JP3268147B2 - モノクローナル抗体 - Google Patents
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- C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒトのチミジンホスホリ
ラーゼ及び血小板由来血管内皮細胞増殖因子（ＰＤ−Ｅ
ＣＧＦ）の検出、すなわち各種腫瘍、血管の異常増殖を
伴う疾患、例えば腫瘍の転移、リウマチ性関節炎、糖尿
病性網膜症、未熟児性網膜症、老人性黄斑部変性などの
診断及び治療によるモニタリング、並びに薬剤等のドラ
ッグデリバリーシステムに有用なモノクローナル抗体に
関する。
ラーゼ及び血小板由来血管内皮細胞増殖因子（ＰＤ−Ｅ
ＣＧＦ）の検出、すなわち各種腫瘍、血管の異常増殖を
伴う疾患、例えば腫瘍の転移、リウマチ性関節炎、糖尿
病性網膜症、未熟児性網膜症、老人性黄斑部変性などの
診断及び治療によるモニタリング、並びに薬剤等のドラ
ッグデリバリーシステムに有用なモノクローナル抗体に
関する。
【０００２】
【従来の技術】チミジンホスホリラーゼはチミジンの代
謝に必須の酵素でヒト及び各種動物の種々の組織（肝
臓、肺、小腸、大腸、胎盤など）での活性発現が報告さ
れている〔Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，
５８，１５８７−１５９０（１９７７）及びＢｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１０３４，１０７
−１１３（１９９０）〕。また各種悪性腫瘍において、
チミジンホスホリラーゼは正常組織と比較して活性の亢
進することが報告されており〔Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．
Ｂｕｌｌ．，３４，４２２５−４２３２（１９８
６）〕、抗癌剤の標的酵素となっている。
謝に必須の酵素でヒト及び各種動物の種々の組織（肝
臓、肺、小腸、大腸、胎盤など）での活性発現が報告さ
れている〔Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，
５８，１５８７−１５９０（１９７７）及びＢｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１０３４，１０７
−１１３（１９９０）〕。また各種悪性腫瘍において、
チミジンホスホリラーゼは正常組織と比較して活性の亢
進することが報告されており〔Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．
Ｂｕｌｌ．，３４，４２２５−４２３２（１９８
６）〕、抗癌剤の標的酵素となっている。
【０００３】また、血管の異常増殖の際には、ＰＤ−Ｅ
ＣＧＦは正常組織と比較して活性の亢進することが報告
されており〔Ｎａｔｕｒｅ，３３８，５５７−５６２
（１９８９）〕、血管の異常増殖を伴う疾患の指標とな
っている。
ＣＧＦは正常組織と比較して活性の亢進することが報告
されており〔Ｎａｔｕｒｅ，３３８，５５７−５６２
（１９８９）〕、血管の異常増殖を伴う疾患の指標とな
っている。
【０００４】近年、ヒトチミジンホスホリラーゼはＰＤ
−ＥＣＧＦと遺伝的に同一であることが報告されており
〔Ｎａｔｕｒｅ，３３８，５５７−５６２（１９８
９）、Ｎａｔｕｒｅ，３５６，６６８（１９９２）及び
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１４，９−１４（１９９
３）〕、チミジンホスホリラーゼ及びＰＤ−ＥＣＧＦの
活性の測定は悪性腫瘍のみならず血管新生の異常増殖を
伴う疾患、例えばリウマチ性関節炎、糖尿病性網膜症、
未熟児性網膜症、老人性黄斑部変性などの診断に有用で
ある。
−ＥＣＧＦと遺伝的に同一であることが報告されており
〔Ｎａｔｕｒｅ，３３８，５５７−５６２（１９８
９）、Ｎａｔｕｒｅ，３５６，６６８（１９９２）及び
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１４，９−１４（１９９
３）〕、チミジンホスホリラーゼ及びＰＤ−ＥＣＧＦの
活性の測定は悪性腫瘍のみならず血管新生の異常増殖を
伴う疾患、例えばリウマチ性関節炎、糖尿病性網膜症、
未熟児性網膜症、老人性黄斑部変性などの診断に有用で
ある。
【０００５】従来のヒトチミジンホスホリラーゼ及びＰ
Ｄ−ＥＣＧＦの活性の測定方法は、組織中のこれら酵素
の活性を測定することで調べられていたため、組織を必
要量摘出し粗酵素液を分画する必要があった。そのため
手技的にも煩雑であるばかりではなく、細胞間レベルで
の微細な比較はできず、実用面及び精度面で大きな問題
があった。
Ｄ−ＥＣＧＦの活性の測定方法は、組織中のこれら酵素
の活性を測定することで調べられていたため、組織を必
要量摘出し粗酵素液を分画する必要があった。そのため
手技的にも煩雑であるばかりではなく、細胞間レベルで
の微細な比較はできず、実用面及び精度面で大きな問題
があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、チミジンホスホリラーゼ／ＰＤ−ＥＣＧＦを特異的
に測定でき、簡便で広く適用可能であって実用的価値の
ある手段を提供することにある。
は、チミジンホスホリラーゼ／ＰＤ−ＥＣＧＦを特異的
に測定でき、簡便で広く適用可能であって実用的価値の
ある手段を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】斯かる事情に鑑み、本発
明者らは鋭意研究を行った結果、ヒトチミジンホスホリ
ラーゼ及びＰＤ−ＥＣＧＦタンパク中のペプチドを免疫
原とするモノクローナル抗体を作製し、これがヒトチミ
ジンホスホリラーゼ及びＰＤ−ＥＣＧＦを特異的に認識
し、ヒトチミジンホスホリラーゼ及びＰＤ−ＥＣＧＦの
活性が亢進している種々の疾患の診断に有用であること
を見い出し本発明を完成した。
明者らは鋭意研究を行った結果、ヒトチミジンホスホリ
ラーゼ及びＰＤ−ＥＣＧＦタンパク中のペプチドを免疫
原とするモノクローナル抗体を作製し、これがヒトチミ
