JP3282603B2 - Adjuvants and vaccines using them - Google Patents
Adjuvants and vaccines using themInfo
- Publication number
- JP3282603B2 JP3282603B2 JP02042499A JP2042499A JP3282603B2 JP 3282603 B2 JP3282603 B2 JP 3282603B2 JP 02042499 A JP02042499 A JP 02042499A JP 2042499 A JP2042499 A JP 2042499A JP 3282603 B2 JP3282603 B2 JP 3282603B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- adjuvant
- soyasaponin
- oleanane
- saponin
- formula
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 title claims description 103
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 14
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 claims description 70
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 claims description 70
- 229930187719 Soyasaponin Natural products 0.000 claims description 67
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 claims description 48
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 24
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 23
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 claims description 16
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 claims description 16
- XFXHYKZIZSNVSQ-TZRAUYBZSA-N Soyasaponin A1 Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O[C@H]1O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@H]5CC([C@H]([C@@H](O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@@H](O)CO6)O)[C@]5(C)CC[C@@]4(C)[C@]3(C)CC[C@H]2[C@]1(CO)C)O)(C)C)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O XFXHYKZIZSNVSQ-TZRAUYBZSA-N 0.000 claims description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 8
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 claims description 8
- CDDWAYFUFNQLRZ-KJVHGCRFSA-N (3beta,21beta,22beta)-olean-12-ene-3,21,22,24-tetrol Chemical compound C([C@@]12C)C[C@H](O)[C@](C)(CO)[C@@H]1CC[C@]1(C)[C@@H]2CC=C2[C@@H]3CC(C)(C)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@]3(C)CC[C@]21C CDDWAYFUFNQLRZ-KJVHGCRFSA-N 0.000 claims description 6
- CDDWAYFUFNQLRZ-UHFFFAOYSA-N soyasapogenol A Natural products CC12CCC(O)C(C)(CO)C1CCC1(C)C2CC=C2C3CC(C)(C)C(O)C(O)C3(C)CCC21C CDDWAYFUFNQLRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- CTQURVKMWHDOKO-UHFFFAOYSA-N Dehydrosoyasaponin I Natural products CC1OC(OC2C(O)C(O)C(CO)OC2OC3C(O)C(O)C(OC3OC4CCC5(C)C(CCC6(C)C5CC=C7C8CC(C)(C)CC(=O)C8(C)CCC67C)C4(C)C=O)C(=O)O)C(O)C(O)C1O CTQURVKMWHDOKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- CROUPKILZUPLQA-ITVSDQETSA-N Dehydrosoyasaponin I Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H](O[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]2O)C(O)=O)O[C@@H]2[C@]([C@H]3[C@]([C@@H]4[C@@]([C@@]5(CC[C@@]6(C)C(=O)CC(C)(C)C[C@H]6C5=CC4)C)(C)CC3)(C)CC2)(C)CO)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O CROUPKILZUPLQA-ITVSDQETSA-N 0.000 claims description 5
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 claims description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 5
- PTDAHAWQAGSZDD-IOVCITQVSA-N soyasaponin I Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H](O[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]2O)C(O)=O)O[C@@H]2[C@]([C@H]3[C@]([C@@H]4[C@@]([C@@]5(CC[C@@]6(C)[C@H](O)CC(C)(C)C[C@H]6C5=CC4)C)(C)CC3)(C)CC2)(C)CO)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O PTDAHAWQAGSZDD-IOVCITQVSA-N 0.000 claims description 4
- INHDFRRYDVURKR-ACAMOKTQSA-N (2s,3s,4s,5r,6r)-6-[[(3s,4s,4ar,6ar,6bs,8ar,9s,10r,12as,14ar,14br)-9-[(2s,3r,4r,5s)-4,5-dihydroxy-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-10-hydroxy-4-(hydroxymethyl)-4,6a,6b,8a,11,11,14b-heptamethyl-1,2,3,4a,5,6,7 Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O[C@H]1O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@H]5CC([C@H]([C@@H](O[C@H]6[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)CO6)O[C@H]6[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@]5(C)CC[C@@]4(C)[C@]3(C)CC[C@H]2[C@]1(CO)C)O)(C)C)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O INHDFRRYDVURKR-ACAMOKTQSA-N 0.000 claims description 3
- YOQAQNKGFOLRGT-UXXABWCISA-N (3beta,22beta)-olean-12-ene-3,22,24-triol Chemical compound C1C[C@H](O)[C@](C)(CO)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C)[C@H](O)CC(C)(C)C[C@H]5C4=CC[C@@H]3[C@]21C YOQAQNKGFOLRGT-UXXABWCISA-N 0.000 claims description 3
- KFFJPIQLAPHYBF-UHFFFAOYSA-N Azukisaponin V Natural products COC(=O)C1OC(OC2CCC3(C)C(CCC4(C)C3CC=C5C6CC(C)(C)CC(O)C6(O)CCC45C)C2(C)CO)C(OC7OC(CO)C(O)C(O)C7OC8OC(C)C(O)C(O)C8O)C(O)C1O KFFJPIQLAPHYBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- URRZRRQMNMZIAP-UHFFFAOYSA-N Kudzusapogenol C Natural products CC12CCC(O)C(C)(CO)C1CCC1(C)C2CC=C2C3CC(C)(C)C(O)CC3(C)CCC21C URRZRRQMNMZIAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- JFHRJMPZZYINAI-UHFFFAOYSA-N Soyasaponin I Natural products CC1OC(OC2C(O)C(O)C(CO)OC2OC3C(O)C(O)C(CO)OC3OC4CCC5(C)C(CCC6(C)C5CC=C7C8CC(C)(C)CC(O)C8(C)CCC67C)C4(C)CO)C(O)C(O)C1O JFHRJMPZZYINAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- IBZLICPLPYSFNZ-IVWMTKFPSA-N Soyasaponin II Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H](O[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]2O)C(O)=O)O[C@@H]2[C@]([C@H]3[C@]([C@@H]4[C@@]([C@@]5(CC[C@@]6(C)[C@H](O)CC(C)(C)C[C@H]6C5=CC4)C)(C)CC3)(C)CC2)(C)CO)OC[C@H](O)[C@@H]1O IBZLICPLPYSFNZ-IVWMTKFPSA-N 0.000 claims description 3
- MADZMXIFUWFDJK-AEARDBQCSA-N soyasapogenol B Natural products CC1(C)C[C@@H](O)[C@]2(C)CC[C@]3(C)C(=CC[C@@H]4[C@@]5(C)CC[C@H](O[C@@H]6O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H]6O[C@@H]7O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]7O[C@@H]8OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]8O)C(=O)O)[C@](C)(CO)[C@@H]5CC[C@@]34C)[C@H]2C1 MADZMXIFUWFDJK-AEARDBQCSA-N 0.000 claims description 3
- VCNKUCWWHVTTBY-UHFFFAOYSA-N 18alpha-Oleanane Natural products C1CCC(C)(C)C2CCC3(C)C4(C)CCC5(C)CCC(C)(C)CC5C4CCC3C21C VCNKUCWWHVTTBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MIJYXULNPSFWEK-GTOFXWBISA-N 3beta-hydroxyolean-12-en-28-oic acid Chemical compound C1C[C@H](O)C(C)(C)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C(O)=O)CCC(C)(C)C[C@H]5C4=CC[C@@H]3[C@]21C MIJYXULNPSFWEK-GTOFXWBISA-N 0.000 claims description 2
- IBZLICPLPYSFNZ-UHFFFAOYSA-N Astragaloside VIII Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(OC(C(O)C2O)C(O)=O)OC2C(C3C(C4C(C5(CCC6(C)C(O)CC(C)(C)CC6C5=CC4)C)(C)CC3)(C)CC2)(C)CO)OCC(O)C1O IBZLICPLPYSFNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FTPPTNQVRLPEAE-UHFFFAOYSA-N Soyasapogenol-E Natural products CC1(C)CC(=O)C2(C)CCC3C(=CCC4C3(C)CCC5C(C)(CO)C(O)CCC45C)C2(C)C1 FTPPTNQVRLPEAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- PZLAZXBSOCTDBG-UHFFFAOYSA-N Soyasaponin II Natural products CC1OC(OC2C(O)C(O)COC2OC3C(O)C(O)C(CO)OC3OC4CCC5(C)C(CCC6(C)C5CC=C7C8CC(C)(C)CC(O)C8(C)CCC67C)C4(C)CO)C(O)C(O)C1O PZLAZXBSOCTDBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- SIOMFBXUIJKTMF-UHFFFAOYSA-N hypoglauterpenic acid Natural products C1CC(O)C(C)(C)C2=CCC3(C)C4(C)CCC5(C(O)=O)CCC(C)(C)CC5C4=CCC3C21C SIOMFBXUIJKTMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- BPAWXSVOAOLSRP-UHFFFAOYSA-N oleanane Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1CCC2(C)C(CCC3(C)C2CC=C4C5CC(C)(C)CCC5(C)C(O)CC34C)C1(C)C BPAWXSVOAOLSRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FNRBOAGVUNHDIL-LMZUXBMISA-N soyasapogenol E Chemical compound C([C@@]12C)C[C@H](O)[C@](C)(CO)[C@@H]1CC[C@]1(C)[C@@H]2CC=C2[C@@H]3CC(C)(C)CC(=O)[C@]3(C)CC[C@]21C FNRBOAGVUNHDIL-LMZUXBMISA-N 0.000 claims description 2
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims 1
- 229940031572 toxoid vaccine Drugs 0.000 claims 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 61
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 26
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 22
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 21
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 17
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 15
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 15
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 8
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 6
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 6
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 6
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 6
- TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N Aglycone of yadanzioside D Natural products COC(=O)C12OCC34C(CC5C(=CC(O)C(O)C5(C)C3C(O)C1O)C)OC(=O)C(OC(=O)C)C24 TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N Astrantiagenin E-methylester Natural products CC12CCC(O)C(C)(CO)C1CCC1(C)C2CC=C2C3CC(C)(C)CCC3(C(=O)OC)CCC21C PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 5
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 5
- 244000309464 bull Species 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N homoegonol Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1=CC2=CC(CCCO)=CC(OC)=C2O1 PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N squalane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 4
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- PIGTXFOGKFOFTO-FVFWYJKVSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[[(3S,4S,4aR,6aR,6bS,8R,8aR,12aS,14aR,14bR)-8a-carboxy-4-formyl-8-hydroxy-4,6a,6b,11,11,14b-hexamethyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound O([C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)C[C@@H](O)[C@]1(CCC(C[C@H]14)(C)C)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O PIGTXFOGKFOFTO-FVFWYJKVSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 beta-D-glucopyranosyl Chemical group 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 2
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N n-Triacontane Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 229930189104 soyasapogenol Natural products 0.000 description 2
