JP3238701B2

JP3238701B2 - リポソーム押出法

Info

Publication number: JP3238701B2
Application number: JP51854391A
Authority: JP
Inventors: コエ，ロイデン，エム; チエス，ロバート，エル; ポートノッフ，ジョエル，ビー
Original assignee: ザリポソームカンパニー，インコーポレイテッド
Priority date: 1990-10-05
Filing date: 1991-10-04
Publication date: 2001-12-17
Anticipated expiration: 2016-12-17
Also published as: AU649293B2; GR3020216T3; IE913494A1; DK0552299T3; EP0552299A1; AU8945091A; FI103092B; EP0552299A4; CA2091776C; DE69118708T2; FI103092B1; EP0552299B1; FI931512A0; CA2091776A1; ATE136456T1; FI931512L; ES2087315T3; JPH06501646A; WO1992005772A1; DE69118708D1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、リポソームのサイジング（分粒）方法に関
するものであり、更に詳しくは、分岐細孔型酸化アルミ
ニウム多孔性フィルターからリポソームを押し出すこと
を含むサイジング方法に関するものである。

リポソームは、取り込まれた水性容積を含む完全に閉
鎖された脂質二分子膜である。リポソームは、単ラメラ
小胞（１個の二分子膜を有する）であっても、多重ラメ
ラ小胞（複数の膜状二分子膜が、それぞれ隣接する膜か
ら水性層により分離されていることを特徴とする玉葱状
構造物）であってもよい。二分子膜は、疎水性“尾”領
域と親水性“頭”領域とを有する２つの脂質単分子膜で
構成されている。膜状二分子膜の構造は、脂質単分子膜
の疎水性（非極性）“尾”が二分子膜の中心に向かって
配向し、一方、親水性“頭”が水性相に向かって配向す
るようになっている。

Bangham等〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー（J.Mol.Biol.），13,238−252（1965）〕の初
期のリポソーム調製法では、リン脂質を有機溶剤中に懸
濁させ、次いでそれを蒸発乾固させて、反応容器上にリ
ン脂質フィルムを残留させる。次いで、適量の水性相を
加えて、混合物を“膨潤”させ、多重ラメラ小胞（MLV
s）からなる生成リポソームを機械的手段により分散さ
せる。この技術は、大単ラメラ小胞（LUV）と同様に、P
apahadjopoulos等〔バイオヒミカ・バイオフィジカ・エ
ト・アクタ（Biochim.Biophys.Acta.）,135,624−638
（1968）〕が述べている音波処理した小単ラメラ小胞
（SUV）の開発の基礎を提供している。更に、1980年11
月25日にPapahadjopoulos等に発行された米国特許4,23
5,871号は、逆相蒸発小胞（REVs）としても知られてい
るオリゴラメラ脂質小胞を作る“逆相蒸発法”について
述べている。

例えば、活性成分取込効率及び装填性が高く、安定性
が良好であり、漏れが少なく、製造が容易であるといっ
たような、特に改善された性質を有していることがわか
っている改良された多重ラメラ小胞を形成するために、
別の方法が開発されている。このような改良された一つ
のリポソームは、安定複ラメラ小胞（SPLVs）と呼ば
れ、1985年６月11日に発行されたLenk等の米国特許第4,
522,803号に記載されている、このような改良された他
のものは、単相小胞（MPVs）と定義され、1986年５月13
日に発行されたFountain等の米国特許第4,558,578号に
記載されている。これらのリポソームは、両方とも、実
質的に等しい層間（ラメラ間）溶質分散を有していると
いわれている。広範な文献目録を含む、種々のリポソー
ム製造方法の概説を、参考のためにここに引用した、M.
Ostro編、リポソーム（1983）、27〜51頁、Deamer及びU
sterの“リポソームの製造：方法と機構”に述べられて
いる。各種の薬剤搬送体系において、遊離薬剤の投与と
組み合わせて、あるいはそれに代わるものとして使用す
るために、リポソーム内にカプセル化されるか、若しく
はリポソームと結合した薬剤を投与することが提案され
ている。いくつかの適用において、リポソームは、長期
間にわたって、薬剤を接続放出することが見出されてお
り、これは、種々の形態の癌又はエイズ関連病の治療に
しばしば要求される長期間の化学療法養生法において、
特に重要であることができる。リポソームのもう一つの
性質は、食細胞のようなある特定の細胞により取り込ま
れる能力であり、従って、リポソームは、その活性成分
を細胞の内部に搬送することができる。このことは、ミ
コバクテリア、プルセラ、リステリア及びサルモネラ種
と関連する感染のような細胞内感染を治療する際に、こ
のようなリポソーム治療を特に有用なものとする。この
ように、リポソーム内にカプセル化された薬剤を、多量
の遊離非カプセル薬剤を血流中に投与することなく、こ
のような細胞内疾病の治療のために搬送することができ
る。更に、ある特定の薬剤又は他の生理活性剤を単にリ
ポソームと結合させるだけで、かかる薬剤又は生理活性
剤の活性を高め若しくは改良し、あるいはそれらの毒性
を低減させることが見出されている。