ジンホスホリラーゼ及びＰＤ−ＥＣＧＦを特異的に認識
し、ヒトチミジンホスホリラーゼ及びＰＤ−ＥＣＧＦの
活性が亢進している種々の疾患の診断に有用であること
を見い出し本発明を完成した。
【０００８】すなわち、本発明はヒトのチミジンホスホ
リラーゼ及びヒト血小板由来血管内皮細胞増殖因子に対
して反応する、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプ
チド又はこれを抗原認識部位とするペプチドに対するモ
ノクローナル抗体を提供するものである。
リラーゼ及びヒト血小板由来血管内皮細胞増殖因子に対
して反応する、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプ
チド又はこれを抗原認識部位とするペプチドに対するモ
ノクローナル抗体を提供するものである。
【０００９】配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチ
ド及び配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドは、
各々ヒトチミジンホスホリラーゼの一部であり、当該ペ
プチドを抗原部位として認識されるペプチドとしては、
配列番号１又は２のアミノ酸配列を有するものであれば
特に制限されないが、ヒトチミジンホスホリラーゼ、Ｐ
Ｄ−ＥＣＧＦ、ヒトチミジンホスホリラーゼ又はＰＤ−
ＥＣＧＦの一部であって配列番号１又は２のアミノ酸配
列を含むペプチド、又はこれらのペプチドにキャリアタ
ンパクを結合させたペプチドが挙げられる。該キャリア
タンパクとしては、例えばグルタチオントランスフェラ
ーゼ（ＧＳＴ）、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）
等が挙げられる。
ド及び配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドは、
各々ヒトチミジンホスホリラーゼの一部であり、当該ペ
プチドを抗原部位として認識されるペプチドとしては、
配列番号１又は２のアミノ酸配列を有するものであれば
特に制限されないが、ヒトチミジンホスホリラーゼ、Ｐ
Ｄ−ＥＣＧＦ、ヒトチミジンホスホリラーゼ又はＰＤ−
ＥＣＧＦの一部であって配列番号１又は２のアミノ酸配
列を含むペプチド、又はこれらのペプチドにキャリアタ
ンパクを結合させたペプチドが挙げられる。該キャリア
タンパクとしては、例えばグルタチオントランスフェラ
ーゼ（ＧＳＴ）、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）
等が挙げられる。
【００１０】本発明のモノクローナル抗体は、例えば、
前記ペプチドを抗原として認識する抗体を産生するクロ
ーンを培養することによって製造される。このようなク
ローンは、通常の細胞融合法、すなわち、抗体産生細胞
と骨髄腫細胞との間に融合ハイブリッドを形成させ、該
ハイブリッドをクローン化し、前記ペプチドを抗原とし
て認識する抗体を産生するクローンを選択することによ
って製造される。
前記ペプチドを抗原として認識する抗体を産生するクロ
ーンを培養することによって製造される。このようなク
ローンは、通常の細胞融合法、すなわち、抗体産生細胞
と骨髄腫細胞との間に融合ハイブリッドを形成させ、該
ハイブリッドをクローン化し、前記ペプチドを抗原とし
て認識する抗体を産生するクローンを選択することによ
って製造される。
【００１１】ここで用いる抗体産生細胞としては、配列
番号１又は２のアミノ酸配列を有するペプチド、これを
抗原部位として認識されるペプチド又はこれらのペプチ
ドとキャリアタンパクとの結合物を抗原として免疫させ
た動物からの脾細胞、リンパ節細胞及びＢリンパ球が例
示される。
番号１又は２のアミノ酸配列を有するペプチド、これを
抗原部位として認識されるペプチド又はこれらのペプチ
ドとキャリアタンパクとの結合物を抗原として免疫させ
た動物からの脾細胞、リンパ節細胞及びＢリンパ球が例
示される。
【００１２】抗体産生細胞の調製は、常法に従って行わ
れる。例えば、まず抗原を注射直前に完全もしくは不完
全フロイントアジュバント中で乳化、懸濁させ、動物の
皮下又は腹腔内に２〜３週間毎に数回（好ましくは３
回）注射を繰り返すことにより動物を免疫させる。免疫
させる動物としてはマウス、ラット、ウマ、ヤギ及びウ
サギ等が例示される。抗原の静脈内投与による最終免疫
より３〜５日後、免疫動物から脾細胞などの抗体産生細
胞を分取する。
れる。例えば、まず抗原を注射直前に完全もしくは不完
全フロイントアジュバント中で乳化、懸濁させ、動物の
皮下又は腹腔内に２〜３週間毎に数回（好ましくは３
回）注射を繰り返すことにより動物を免疫させる。免疫
させる動物としてはマウス、ラット、ウマ、ヤギ及びウ
サギ等が例示される。抗原の静脈内投与による最終免疫
より３〜５日後、免疫動物から脾細胞などの抗体産生細
胞を分取する。
【００１３】骨髄腫細胞としては、マウス、ラット及び
ヒト等由来のものが使用されるが、上記抗体産生細胞と
同種の動物由来であることが望ましい。例えば、マウス
脾細胞の融合の相手としてはＰ３ＵＩ及びＳＰ−２／Ｏ
−Ａｇ１４〔Ｎａｔｕｒｅ２７７，１３１−１３３（１
９７９）〕等のマウス骨髄腫細胞が用いられる。
ヒト等由来のものが使用されるが、上記抗体産生細胞と
同種の動物由来であることが望ましい。例えば、マウス
脾細胞の融合の相手としてはＰ３ＵＩ及びＳＰ−２／Ｏ
−Ａｇ１４〔Ｎａｔｕｒｅ２７７，１３１−１３３（１
９７９）〕等のマウス骨髄腫細胞が用いられる。
【００１４】細胞融合は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ ２５
６，４９５−４９７（１９７５）に記載の方法や、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８，５
１２２−５１２６（１９８１）に記載のＵｅｄａらの方
法又はこれに準ずる方法によって行われ、通常、３０〜
５０％ポリエチレングリコール（平均分子量１０００〜
４０００）を用いて、３０〜４０℃で、１〜３分間程度
反応させることによって行われる。より好ましくは、３