- OKIHRVKXRCAJFQ-AHBDIROXSA-N soyasaponin III Chemical group O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O[C@H]1O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@]1(CO)C)C)(C)CC[C@@]1(C)[C@H](O)CC(C[C@H]14)(C)C)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O OKIHRVKXRCAJFQ-AHBDIROXSA-N 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229940032094 squalane Drugs 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- TXJTZIIDMZBTEB-UHFFFAOYSA-N (3alpha,11alpha)-3,11,23-Trihydroxy-20(29)-lupen-28-oic acid Natural products C1CC(O)C(C)(CO)C2CCC3(C)C4(C)CCC5(C(O)=O)CCC(C(=C)C)C5C4CC(O)C3C21C TXJTZIIDMZBTEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-SVZMEOIVSA-N D-fucopyranose Chemical compound C[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010065390 Inflammatory pain Diseases 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N L-ribopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930185199 Sapogenol Natural products 0.000 description 1
- 241000219287 Saponaria Species 0.000 description 1
- QSWYVJWAKZGGIL-IVHYXLJLSA-N Soyasaponin A2 Natural products O=C(O)[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)[C@H](O[C@@H]2[C@](CO)(C)[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@](C)([C@@]5(C)C([C@@H]6[C@](C)([C@H](O[C@H]7[C@@H](O)[C@H](O[C@H]8[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O8)[C@H](O)CO7)[C@H](O)C(C)(C)C6)CC5)=CC4)CC3)CC2)O1 QSWYVJWAKZGGIL-IVHYXLJLSA-N 0.000 description 1
- UZUYQJHHUUDLDJ-UHFFFAOYSA-N Soyasaponin III Natural products CC1(C)CC(O)C2(C)CCC3(C)C(=CCC4C5(C)CCC(OC6OC(CO)C(O)C(O)C6OC7OC(CO)C(O)C(O)C7O)C(C)(CO)C5CCC34C)C2C1 UZUYQJHHUUDLDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 241001504592 Trachurus trachurus Species 0.000 description 1
- OCNZHGHKKQOQCZ-CLFAGFIQSA-N [(z)-octadec-9-enoyl] (z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC OCNZHGHKKQOQCZ-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 1
- 229930189099 acetyl-soyasaponin Natural products 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N aldehydo-L-rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004637 bakelite Substances 0.000 description 1
- 125000001488 beta-D-galactosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- WQLVFSAGQJTQCK-UHFFFAOYSA-N diosgenin Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CCC(O)CC4=CCC3C2C2)C)C2OC11CCC(C)CO1 WQLVFSAGQJTQCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000018927 edible plant Nutrition 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002031 ethanolic fraction Substances 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229950002441 glucurolactone Drugs 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000401 methanolic extract Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000003281 pleural cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- NWMIYTWHUDFRPL-UHFFFAOYSA-N sapogenin Natural products COC(=O)C1(CO)C(O)CCC2(C)C1CCC3(C)C2CC=C4C5C(C)(O)C(C)CCC5(CCC34C)C(=O)O NWMIYTWHUDFRPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、おもにダイズ（ラ
テン名：グリシンマックス）をはじめとした、マメ科植
物より抽出される有効サポニン成分を免疫賦活剤（アジ
ュバント物質）として含有することを特徴とするアジュ
バントおよびそれを用いたワクチンに関する。TECHNICAL FIELD The present invention is characterized by containing an effective saponin component mainly extracted from legumes such as soybean (Latin name: glycine max) as an immunostimulant (adjuvant substance). Adjuvants and vaccines using the same.
【０００２】[0002]
【従来の技術】人あるいは動物の感染予防のために何ら
かの物質を抗原と共に投与すると、その抗原に対する免
疫応答を増強させることができる。この物質を免疫賦活
剤、あるいはアジュバント物質と呼んでいる。ワクチン
製剤の効果を増強させることを期待して、このような免
疫賦活剤を単味でワクチンへ添加したり、あるいは免疫
賦活剤を含めた複数の物質とを適当な組成比で混合して
ワクチンへ添加する方法が従来から提案されてきた。前
記添加物を構成する各物質を混合したものをアジュバン
ト組成物と呼ぶ。単味の免疫賦活剤およびアジュバント
組成物は、総称してアジュバントと呼ばれる。2. Description of the Related Art When some substance is administered together with an antigen to prevent human or animal infection, an immune response against the antigen can be enhanced. This substance is called an immunostimulant or adjuvant substance. In hopes of enhancing the effect of the vaccine preparation, such an immunostimulant may be added to the vaccine alone, or the vaccine may be mixed with a plurality of substances including the immunostimulant in an appropriate composition ratio. Conventionally, a method of adding to the carbon has been proposed. A mixture of the substances constituting the additive is called an adjuvant composition. Plain immunostimulants and adjuvant compositions are collectively referred to as adjuvants.
【０００３】アジュバントとして、これまでにアルミニ
ウムゲルアジュバント、また一部の領域では、オイルア
ジュバントが実用化されている。近年になって、種々の
免疫賦活剤が見いだされてきた。そのひとつとして、あ
る種のサポニンがアジュバント活性を有することも既に
明らかとなっている。さらに、このようなサポニンを単
味でワクチンへ添加し、あるいは他の物質と混合したア
ジュバント組成物として添加した種々のワクチン製剤の
処方が提案されている。アジュバントとして用いること
のできる代表的なサポニンとして、南米原産の植物キラ
ヤサポナリアより抽出されるキラヤサポニンあるいはキ
ル-Ａ（Quil-Ａと表記）が知られている。As an adjuvant, an aluminum gel adjuvant and, in some areas, an oil adjuvant have been put to practical use. In recent years, various immunostimulants have been found. As one of them, it has been already clarified that certain saponins have adjuvant activity. Further, various vaccine formulations have been proposed in which such a saponin is simply added to a vaccine or added as an adjuvant composition mixed with other substances. As a typical saponin that can be used as an adjuvant, there is known Kiraya saponin or Quil-A (expressed as Quil-A) extracted from a plant native to South America, Quillaya saponaria.
【０００４】従来からアジュバントとしての使用が提案
されている上記のサポニンは、適当な処方下では、少量
でも効果的なアジュバント活性を誘導することができる
が、同時に下記の問題点が残されていた。 １．主成分の精製単離が困難。 ２．毒性反応や局所反応などのいわゆる副反応を起こし
うる。すなわち、有効域／毒性域の範囲幅が狭い。 ３．主成分の分子構造が未知であるか、あるいは構造推
定にとどまるために、定量および定性基準が明確でない
ものが多い。 これらの理由により、アジュバントとして上記のサポニ
ンを安全なワクチンの製造に安定供給することには高度
な技術を要した。The above-mentioned saponins, which have been proposed to be used as adjuvants, can induce an effective adjuvant activity even in a small amount under an appropriate formulation, but have the following problems. . 1. Difficult to purify and isolate main components. 2. So-called side reactions such as toxic reactions and local reactions can occur. That is, the range of the effective range / toxic range is narrow. 3. In many cases, the quantitative and qualitative criteria are not clear because the molecular structure of the main component is unknown or remains only for structure estimation. For these reasons, advanced technology was required to stably supply the above saponins as adjuvants for the production of safe vaccines.
【０００５】このような問題を解決する目的で、特表平
７-５０４１５６号公報において、サポニン−抗原複合
物とその用途が提案された。この提案によりキラヤサポ
ニンの活性成分をある程度限定し、副反応を軽減するこ
とができた。しかしながら、活性主成分の精製過程にお
いて、原料エキス中に類似成分が多含されるとともに分
子構造そのものが複雑であるがゆえに、構造解析が非常
に困難であった。近年になってようやく信頼できる構造
解析が進められてきたが、それまでに報告されたキラヤ
サポニン関連成分の化学構造に関しては、推定構造に関
する報告が多かった。したがって、このような物質をア
ジュバントとして人あるいは動物へ適用するためには、
なお活性成分の単離と構造決定による活性本体の特定が
課題とされていた。For the purpose of solving such a problem, Japanese Patent Publication No. Hei 7-504156 proposed a saponin-antigen complex and its use. With this proposal, the active ingredient of quillaja saponin was limited to some extent and side reactions could be reduced. However, in the process of purifying the active main component, structural analysis was extremely difficult because the raw material extract contained many similar components and the molecular structure itself was complicated. In recent years, reliable structural analysis has been advanced at last, but there have been many reports on the predicted structure of the chemical structure of the quillajasaponin-related component reported so far. Therefore, in order to apply such substances to humans or animals as adjuvants,
In addition, the isolation of the active ingredient and the identification of the active substance by the structure determination have been a subject.
【０００６】本発明者らは、先に特願平１０-１２５５
８６号において、アジュバントとして、インゲンマメよ
り見い出された新規なサポニン、ラブラボシド類の構造
を決定するとともに、該サポニンのアジュバントとして
の効果と用途を開示した。この発明においては、これま
で問題とされてきた活性成分の単離精製およびサポニン
分子の絶対構造の決定の課題が満たされているととも
に、食物由来の高い安全性が付加されたアジュバントと
しての有用性が開示されている。The present inventors have previously disclosed in Japanese Patent Application No. 10-1255.
No. 86, the structure of novel saponins and lablabsides found from common beans was determined as an adjuvant, and the effect and use of the saponin as an adjuvant were disclosed. The present invention satisfies the problems of isolation and purification of the active ingredient and determination of the absolute structure of the saponin molecule, which have been problematic, and is useful as an adjuvant to which high safety derived from food is added. Is disclosed.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、既に
分子構造が明確にされているサポニンを免疫賦活剤とす
る、より商業的規模での調製が容易なアジュバントを提
供し、安全性の高い高性能なワクチンを提供することに
ある。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide an adjuvant which uses saponin, whose molecular structure is already defined, as an immunostimulant and which can be easily prepared on a commercial scale. It is to provide a high-performance vaccine.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために、高いアジュバント活性と安全性を
有し、かつ商業的調製に有利なサポニンを得るべく鋭意
研究した結果、ダイズ（ラテン名：グリシンマックス）
をはじめとする、マメ科植物由来のサポニン、すなわち
ソヤサポニンが、本発明の目的とするアジュバントとし
ての諸条件を満たすことを見いだし、同時に、当該サポ
ニンの分子構造とアジュバント活性との相関性を解明
し、高アジュバント活性サポニンのアジュバントへの適
用を可能とした。同時に単離精製前のサポニン分画につ
いても研究した結果、本分画もアジュバントへ適用可能
であることを究明した。Means for Solving the Problems In order to achieve the above object, the present inventors have conducted intensive studies to obtain saponins having high adjuvant activity and safety and advantageous for commercial preparation. Soybean (Latin name: Glycine Max)
And other saponins derived from legumes, that is, soyasaponins, satisfying various conditions as an adjuvant aimed at by the present invention, and at the same time, elucidated the correlation between the molecular structure of the saponin and adjuvant activity. This enabled the application of highly adjuvant-active saponins to adjuvants. At the same time, we studied the saponin fraction before isolation and purification, and found that this fraction could be applied to adjuvants.