リポソームは、粒子のごとく挙動し、一般に、平均粒
径及び粒径分布により表わされる。リポソームのある特
定の使用では、特に薬剤の非経口投与における使用で
は、特に、実質的に全てのリポソームが、所定の最大直
径よりも小さい粒径となるように、リポソームをサイジ
ングすることにより、リポソームを目的とする平均粒径
にサイジングし、制御された粒径分布を保持することが
重要である。非経口投与を目的とするリポソームについ
ては、一つの望ましい粒径範囲は、約100nmと1000nmの
間であり、好ましくは約100nmと500nmの間である（ここ
で用いる場合、nmはナノメートル（10−⁹m）を表わし、
umはマイクロメートル（10−⁶m）を表わす）。一般に、
約200nmの粒径を識別する従来の滅菌フィルターで濾過
することにより、リポソームを滅菌する要望があるとき
は、最大目的粒径がしばしば制限される。しかし、主要
な生物学的効率（overriding biological efficacy）及
び／又は安全係数により、大きいか、または小さいとい
った、特定の粒径の必要性を示すことができる。リポソ
ームの粒径範囲を制御することにより、リポソームの安
定性及び耐漏れ性と共に、生体内リポソームの有効性を
改良することができる。

種々のリポソーム製造法により、一般に、粒径が広範
囲に変わるリポソームの懸濁液が作られ、その多くは、
平均粒径が1000nmを超える。このような懸濁液の中のリ
ポソームの粒径及び粒径分布を低減させるために、多く
の方法が提案されている。簡単な均質化方法において
は、リポソーム粒子の目的とする平均粒径が得られるま
で、高圧下で、リポソームの懸濁液を小さいオリフィス
又は反応室を通して、繰り返し、ポンプで送る。この方
法の限界は、リポソーム粒径分布が、典型的に非常に広
く、均質化サイクル数、圧力及び内部温度によって変動
するということである。

直径が100nmよりも小さいと、一般にいわれる小単ラ
メラ小胞（SUVs）は高度にひずみ、湾曲した二分子膜で
構成されている。SUVsは、典型的には、より大きいリポ
ソームを超音波処理で破砕することにより製造される。
このようなリポソームの狭い粒子分布は、リポソーム
が、その最も小さい粒径、約50nm未満、にされたとき
に、達成されることができるだけであることがわかって
いる。更に、この方法は、一般に、比較的小容量の長時
間音波処理で、バッチ法として行なわれるために、大規
模生産には向かないかも知れない。更に、音波処理中の
熱蓄積が、脂質に過酸化の損傷をもたらし、音波処理プ
ローブが、潜在的に生体内でまったく有毒であるおそれ
のあるチタン粒子を放散するかも知れない。

200nmのユニポア（Unipore）（商標）カーボネートフ
ィルターでの濾過によるリポソームのサイジング方法
は、Szoka,プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.），75,4194−８（1978）で検討されている。約1
000nmから約100nmまでの一連の均一な直線状細孔型ポリ
カーボネート膜からのリポソーム押出に基づくサイジン
グ処理法は、Hunt等、米国特許第4,529,561号、1985年
７月16日発行、に記載されている。しかし、この方法
は、比較的遅く、目的とする粒径分布を得るには、種々
のサイズのフィルターに多数回通す必要があることが多
い。

小胞は、ここに参考のために引用しているCullis等、
米国特許第5,008,050号、1991年４月16日発行、に記載
されている押出法を用いて粉砕してもよい。この技術に
より作られる小胞は、100nm以下の細孔サイズを有する
フィルターから加圧下に押し出される。この方法は、上
記均質化及び音波処理方法の問題を回避し、上に引用さ
れた米国特許第4,529,561号に記載されたように、サイ
ズの小さくなるフィルターに何回も通す必要はない。こ
のような方法は、特に、この物質を選択されたサイズの
フィルターに数回循環させることにより、まったく狭い
リポソームの粒径分布を与えることができる。更に、こ
のような押出により、多重ラメラ小胞がオリゴラメラ又
は単ラメラ形態にさえ変わるかも知れないし、それがあ
る用途には必要とされるかも知れないと信じられてい
る。しかし、本明細書において以下に述べる実施例によ
り示されるように、この参考実施例で用いられるヌクレ
ポア（Nuclepore）（商標）フィルターのような、100nm
のポリカーボネートフィルターからかかる押出が行なわ
れる場合は、比較的高い圧力でも、流量は比較的低いか
もしれない。