０〜５０％ポリエチレングリコール（平均分子量４００
０）を用いて、３７℃で、１〜３分間程度反応させるこ
とによって行われる。
６，４９５−４９７（１９７５）に記載の方法や、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８，５
１２２−５１２６（１９８１）に記載のＵｅｄａらの方
法又はこれに準ずる方法によって行われ、通常、３０〜
５０％ポリエチレングリコール（平均分子量１０００〜
４０００）を用いて、３０〜４０℃で、１〜３分間程度
反応させることによって行われる。より好ましくは、３
０〜５０％ポリエチレングリコール（平均分子量４００
０）を用いて、３７℃で、１〜３分間程度反応させるこ
とによって行われる。
【００１５】細胞融合によって得られたハイブリドーマ
は、例えば、マイクロプレート中で培養し、ＨＡＴ培地
（ヒポキサンチン１００μＭ、アミノプテリン０．４μ
Ｍ、チミジン１６μＭを含む基礎培地）等を用い、成育
してくる細胞として選択される。更に選択されたハイブ
リドーマは抗原結合性を検定した上で、クローニングに
付される。
は、例えば、マイクロプレート中で培養し、ＨＡＴ培地
（ヒポキサンチン１００μＭ、アミノプテリン０．４μ
Ｍ、チミジン１６μＭを含む基礎培地）等を用い、成育
してくる細胞として選択される。更に選択されたハイブ
リドーマは抗原結合性を検定した上で、クローニングに
付される。
【００１６】すなわち、増殖の見られたウエルの培養上
清中の抗体価を、例えば、抗原ペプチドをスクリーニン
グ用抗原として用いたＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉ
ｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）
法〔Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｌａｎｃｅｔ，１，６６
５（１９７１）〕等の酵素抗体法によって測定し、更
に、限界希釈法によってクローニングを行えばクローン
が得られる。
清中の抗体価を、例えば、抗原ペプチドをスクリーニン
グ用抗原として用いたＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉ
ｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）
法〔Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｌａｎｃｅｔ，１，６６
５（１９７１）〕等の酵素抗体法によって測定し、更
に、限界希釈法によってクローニングを行えばクローン
が得られる。
【００１７】このようにして得られたクローンを通常の
動物細胞と同様に培養すれば、培地中に本発明のモノク
ローナル抗体が産生される。また、このクローンは、例
えば、あらかじめ０．５mlのプリスタンを投与したＢａ
ｌｂ／ｃマウスの腹腔内へ移植することにより、７〜１
４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を産生
するので、当該腹水より本発明モノクローナル抗体を採
取することもできる。
動物細胞と同様に培養すれば、培地中に本発明のモノク
ローナル抗体が産生される。また、このクローンは、例
えば、あらかじめ０．５mlのプリスタンを投与したＢａ
ｌｂ／ｃマウスの腹腔内へ移植することにより、７〜１
４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を産生
するので、当該腹水より本発明モノクローナル抗体を採
取することもできる。
【００１８】クローンの培養液や腹水からの本発明モノ
クローナル抗体の回収は、ＩｇＧの精製方法として既知
の方法、例えば、陰イオン交換体、ヒドロキシアパタイ
ト、プロテインＡ又はＧ固定化カラム及びプロタミン固
定化カラム等を用いた各種のカラムクロマトグラフィ
ー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法及び
低張緩衝液沈殿法を応用することで、容易に達成され
る。
クローナル抗体の回収は、ＩｇＧの精製方法として既知
の方法、例えば、陰イオン交換体、ヒドロキシアパタイ
ト、プロテインＡ又はＧ固定化カラム及びプロタミン固
定化カラム等を用いた各種のカラムクロマトグラフィ
ー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法及び
低張緩衝液沈殿法を応用することで、容易に達成され
る。
【００１９】以上の如くして得られた本発明のモノクロ
ーナル抗体のうち、ＩｇＧに属するものが好ましい。
ーナル抗体のうち、ＩｇＧに属するものが好ましい。
【００２０】また、本発明モノクローナル抗体のうち、
ヒトチミジンホスホリラーゼ全体を抗原として得られた
モノクローナル抗体よりも、ヒトチミジンホスホリラー
ゼの一部であって配列番号１又は２のアミノ酸配列を含
むペプチド又はそのキャリアタンパクとの結合物を抗原
として得られたモノクローナル抗体が好ましい。
ヒトチミジンホスホリラーゼ全体を抗原として得られた
モノクローナル抗体よりも、ヒトチミジンホスホリラー
ゼの一部であって配列番号１又は２のアミノ酸配列を含
むペプチド又はそのキャリアタンパクとの結合物を抗原
として得られたモノクローナル抗体が好ましい。
【００２１】このヒトチミジンホスホリラーゼ断片を抗
原として得られたモノクローナル抗体は、ヒトチミジン
ホスホリラーゼ全体に対する抗体よりも、外来タンパク
との交差反応性は低くなり、その結果として、このヒト
チミジンホスホリラーゼ断片に対する抗体が、癌の診断
に使用された場合には、ヒトチミジンホスホリラーゼ全
体に対する抗体よりも感度が上昇する。かかるヒトチミ
ジンホスホリラーゼ断片を抗原として得られた抗体は、
全ヒトチミジンホスホリラーゼに対して免疫学的に反応
性である。
原として得られたモノクローナル抗体は、ヒトチミジン
ホスホリラーゼ全体に対する抗体よりも、外来タンパク
との交差反応性は低くなり、その結果として、このヒト
チミジンホスホリラーゼ断片に対する抗体が、癌の診断