【０００９】すなわち、人あるいは動物用の免疫賦活剤
として、前述のサポニンアジュバントを適用するために
は、活性サポニンの分子構造を特定すると同時に、精製
品の生物活性の知見をもとに得られる構造活性相関の解
明が不可欠であった。さらに、実用に即した課題とし
て、高い安全性の保証と市場性が挙げられる。That is, in order to apply the above-mentioned saponin adjuvant as an immunostimulant for humans or animals, it is necessary to specify the molecular structure of the active saponin and at the same time to obtain the structure obtained based on the knowledge of the biological activity of the purified product. Elucidation of the activity correlation was essential. In addition, practical issues include assurance of high safety and marketability.
【００１０】本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意
研究した結果、食用植物を原料起源とする既知物質ソヤ
サポニンを免疫賦活剤として使用することにより、安全
性が高くかつアジュバント活性を有するアジュバントと
しうることを見い出し、本発明を完成するに至った。[0010] The present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object. As a result, the use of soyasaponin, a known substance derived from edible plants as a raw material, as an immunostimulant provides an adjuvant having high safety and adjuvant activity. And found that the present invention was completed.
【００１１】すなわち、本発明のアジュバントは、一般
式That is, the adjuvant of the present invention has the general formula
【化１０】 （式中、Ｒ1およびＲ2は糖鎖基を表わす）で表わされ
る、ソヤサポゲノールＡを基本骨格とするオレアナン型
サポニンの少なくとも1種を免疫賦活剤として含有する
ことを特徴とするアジュバント、一般式Embedded image (Wherein R 1 and R 2 each represent a sugar chain group), characterized in that the adjuvant contains at least one oleanane-type saponin having soyasapogenol A as a basic skeleton as an immunostimulant,
【化１１】 （式中、Ｒは糖鎖基を表わす）で表わされる、ソヤサポ
ゲノールＢを基本骨格とするオレアナン型サポニンの少
なくとも1種を免疫賦活剤として含有することを特徴と
するアジュバントおよび一般式Embedded image (Wherein R represents a sugar chain group) an adjuvant comprising at least one oleanane-type saponin having soyasapogenol B as a basic skeleton as an immunostimulant, and a general formula
【化１２】 （式中、Ｒは糖鎖基を表わす）で表わされる、ソヤサポ
ゲノールＥを基本骨格とするオレアナン型サポニンの少
なくとも1種を免疫賦活剤として含有することを特徴と
するアジュバント、である。Embedded image (Wherein, R represents a sugar chain group), which is an adjuvant characterized by containing at least one oleanane-type saponin having soyasapogenol E as a basic skeleton as an immunostimulant.
【００１２】前記一般式［Ｉ］、［II］および［III］
中の糖鎖Ｒ1、Ｒ2、およびＲは、D-グルコース、D-アラ
ビノース、D-ガラクトース、D-キシロース、D-フコー
ス、L-ラムノース、あるいはD-グルクロン酸分子などの
単糖類単位が合計１〜６個程度結合したものである。ま
たこれら単糖類のOH基、ときにはアグリコン分子に直結
するOH基が、メチル基、エチル基、あるいはアセチル基
などをはじめとした炭素鎖により化学修飾されたものな
ど、構造上多数の類似体や誘導体が存在する。本発明の
アジュバントに使用されるサポニンは、これらの糖鎖が
前記一般式の基本骨格に結合したオレアナン型サポニン
である。The above general formulas [I], [II] and [III]
In the sugar chains R 1 , R 2 , and R, monosaccharide units such as D-glucose, D-arabinose, D-galactose, D-xylose, D-fucose, L-rhamnose, or D-glucuronic acid molecule are used. About 1 to 6 pieces are combined in total. A large number of structurally similar analogs and derivatives, such as those in which the OH group of these monosaccharides, and sometimes the OH group directly linked to the aglycone molecule, are chemically modified with a carbon chain such as a methyl group, an ethyl group, or an acetyl group Exists. The saponin used in the adjuvant of the present invention is an oleanane-type saponin in which these sugar chains are bonded to the basic skeleton of the above general formula.
【００１３】前記一般式［Ｉ］、［II］、および［II
I］で表されるオレアナン型サポニンは、総称してソヤ
サポニンと呼ばれる。本発明のソヤサポニンには、次に
示すような分子構造を有するものが含まれる。The general formulas [I], [II] and [II]
The oleanane-type saponins represented by I] are collectively called soyasaponins. The soyasaponins of the present invention include those having the following molecular structures.
【００１４】前記一般式［Ｉ］で表わされるオレアナン
型サポニンのうち、一般式［Ｉ］中、３位の糖鎖Ｒ1基
として、β-D-グルコピラノシル（１→３）-β-D-ガラ
クトピラノシル（１→２）-β-D-グルクロノピラノシル
基が結合し、かつ２２位の糖鎖Ｒ2基としてβ-D-グルコ
ピラノシル（１→３）-α-L-アラビノピラノシル基が結
合したものは、ソヤサポニンＡ1であり、下記式[0014] Among the oleanane type saponins represented by the general formula [I], In the formula [I], as the 3-position of a sugar chain group R 1, beta-D-glucopyranosyl (1 → 3) -β-D- galactopyranosyl (1 → 2) -β-D- glucuronolactone pyranosyl group is bonded, and 22-position of the sugar chain R as 2 groups beta-D-glucopyranosyl (1 → 3) -α-L- arabino what Nopiranoshiru group is attached is soyasaponin a 1, the following formula
【化１３】 で表わされる。Embedded image Is represented by
【００１５】また、前記一般式［Ｉ］で表わされるオレ
アナン型サポニンのうち、一般式［Ｉ］中、３位の糖鎖
Ｒ1基としてβ-D-ガラクトピラノシル（１→２）-β-D-
グルクロノピラノシル基が結合し、かつ２２位の糖鎖Ｒ
2基としてβ-D-グルコピラノシル（１→３）-α-L-アラ
ビノピラノシル基が結合したものは、ソヤサポニンＡ 2
であり、下記式The olefin represented by the general formula [I]
Among the anan-type saponins, the sugar chain at position 3 in the general formula [I]
R1Β-D-galactopyranosyl (1 → 2) -β-D-
A glucuronopyranosyl group is bonded and the sugar chain R at the 22-position
TwoΒ-D-glucopyranosyl (1 → 3) -α-L-ara as a group
The one to which the vinopyranosyl group is bonded is soyasaponin A Two
And the following equation
【化１４】 で表わされる。以上の構造解析データの詳細は、Chem.
Pharm. Bull., 33(3) , 1069-1076 (1985)の報告の中
で、北川らの研究成果として紹介されている。Embedded image Is represented by For details of the above structural analysis data, see Chem .
In the report of Pharm . Bull. , 33 (3), 1069-1076 (1985), it is introduced as a research result by Kitagawa et al.
【００１６】さらに、前記一般式［II］で表わされるオ
レアナン型サポニンのうち、一般式［II］中、３位の糖
鎖Ｒ基としてα-L-ラムノピラノシル（１→２）-β-D-
ガラクトピラノシル（１→２）-β-D-グルクロノピラノ
シル基が結合したものはソヤサポニンＩであり、下記式Further, among the oleanane-type saponins represented by the general formula [II], α-L-rhamnopyranosyl (1 → 2) -β-D-
The one to which the galactopyranosyl (1 → 2) -β-D-glucuronopyranosyl group is bound is soyasaponin I and has the following formula
【化１５】 で表わされる。Embedded image Is represented by
【００１７】また、前記一般式［II］で表わされるオレ
アナン型サポニンのうち、一般式［II］中、３位の糖鎖
Ｒ基としてα-L-ラムノピラノシル（１→２）-α-L-ア
ラビノピラノシル（１→２）-β-D-グルクロノピラノシ
ル基が結合したものはソヤサポニンIIであり、下記式Further, among the oleanane-type saponins represented by the general formula [II], α-L-rhamnopyranosyl (1 → 2) -α-L- is used as the sugar group R at the 3-position in the general formula [II]. The one to which the arabinopyranosyl (1 → 2) -β-D-glucuronopyranosyl group is bonded is soyasaponin II and has the following formula
【化１６】 で表わされる。Embedded image Is represented by
【００１８】さらに、前記一般式［II］で表わされるオ
レアナン型サポニンのうち、一般式［II］中、３位の糖
鎖Ｒ基としてβ-D-ガラクトピラノシル（１→２）-β-D
-グルクロノピラノシル基が結合したものはソヤサポニ
ンIIIであり、下記式Furthermore, among the oleanane-type saponins represented by the general formula [II], β-D-galactopyranosyl (1 → 2) -β is used as the sugar group R at the 3-position in the general formula [II]. -D
-The glucuronopyranosyl group is bonded to soyasaponin III, and has the following formula
【化１７】 で表わされる。以上の構造解析データは、北川らの報
告、Chem. Pharm. Bull., 24(1) , 121-129 (1976)に、
詳細にわたって記載されている。Embedded image Is represented by The above structural analysis data is reported by Kitagawa et al., Chem . Pharm . Bull. , 24 (1), 121-129 (1976).
It is described in detail.
【００１９】さらに、前記一般式［III］で表わされる
オレアナン型サポニンのうち、一般式［III］中、３位
の糖鎖Ｒ基としてα-L-ラムノピラノシル（１→２）-β
-D-ガラクトピラノシル（１→２）-β-D-グルクロノピ
ラノシル基が結合したものはデヒドロソヤサポニンＩで
あり、下記式Further, among the oleanane-type saponins represented by the general formula [III], α-L-rhamnopyranosyl (1 → 2) -β is used as the sugar group R at the 3-position in the general formula [III].
The compound to which -D-galactopyranosyl (1 → 2) -β-D-glucuronopyranosyl group is bound is dehydrosoyasaponin I, and has the following formula
【化１８】 で表わされる。Embedded image Is represented by
【００２０】ソヤサポニンは、先に北川らが、Chem. Ph
arm. Bull., 24(1) , 121-129 (1976)をはじめとした報
告において、ダイズ（ラテン名、グリシンマックス）中
サポニンの成分検索をおこない、ソヤサポゲノールＡ、
Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥを基本骨格（サポゲニン）とした
種々のソヤサポニン類の分子構造を解析するとともに、
構造構造上、非常に多種類のタイプのサポニンが存在す
ることが明らかにされている。本発明は、これらの物質
を、アジュバントとして応用したものである。Soyasaponin was first described by Kitagawa et al. In Chem . Ph .
