを喪失させた。48.5kDの蛋白質の消失が、
培養濾液の作用の結果であるかまたは得られたプラスミ
ン活性の結果であるかどうかは明らかでない。これら２
種の蛋白質の消失は、56.2、28.8および25.4kDの見かけ
上の分子量を有する３種のスモールポリペプチドの形成
と一致した。

ウロキナーゼ（ヒト起源のプラスミノーゲン・アクチ
ベーター）によるウシ・プラスミノーゲンの活性化は、
分子量53.7および25.4kDのわずか２種のポリペプチドの
形成をもたらすと予測される（シャルラーら、1985）。
これらの蛋白質は、おそらく、各々、56.2および25.4kD
の蛋白質に対応している。その推定53.7kDのポリペプチ
ドは２つの潜在的糖付加部位を有し（シャルラーら、19
85）、これで推定値と観測値の間の不一致を説明でき
る。これはエス・ウベリス・ストレプトキナーゼがウシ
・プラスミノーゲン分子の活性化の間にウロキナーゼと
同様の方法にて作用することを示唆する。

全体のプラスミノーゲン活性化を達成するために用い
る濃度よりも２倍高い濃度で培養濾液を電気泳動した後
には、蛋白質バンドは見られないため、付加的なポリペ
プチド（28.8kD）の存在下は、細菌蛋白質の存在により
簡単には説明できない。この研究の間でプラスミノーゲ
ン活性化の後に観察される３種のポリペプチドの分子量
の累計は、ウシ・プラスミノーゲンのものと明らかに食
い違っている。これについての一の説明は、28.8kDポリ
ペプチドがプラスミノーゲン調製物に混入している48.5
kD蛋白質の分解生成物であり、活性化の間に減少すると
いうものである。精製したエス・ウベリス・ストレプト
キナーゼによる精製したプラスミノーゲンの活性化の生
成物の分子量を測定することによりこの不一致は解決さ
れるであろう。

実施例5:エス・ウベリス・ストレプトキナーゼに対する
モノクローナル抗体の生成マウスの予防接種精製したストレプトキナーゼ（10μｇ）をフロイント
不完全アジュバントと混合し、Balb/cマウスに皮下注射
した。この操作を、約21日間のインターバルの後に繰り
返した。特異抗体の生成を、以下のように、第二の注射
の10日後にモニター観察した。第二の注射の約１カ月後
で脾臓細胞の融合の４日前に、リン酸緩衝セイライン
（PBS;pH7.2）に懸濁させた精製ストレプトキナーゼ10
μｇを静脈内投与し、抗体産生を増加させた。

ハイブリドーマ細胞の産生および培養脾臓を予防接種したマウスから取り出し、常法に従っ
て融合を行った（ガルフレ（Galfre）ら、1977）。融合
細胞を、10％（v/v）ウシ胎児血清、0.1mMハイポキサン
チン、0.016mMチミジンおよび40μＭアミノプテリン
（英国、プール、シグマ社）含有のHAT培地（RPMI 1640
（英国、ペースリー、ライフ・テクノロジー（Life Tec
hnologies），ギブコ（Gibco）BRL）に再び懸濁させ
た。ついで、細胞を、２×10⁴個のマウス・マクロファ
ージ含有のHAT培地（1ml）で24時間前に接種した24−ウ
ェルの菌株群プレートに２×10⁶細胞/mlの濃度で分配し
た（1ml/ウェル）。その上清の試料をストレプトキナー
ゼ特異抗体の存在について試験した場合、ハイブリドー
マコロニーが明らかに可視できるまで、該プレートを、
５％CO₂の存在下、37℃でインキュベートした。上清が
ストレプトキナーゼ特異抗体を示したコロニーを増殖さ
せ、前記のように上清を抗−ストレプトキナーゼ活性に
ついて試験した。活性を示す培養を制限希釈により２回
クローンした。

Balb/cマウスを２〜４×10⁶個のクローン化ハイブリ
ドーマ細胞を用いて腹腔内（I.P.）注射することにより
腹水液を調製した。この操作の１週間前に、該マウスを
0.5mlの「プリスタン（Pristane）」（英国、ギリンガ
ム、アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Aldrich Ch
emical Co.）の商品名）のI.P.注射液を投与した。

ストレプトキナーゼ特異マウス抗体の検出精製、凍結乾燥したストレプトキナーゼを炭酸ナトリ
ウム緩衝液（pH9.6）に１μg/mlの濃度で再び溶解し、1
00μｌを、平底の96−ウェルのマイクロタイタートレイ
（米国、バージニア州、フロー・ラブズ（リンブロ）
（Flow labs（Linbro））のウェルに加えた。ストレプ
トキナーゼを該ウェルに18時間４℃で結合させた。過剰
なELISA−緩衝液（ツィーン20、0.05％v/v含有の0.1Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2）を用いて洗浄すること
により、非結合ストレプトキナーゼを該ウェルから除去
した。抗体含有溶液を適当なウェルに加え、結合ストレ
プトキナーゼと37℃で１時間反応させた。前記のよう
に、ELISA−緩衝液で洗浄することで非結合抗体を除去
した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に接合した
マウス・イムノグロブリン−特異抗体を添加し、37℃で
１時間インキュベートし、ELISA−緩衝液で洗浄して非
結合接合体を除去することにより結合抗体を検出した。
これはＯ−フェニルアミンジアミン（0.34mg/ml）およ
び過酸化水素（0.03％,v/v）含有のクエン酸緩衝液（0.
05Mクエン酸24.3ml、0.1M Na₂HPO₄25.7ml）100μｌを添
加することによって結合HRPを比色定量検出するもので
ある。顕色を約20分間行わせ、等容量の1M硫酸を加える
ことにより停止させた。