に使用された場合には、ヒトチミジンホスホリラーゼ全
体に対する抗体よりも感度が上昇する。かかるヒトチミ
ジンホスホリラーゼ断片を抗原として得られた抗体は、
全ヒトチミジンホスホリラーゼに対して免疫学的に反応
性である。
【００２２】本発明のモノクローナル抗体のＦｖ、Ｆａ
ｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、抗体の結合部位を有し、
完全抗体と同様に抗原に対する結合能力があることは、
当該分野ではよく知られており、タンパク分解酵素を用
いた抗体の断片化により容易に得ることができる。
ｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、抗体の結合部位を有し、
完全抗体と同様に抗原に対する結合能力があることは、
当該分野ではよく知られており、タンパク分解酵素を用
いた抗体の断片化により容易に得ることができる。
【００２３】本発明のモノクローナル抗体を利用した診
断薬は測定感度の向上を図る各種の検出法、例えば、Ｅ
ＬＩＳＡ法におけるアビジン−ビオチン−ペルオキシダ
ーゼ複合体（ＡＢＣ）法、ストレプトアビジン−ビオチ
ン複合体（ＳＢＣ）法及びペルオキシダーゼ−抗ペルオ
キシダーゼ（ＰＡＰ）法等と組み合わせることができ、
単独又は他の診断薬と組み合わせて使用することが可能
である。
断薬は測定感度の向上を図る各種の検出法、例えば、Ｅ
ＬＩＳＡ法におけるアビジン−ビオチン−ペルオキシダ
ーゼ複合体（ＡＢＣ）法、ストレプトアビジン−ビオチ
ン複合体（ＳＢＣ）法及びペルオキシダーゼ−抗ペルオ
キシダーゼ（ＰＡＰ）法等と組み合わせることができ、
単独又は他の診断薬と組み合わせて使用することが可能
である。
【００２４】
【発明の効果】本発明によって得られたモノクローナル
抗体は、ヒトチミジンホスホリラーゼ及びＰＤ−ＥＣＧ
Ｆを特異的に認識するため、チミジンホスホリラーゼ及
びＰＤ−ＥＣＧＦの活性亢進を伴う種々の疾患の免疫化
学的及び免疫組織学的診断に有用である。これら疾患に
は、例えば悪性腫瘍とその転移癌、リウマチ性関節炎、
糖尿病性網膜症、未熟児性網膜症、老人性黄斑部変性な
どがある。また、これらの診断は、体液を用いて行うこ
ともできる。なぜなら細胞の死に伴い本抗原が体液中に
流出するからである。本発明のモノクローナル抗体を利
用した診断薬は、測定感度の向上を図る各種の検出法、
例えばＥＬＩＳＡ法におけるＡＢＣ法、ＳＢＣ法及びＰ
ＡＰ法と組み合わせることができ、単独又は他の診断薬
と組み合わせて使用することが可能である。
抗体は、ヒトチミジンホスホリラーゼ及びＰＤ−ＥＣＧ
Ｆを特異的に認識するため、チミジンホスホリラーゼ及
びＰＤ−ＥＣＧＦの活性亢進を伴う種々の疾患の免疫化
学的及び免疫組織学的診断に有用である。これら疾患に
は、例えば悪性腫瘍とその転移癌、リウマチ性関節炎、
糖尿病性網膜症、未熟児性網膜症、老人性黄斑部変性な
どがある。また、これらの診断は、体液を用いて行うこ
ともできる。なぜなら細胞の死に伴い本抗原が体液中に
流出するからである。本発明のモノクローナル抗体を利
用した診断薬は、測定感度の向上を図る各種の検出法、
例えばＥＬＩＳＡ法におけるＡＢＣ法、ＳＢＣ法及びＰ
ＡＰ法と組み合わせることができ、単独又は他の診断薬
と組み合わせて使用することが可能である。
【００２５】また、本発明のモノクローナル抗体は、組
織のイメージング、例えば、インジウム−III標識抗体
を用いた画像診断にも応用が可能である。
織のイメージング、例えば、インジウム−III標識抗体
を用いた画像診断にも応用が可能である。
【００２６】また、例えば、悪性腫瘍に対しては、Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４２，４５７−４６４（１９８
２）において報告されているようにリシンやアブリンの
活性部分を抗体と結合させたイムノトキシン等により、
ターゲティング治療としての応用も可能である。
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４２，４５７−４６４（１９８
２）において報告されているようにリシンやアブリンの
活性部分を抗体と結合させたイムノトキシン等により、
ターゲティング治療としての応用も可能である。
【００２７】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２８】実施例１ 抗原−ヒトチミジンホスホリラーゼ又はＰＤ−ＥＣＧＦ
のＮ末端領域及びＣ末端領域とグルタチオントランスフ
ェラーゼ（ＧＳＴ）の結合タンパク質の調製 ＧＳＴとの融合タンパクは、市販されているファルマシ
ア社のＧＳＴ−ジーンフュージョンシステムを用いて作
成した。すなわちヒトチミジンホスホリラーゼ又はＰＤ
−ＥＣＧＦのＮ末端側７残基目から２５０残基目のポリ
ペプチドとＧＳＴとの融合タンパク及びヒトチミジンホ
スホリラーゼ又はＰＤ−ＥＣＧＦのＣ末端側３５３残基
目から４８３残基目のポリペプチドとＧＳＴとの融合タ
ンパクになるように大腸菌の発現ベクターに組み込ん
だ。
のＮ末端領域及びＣ末端領域とグルタチオントランスフ
ェラーゼ（ＧＳＴ）の結合タンパク質の調製 ＧＳＴとの融合タンパクは、市販されているファルマシ
ア社のＧＳＴ−ジーンフュージョンシステムを用いて作
成した。すなわちヒトチミジンホスホリラーゼ又はＰＤ
−ＥＣＧＦのＮ末端側７残基目から２５０残基目のポリ
ペプチドとＧＳＴとの融合タンパク及びヒトチミジンホ
スホリラーゼ又はＰＤ−ＥＣＧＦのＣ末端側３５３残基
目から４８３残基目のポリペプチドとＧＳＴとの融合タ
ンパクになるように大腸菌の発現ベクターに組み込ん
だ。
【００２９】このプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに導入
し、１００μｇ／mlのアンピシリンを含んだ２００mlの
ＬＢ培養液で波長６６０nmの吸光度が０．６になるまで
培養した。吸光度が０．６になったところで最終濃度が
１mMになるようにイソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガ
ラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加え、更に３時間培養
した後、遠心分離して大腸菌のみを回収した。菌体はＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドサンプル緩衝液に溶解し、分
取型のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動装置（日本
エイドー社製）で相当するタンパク質を泳動分取し、Ｎ
末端側６．４mg、Ｃ末端側５．７mgの抗原を各々得た。
し、１００μｇ／mlのアンピシリンを含んだ２００mlの
ＬＢ培養液で波長６６０nmの吸光度が０．６になるまで
培養した。吸光度が０．６になったところで最終濃度が
１mMになるようにイソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガ
ラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加え、更に３時間培養
した後、遠心分離して大腸菌のみを回収した。菌体はＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドサンプル緩衝液に溶解し、分
取型のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動装置（日本
エイドー社製）で相当するタンパク質を泳動分取し、Ｎ
末端側６．４mg、Ｃ末端側５．７mgの抗原を各々得た。
【００３０】実施例２ 抗ヒトチミジンホスホリラーゼ又はＰＤ−ＥＣＧＦモノ
クローナル抗体産生細胞のクローン化 ８週令のＢａｌｂ／ｃマウス雌（日本クレア社製）３匹
をまずフロイント完全アジュバンド中で、実施例１で得
られたチミジンホスホリラーゼ又はＰＤ−ＥＣＧＦのＮ
末端領域及びＣ末端領域とＧＳＴの結合タンパク質を各
々初回免疫した後、マウス１匹あたりそれぞれ１００μ
ｇの融合タンパク質を０．４mlの溶液として腹腔内に投
与し、１回目の免疫から１４日後にフロイント完全アジ
ュバンドと共に溶解した融合タンパク質を追加免疫し、
更に最終免疫として２回目の免疫から１０日後に腹腔内
投与により補助免疫し、４日後にマウスの脾臓を取り出
し、３mlの増殖培地中に徐々に均一化させ、２００Ｇで
遠心分離して脾臓細胞を分離した。
クローナル抗体産生細胞のクローン化 ８週令のＢａｌｂ／ｃマウス雌（日本クレア社製）３匹
をまずフロイント完全アジュバンド中で、実施例１で得
られたチミジンホスホリラーゼ又はＰＤ−ＥＣＧＦのＮ
末端領域及びＣ末端領域とＧＳＴの結合タンパク質を各
々初回免疫した後、マウス１匹あたりそれぞれ１００μ
ｇの融合タンパク質を０．４mlの溶液として腹腔内に投
与し、１回目の免疫から１４日後にフロイント完全アジ
ュバンドと共に溶解した融合タンパク質を追加免疫し、
更に最終免疫として２回目の免疫から１０日後に腹腔内
投与により補助免疫し、４日後にマウスの脾臓を取り出
し、３mlの増殖培地中に徐々に均一化させ、２００Ｇで
遠心分離して脾臓細胞を分離した。
【００３１】得られた細胞を合わせた後、ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）を５０％（Ｖ／Ｖ）含むＲＰＭＩ
１６４０培地（ＰＥＧ４００溶液）にゆっくり懸濁
し、徐々にＲＰＭＩ １６４０培地で希釈してＰＥＧ濃
度を５％（Ｖ／Ｖ）にし、細胞を遠心分離機で分離し、
徐々に増殖培地を分散させ、マイクロタイタープレート
のウエルに１ウエル当たり１０6個／０．１mlの細胞を
植え、５％二酸化炭素中で３７℃で２分間インキュベー
トした。
グリコール（ＰＥＧ）を５０％（Ｖ／Ｖ）含むＲＰＭＩ
１６４０培地（ＰＥＧ４００溶液）にゆっくり懸濁
し、徐々にＲＰＭＩ １６４０培地で希釈してＰＥＧ濃
度を５％（Ｖ／Ｖ）にし、細胞を遠心分離機で分離し、
徐々に増殖培地を分散させ、マイクロタイタープレート
のウエルに１ウエル当たり１０6個／０．１mlの細胞を
植え、５％二酸化炭素中で３７℃で２分間インキュベー
トした。
【００３２】このようにして調製したマウス脾細胞とミ
エローマ細胞Ｐ３Ｕ１（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１）を電
気融合装置を使用し、電気融合法で融合した。細胞融合
後１日目に、０．１mlのＨＡＴ培地を加え、その後３日
毎に、半分のＨＡＴ培地を新しいＨＡＴ培地と交換した
ところ、クローンが８日後に現れ、１０日後迄にＩｇＧ
産生検査の為、固相−抗体結合テスト（ＥＬＩＳＡ法）
で上澄み液をスクリーニングした。
エローマ細胞Ｐ３Ｕ１（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１）を電
気融合装置を使用し、電気融合法で融合した。細胞融合
後１日目に、０．１mlのＨＡＴ培地を加え、その後３日
毎に、半分のＨＡＴ培地を新しいＨＡＴ培地と交換した
ところ、クローンが８日後に現れ、１０日後迄にＩｇＧ
産生検査の為、固相−抗体結合テスト（ＥＬＩＳＡ法）
で上澄み液をスクリーニングした。
【００３３】抗体産生陽性群を２４個ウエルのあるプレ
ートに拡げ、細胞密度が高くなった時に２５cm2の培養
フラスコに移し変え、ハイブリドーマをＨＴ培地（アミ
ノプリテンを含まないＨＡＴ培地）で保持し、抗体産生
をチェックした。
ートに拡げ、細胞密度が高くなった時に２５cm2の培養
フラスコに移し変え、ハイブリドーマをＨＴ培地（アミ
ノプリテンを含まないＨＡＴ培地）で保持し、抗体産生
をチェックした。
【００３４】ＩｇＧ産生クローンから、チミジンホスホ
リラーゼ又はＰＤ−ＥＣＧＦに対して、Ｎ末端側及びＣ
末端側に特異的に反応するクローンを得るためにＥＬＩ
ＳＡ法でスクリーニングを行った。すなわち、９６穴の
ＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレートに抗原として用
いたＧＳＴとの融合ポリペプチドを１０μｇ／ml濃度で
各ウエルに５０μｌずつ加え、４℃で一晩放置した。次
に市販のブロッキング液（大日本製薬社製）を２００μ
ｌずつ加え、室温で２時間放置し、クローン化したハイ