In reports including arm . Bull. , 24 (1), 121-129 (1976), a search was made for the components of saponin in soybean (Latin name, glycine max), and soyasapogenol A,
While analyzing the molecular structures of various soyasaponins with B, C, D, and E as the basic skeleton (sapogenin),
It has been revealed that there are a great variety of types of saponins in structure. The present invention applies these substances as adjuvants.
【００２１】本発明のアジュバントは、前記の一般式
［Ｉ］、［II］、および［III］で表されるソヤサポニ
ンを、リン酸緩衝食塩水や生理食塩水に添加して調製さ
れる。このアジュバントは生体に対して、可溶化抗原、
例えば、卵白アルブミン（以下、ＯＶＡと記す）などの
タンパク質、あるいはリシントキソイドなどのタンパク
毒素に対するイムノグロブリンＧ（以下、ＩｇＧと記
す）などの抗体、特にＩｇＧ１抗体の産生を増大させ
る。抗体産生増強の結果、生体は、タンパク性毒素の攻
撃試験による致死を、本発明により、回避可能となっ
た。The adjuvant of the present invention is prepared by adding soyasaponin represented by the above general formulas [I], [II] and [III] to a phosphate buffered saline or physiological saline. This adjuvant provides a solubilized antigen,
For example, it increases the production of an antibody such as immunoglobulin G (hereinafter referred to as IgG) against a protein such as ovalbumin (hereinafter referred to as OVA) or a protein toxin such as ricin toxoid, in particular, an IgG1 antibody. As a result of the enhancement of antibody production, the living body of the present invention can avoid lethality due to a proteinaceous toxin challenge test according to the present invention.
【００２２】また、本発明のアジュバントは、ＩｇＧ２
ａ抗体の産生をも増大させることも確認された。豚ヘル
ペスウイルス不活化抗原（以下、ＰＲＶ抗原と記す）と
混合して接種すると、本ウイルスの感染による致死を回
避させる高い免疫賦活活性を有する。したがって、本発
明のアジュバントは、免疫賦活活性が高く、かつ安全性
の高いアジュバントである。The adjuvant of the present invention is an IgG2
It was also confirmed that the production of a antibody was also increased. When mixed and inoculated with a swine herpes virus inactivating antigen (hereinafter referred to as PRV antigen), it has a high immunostimulatory activity to avoid lethality due to infection with the virus. Therefore, the adjuvant of the present invention is a highly safe adjuvant with high immunostimulatory activity.
【００２３】上記のような本発明に係るアジュバント
は、前記一般式［Ｉ］、［II］および［III］で表され
るソヤサポニンを単離精製する前のソヤサポニン分画
（粗精製物）の状態でも用いることができる。The adjuvant according to the present invention as described above is in the state of a soyasaponin fraction (crude product) before isolating and purifying the soyasaponin represented by the general formulas [I], [II] and [III]. However, it can be used.
【００２４】さらに、本発明のアジュバントは、例えば
アルミニウムゲルアジュバントやオイルエマルション型
アジュバントなど、他のアジュバントへ適当量配合する
ことで、各々が持つアジュバント能力をさらに上昇させ
る。ある種のサポニンと上記のアジュバントとを混合、
接種する方法自体は公知である。ソヤサポニンに関する
本発明の特記すべき点は、安全性の高いソヤサポニンを
用いることで、他のアジュバントへ配合しても副反応を
伴わない点である。Further, the adjuvant of the present invention further enhances the adjuvant ability of each of the adjuvants by blending it with other adjuvants such as aluminum gel adjuvant and oil emulsion type adjuvant in an appropriate amount. Mix certain saponins with the above adjuvants,
The inoculation method itself is known. A remarkable point of the present invention relating to soyasaponin is that by using soyasaponin having high safety, even if it is blended with other adjuvants, there is no side reaction.
【００２５】[0025]
【発明の実施の形態】本発明中のソヤサポニンの原料と
なるマメ科植物は、食用、食物原料、家畜飼料、あるい
は薬用育種などさまざまな種類のマメが目的に応じた種
々の用途で利用されている。例えばマメ科植物のなかで
も食用とされるマメ類は、およそ４８０近くの属と１２
０００以上の種に分類される。多くは乾燥種子をそのま
ま、種類によっては未熟段階の種子、さや、葉、やわら
かい茎、あるいは根が収穫され、野菜として食される。
マメ類は６０００年以上の間、世界の様々な地域で栽
培、食用とされてきた経緯を持つ。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The leguminous plant used as a raw material for soyasaponin in the present invention is used for various purposes according to the purpose, such as various kinds of beans such as food, food raw materials, livestock feed, and medicinal breeding. I have. For example, among legumes, legumes that are edible include nearly 480 genera and 12 species.
It is classified into more than 000 species. In many cases, dried seeds are harvested as they are, and depending on the kind, seeds, pods, leaves, soft stems or roots at an immature stage are harvested and eaten as vegetables.
Legumes have been cultivated and consumed in various parts of the world for more than 6000 years.
【００２６】なかでもダイズは、良質な植物性タンパク
質や油分が多量に含まれるとともに、サポニン類をはじ
めとした配糖体など、多種類の植物系二次代謝成分が含
まれる有用植物として知られている。また日本において
も、「豆になる」や「豆なひと」などのような、マメに
かかわる諺が古くから残されていることからも、古来よ
りマメ類が日常生活と密接な関係を有していたことが容
易に伺える。このように長年の歴史から食物としての有
用性と安全性が証明された食用マメ類を原料とするサポ
ニンは、高価な生薬に比べて非常に安価で入手が可能
で、かつ大量調製が容易である。Among them, soybean is known as a useful plant that contains a large amount of high-quality vegetable protein and oil, and also contains various plant-based secondary metabolic components such as glycosides such as saponins. ing. Also, in Japan, beans have been closely related to daily life since ancient times, as proverbs related to beans, such as "become a bean" and "bean of a bean," have been around for a long time. It is easy to see what they were doing. Saponins made from edible beans, which have proven useful and safe as food from many years of history, can be obtained at very low cost compared to expensive crude drugs, and can be easily prepared in large quantities. is there.
【００２７】本発明のアジュバントに用いられるソヤサ
ポニンは、マメ科植物、とりわけダイズ（ラテン名：グ
リシンマックス）乾燥種子から精製単離されたサポニン
である。また未精製のサポニン分画そのものも十分なア
ジュバント活性を有する。さらに、これらソヤサポニン
やその誘導体は、前記ダイズに限定されず、種々のマメ
科植物の種子中に含まれていることが確認、報告されて
いる。本発明のサポニンは、例えば以下の実施例のよう
にして得られる。The soyasaponin used in the adjuvant of the present invention is a saponin purified and isolated from dried legumes, especially soybean (Latin name: glycine max). The unpurified saponin fraction itself has a sufficient adjuvant activity. Furthermore, it has been confirmed and reported that these soyasaponins and their derivatives are not limited to the soybeans but are contained in the seeds of various legumes. The saponin of the present invention can be obtained, for example, as in the following examples.
【００２８】[0028]
【実施例】（１）ソヤサポニン類の単離精製 ソヤサポニン類の単離精製手順は、北川らの方法（Che
m. Pharm. Bull., 33(2) , 598-608 (1985)に記載）に
準じた。図１に精製過程の概要を示す。ダイズ（ラテン
名、グリシンマックス）乾燥種子粉末をメタノールにて
５時間環流抽出後、減圧エバポレーションによりメタノ
ールを除去して、メタノールエキスを得た。このエキス
をn-ヘキサンにて脱脂後、n-ヘキサン不溶性画分をn-ブ
タノール：水（１：１）にて分液処理した。得られたブ
タノール分画を酢酸エチルに少量ずつ混合、撹拌して沈
渣を得た。これをカラムクロマトグラフィー（Ｓｉ
Ｏ2、クロロフォルム：メタノール：水＝６５：３５：
１０）にかけて、ソヤサポニン分画を得た。このサポニ
ン分画をさらにカラム処理することでソヤサポニンＩ、
II、III、Ａ1、Ａ2およびデヒドロソヤサポニンＩを得
た。各々の精製ソヤサポニンは、薄相クロマトチャート
（Pre-coated silica gel 60 F254、クロロフォルム：
メタノール：水＝６：４：１）上のＲf値とスポットパ
ターンより、また必要に応じて核磁気共鳴スペクトルの
シグナルデータより同定した。ソヤサポゲノールＡおよ
びＢは、それぞれソヤサポニンＡ1およびソヤサポニン
Ｉの糖鎖部分を加水分解処理により解離することで調製
した。EXAMPLES (1) Isolation and purification of soyasaponins The isolation and purification procedure of soyasaponins was carried out according to the method of Kitagawa et al.Che
m.Pharm.Bull., 33 (2), 598-608 (1985))
According to. FIG. 1 shows an outline of the purification process. Soybean (Latin
Name, glycine max) dry seed powder with methanol
After reflux extraction for 5 hours, methanol was removed by evaporation under reduced pressure.
The methanol was removed to obtain a methanol extract. This extract
After degreasing with n-hexane, the n-hexane insoluble fraction was
Separation treatment was carried out with ethanol: water (1: 1). The obtained b
The ethanol fraction was mixed little by little with ethyl acetate, stirred and precipitated.
A residue was obtained. This is subjected to column chromatography (Si
OTwo, Chloroform: methanol: water = 65: 35:
10) to obtain a soyasaponin fraction. This saponi
The soyasaponin I,
II, III, A1, ATwoAnd dehydrosoyasaponin I
Was. Each purified soyasaponin is a thin-phase chromatographic chart.
(Pre-coated silica gel 60 F254, Chloroform:
Mf: water = 6: 4: 1) Rf value and spot
From the turn and, if necessary, the nuclear magnetic resonance spectrum.
It was identified from the signal data. Soyasapogenol A and
And B are soyasaponin A1And soyasaponin
Prepared by dissociating the sugar chain of I by hydrolysis
did.