1988年４月12日に発行された米国特許第4,737,323号
は、非対称セラミックフィルターからの押出によるリポ
ソームのサイジング方法を記載していている。このよう
なフィルターは、比較的高い圧力で作動するように設計
されており、詰まりを防ぐために、逆流出（バックフラ
ッシュ）されることができる。1990年５月23日に発行さ
れた米国特許第4,927,637号は、ウエブ状の“蛇行路（t
ortuous−path）”構成を有するポリマーフィルターに
リポソームを通すことによるリポソームのサイジング方
法を記載している。

別のタイプのフィルター媒体が、Furneaux等、米国特
許第4,687,551号、1987年８月18日発行、に記載されて
いる。この特許は、フィルムの一つの面から他の面に分
岐細孔が延在している陽極酸化アルミニウム（anodic a
lminum oxide）フィルムを含む、新しいタイプのフィル
ターシートを開示している。このフィルムは、一つの面
から内側へ伸びるより大きい細孔の系と、他の面から内
側へ伸びるより小さい細孔の系を含むという点に特徴が
ある。一つ以上のより小さい細孔の内側端部が一つのよ
り大きい細孔の内側端部と結合し、より大きい細孔が実
質的に盲になっていないように、より大きい細孔の系
が、より小さい細孔の系と連結している。この特許は、
このような分岐細孔型酸化アルミニウム多孔性フィルム
及びその形成方法を開示する目的で、本明細書に参考の
ために引用されている。

特定の実施態様において、Furneaux等の特許の分岐細
孔陽極酸化アルミニウムフィルムは、次のように記載さ
れている。

一つの面からある距離だけフィルムの中へ延び、内側
端部近傍において直径がｄであるより大きい細孔の系
と、他の面から距離ｓだけフィルムの中へ延び、実質的
に均一な最小直径ｐを有するより小さい細孔の系とを含
み、一つ又はそれ以上のより小さい細孔の内側端部が一つ
のより大きい細孔の内側端部と結合し、より大きい細孔
が実質的に盲になっていないように、より大きい細孔の
系が、より小さい細孔の系と連結しており、ｄは10nm〜2um、ｐは少なくとも2nmであるが0.5d未満、ｓは10nm〜1umである、フィルムの一つの面から他の面に伸びている細孔を有す
る陽極酸化アルミニウムフィルム。

このような分岐細孔型フィルムのサイズ等級は、より
小さい細孔の実質的に均一な最小直径ｐに等しい。

Furneaux等の特許の記載に従って作られた濾過膜は、
市販されており、Anotec Separations,New York,NYによ
り、アノポア（Anopore）（商標）の名前で販売されて
いる。このような分岐細孔型膜に関する追加の情報が、
Furneaux等、“陽極酸化されたアルミニウムからの多孔
性の調節された膜の形成”、ネイチャー（Nature），33
7,147−９（1989）に提供されている。

このような分岐細孔アノポア（商標）フィルターの一
使用が、Jones等、“バクテリアの直接計数に関する、
トラックエッチされた（track−etched）ポリカーボネ
ート膜フィルター（ヌクレポア）との新しい無機膜フィ
ルター（アノポア）の比較”、Applied and Environmen
tal Mrcrobiology,55（２）,529−30（1989）、に記載
されている。この論文は、細孔サイズが200nmのアノポ
ア（商標）フィルターのバクテリア濾過能を、細孔サイ
ズが200nmのヌクレポア（Nuclenore）（商標）フィルタ
ーと比較している。

本発明の方法によれば、（１）一部の粒径が所定の最
大粒径よりも大きいポリソームの懸濁液を用意し、
（２）この懸濁液を、加圧下に１回以上酸化アルミニウ
ム多孔性フィルムに通過させることにより、所定の最大
粒径よりも大きいポリソームを実質的に含まないリポソ
ーム集団（population）が製造される。

約100〜1000nmの範囲内の平均粒径を有するリポソー
ムを得るために、1000nm以下の細孔サイズを有するフィ
ルムを用いることができる。本発明の特定の実施態様に
おいては、所定の最大直径が約500nm未満であるリポソ
ーム集団を得るために、200nm以下の細孔サイズ等級を
有するフィルムを用いる。他の実施態様においては、約
100nm以下の細孔サイズを有するフィルムを使用し、平
均リポソーム粒径が約100〜200nmとなるまで、リポソー
ム懸濁液を１回以上フィルターに通す。