色相を492nmの波長で分光測光法により測定し、特異
抗体の存在を対照ウェル（ストレプトキナーゼを含有し
ないウェルおよび抗体含有溶液が加えられていなかった
他のウェル）における顕色と比較することにより測定し
た。

ストレプトキナーゼ中和活性の検出モノクローナル抗体（mAb）をPBS（pH7.2）に希釈
し、各希釈液を等容量のストレプトキナーゼ（0.5μg/m
l）と混合した。該混合物を室温で10分間インキュベー
トし、その後、各mAbの希釈液からの20μｌを、オキソ
イド脱脂乳（１％,w/v）および10^-3単位/mlのウシ・プ
ラスミノーゲン（シグマ）含有のアガロースシート中に
カットされたウェルに置いた。

mAbおよびストレプトキナーゼ含有のウェルを、スト
レプトキナーゼおよび等容量のPBSを加えた対照ウェル
（陽性）と、mAbだけを加えたウェル（陰性）と比較し
た。ストレプトキナーゼを中和するmAbの能力を、0.5μ
g/mlの全阻害が達成される最低濃度として表す（第１
表）。

実施例6:エス・ウベリス・ストレプトキナーゼに対する
ポリクローナル抗体の産生ウサギ予防接種および特異抗体の検出精製したストレプトキナーゼ（50μｇ）をフロイント
不完全アジュバントと混合し、ニュージランド系白ウサ
ギに皮下注射した。最初の注射の５週間および８週間後
で、さらに２回、この操作を繰り返した。本実施例にお
いて西洋ワサビ・ペルオキシダーゼに接合した抗体がウ
サギ・イムノグロブリンに対して特異的であるほかは、
実施例５にてマウス抗体について記載されているように
注射後の種々の時点で特異抗体の産生をモニターした。

ストレプトキナーゼ中和活性の検出固定化蛋白質Ｇ（スウェーデン、ウプサラ、MAB TRAP
ファーマシア）を用いてポリクローナル血清から精製し
たイムノグロブリンのストレプトキナーゼ活性を中和す
る能力を、特異モノクローナル抗体について実施例５に
記載されているように正確に測定した。

ポリクローナル抗体はエス・ウベリス・ストレプトキ
ナーゼの活性を中和するが、シグマ・ケミカル・カンパ
ニー（Sigma Chemical Co.）（英国、ドーセット州、プ
ール）から入手したエス・エクイシミリス（S.equisimi
lis）の活性を中和しなかった。

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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 39/09 A61K 39/395 A61P 31/04 171 C07K 14/315 C07K 16/40 C12N 15/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ウシ乳房炎の治療または予防に用いるため
のワクチンであって、免疫学的に有効な量の、動物にて
乳房炎を生じさせるストレプトコッカス菌により産生さ
れる、ウシプラスミノーゲン活性化蛋白、またはその蛋
白の免疫原性フラグメントおよび医薬上許容される担体
を含むワクチン。
【請求項２】ストレプトコッカス菌がストレプトコッカ
ス・ウベリスである請求項１記載のワクチン。
【請求項３】免疫学的に有効な量の、ストレプトコッカ
ス菌により産生される、ウシプラスミノーゲン活性化蛋
白、またはその蛋白の免疫原性フラグメントを動物に投
与することを特徴とする、ウシ乳房炎の治療または予防
法。
【請求項４】ストレプトコッカス菌がストレプトコッカ
ス・ウベリスである請求項３記載の方法。
【請求項５】ストレプトコッカス・ユベリスにより産生
されるウシプラスミノーゲン活性化蛋白またはその蛋白
の免疫原性フラグメントと、医薬上許容される担体とを
組み合わせることを特徴とする、ウシ乳房炎の治療また
は予防用ワクチンの製法。
【請求項６】SDS−PAGEで測定した場合に約29kDの分子
量を有する、ストレプトコッカス・ウベリスで産生され
る単離ウシプラスミノーゲン活性化蛋白、またはその蛋
白の免疫原性フラグメント。
【請求項７】SDS−PAGEで測定した場合に約29kDの分子
量を有する、ストレプトコッカス・ウベリスで産生され
るウシプラスミノーゲン活性化蛋白に対して反応性を有
する単離された抗体。
【請求項８】乳汁にて蛋白分解を生じさせる方法であっ
て、乳汁にストレプトコッカス・ウベリスにより産生さ
れるウシプラスミノーゲン活性化蛋白を添加することを
特徴とする方法。