【００２９】（２）免疫賦活活性の測定方法 （a）マウス抗ＯＶＡ抗体の測定 （a-1）免疫原の調製と接種：リン酸緩衝食塩水0.5ml
に、ソヤサポニンを各々200μg、ＯＶＡ100μgを加え
て、りん酸緩衝食塩水にて終濃度1.0mlにする。これを
免疫原として、0.1mlをddYマウス雌4週令の大腿部筋肉
内に接種する。1群10頭にて実施した。接種後４週目に
キャピラリーグラスにて20μlの眼窩採血をおこなう。
得られた血液は、12,000rpm、5分間遠心分離して、上清
を抗ＯＶＡ抗体価の測定に供する。 （a-2）抗ＯＶＡ抗体価の測定：96ウェルＵ字底マイク
ロタイタープレート（グライナー社製）に炭酸緩衝液で
0.1％に希釈したＯＶＡ溶液を150μl/well添加、37℃
下、２時間感作、固相する。次にプレートをツイーンＰ
ＢＳにて3回洗浄後、ツイーンＰＢＳにて1：100に希釈
した被検マウス血清を100μl/well添加、37℃下、１時
間感作する。プレートをツイーンＰＢＳにて3回洗浄
後、ツイーンＰＢＳにて1：5000に希釈したペロキシダ
ーゼ標識抗マウス総ＩｇＧを100μl/well添加、37℃
下、30分間感作する。このプレートをツイーンＰＢＳに
て3回洗浄後、オルトフェニレンジアミン溶液（リン酸
クエン酸緩衝液25mlにオルトフェニレンジアミン10mg錠
を溶解、30％過酸化水素水10μlを添加）を100μl/well
添加、25℃下、30分間感作、発色させる。2N硫酸を50μ
l/well添加して、反応を停止する。492nmの吸光度をＥ
ＬＩＳＡ価とする。陽性対照群としてＱＳ−２１接種群
をおいて、各サポニンの抗体価を比較した。 （a-3）結果：抗ＯＶＡ抗体価の測定結果を図２に示
す。ソヤサポニン添加免疫原接種マウスで、抗ＯＶＡ抗
体価の上昇が確認された。いずれのソヤサポニンもサポ
ニン陽性対照群ＱＳ−２１添加群と同等の抗体応答を示
した。ソヤサポニン相互間では有意差はなかったが、糖
鎖が大きいソヤサポニンほど高値を示す傾向があった。
糖鎖のOH基が部分的にアセチル化されたアセチルソヤサ
ポニンＡ1およびＡ2添加群においても、他のソヤサポニ
ン類と同様に、高いアジュバント活性を有することが判
明した。また単離精製前のサポニン分画添加群において
も、精製単離したソヤサポニンと同様に、抗ＯＶＡ抗体
価の上昇が確認された。一方糖鎖を欠いたアグリコン骨
格のみのソヤサポゲノールＡおよびＢ添加免疫原接種マ
ウスでは、抗体応答の上昇は確認されなかった。(2) Method of measuring immunostimulatory activity (a) Measurement of mouse anti-OVA antibody (a-1) Preparation and inoculation of immunogen: 0.5 ml of phosphate buffered saline
Then, 200 μg of soyasaponin and 100 μg of OVA are added, and the final concentration is adjusted to 1.0 ml with phosphate buffered saline. Using this as an immunogen, 0.1 ml is inoculated into a 4-week-old female thigh muscle of a ddY mouse. The test was performed on 10 animals per group. Four weeks after inoculation, 20 μl of orbital blood is collected using a capillary glass.
The obtained blood is centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant is subjected to measurement of anti-OVA antibody titer. (A-2) Measurement of anti-OVA antibody titer: 96-well U-bottom microtiter plate (Greiner) with carbonate buffer
Add 150µl / well of OVA solution diluted to 0.1%, 37 ℃
Sensitize for 2 hours under the solid phase. Next, plate Tween P
After washing three times with BS, 100 μl / well of test mouse serum diluted 1: 100 with Tween PBS is added, and sensitization is performed at 37 ° C. for 1 hour. After the plate was washed three times with Tween PBS, 100 μl / well of peroxidase-labeled anti-mouse total IgG diluted 1: 5000 with Tween PBS was added, and the plate was washed at 37 ° C.
Sensitize for 30 minutes below. After washing the plate three times with Tween PBS, 100 μl / well of an orthophenylenediamine solution (dissolve 10 mg of an orthophenylenediamine tablet in 25 ml of a phosphate citrate buffer and add 10 μl of 30% hydrogen peroxide solution)
Add, sensitize and color at 30 ° C for 30 minutes. 2N sulfuric acid 50μ
Stop the reaction by adding l / well. The absorbance at 492 nm is E
LISA value. The antibody titer of each saponin was compared in a QS-21 inoculated group as a positive control group. (A-3) Results: FIG. 2 shows the measurement results of the anti-OVA antibody titer. An increase in anti-OVA antibody titer was confirmed in soyasaponin-added immunogen-inoculated mice. All the soyasaponins showed an antibody response equivalent to that of the saponin positive control group QS-21 added group. Although there was no significant difference between soyasaponins, soyasaponins with larger sugar chains tended to show higher values.
Also in acetyl soya saponins A 1 and A 2 addition group where the OH group is partially acetylated sugar chain, as well as other soyasaponin class, to have high adjuvant activity it has been found. In the saponin fraction-added group before isolation and purification, an increase in the anti-OVA antibody titer was confirmed, similarly to the purified and isolated soyasaponin. On the other hand, in the soyasapogenol A and B-added immunogen-inoculated mice containing only the aglycone skeleton lacking a sugar chain, no increase in the antibody response was confirmed.
【００３０】（b）リシン攻撃試験とマウス抗リシン抗
体の測定 （b-1）免疫原の調製と接種：りん酸緩衝食塩水0.5ml
に、ソヤサポニンを各々200μg、リシン（ホルマリント
キソイド化処理済。）100μgを加えて、りん酸緩衝食塩
水にて終濃度1.0mlにする。なお、このホルマリントキ
ソイド化処理方法は、ギャレス・D. グリフィスらの方
法（Vaccine, 15(17/18), 1933-1939 (1997)に記載)に
準じた。これを免疫原として、0.1mlをddYマウス雌4週
令の背部皮下に接種する。1群10頭にて実施した。なお
攻撃の直前に、キャピラリーグラスにて20μlの眼窩採
血をおこない、マウス血中抗リシン抗体価の測定に供し
た。 （b-2）攻撃試験：りん酸緩衝食塩水0.5mlに、終濃度15
μg/0.1ml/dose（=３LD50)となるようにリシンを溶解、
これを上記免疫後4週目のマウス胸腔内に接種する。LD
50は予備試験によって、あらかじめ算出しておいた。1
群10頭にて実施した。接種後10日間のマウスの生存率を
観測、生存率（［生存率％］=（［生存数］/［供試頭
数］）×100）を算出し、比較検討した。 （b-3）抗リシン抗体価の測定：抗ＯＶＡ抗体価測定方
法に準じて実施した。96ウェルＵ字底マイクロタイター
プレート（グライナー社製）に炭酸緩衝液で0.02％に希
釈したリシン溶液を150μl/well添加、37℃下、2時間感
作、固相する。プレートをツイーンＰＢＳにて３回洗浄
後、ツイーンＰＢＳにて1：50に希釈した被検マウス血
清を100μl/well添加、37℃下、1時間感作する。プレー
トをツイーンＰＢＳにて３回洗浄後、ツイーンＰＢＳに
て1：5000に希釈したペロキシダーゼ標識抗マウス総Ｉ
ｇＧを100μl/well添加、37℃下、30分間感作する。プ
レートをツイーンＰＢＳにて３回洗浄後、オルトフェニ
レンジアミン溶液（リン酸クエン酸緩衝液25mlにオルト
フェニレンジアミン10mg錠を溶解、30％過酸化水素水10
μlを添加）を100μl/well添加、25℃下、30分間感作、
発色させる。2N硫酸を50μl/well添加して、反応を停止
する。492nmの吸光度をＥＬＩＳＡ価とする。陽性対照
群としてＱＳ−２１接種群をおいて、各サポニンの抗体
価を比較した。 （b-4）結果：表１はリシン攻撃によるマウス生存率の
推移の成績を示す。(B) Lysine challenge test and measurement of mouse anti-lysine antibody (b-1) Preparation and inoculation of immunogen: 0.5 ml of phosphate buffered saline
Then, 200 μg of soyasaponin and 100 μg of lysine (formalin toxoid-treated) were added thereto, and the final concentration was adjusted to 1.0 ml with a phosphate buffered saline. The formalin toxoid treatment was performed according to the method of Gareth D. Griffith et al. (Described in Vaccine , 15 (17/18), 1933-1939 (1997)). Using this as an immunogen, 0.1 ml is inoculated subcutaneously on the back of a 4-week-old female ddY mouse. The test was performed on 10 animals per group. Immediately before the challenge, 20 μl of orbital blood was collected using a capillary glass and subjected to measurement of anti-lysine antibody titer in mouse blood. (B-2) Challenge test: 0.5 ml phosphate buffered saline, final concentration 15
μg / 0.1ml / dose (= 3LD 50) and so as to dissolve the ricin,
This is inoculated into the pleural cavity of mice 4 weeks after the above immunization. LD
50 was previously calculated by a preliminary test. 1
The test was performed in groups of 10 animals. The survival rate of the mice for 10 days after the inoculation was observed, and the survival rate ([survival rate%] = ([surviving number] / [test head number]) × 100) was calculated and compared. (B-3) Measurement of anti-lysine antibody titer: This was carried out according to the anti-OVA antibody titer measuring method. A lysine solution diluted to 0.02% with a carbonate buffer is added to a 96-well U-bottom microtiter plate (manufactured by Greiner) at 150 µl / well, sensitized at 37 ° C for 2 hours, and solidified. After washing the plate three times with Tween PBS, 100 μl / well of test mouse serum diluted 1:50 with Tween PBS is added, and sensitization is performed at 37 ° C. for 1 hour. After washing the plate three times with Tween PBS, the peroxidase-labeled anti-mouse total I diluted 1: 5000 with Tween PBS was used.
Add 100 μl / well of gG and sensitize at 37 ° C for 30 minutes. After washing the plate three times with Tween PBS, an orthophenylenediamine solution (dissolve a 10 mg tablet of orthophenylenediamine in 25 ml of phosphate citrate buffer, and add 10%
100 μl / well, sensitization at 25 ° C for 30 minutes,
Let it develop color. The reaction is stopped by adding 50 μl / well of 2N sulfuric acid. The absorbance at 492 nm is taken as the ELISA value. The antibody titer of each saponin was compared in a QS-21 inoculated group as a positive control group. (B-4) Results: Table 1 shows the results of changes in the survival rate of mice by lysine challenge.