本発明の更なる実施態様においては、目的とする粒径
分布が得られるまで、リポソーム懸濁液を多孔性フィル
ムに繰り返し通す。特定の実態様では、リポソームを多
孔性フィルムに２〜10回通す。更に別の実施態様におい
ては、２〜10マイクロメートルのフィルターに１回以上
通すことにより、リポソームをプレサイズ（presize）
する。本発明で使用するのに好ましいフィルムは、分岐
細孔型陽極酸化アルミニウム多孔フィルムである。上で
論じたように、このような分岐細孔陽極酸化アルミニウ
ム多孔フィルムは、二つの実質的に平行な主面を有し、
細孔がシートの一つの面から他の面に伸びて延在してお
り、一つの面からシート内へ伸びる大きい細孔の系と、
他の面から内側へ伸びる小さい細孔の系を含み、一つ以
上の小さい細孔の内側端部が一つの大きい細孔の内側端
部と結合し、大きい細孔が実質的に盲になっていないよ
うに、大きい細孔の系が、小さい細孔の系と連結してい
る酸化アルミニウムシートである。このような分岐細孔
型フィルムのサイズ等級は、小さい方の細孔の最小直径
に等しく、その細孔は、実質的に均一であることが好ま
しい。

本発明の更なる実施態様においては、この濾過方法を
実施する装置が提供される。この装置は、酸化アルミニ
ウム多孔性フィルムを操作配置に保持する一つ以上のフ
ィルター集成装置（アセンブリ）、リポソーム懸濁液を
そのフィルター集成装置へ供給する手段、及びその集成
装置から濾液を受容する手段を含む。特定の実施態様で
は、二つ以上の集成装置を平行配置で使用して、供給手
段から受容手段へ通過するリポソーム懸濁液を濾過す
る。濾液の少なくとも一部を再循環させて、受容手段か
ら供給手段へ戻す手段を任意に設けることもでき、かく
して、リポソームをフィルターに多数回通すのに備え
る。更に、受容手段の下流に、滅菌フィルターを設ける
ことができ、それは医薬用の濾液を調製するのに適当で
あるかもしれない。

押出は、速くて安価であり、除去されなければならな
い溶媒や他の薬品の使用を必要としない。

図１は、本発明により作られたフィルター集成装置
の、縮尺によらない簡略化した平面図である。

図２は、図１に示したフィルター集成装置の、線２−
２による、縮尺によらない簡略化した側断面図である。

図３は、本発明により作られた押出系の概略図であ
る。

上記Furneaux等の文献で論じられているように、酸の
中でアルミニウムを陽極化して、フィルムの一つの面の
大きい細孔サイズ開口からフィルムの他の面の小さい細
孔サイズ開口へ分岐していることが好ましい円筒状細孔
を有するセル又は開口の均一な配列を作ることができ
る。このようなフィルターは、種々の細孔サイズで入手
することができ、リポソームの最終用途に応じて、より
小さい又はより大きい細孔サイズを使用することができ
るが、本発明で使用するには、小さい方の細孔の細孔サ
イズが約1000nm未満であるものが好ましい（以下、特に
断わらない限り、このようなフィルターに関する“細孔
サイズ”は、小さい方の細孔の最小細孔サイズを意味す
るものとする）。現在、Anotec Separations社から市販
されているアノポア（商標）陽極化アルミニウム多孔性
フィルムのうち、細孔サイズが200nm未満であるもの
は、分岐細孔構造のものであり、細孔サイズが200nm以
上であるものは、一つの面から他の面へ細孔サイズが均
一なものである。リポソームの目的とする平均粒径が約
200nm未満である場合は、フィルターの好ましい細孔サ
イズは約100nm未満である。これらのフィルターは、好
ましい分岐細孔型構造のものでもある。これらの酸化ア
ルミニウムフィルターは、親水性である。即ち、それら
は、水性溶媒中で膨潤せず、良好な耐有機溶媒性を有
し、高流通特性を促進する均一なサイズの細孔を有して
いる。このようなフィルムの性質のために、比較的低圧
下にて、比較的高流量で、リポソームをフィルムから押
し出せることがわかった（下記実施例３参照）。このよ
うに、酸化アルミニウムフィルターは、従来知られてい
るポリマーのフィルターよりも、リポソームを押し出す
のに優れていることがわかる。

本発明においては、リポソームが小さいサイズの細孔
を有する面に入り、大きいサイズの細孔を有する面から
出るように、分岐細孔フィルターを用いるのが好まし
い。しかし、下記実施例に示すごとく、リポソームが大
きい細孔サイズの面に入るような逆の位置にフィルター
を設けた場合でも、良好な押出を得ることができる。

本発明の方法によれば、一部の粒径が所定の最大粒径
よりも大きいリポソームの懸濁液から、所定の最大粒径
よりも大きいリポソームを実質的に含まないリポソーム
集団が製造される。この方法は、上記タイプの一つのよ
うな、酸化アルミニウム多孔性フィルムに、リポソーム
の懸濁液を、加圧下で１回以上通すことを含む。