ブリドーマ細胞の培養上清を各々加え３７℃で１時間保
温した。
リラーゼ又はＰＤ−ＥＣＧＦに対して、Ｎ末端側及びＣ
末端側に特異的に反応するクローンを得るためにＥＬＩ
ＳＡ法でスクリーニングを行った。すなわち、９６穴の
ＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレートに抗原として用
いたＧＳＴとの融合ポリペプチドを１０μｇ／ml濃度で
各ウエルに５０μｌずつ加え、４℃で一晩放置した。次
に市販のブロッキング液（大日本製薬社製）を２００μ
ｌずつ加え、室温で２時間放置し、クローン化したハイ
ブリドーマ細胞の培養上清を各々加え３７℃で１時間保
温した。
【００３５】ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体
（オルガノン・テクニカ社製）を最終濃度１．０μｇ／
mlになるように加え、３７℃で１時間保温した後、ＯＰ
ＤＡ／過酸化水素水を１００μｌ加え、室温で２０分間
反応させた。反応終了後、２Ｎ硫酸を１００μｌ加えて
反応を停止させた後、マイクロタイターリーダーで４９
０nm及び５９５nmの吸光度を測定し、その差を計算して
スクリーニングを行った。結果を表１及び表２に示す。
（オルガノン・テクニカ社製）を最終濃度１．０μｇ／
mlになるように加え、３７℃で１時間保温した後、ＯＰ
ＤＡ／過酸化水素水を１００μｌ加え、室温で２０分間
反応させた。反応終了後、２Ｎ硫酸を１００μｌ加えて
反応を停止させた後、マイクロタイターリーダーで４９
０nm及び５９５nmの吸光度を測定し、その差を計算して
スクリーニングを行った。結果を表１及び表２に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
【表２】
【００３８】その結果、Ｎ末端側抗原に対して６個、Ｃ
末端側抗原に対して６個陽性となった株が得られた。
末端側抗原に対して６個陽性となった株が得られた。
【００３９】次に、各々のクローンについてチミジンホ
スホリラーゼ又はＰＤ−ＥＣＧＦとの結合性を検討する
ために、前述のＥＬＩＳＡ法でチミジンホスホリラーゼ
又はＰＤ−ＥＣＧＦの濃度が１μｇ／mlになるように抗
原だけを加えてスクリーニングを行った。その結果、Ｇ
ＳＴとＮ末端側チミジンホスホリラーゼ又はＰＤ−ＥＣ
ＧＦの融合タンパク質と結合し、且つチミジンホスホリ
ラーゼ又はＰＤ−ＥＣＧＦとも結合するクローンを選択
し、双方に非常によく結合するクローンをそれぞれ得
た。（Ｎ末端側クローン；２Ａ４，Ｃ末端側クローン；
２Ｄ９）
スホリラーゼ又はＰＤ−ＥＣＧＦとの結合性を検討する
ために、前述のＥＬＩＳＡ法でチミジンホスホリラーゼ
又はＰＤ−ＥＣＧＦの濃度が１μｇ／mlになるように抗
原だけを加えてスクリーニングを行った。その結果、Ｇ
ＳＴとＮ末端側チミジンホスホリラーゼ又はＰＤ−ＥＣ
ＧＦの融合タンパク質と結合し、且つチミジンホスホリ
ラーゼ又はＰＤ−ＥＣＧＦとも結合するクローンを選択
し、双方に非常によく結合するクローンをそれぞれ得
た。（Ｎ末端側クローン；２Ａ４，Ｃ末端側クローン；
２Ｄ９）
【００４０】実施例３ 細胞培養による抗チミジンホスホリラーゼ／ＰＤ−ＥＣ
ＧＦモノクローナル抗体の産生 抗チミジンホスホリラーゼ抗体産生ハイブリドーマは、
７５cm2組織培養フラスコを用い１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎
児血清（ＦＣＳ）、１００mMピルビン酸及び２−メルカ
プトエタノールを含んだＲＰＭＩ １６４０培地中で継
代培養した。一方、抗体を精製する際には、無血清培地
であるＰＵＦ−１（ギブコ社製）を用いて培養した。こ
の中で８×１０5個／mlまで増殖したバイブリドーマ細
胞を、２００Ｇで５分間の遠心分離によって回収した。
得られた培養上清を、ＰＭ１０限外濾過膜（アミコン社
製）を用いて１０ml以下になるように濃縮し、０．４５
μｍのメンブレンフィルターで濾過した。以上のように
して得られた粗画分に等量の結合用緩衝液を加えてよく
混合し、あらかじめ結合用緩衝液で平衡化しておいたプ
ロテインＡカラムに粗画分を通過させ、ＩｇＧをプロテ
インＡに結合させ、結合用緩衝液１０mlで洗浄した後、
溶出用緩衝液３mlで結合したＩｇＧを溶出させこの画分
を回収した。得られた画分３mlに直ちに１Ｍトリス塩酸
緩衝液（pH９．０）を１ml加え、pHを中性付近に戻した
後、一晩生理リン酸緩衝液（ＰＢＳ）にて透析し、高純
度のモノクローナル抗体ＩｇＧを得た。
ＧＦモノクローナル抗体の産生 抗チミジンホスホリラーゼ抗体産生ハイブリドーマは、
７５cm2組織培養フラスコを用い１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎
児血清（ＦＣＳ）、１００mMピルビン酸及び２−メルカ
プトエタノールを含んだＲＰＭＩ １６４０培地中で継
代培養した。一方、抗体を精製する際には、無血清培地
であるＰＵＦ−１（ギブコ社製）を用いて培養した。こ
の中で８×１０5個／mlまで増殖したバイブリドーマ細
胞を、２００Ｇで５分間の遠心分離によって回収した。
得られた培養上清を、ＰＭ１０限外濾過膜（アミコン社
製）を用いて１０ml以下になるように濃縮し、０．４５
μｍのメンブレンフィルターで濾過した。以上のように
して得られた粗画分に等量の結合用緩衝液を加えてよく
混合し、あらかじめ結合用緩衝液で平衡化しておいたプ
ロテインＡカラムに粗画分を通過させ、ＩｇＧをプロテ
インＡに結合させ、結合用緩衝液１０mlで洗浄した後、
溶出用緩衝液３mlで結合したＩｇＧを溶出させこの画分
を回収した。得られた画分３mlに直ちに１Ｍトリス塩酸
緩衝液（pH９．０）を１ml加え、pHを中性付近に戻した
後、一晩生理リン酸緩衝液（ＰＢＳ）にて透析し、高純
度のモノクローナル抗体ＩｇＧを得た。
【００４１】なお、得られた抗チミジンホスホリラーゼ
抗体のサブクラスは市販されているマウスモノクローナ
ル抗体イソタイピングキット（アマシャム社製）を用い
た酵素免疫測定法により決定した。クローンのクラス・
サブクラスを表３及び表４に示す。
抗体のサブクラスは市販されているマウスモノクローナ
ル抗体イソタイピングキット（アマシャム社製）を用い