【表１】 リシン非免疫群で、攻撃後４日目以降から徐々に死亡が
確認されたのに対して、ソヤサポニン添加免疫原接種マ
ウスは、90％から100％の高い耐過率を示した。アジュ
バント未添加群でも40％程度の耐過率を示すが、ソヤサ
ポニン添加群ではそれを上回る値を示し、この差がアジ
ュバント効果である。一方、糖鎖構造を欠損したソヤサ
ポゲノールＡおよびＢにおいては、アジュバント未添加
群以下の値を示した。以上の成績を図３に示す。マウス
血中抗リシン抗体価を測定したところ、すべてのソヤサ
ポニン添加免疫原接種群で、高値を示すことが確認でき
た。抗リシン抗体価測定結果を図４に示す。また、精製
単離前のサポニン分画添加群においても、精製単離品と
同様の成績を示した。ソヤサポニン相互間で有意差はな
かった。リシン抗原における以上の傾向は、ＯＶＡ抗原
の試験成績に類似する。したがって精製ソヤサポニンあ
るいはソヤサポニン分画が、ＯＶＡやリシンに代表され
るタンパク抗原をはじめ、これらに類似する防御機構に
かかわる抗原を免疫原やワクチンとした際のアジュバン
トとして有用であることが、本試験成績より証明され
た。[Table 1] In the non-lysine-immunized group, death was gradually confirmed from the fourth day after the challenge, whereas the mice inoculated with the soyasaponin-added immunogen showed a high tolerance rate of 90% to 100%. The adjuvant-free group also showed an excess rate of about 40%, but the soyasaponin-added group showed a value higher than that, and this difference is the adjuvant effect. On the other hand, in soyasapogenols A and B lacking the sugar chain structure, the values were lower than those of the group without adjuvant. The above results are shown in FIG. When the anti-lysine antibody titer in the mouse blood was measured, it was confirmed that the value was high in all the soyasaponin-added immunogen-inoculated groups. FIG. 4 shows the measurement results of the anti-lysine antibody titer. In addition, the saponin fraction added group before purification and isolation showed the same results as the purified and isolated product. There was no significant difference between soyasaponins. These trends for the ricin antigen are similar to the test results for the OVA antigen. Therefore, the results of this study show that purified soyasaponin or soyasaponin fraction is useful as an adjuvant when an antigen related to a protective mechanism similar to these, including protein antigens represented by OVA and lysine, is used as an immunogen or vaccine. More proven.
【００３１】（ｃ）ＰＲＶの攻撃試験とマウス抗ＰＲＶ
抗体価の測定 （c-1）不活化ウイルス抗原液の調製：7.5×107PFU/ml
のＰＲＶウイルス液に終濃度0.1％となるようにホルマ
リンを添加して、37℃下2日間静置する。この液をりん
酸緩衝食塩水に2日間透析して、不活化ウイルス抗原液
とする。 （c-2）免疫原の調製と接種：抗原としてホルマリン不
活化ＰＲＶウイルス抗原液を用いる。抗原液は、マウス
1doseあたりＰＲＶウイルス7.5×106 PFU（不活化処理
前の数値）、および各種サポニンを20μgとなるように
りん酸緩衝食塩水に加える。これを免疫原として、0.1m
l/doseをddYマウス雌4週令の右脚大腿部筋肉内に接種す
る。1群10頭にて実施した。攻撃の直前に、キャピラリ
ーグラスにて50μlの眼窩採血をおこない、マウス血中
抗ＰＲＶ抗体価の測定に供した。 （c-3）攻撃試験：免疫原接種後4週目に1doseあたり200
LD（/0.1ml）のＰＲＶウイルス液を背部皮下に接種す
る。1群10頭にて実施した。攻撃後1週間のマウス生存数
を記録、生存率（［生存率％］=（［生存数］/［供試頭
数］）×100）を算出し、比較検討した。 （c-4）抗ＰＲＶ抗体価の測定：抗ＯＶＡ抗体価測定方
法に準じて実施した。96ウェルＵ字底マイクロタイター
プレート（グライナー社製）に炭酸緩衝液で7.5×105 P
FU/mlに調製したＰＲＶ溶液を150μl/well添加、37℃
下、2時間感作、固相する。次にプレートへ、３％牛血
アルブミン加ツイーンＰＢＳを150μl/well添加、37℃
下、2時間感作、ブロック処理する。感作後ツイーンＰ
ＢＳにてにて3回洗浄後、ツイーンＰＢＳにて1：200に
希釈した被検マウス血清を100μl/well添加、37℃下、1
時間感作する。このプレートをツイーンＰＢＳにて3回
洗浄後、ツイーンＰＢＳにて1：5000に希釈したペロキ
シダーゼ標識抗マウス総ＩｇＧ、ＩｇＧ1、およびＩｇ
Ｇ２ａをそれぞれ100μl/well添加、37℃下、30分間感
作する。再びプレートをツイーンＰＢＳにて３回洗浄
後、オルトフェニレンジアミン溶液（リン酸クエン酸緩
衝液25mlにオルトフェニレンジアミン10mg錠を溶解、30
％過酸化水素水10μlを添加）を100μl/well添加、25℃
下、30分間感作、発色させる。2N硫酸を50μl/well添加
して、反応を停止する。492nmの吸光度をＥＬＩＳＡ価
とする。陽性対照群としてＱＳ−２１接種群をおいて、
各サポニンの抗体価を比較した。 （c-5）結果：表２はＰＲＶ攻撃によるマウス生存率の
推移の成績を示す。(C) PRV challenge test and mouse anti-PRV
Measurement of antibody titer (c-1) Preparation of inactivated virus antigen solution: 7.5 × 10 7 PFU / ml
To the final PRV virus solution at a final concentration of 0.1%, and allowed to stand at 37 ° C. for 2 days. This solution is dialyzed against phosphate buffered saline for 2 days to obtain an inactivated virus antigen solution. (C-2) Preparation and inoculation of immunogen: Formalin-inactivated PRV virus antigen solution is used as an antigen. Antigen solution is mouse
7.5 × 10 6 PFU of PRV virus per dose (value before inactivation treatment) and various saponins are added to a phosphate buffered saline so as to be 20 μg. Using this as an immunogen, 0.1 m
l / dose is inoculated into the right leg thigh muscle of a 4-week-old female ddY mouse. The test was performed on 10 animals per group. Immediately before the challenge, 50 μl of orbital blood was collected using a capillary glass and subjected to measurement of anti-PRV antibody titers in mouse blood. (C-3) Challenge test: 200 per dose at 4 weeks after immunogen inoculation
LD (/0.1 ml) PRV virus solution is inoculated subcutaneously on the back. The test was performed on 10 animals per group. The number of surviving mice one week after the challenge was recorded, and the survival rate ([survival%] = ([survival number] / [test head number]) × 100) was calculated and compared. (C-4) Measurement of anti-PRV antibody titer: The measurement was performed according to the anti-OVA antibody titer measuring method. 7.5 × 10 5 P with a carbonate buffer in a 96-well U-bottom microtiter plate (manufactured by Greiner)
Add 150μl / well of PRV solution adjusted to FU / ml, 37 ℃
Sensitize for 2 hours under the solid phase. Next, 150 μl / well of Tween PBS containing 3% bovine blood albumin was added to the plate, and the temperature was 37 ° C.
Below, 2 hours sensitization, block processing. Twist P after sensitization
After washing three times with BS, 100 μl / well of test mouse serum diluted 1: 200 with Tween PBS was added, and the mixture was added at 37 ° C. for 1 hour.
Sensitize time. After washing the plate three times with Tween PBS, peroxidase-labeled anti-mouse total IgG, IgG1, and IgG diluted 1: 5000 with Tween PBS.
G2a is added at 100 μl / well and sensitized at 37 ° C. for 30 minutes. After washing the plate again with Tween PBS three times, an orthophenylenediamine solution (dissolve 10 mg of orthophenylenediamine tablets in 25 ml of phosphate citrate buffer, 30
10% hydrogen peroxide solution) (100μl / well), 25 ℃
Lower, sensitize for 30 minutes, develop color. The reaction is stopped by adding 50 μl / well of 2N sulfuric acid. The absorbance at 492 nm is taken as the ELISA value. QS-21 inoculation group was set as a positive control group,
The antibody titers of each saponin were compared. (C-5) Results: Table 2 shows the results of changes in the mouse survival rate due to PRV challenge.
【表２】 200LD50の高濃度攻撃であったために、非免疫群は全頭
死亡した。アジュバント未添加免疫原接種群の生存率は
50％であることから、本免疫原単味でも、ある程度防御
に有効である。ソヤサポニン添加群では生存率90％の高
い防御効果を示した。生存率の経時変化もソヤサポニン
相互に類似した。ソヤサポニン分画においても高い防御
効果が認められた。一方ソヤサポゲノールＡとＢにおい
ては防御効果はなかった。以上の成績を図５に示す。抗
ＰＲＶ抗体価に関して、総ＩｇＧに加えて、抗体サブク
ラスＩｇＧ1およびＩｇＧ２ａについても測定した。こ
れらの抗ＰＲＶ抗体価の測定結果を図６〜図８に示す。
総ＩｇＧは、ソヤサポニン添加群で高値を示した。これ
は、ＯＶＡやリシンを抗原とした場合と同様の傾向であ
る。ソヤサポニン類添加群は、アジュバント未添加免疫
原接種群にくらべてＩｇＧ１とＩｇＧ２ａも良く上昇し
ており、アジュバント未添加群との間に有意差があっ
た。ただしソヤサポニン相互間では有意差はなかった。
ＰＲＶの場合、ウイルス中和抗体以外に細胞性免疫の励
起も防御効果に有効であることが考えられる。ＩｇＧ２
ａ抗体が多く産生されていることから、免疫原にソヤサ
ポニンを添加することで、細胞性免疫を誘発したことが
示唆される。[Table 2] All non-immunized animals died due to the high concentration of 200 LD 50 challenge. Survival rate of immunogen inoculated group without adjuvant
Since it is 50%, even this immunogen alone is effective for protection to some extent. The soyasaponin group showed a high protective effect with a survival rate of 90%. The time course of the survival rate was similar to that of soyasaponins. A high protective effect was also observed in the soyasaponin fraction. On the other hand, soyasapogenols A and B had no protective effect. The above results are shown in FIG. Anti-PRV antibody titers were measured for antibody subclasses IgG1 and IgG2a in addition to total IgG. The measurement results of these anti-PRV antibody titers are shown in FIGS.
The total IgG showed a high value in the soyasaponin-added group. This is the same tendency as when OVA or lysine was used as the antigen. In the soyasaponins-added group, IgG1 and IgG2a were also higher than in the immunogen-inoculated group without the adjuvant, and there was a significant difference between the group and the group without the adjuvant. However, there was no significant difference between soyasaponins.
In the case of PRV, excitation of cell-mediated immunity other than the virus neutralizing antibody is also considered to be effective for the protective effect. IgG2
The high production of antibody a suggests that adding soyasaponin to the immunogen induced cellular immunity.
【００３２】ソヤサポニンは上記のように単味に限ら
ず、他のアジュバント、例えばアルミニウムゲルアジュ
バント、Ｗ／Ｏ型オイルアジュバント、あるいはＯ／Ｗ
型オイルアジュバントなどと混合することでも、効果的
に活性を誘導することができる。その調製方法と効果を
以下に記載する。The soyasaponin is not limited to a simple substance as described above, but may be other adjuvants such as aluminum gel adjuvant, W / O type oil adjuvant, or O / W.
The activity can also be effectively induced by mixing with a type oil adjuvant or the like. The preparation method and effects are described below.