リポソームの集団が、“所定の最大粒径よりも大きい
リポソームを実質的に含まない”かどうかを測定するた
めに、標準サイザーを用いて、リポソームをテストする
ことができる。このような一つのサイザーは、Malvern
Instruments,Malvern,Englandから入手できるモールバ
ーンサイザー（Malvern Sizer）であり、それは、下記
実施例のいくつかに記載され、使用されている。粒径分
布を測定するのに用いることのできる他のサイザーは、
Hiac/Royco Instruments,Menlo Park,CAから入手できる
ニコンプ（Nicomp）（商標）レーザー粒子サイザーであ
り、これも、下記実施例のいくつかに記載され、使用さ
れている。下記実施例で報告されている粒径分布におい
ては、テスト結果が、集団中に存在するリポソームの0.
0パーセントが所定の粒径より大きいことを示す場合
は、集団がこのような大きい粒径のリポソームを“実質
的に含まない”ことを示す。

必須ではないが、リポソームの粒径、特に粒径分布
を、第一工程として、より大きいフィルターから押し出
すことにより、より小さく、より均一にすることもでき
る。例えば、当該技術においてよく知られているよう
に、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）から作られた
フィルターのような、サイズが２〜10マイクロメートル
の適当なフィルターからリポソームを押し出せば、酸化
アルミニウムフィルターから押し出す前に、粒径及び粒
径分布が小さくなり、それにより、押出の時間を低減さ
せることができる。

押出中の圧力は、用いられるリポソーム、その平均粒
径及び粒径分布並びに目的とする流量によって変わって
くる。押出圧力は、約200〜約1000psi（1.4〜6.9MPa）
の範囲で変わってもよいが、約600psi（4.2MPa）未満の
圧力が好ましい。

一般に、本発明の分岐細孔型酸化アルミニウムフィル
ターを用いる場合、従来知られているポリカーボネート
フィルターに対して、粒径、粒径分布及び流量に関して
同様な結果を得るのに必要とする押出回数が少なくな
る。しかし、より狭い粒径分布を得るために、特に、全
てのリポソームを所定の最大粒径よりも小さくするため
に、酸化アルミニウムフィルターからの押出を繰り返し
てもよい。例えば、粒径分布を狭くして、速く、有効で
安価な方法で、高性能の比較的均一なリポソームを製造
するには、リポソームをフィルターから２〜10回押し出
すのが好ましい。多数回の押出により、多重ラメラ小胞
を、より好ましいオリゴラメラ又は単ラメラ形態に変え
ることもできる。

本発明の押出法に続いて、透析又は透析ろ過（ダイア
フィルトレーション）により、比較的均一な粒径の安定
な薬剤カプセル化リポソームを残して、遊離のカプセル
化されなかった治療薬又はその他の溶液を容易に除去す
ることができる。得られたリポソームは、容易に計量さ
れて、非経口又は経口で投与するための均一な用量とす
ることができる。

本発明を次の実施例により更に説明するが、ここに記
載されたものに本発明を限定するものではない。

実施例１リポソームの調製３バッチのリポソーム（以下Ａ、Ｂ、Ｃで表わす）を
次のようにして調製した。

卵ホスファチジルコリン（Princeton Lipids,Princet
on,New Jerseyから取得）71.3mg/ml及びコレステロール
（J.T.Baker,Phillipsburg,New Jersey）28.7mg/mlを0.
15〜0.5mlの塩化メチレンに溶解し、300mMクエン酸緩衝
液（pH4.0）に加えて、1mlの容積にした。混合物を約40
℃に加熱して、塩化メチレンを除去した。溶剤の除去を
促進するために、バッチＡ及びＣには窒素を通したが、
バッチＢは部分真空下で加熱した。

得られたリポソームは、種々の粒径及び種々の粒径分
布の小胞であった。粉砕前のこれらのリポソームの最初
の粒径分布を、Malvern Instruments,Malvern,England
から入手できる。63mmのレンズを有するモールバーンサ
イザー3600E型で測定した。結果を表Ｉに示す。表Ｉに
おいて、平均直径及び粒径分布範囲は、マイクロメート
ル（um）表わされる。押出前に、バッチＢを、細孔サイ
ズが５μｍのマイテックス（Mitex）（商標）PTFEフィ
ルター（Millipore Corp.,Bedford,Mass.）によりプレ
サイズ（予備分粒）した。プレサイジング後のバッチＢ
のリポソームについての平均直径及び分布範囲が、表Ｉ
に含まれている。バッチＡ及びＣは、プレサイジングに
通されなかった。この結果は、サイズしていないリポソ
ームの粒径分布において、かなりのバッチ対バッチ（ba
tch−to−batch）変動を示している。