た酵素免疫測定法により決定した。クローンのクラス・
サブクラスを表３及び表４に示す。
【００４２】
【表３】
【００４３】
【表４】
【００４４】実施例４ マウスの腹水を用いた抗チミジンホスホリラーゼ／ＰＤ
−ＥＣＧＦモノクローナル抗体の産生 ハイブリドーマ細胞を血清を含まないＲＰＭＩ １６４
０培地で１回洗浄し、１×１０7個／mlの割合でＲＰＭ
Ｉ １６４０培地に再懸濁した。５×１０6個のハイブ
リドーマ細胞をヌードマウスＢａｌｂｃ／ｎｕ−ｎｕの
腹腔内に注射し、２週間後にマウスの腹腔内からモノク
ローナル抗体を採取した。得られた腹水を、１５００Ｇ
で１５分間遠心分離した後、０．４５μｍのメンブレン
フィルターで濾過した。
−ＥＣＧＦモノクローナル抗体の産生 ハイブリドーマ細胞を血清を含まないＲＰＭＩ １６４
０培地で１回洗浄し、１×１０7個／mlの割合でＲＰＭ
Ｉ １６４０培地に再懸濁した。５×１０6個のハイブ
リドーマ細胞をヌードマウスＢａｌｂｃ／ｎｕ−ｎｕの
腹腔内に注射し、２週間後にマウスの腹腔内からモノク
ローナル抗体を採取した。得られた腹水を、１５００Ｇ
で１５分間遠心分離した後、０．４５μｍのメンブレン
フィルターで濾過した。
【００４５】以上のようにして得られた粗画分に等量の
結合用緩衝液を加えてよく混合し、あらかじめ結合用緩
衝液で平衡化しておいたプロテインＡカラムに粗画分を
通過させ、ＩｇＧをプロテインＡに結合させ、結合用緩
衝液１０mlで洗浄した後、溶出用緩衝液３mlで結合した
ＩｇＧを溶出させこの画分を回収した。得られた画分３
mlに直ちに１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH９．０）を１ml加
え、pHを中性付近に戻した後、一晩ＰＢＳに対して透析
し、高純度のモノクローナル抗体ＩｇＧを得た。なお、
得られた抗チミジンホスホリラーゼ抗体のサブクラスは
市販されているマウスモノクローナル抗体イソタイピン
グキット（アマシャム社製）を用いた酵素免疫測定法に
より決定した。クローンのクラス・サブクラスは実施例
３と同一であった。
結合用緩衝液を加えてよく混合し、あらかじめ結合用緩
衝液で平衡化しておいたプロテインＡカラムに粗画分を
通過させ、ＩｇＧをプロテインＡに結合させ、結合用緩
衝液１０mlで洗浄した後、溶出用緩衝液３mlで結合した
ＩｇＧを溶出させこの画分を回収した。得られた画分３
mlに直ちに１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH９．０）を１ml加
え、pHを中性付近に戻した後、一晩ＰＢＳに対して透析
し、高純度のモノクローナル抗体ＩｇＧを得た。なお、
得られた抗チミジンホスホリラーゼ抗体のサブクラスは
市販されているマウスモノクローナル抗体イソタイピン
グキット（アマシャム社製）を用いた酵素免疫測定法に
より決定した。クローンのクラス・サブクラスは実施例
３と同一であった。
【００４６】実施例５ イムノブロット法によるチミジンホスホリラーゼ／ＰＤ
−ＥＣＧＦの検出 細胞、正常組織及び腫瘍組織から調製したタンパク粗抽
出液２００μｇを変性条件下でアクリルアミドの濃度が
４％−２０％の勾配ゲルを使用したＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で分析した後、市販のＰＶＤＦ膜
（ミリポア社製）にタンパク質を電気的に転写した。ス
キムミルクで非特異的な吸着をブロッキングした後、
０．５μｇ／mlの濃度で実施例４で精製した抗チミジン
ホスホリラーゼ／ＰＤ−ＥＣＧＦ抗体（クローン２Ａ
４）を加え、室温で１時間放置した後、４℃で一晩放置
した。ペルオキシダーゼで標識化された抗マウスイムノ
グロブリンは、市販の製品を用い、ペルオキシダーゼの
発色には、ＥＣＬのシステム（アマシャム社製）を使用
した。結果を図１及び図２に示す。
−ＥＣＧＦの検出 細胞、正常組織及び腫瘍組織から調製したタンパク粗抽
出液２００μｇを変性条件下でアクリルアミドの濃度が
４％−２０％の勾配ゲルを使用したＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で分析した後、市販のＰＶＤＦ膜
（ミリポア社製）にタンパク質を電気的に転写した。ス
キムミルクで非特異的な吸着をブロッキングした後、
０．５μｇ／mlの濃度で実施例４で精製した抗チミジン
ホスホリラーゼ／ＰＤ−ＥＣＧＦ抗体（クローン２Ａ
４）を加え、室温で１時間放置した後、４℃で一晩放置
した。ペルオキシダーゼで標識化された抗マウスイムノ
グロブリンは、市販の製品を用い、ペルオキシダーゼの
発色には、ＥＣＬのシステム（アマシャム社製）を使用
した。結果を図１及び図２に示す。
【００４７】図１は実施例４で調製したＮ末端側の抗体
２Ａ４とＣ末端側の抗体２Ｄ９の染色結果であり、ＧＳ
ＴとＮ末端側ポリペプチド融合タンパク質には２Ａ４
が、ＧＳＴとＣ末端側ポリペプチド融合タンパク質には
２Ｄ９がそれぞれ特異的に反応し、且つチミジンホスホ
リラーゼ／ＰＤ−ＥＣＧＦのｃＤＮＡを導入し、過剰発
現させたＫＢ細胞には両抗体共に反応し、分子量５５Ｋ
Ｄに相当する大きさの位置に明らかにバンドが検出され
た。
２Ａ４とＣ末端側の抗体２Ｄ９の染色結果であり、ＧＳ
ＴとＮ末端側ポリペプチド融合タンパク質には２Ａ４
が、ＧＳＴとＣ末端側ポリペプチド融合タンパク質には
２Ｄ９がそれぞれ特異的に反応し、且つチミジンホスホ
リラーゼ／ＰＤ−ＥＣＧＦのｃＤＮＡを導入し、過剰発
現させたＫＢ細胞には両抗体共に反応し、分子量５５Ｋ
Ｄに相当する大きさの位置に明らかにバンドが検出され
た。
【００４８】図２は２Ａ４を用いたヒト乳癌組織と隣接
正常組織の比較結果３例であり、分子量５５ＫＤに相当
する大きさの位置のバンドからわかるように、右側の隣
接正常組織と比較して癌組織でのチミジンホスホリラー
ゼ／ＰＤ−ＥＣＧＦの発現が高くなっていた。
正常組織の比較結果３例であり、分子量５５ＫＤに相当
する大きさの位置のバンドからわかるように、右側の隣
接正常組織と比較して癌組織でのチミジンホスホリラー
ゼ／ＰＤ−ＥＣＧＦの発現が高くなっていた。
【００４９】なお、図１中のレーンは次の通りである。 ＧＳＴ−Ｎ；ＧＳＴとヒトチミジンホスホリラーゼのＮ