【００３３】（ｄ）ソヤサポニンによる他のアジュバン
ト組成物のアジュバント効果増強作用 （d-1）免疫原の調製方法と接種 （d-1-1）「ソヤサポニンＡ1・アルミニウムゲル・コン
ビネーションアジュバント」の調製および免疫原の調製 20mMリン酸緩衝液（ｐＨ6.0）をベースとして、リン酸
アルミニウムゲルアジュバントを調製する。ＯＶＡを終
濃度100μg/mlとなるようにアルミゲルへ吸着させる。
なお吸着条件は免疫調製に先立って確認した。次いでソ
ヤサポニンＡ1を終濃度100、200、500、1000、および20
00μg/mlとなるように各々添加する。 （d-1-2）「ソヤサポニンＡ1・Ｗ／Ｏ型オイル・コンビ
ネーションアジュバント」の調製および免疫原の調製 ＯＶＡ抗原の原液へ、免疫原終濃度100、200、500、100
0、および2000μg/mlとなるようにソヤサポニンＡ1を溶
解する。このソヤサポニンＡ1加ＯＶＡ抗原液と、無水
マンニトールオレイン酸エステル（3.1％）添加スクワ
ランを3：7の比率で混合し、ウルトラホモミキサーで乳
化してＷ／Ｏ型免疫原とした。 （ｄ-1-3）「ソヤサポニンＡ1・Ｏ／Ｗ型オイル・コン
ビネーションアジュバント」の調製および免疫原の調製 無水マンニトールオレイン酸エステル（5.0％）添加ス
クワランを調製した。このオイル50部をとり、ガラス容
器中のリン酸緩衝生理食塩水液50部に滴下しながらウル
トラホモミキサーで乳化してＯ／Ｗ型乳剤を調製した。
このアジュバント乳剤に対して、ＯＶＡ抗原液（免疫原
中ＯＶＡ終濃度200μg/ml、およびソヤサポニンＡ1終濃
度100、200、500、1000、および2000μg/mlとなるよう
に各々溶解しておく）３部を添加してＯ／Ｗ型免疫原と
した。以上３種類の免疫原を、各々0.1mlをddYマウス雌
4週令の大腿部筋肉内に接種する。1群10頭にて実施し
た。また、アルミゲルのみのソヤサポニンＡ1未添加群
も設定した。接種後4週目にキャピラリーグラスにて20
μlの眼窩採血をおこなう。血清分離後、上清を抗ＯＶ
Ａ抗体価の測定に供する。抗ＯＶＡ抗体価としてＥＬＩ
ＳＡを実施した。抗体価測定方法は、前記の手順に準じ
る。(D) Enhancement of adjuvant effect of other adjuvant compositions by soyasaponin (d-1) Preparation and inoculation of immunogen (d-1-1) Preparation of "soyasaponin A 1 aluminum gel combination adjuvant" And preparation of immunogen An aluminum phosphate gel adjuvant is prepared based on 20 mM phosphate buffer (pH 6.0). OVA is adsorbed to an aluminum gel to a final concentration of 100 μg / ml.
In addition, the adsorption conditions were confirmed before the immunization preparation. Then soyasaponin A 1 to a final concentration 100,200,500,1000, and 20
Each is added so as to be 00 μg / ml. (D-1-2) Preparation of “Soyasaponin A 1 / W / O-type oil combination adjuvant” and preparation of immunogen To the stock solution of OVA antigen, the final concentration of immunogen was 100, 200, 500, 100
0, and dissolving soyasaponin A 1 such that the 2000 [mu] g / ml. This soyasaponin A 1 -added OVA antigen solution and squalane containing anhydrous mannitol oleate (3.1%) were mixed at a ratio of 3: 7, and emulsified with an ultra homomixer to obtain a W / O-type immunogen. (D-1-3) Preparation of "Soyasaponin A 1 / O / W type oil combination adjuvant" and preparation of immunogen Squalane containing mannitol oleic anhydride (5.0%) was prepared. An O / W emulsion was prepared by taking 50 parts of this oil and emulsifying it with an ultra homomixer while dripping it into 50 parts of a phosphate buffered saline solution in a glass container.
To this adjuvant emulsion, an OVA antigen solution (dissolved so that the final concentration of OVA in the immunogen is 200 μg / ml and the final concentration of soyasaponin A 1 is 100, 200, 500, 1000, and 2000 μg / ml, respectively) 3 A part was added to obtain an O / W type immunogen. 0.1 ml each of the above three types of immunogens was ddY mouse female
Inoculate into the 4-week-old thigh muscle. The test was performed on 10 animals per group. In addition, also set soyasaponin A 1 non-addition group of only Arumigeru. 4 weeks after inoculation with a capillary glass 20
Perform μl orbital blood sampling. After serum separation, the supernatant was
Provide for measurement of A antibody titer. ELI as anti-OVA antibody titer
SA was performed. The antibody titer is measured according to the above procedure.
【００３４】（d-2）結果：アルミニウムゲルアジュバ
ントにおいては、アルミゲル単味にソヤサポニンＡ 1を
添加することで抗体価が上昇することが確認された。添
加量として10から20μg/doseにかけてよい成績を示し
た。添加量が上昇すると、抗体価がやや下降する傾向が
確認された。Ｗ／Ｏ型オイルアジュバント免疫原におい
ても同様に、ソヤサポニンＡ1の微量添加（10μg/dose)
で高値を示した。一方添加量が増加すると、ソヤサポニ
ンＡ1未添加群よりも低値を示すとともに、群内バラツ
キが大きくなる傾向が確認された。Ｏ／Ｗ型オイルアジ
ュバント免疫原においては、Ｗ／Ｏ型と若干レスポンス
パターンは異なるものの、ソヤサポニンＡ1の少量添加
（10〜50μg/dose)で高値を示し、この添加量が増加す
ると、群内バラツキが大きくなる傾向を示した。以上の
結果を図９に示す。(D-2) Result: aluminum gel adjuva
Sotosaponin A in aluminum gel 1To
It was confirmed that the addition increased the antibody titer. Attachment
Good results were obtained at doses of 10 to 20 μg / dose.
Was. As the amount added increases, the antibody titer tends to decrease slightly.
confirmed. W / O oil adjuvant immunogen
Similarly, soyasaponin A1Trace addition (10μg / dose)
Showed a high value. On the other hand, when the added amount increases, soyasaponi
A1It shows a lower value than the non-added group,
The tendency to increase the key was confirmed. O / W type oil horse mackerel
W / O type and slight response in uvant immunogen
Soyasaponin A, although the pattern is different1Small amount of
(10-50 μg / dose) shows a high value, and this amount increases
Then, there was a tendency that the variation within the group became large. More than
FIG. 9 shows the results.
【００３５】以上の成績より、これら既存のアジュバン
ト組成物へのソヤサポニンの添加が効果的であることが
証明された。ただしソヤサポニンには至適添加量があ
り、アジュバントの種類によってまちまちであることが
確認された。これはソヤサポニンの添加量に応じて、各
々のアジュバント組成物が持つ物理学的性状（粘度ある
いは抗原分子との相互作用）などが変化することによる
ものと考えられる。したがってソヤサポニン添加の際
は、至適添加量の問題を考慮しておくことが重要であ
る。また本試験すべての群で、局所反応をはじめとした
副反応は観察されなかった。From the above results, it was proved that the addition of soyasaponin to these existing adjuvant compositions was effective. However, it was confirmed that there was an optimal amount of soyasaponin to be added, and that it varied depending on the type of adjuvant. This is considered to be due to the fact that the physical properties (viscosity or interaction with antigen molecules) of each adjuvant composition change depending on the amount of soyasaponin added. Therefore, when adding soyasaponin, it is important to consider the problem of the optimal addition amount. No side reactions including local reactions were observed in all groups in this test.
【００３６】ソヤサポニンはタンパク抗原に対する抗体
応答を上昇させるのに有用な効果をもつ免疫賦活剤であ
ることが明らかとなった。また本サポニンがアジュバン
ト活性を発揮するためには、サポニン分子の糖鎖の存在
が必須である。またこの糖鎖はアセチル基などによって
部分的に化学修飾されていても、高いアジュバント効果
を期待できることが判明した。またサポニン分画に関し
ても、精製ソヤサポニン同様にアジュバント組成物とす
ることができる。ただしサポニン分画は、分子内に糖鎖
を有するソヤサポニンを多含することが重要である。It has been found that soyasaponin is an immunostimulant that has a useful effect in increasing an antibody response to a protein antigen. In order for the present saponin to exhibit adjuvant activity, the presence of the sugar chain of the saponin molecule is essential. It was also found that a high adjuvant effect can be expected even if this sugar chain is partially chemically modified with an acetyl group or the like. As for the saponin fraction, an adjuvant composition can be obtained as in the case of purified soyasaponin. However, it is important that the saponin fraction contains a large amount of soyasaponin having a sugar chain in the molecule.
【００３７】（３）局所反応の観察と溶血活性の測定 （a）局所反応の観察 （a-1）方法：ソヤサポニンＡ1について試験を実施し
た。対照としてＱＳ−２１を試験に供した。各サポニン
をＰＢＳに溶解して、1ドースあたり20、200、および20
00μg/0.1mlを各濃度をモルモット脚部筋肉注射する。
接種後7日目の接種部位の腫脹や炎症などの、副反応の
有無を観察した。 （a-2）結果：表３は局所反応の有無の観察記録を示
す。[0037] (3) Measurement of observation and hemolytic activity of local reactions (a) Observation of local reactions (a-1) Method: For soyasaponin A 1 The tests were carried out. QS-21 was subjected to the test as a control. Each saponin was dissolved in PBS to give 20, 200, and 20
Inject guinea pig leg muscle at each concentration of 00 μg / 0.1 ml.
Seven days after inoculation, the presence or absence of side reactions such as swelling and inflammation at the site of inoculation was observed. (A-2) Results: Table 3 shows observation records of the presence or absence of local reaction.
【表３】 ＱＳ−２１においては、高濃度接種群で、接種部位の腫
脹と壊死が観察された。一方、ソヤサポニンＡ1は2000
μg接種でも、なんら副反応を示さなかった。[Table 3] In QS-21, swelling and necrosis of the inoculation site were observed in the high concentration inoculation group. On the other hand, soyasaponin A 1 2000
Even the μg inoculation did not show any side reaction.