表Ｉ押出前のリポソーム粒径バッチ平均直径（um）分布範囲（um）Ａ 23.2 1.5−118 Ｂ 14.9 1.5−118 Ｂ＊ 2.5 ＜1.2−５Ｃ 3.3 ＜1.2−14 ＊５マイクロメートルプレサイジング後実施例２リポソームの押出本発明により、実施例１のリポソームを、上記タイプ
の直径90mm、細孔サイズ100nm（小さい細孔）のアノポ
ア（商標）分岐細孔酸化アルミニウムフィルターに通し
て、加圧下で５回押し出した。バッチＡ及びＢについて
のフィルターの配置は、小さい細孔の表面を通して投入
されるものであった。大きい細孔を通して投入されるよ
うに、フィルターを逆にした状態で押し出したバッチＣ
についても、良好な結果が得られた。表示した回数だけ
フィルターに通した後、リポソームの平均直径及びリポ
ソームの粒径分布を測定した。粒径分布は、Hiac/Royco
Instruments,Menlo Park,CAから入手できるニコンプ
（商標）モデル370レーザー粒子サイザー（選別機）で
測定した。各押出後に測定した結果を、表IIにまとめ
る。

比較例比較のために、実施例のバッチＣで調製したリポソー
ムのサンプルを、最初の５回は直径90mm、細孔サイズ20
0nmのヌクレポア（商標）ポリカーボネートフィルター
に通し、２回は100nmのヌクレポア（商標）フィルター
に通し、１回は220nmの滅菌フィルターに通して、合計
８回押し出した（ヌクレポア（商標）フィルターは、Nu
clepore,Inc.,Pleasanton,CAから市販されている）。本
発明により、第二のサンプルを、直径90mm、細孔サイズ
100nmのアノポア（商標）フィルターに４回通して押し
出した。第一のサンプルの場合と同様に、このサンプル
を220nmの滅菌フィルターに通した。第１欄に示した押
出回数後に、粒径データを測定した。全ての押出は、40
0psi（2.8MPa）の同一圧力で行なわれた。結果を表III
に示す。

本発明の分岐細孔型酸化アルミニウムフィルターは、
同等の粒径分布を得るのに、ポリカーボネートフィルタ
ーよりも高い流量で、必要とする押出回数が少ない。

実施例３分岐細孔型陽極化酸化アルミニウムフィルムの粉砕能
力を、同等の細孔サイズのポリカーボネートフィルター
と比較するために、追加のテストを行なった。実施例１
により作られた卵ホスファチジルコリンとコレステロー
ルのリポソームを用い、100mg/mlのリポソーム水性懸濁
液で、テストを行なった。この実施例では、コレステロ
ールを、Croda Chemicals,New York,New Yorkから取得
した。モールバーンサイザーで測定した当初の粒径分布
は、中立径が10.9um、直径範囲が2.4〜118umであった。
サブミクロン粉砕を促進するために、100psi（0.7MPa）
の圧力で、バッチを5umのマイテックス（商標）PTFEフ
ィルターに２回通して処理した。この工程後、リポソー
ムの中立径は、3.5μｍと測定され、直径の範囲は、1.9
〜11umであった。

このバッチを２つの部分に分割した。部分番号１を0.
1マイクロメートルのアノポア（商標）フィルターに通
して、押し出し、部分２を0.1マイクロメートルのヌク
レポア（商標）ポリカーボネートフィルターに通して、
押し出した。両部分についての最初の押出圧力は、300p
si（2.1MPa）であった。押出流量、粒径及び粒径分布
を、フィルターに通す毎に測定した。各部分について、
合計５回の押出を行なった。結果を表IVに示す。

これらのデータは、両フィルターが、同一押出回数で
同様な粒径分布を与えることができることを示してい
る。しかし、第一の部分に用いられた酸化アルミニウム
フィルターは、第二の部分に用いられたポリカーボネー
トフィルターよりも、圧力が低くてもよく、はるかに高
い流量で操作された。酸化アルミニウムフィルターを通
す全ての押出は、300psi（2.1MPa）の圧力、0.6〜0.8リ
ットル／分の流量で行なわれた。ポリカーボネートフィ
ルターを用いて押出を繰り返した場合は、0.02リットル
／分という非常に低い流量で、フィルターでの最初の押
出を完了させるだけでも、初期圧力を300spi（2.1MPa）
から500spi（3.4MPa）に高めなければならなかった。２
〜５回目の押出では、0.2〜0.3リットル／分の流量を保
持するために、700psi（4.8MPa）という高圧力が必要で
あった。

実施例４リポソームを粉砕するのに用いられる100nmのアノポ
ア（商標）分岐細孔フィルターの方向に関して、リポソ
ームの押出特性の差異を検討するために、更にテストを
行なった。上で論じたように、アノポア（商標）0.1um
分岐細孔フィルターは、100nmの細孔を有する小さい細
孔の側と、200nmの細孔を有する大きい細孔の側とを有
している。このテストでは、小さい細孔の側を上流にす
るかあるいは大きい細孔の側を上流にした100nmアノポ
ア（商標）フィルターに、同一リポソーム物質の一部を
通す効果を求めるために、比較を行なった。