末端ペプチドを結合させたポリペプチド ＧＳＴ−Ｃ；ＧＳＴとヒトチミジンホスホリラーゼのＣ
末端ペプチドを結合させたポリペプチド ＫＢ；ＫＢ細胞の細胞抽出液 ＫＢ−ＴＰ；ＫＢ細胞にヒトチミジンホスホリラーゼ／
ＰＤ−ＥＣＧＦのｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞
の細胞抽出液
末端ペプチドを結合させたポリペプチド ＧＳＴ−Ｃ；ＧＳＴとヒトチミジンホスホリラーゼのＣ
末端ペプチドを結合させたポリペプチド ＫＢ；ＫＢ細胞の細胞抽出液 ＫＢ−ＴＰ；ＫＢ細胞にヒトチミジンホスホリラーゼ／
ＰＤ−ＥＣＧＦのｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞
の細胞抽出液
【００５０】実施例６ チミジンホスホリラーゼ／ＰＤ−ＥＣＧＦのヒト臨床組
織切片における免疫組織化学染色 ヒト悪性腫瘍組織及び隣接正常組織を摘出後、直ちに１
０％（Ｖ／Ｖ）ホルマリン生理食塩緩衝液で固定し、２
４時間室温で放置後、パラフィンで包埋し、３μｍの切
片を作成した。脱パラフィン処理した後、実施例４で精
製した精製抗チミジンホスホリラーゼ抗体（クローン２
Ａ４）を１μｇ／mlの濃度で加え、室温で１時間放置し
た後、４℃で一晩放置した。更に市販されているフナコ
シＡＢＣ ｅｌｌｉｔｅキット（ベクター社製）を用い
て染色した。結果を図３及び図４に示す。
織切片における免疫組織化学染色 ヒト悪性腫瘍組織及び隣接正常組織を摘出後、直ちに１
０％（Ｖ／Ｖ）ホルマリン生理食塩緩衝液で固定し、２
４時間室温で放置後、パラフィンで包埋し、３μｍの切
片を作成した。脱パラフィン処理した後、実施例４で精
製した精製抗チミジンホスホリラーゼ抗体（クローン２
Ａ４）を１μｇ／mlの濃度で加え、室温で１時間放置し
た後、４℃で一晩放置した。更に市販されているフナコ
シＡＢＣ ｅｌｌｉｔｅキット（ベクター社製）を用い
て染色した。結果を図３及び図４に示す。
【００５１】図３は正常組織の陰性例であり、図４は大
腸癌組織で染色した一例である。このように明らかに腫
瘍組織の細胞質が陽性に染色されており、パラフィン固
定によって抗原性が低くなっても、採取されてから相当
の時間が経過しても反応する、非常に使いやすく、臨床
応用に適した有用性の高い抗体であることが判明した。
腸癌組織で染色した一例である。このように明らかに腫
瘍組織の細胞質が陽性に染色されており、パラフィン固
定によって抗原性が低くなっても、採取されてから相当
の時間が経過しても反応する、非常に使いやすく、臨床
応用に適した有用性の高い抗体であることが判明した。
【００５２】
配列番号：１ 配列の長さ：２４４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【００５３】配列番号：２ 配列の長さ：１３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Pro Gly Leu Ala Arg Ala Leu Cys Ser Gly Ser Pro Ala Glu Arg 1 5 10 15 Arg Gln Leu Leu Pro Arg Ala Arg Glu Gln Glu Glu Leu Leu Ala Pro 20 25 30 Ala Asp Gly Thr Val Glu Leu Val Arg Ala Leu Pro Leu Ala Leu Val 35 40 45 Leu His Glu Leu Gly Ala Gly Arg Ser Arg Ala Gly Glu Pro Leu Arg 50 55 60 Leu Gly Val Gly Ala Glu Leu Leu Val Asp Val Gly Gln Arg Leu Arg 65 70 75 80 Arg Gly Thr Pro Trp Leu Arg Val His Arg Asp Gly Pro Ala Leu Ser 85 90 95 Gly Pro Gln Ser Arg Ala Leu Gln Glu Ala Leu Val Leu Ser Asp Arg 100 105 110 Ala Pro Phe Ala Ala Pro Ser Pro Phe Ala Glu Leu Val Leu Pro Pro 115 120 125 Gln Gln 130
【図１】本発明のモノクローナル抗体の反応特異性につ
いての電気泳動像を示す写真である。
いての電気泳動像を示す写真である。
【図２】本発明のモノクローナル抗体と反応するヒト乳
癌組織と隣接正常組織の発現を比較した結果についての
電気泳動像を示す写真である（３例）。
癌組織と隣接正常組織の発現を比較した結果についての
電気泳動像を示す写真である（３例）。
【図３】本発明のモノクローナル抗体の反応特異性のヒ
ト大腸正常組織切片における免疫組織化学染色の結果を
示す顕微鏡写真である。
ト大腸正常組織切片における免疫組織化学染色の結果を
示す顕微鏡写真である。
【図４】本発明のモノクローナル抗体の反応特異性のヒ
ト大腸癌組織切片における免疫組織化学染色の結果を示
す顕微鏡写真である。
ト大腸癌組織切片における免疫組織化学染色の結果を示
す顕微鏡写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．114, ｐ．９−14 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 16/18 - 16/42 C12N 15/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (2)
- 【請求項１】 ヒトのチミジンホスホリラーゼ及びヒト
血小板由来血管内皮細胞増殖因子に対して反応する、配
列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド又はこれを抗
原認識部位とするペプチドに対するモノクローナル抗
体。 - 【請求項２】 ＩｇＧに属するものである請求項１記載
のモノクローナル抗体。
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