実施例１により作られた卵ホスファチジルコリンとコ
レステロールのリポソームを用い、100mg/mlのリポソー
ム水性懸濁液で、テストを行なった。この物質は、５リ
ットルの単一ロットで調製し、よく混合して、４つの75
0mlサンプル（Ａ〜Ｄ）に分割した。サンプルＡ、Ｂ
は、100nmを上流に向けたものを用いて押し出し、サン
プルＣ、Ｄは、200nmを上流に向けたものを用いた。リ
ポソームの押出は、400psi（2.8MPa）の圧力で、リポソ
ームを分岐細孔フィルターに２回通すことにより行なわ
れた。

各テストサンプルから濾過された物質の粒径分布を、
実施例２に述べたように、ニコンプ（商標）サイザーを
使用して測定し、一般に、等価であることがわかった。
しかし、リポソームを粉砕するのに要する時間は、200n
mフィルター側を上流としたサンプルＣ、Ｄとは反対
に、100nmフィルター側を上流としたサンプルＡ、Ｂで
は、著しく短かった。表Ｖは、平均粒径をナノメートル
（nm）で、濾過時間を分（min）で示す。

次いで、比較例で用いたものと同じタイプの200nm滅
菌フィルターで、押し出された物質を滅菌濾過した。こ
のテスト及び上記比較例で用いた滅菌フィルターは、Mi
llipore Corp.,Bedford,Massにより供給され、デュラポ
ア（Durapore）（商標）ポリビニリデンヂフルオリド
（PVDF）蛇行路膜を有するといわれる、市販のミリパッ
ク（Millipak）（商標）200フィルターであった。全て
の物質が滅菌フィルターを通過したとき、又は物質の定
常流が壊れて、ゆっくり滴下するようになったとき、滅
菌濾過が完了したものとした。平均粒径（nm）、フィル
ターを通過するのに要する時間（min）及び滅菌フィル
ターを通過した物質の容積パーセントを、各サンプルに
ついて測定した。その結果を表VIに示す。

これらのデータは、ほとんど全ての物質がうまく滅菌
フィルターを通過したサンプルＡ、Ｂの滅菌濾過が、非
常に有効であったことを示している。これに対して、サ
ンプルＣ、Ｄは、容積の約半分が滅菌フィルターを通過
することができただけで流れが止まってしまった。

実施例５第１図は、本発明の特定の実施態様により作られ、直
径が90mmのアノポア（商標）フィルターに使用するため
に設計されたフィルター集成装置（10）の、縮尺によら
ない簡略化した平面図である。このフィルター集成装置
は、例えば、上記実施例IIIにおける比較テストに用い
られたヌクレポア（商標）フィルターのような、他のタ
イプのフィルターを収納するのにも使用できるものと認
識されるべきである。第２図は、第１図の線２−２に沿
って破断されたフィルター集成装置（10）の、縮尺によ
らない簡略化した側断面図である。フィルター集成装置
（10）は、フィルターハウジング上半部（11）とフィル
ターハウジング下半部（12）とからなり、複数の締付ネ
ジ（13）で互いに固定されている。第２図において、フ
ィルターユニット（14）は、90mmに切断されたドレイン
ディスク（ヌクレポアカタログ＃231700）上に設けられ
た90mmのアノポアフィルターを示し、そのドレインディ
スクは、90mmのテフロン（登録商標）被覆メッシュフィ
ルターサポート（ミリポアカタログ＃YY3009054）上
に、順次設けられている。フィルターユニット（14）
は、横チャンネル（transverse channel）（16）などの
流体通過手段を備えたステンレススチールフィルター支
持板（15）上に、順次設けられている。支持体（11）
は、フィルターハウジング下半部（12）の座部（17）内
に位置しており、この座部（17）には、フィルターを通
って、液体出口（18）へ通過する液体を導くための放射
状の溝（図示せず）が設けられている。フィルターハウ
ジング上半部（11）は、上半部（11）を下半部（12）上
にネジ（13）で締め付ける際に、フィルターユニット
（14）を正しい位置に保持するリング部（19）を有して
いる。

操作に際しては、濾過すべき液体が、液体入口（20）
からフィルター集成装置（10）へ入り、フィルターユニ
ット（14）及びフィルター支持板（15）を通って流れ、
次いでフィルター出口（18）から外へ導かれる。ハウジ
ング上半部（11）は、安全出口（21）を備えていること
が好ましく、それにより安全弁（図示せず）をハウジン
グに取り付けることができる。

フィルター集成装置（10）を“上半部”及び“下半
部”で説明してきたが、これらの参照は、構造を説明す
る目的のためのものであり、操作中のハウジングの方向
を示すものではない。濾過される液体は、このような比
較的高い圧力で集成装置に送られるので、集成装置は、
任意の方向で使用できると信じられている。

第３図は、本発明により作られた押出系の概略図であ
る。濾過しようとするリポソーム組成物は、高圧供給容
器（31）内に入っており、濾液は、同様の受容容器（3
2）に集められる。これらの容器は、両方とも、リポソ
ーム混合物を維持するために撹拌器を備えているものと
して示されており、温度制御のために熱ジャケットが設
けられている。液体は、底部出口から供給容器を（31）
を出て、90mmのアノポア（商標）フィルターを含む上記
タイプの一つ又はそれ以上のフィルター集成装置（33）
を通って運ばれる。フィルター集成装置（33）は平行に
接続されており、そのような集成装置の使用数は、供給
容器（31）から受容容器（32）への目的とする合計流量
によって決まる。濾液は、受容容器（32）から、上記実
施例４で述べたミリパック（商標）200フィルターのよ
うな滅菌フィルター（35）に強制的に通され、次いで撹
拌されている保持容器（36）に集められる。更に、受容
容器（32）から出てくるものの一部を供給容器（31）へ
再循環させるために、再循環ライン（34）を設けてもよ
い。

用いられてきた用語及び語句は、説明の用語として使
用されているものであって、限定するものではない。こ
のような用語及び語句の使用には、示され、記載された
特徴の均等物又はその一部を排除する意図はなく、請求
された本発明の範囲内では、種々の変更が可能であると
認められる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者チエス，ロバート，エルカナダ国ブリティッシュコロンビア州ヴィ６アール３エム８ヴァンクーバーダンバーストリート 224 １ (72)発明者ポートノッフ，ジョエル，ビーアメリカ合衆国ペンシルバニア州 18954 リッチボログレゴリイプレース 76 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 9/127 B01J 13/02 C25D 11/04 ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】所定の最大粒径よりも大きいリポソームを
実質的に含まないリポソーム集団を製造する方法におい
て、（Ａ）一部の粒径が該所定の最大粒径よりも大きいリポ
ソームの懸濁液を用意すること、及び（Ｂ）この懸濁液を、加圧下に１回以上、分岐細孔型酸
化アルミニウム多孔性フィルムに通過させること、からなり、この分岐細孔型酸化アルミニウム多孔性フィ
ルムが、（ｉ）二つの実質的に平行な主面を有し、細孔がシート
の一つの面から他の面に伸張している酸化アルミニウム
シートからなり、（ii）一つの面からシート内へ延びる大きい細孔の第１
の系と、他の面から内側へ伸びる小さい細孔の第２の系
を含み、一つ以上の小さい細孔の内側端部が一つの大きい細孔の
内側端部と結合し、大きい細孔が実質的に盲になってい
ないように、大きい細孔の系が、小さい細孔の系と連結
している、ことからなる方法。
【請求項２】懸濁液を多孔性フィルムに２〜10回通す請
求の範囲１記載の方法。
【請求項３】懸濁液を600psi（4.2MPa）よりも小さい圧
力で該フィルムに通す請求の範囲１記載の方法。
【請求項４】該分岐細孔型陽極酸化アルミニウム多孔性
フィルムが、200nm以下の細孔サイズを有しており、リ
ポソームの懸濁液をフィルターに２〜10回通してリポソ
ーム集団が100〜200nmの平均粒子サイズを有するものと
する請求の範囲１記載の方法。
【請求項５】リポソームの懸濁液を多孔性フィルムに通
す工程の前に、リポソームをプレサイズ（予備分粒）す
る工程を更に含む方法であって、該プレサイジングが、
２〜10マイクロメートルの範囲内の細孔サイズを有する
フィルターにリポソームの懸濁液を１回以上通すことを
含む、請求の範囲１記載の方法。
【請求項６】（Ａ）該酸化アルミニウム多孔性フィルム
を操作し得る配置に保持する一つ以上のフィルター集成
装置、（Ｂ）リポソームの懸濁液を加圧下にフィルター集成装
置へ供給する加圧供給手段、および（Ｃ）該フィルター集成装置から濾液を受容する受容手
段を含有する、請求の範囲１記載の方法を実施するための
装置。
【請求項７】該フィルター集成装置が、該供給手段と該
受容手段との間での操作上平行な流れのために、該装置
内で配列されている、二つ以上の該フィルター集成装置
を含有する請求の範囲６記載の装置。
【請求項８】濾液を該受容手段から該供給手段へ再循環
させる再循環手段を更に含有する請求の範囲６記載の装
置。