【００３８】（ｂ）溶血活性の測定 （b-1）方法：96ウェルＵ字底マイクロタイタープレー
ト（住友ベークライト社製）に500、250、125、63、3
1、16、7.8、および3.9μg/mlのサポニン2倍階段希釈液
を各々100μl/wellずつ添加する。次に20％ヒツジ赤血
球溶液を25μl/wellで添加し、ゆるやかに混和する。37
℃で30分感作後にこのプレートを1000rpm、10分間遠心
する。遠心上清の570nmにおける吸光度を測定し、グラ
フプロット上から50％溶血濃度を算出した。 （b-2）結果：表４は溶血活性の測定成績を示す。(B) Measurement of hemolytic activity (b-1) Method: 500, 250, 125, 63, 3 in a 96-well U-shaped microtiter plate (Sumitomo Bakelite)
1, 16, 7.8, and 3.9 μg / ml 2-fold serial saponin dilutions are added at 100 μl / well each. Next, a 20% sheep erythrocyte solution is added at 25 μl / well and mixed gently. 37
After sensitization at 30 ° C for 30 minutes, the plate is centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes. The absorbance at 570 nm of the centrifuged supernatant was measured, and the 50% hemolysis concentration was calculated from the graph plot. (B-2) Results: Table 4 shows the measurement results of the hemolytic activity.
【表４】 高アジュバント活性サポニンＱＳ−２１は高い溶血性を
示した。一方、ソヤサポニン類はこの測定濃度域ではい
ずれも溶血性を示さなかった。[Table 4] High adjuvant activity saponin QS-21 showed high hemolysis. On the other hand, none of the soyasaponins showed hemolysis in this concentration range.
【００３９】溶血活性は、血球細胞膜の構成成分のコレ
ステロールとサポニン分子との結合により生じることが
知られている。この機構の説明として、例えば、アウド
レイ・M.・グラウエルトらの報告（Nature, 196, 952-9
55 (1962)に記載）をはじめとする種々の報告がある。
こうしたサポニンの、一種の細胞膜障害活性が、アジュ
バント組成物として接種した際に、時として生体の局所
の炎症反応、腫脹、あるいは痛みなどを引き起こす原因
となる恐れがある。例えば、近年の報告では、ワニア・
レナータ・サントスら（Vaccine, 15(9), 1024-1029 (1
997)に記載）が、サポニンの溶血活性を「望ましくない
作用」と表現している。この点、本発明で用いるサポニ
ン、ソヤサポニン類は、前記のように溶血性を示さな
い。このようなサポニンは、モルモットにおける接種反
応試験の観察でも、何ら副反応を示さなかった。また、
本発明のための各種免疫試験においても、ソヤサポニン
添加免疫原接種群は、すべて接種反応を引き起こさなか
ったことを付加しておく。このようにソヤサポニンは、
アジュバント効果のみならず、高い安全性をもつ有用な
サポニンであることが証明された。It is known that the hemolytic activity is caused by the binding between cholesterol, a constituent of the blood cell membrane, and a saponin molecule. For an explanation of this mechanism, see, for example, a report by Audrey M. Grauert et al. ( Nature , 196, 952-9
55 (1962)).
Such a saponin's cell membrane-damaging activity may sometimes cause a local inflammatory reaction, swelling or pain in a living body when inoculated as an adjuvant composition. For example, recent reports show that
Renata Santos et al. ( Vaccine , 15 (9), 1024-1029 (1
997)) describes the haemolytic activity of saponin as an "undesirable effect." In this regard, the saponins and soyasaponins used in the present invention do not exhibit hemolysis as described above. Such a saponin did not show any side reaction even in the observation of the inoculation reaction test in guinea pigs. Also,
It should be added that in the various immunization tests for the present invention, the soyasaponin-added immunogen-inoculated group did not cause any inoculation reaction. Soyasaponin is like this
It was proved to be a useful saponin having not only an adjuvant effect but also high safety.
【００４０】[0040]
【発明の効果】（１）抗体応答について ソヤサポニンは可溶性抗原やタンパク性毒素に対する抗
体応答を増大させる効果を有することが確認された。抗
体サブクラスのＩｇＧ1のみならずＩｇＧ２ａの応答を
も増大させることが明らかとなった。その結果、本発明
のアジュバントを用いることで、生体は、毒素やウイル
ス感染に起因する致死から回避することが可能となっ
た。またソヤサポニンは、ＩｇＧ２ａの応答を増大させ
ることから、体液性免疫だけでなく細胞性免疫をも励起
する可能性が示唆された。このようなソヤサポニンのア
ジュバント活性を発揮するためには、アグリコン分子に
糖鎖が結合した配糖体の状態であることが必須である。
このようなサポニンは、単糖類のOH基、あるいはアグリ
コン分子に直結するOH基が部分的に化学修飾されていて
も活性を有することが判明した。ソヤサポニン分画も同
様に単離精製品と同様に活性を有する。ただしソヤサポ
ニン分画はアグリコン分子に糖鎖が結合したソヤサポニ
ンを多含することが必須である。 （２）ソヤサポニンの他のアジュバント組成物のアジュ
バント増強効果 ソヤサポニンは単味で高いアジュバント活性を発揮する
ことに加えて、別種類の他のアジュバントと適当量混合
することで、各々のアジュバント効果を増強する。従っ
て、本発明に係るアジュバントは、他のアジュバントと
混合したアジュバントとして使用することができる。 （３）局所反応と溶血活性 特に本発明に係るソヤサポニンを用いたアジュバント
は、上記試験範囲内のどの添加量においても、副反応を
示さず、高い安全性が保持されていることが明らかとな
った。 （４）安全性 本発明により、古来より食用として供せられ、高い安全
性が保証されたマメ科植物の種子、特にダイズを原料と
して得られるソヤサポニンが、アジュバントとして上記
の種々の用途で活用可能であることが確認された。(1) Antibody response It has been confirmed that soyasaponin has an effect of increasing the antibody response to soluble antigens and proteinaceous toxins. It was revealed that the response of not only IgG1 of the antibody subclass but also IgG2a was increased. As a result, by using the adjuvant of the present invention, the living body can be prevented from being killed due to toxin or virus infection. In addition, since soyasaponin increases the response of IgG2a, it is suggested that soyasaponin may excite not only humoral immunity but also cellular immunity. In order to exert the adjuvant activity of soyasaponin, it is essential that the soyasaponin be in a glycoside state in which a sugar chain is bonded to an aglycone molecule.
It has been found that such saponins have activity even when the OH group of the monosaccharide or the OH group directly linked to the aglycone molecule is partially chemically modified. The soyasaponin fraction has the same activity as the isolated purified product. However, it is essential that the soyasaponin fraction contains a large amount of soyasaponin in which a sugar chain is bound to an aglycone molecule. (2) Adjuvant-enhancing effect of other adjuvant compositions of soyasaponin Soyasaponin not only exerts a simple high adjuvant activity but also enhances each adjuvant effect by mixing with an appropriate amount of another adjuvant of another kind I do. Therefore, the adjuvant according to the present invention can be used as an adjuvant mixed with another adjuvant. (3) Local reaction and hemolytic activity In particular, the adjuvant using soyasaponin according to the present invention does not show any side reaction at any amount added within the above test range, and it is clear that high safety is maintained. Was. (4) Safety According to the present invention, soyasaponin, which has been used as an edible substance since ancient times and has high safety guaranteed, and is obtained from soybean as a raw material, particularly soybean, can be used as an adjuvant in the above various applications. Was confirmed.
【図１】 ダイズ種子からのソヤサポニン分画、ソヤサ
ポニンＡ1、Ａ2、Ｉ、II、III、およびデヒドロソヤサ
ポニンＩの精製過程の説明図。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is an explanatory diagram of the purification process of soyasaponin fraction from soybean seed, soyasaponin A 1 , A 2 , I, II, III and dehydrosoyasaponin I.
【図２】 抗ＯＶＡ抗体価（総ＩｇＧのＥＬＩＳＡ価）
の測定結果を示すグラフ。FIG. 2 Anti-OVA antibody titer (total IgG ELISA titer)
5 is a graph showing the measurement results.
【図３】 リシンによる攻撃試験結果（マウス生存率の
推移）を示すグラフ。FIG. 3 is a graph showing the results of an attack test with lysine (transition of mouse survival rate).
【図４】 抗リシン抗体価（総ＩｇＧのＥＬＩＳＡ価）
の測定結果を示すグラフ。FIG. 4 Anti-lysine antibody titer (total IgG ELISA titer)
5 is a graph showing the measurement results.
【図５】 ＰＲＶによる攻撃試験結果（マウス生存率の
推移）を示すグラフ。FIG. 5 is a graph showing the results of a challenge test using PRV (transition of mouse survival rate).
【図６】 抗ＰＲＶ抗体価（総ＩｇＧＥＬＩＳＡ価）の
測定結果を示すグラフ。FIG. 6 is a graph showing the measurement results of anti-PRV antibody titers (total IgG ELISA titers).
【図７】 抗ＰＲＶ抗体価（ＩｇＧ1 ＥＬＩＳＡ価）の
測定結果を示すグラフ。FIG. 7 is a graph showing the results of measuring anti-PRV antibody titers (IgG1 ELISA titers).
【図８】 抗ＰＲＶ抗体価（ＩｇＧ２ａＥＬＩＳＡ価）
の測定結果を示すグラフ。FIG. 8: Anti-PRV antibody titer (IgG2a ELISA titer)
5 is a graph showing the measurement results.
【図９】 各アジュバント組成物へのソヤサポニンＡ1
の添加が抗ＯＶＡ抗体価（総ＩｇＧのＥＬＩＳＡ価）に
及ぼす影響を示すグラフ。FIG. 9: Soyasaponin A 1 for each adjuvant composition
The graph which shows the influence which the addition of has on the anti-OVA antibody titer (ELISA titer of total IgG).
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 吉川 雅之 大阪府箕面市粟生新家３−18−９ (56)参考文献 特表2001−501640（ＪＰ，Ａ) ＢＯＭＦＯＲＤ Ｒ．ｅｔ ａｌ，Ａ ｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｉ ＳＣＯＭ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｄｉｖｅｒ ｓｅ ｓａｐｏｎｉｎｓ，Ｖａｃｃｉｎ ｅ，Ｖｏｌ．10，Ｎｏ．９，572−577, 1992 ＫＩＴＡＧＡＷＡ Ｉｓａｏ ｅｔ ａｌ，Ｓａｐｏｎｉｎ ａｎｄ ｓａｐ ｏｇｅｎｏｌ．ＸＸＸＶＩＩＩ．Ｓｔｒ ｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓｏｙａｓａｐｏ ｎｉｎ Ａ２，ａ ｂｉｓｄｅｓｍｏｓ ｉｄｅ ｏｆ ｓｏｙａｓａｐｏｇｅｎ ｏｌ Ａ，ｆｒｏｍ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａ ｒｍ．Ｂｕｌｌ．，米国，Ｖｏｌ．33, Ｎｏ．２，596−608，1985 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 39/39 A61K 39/245 A61K 35/78 C07J 63/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ)────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Masayuki Yoshikawa 3-18-9 Aow Shinke, Minoh-shi, Osaka (56) References Special Table 2001-501640 (JP, A) BOMFORD R. et al, Adjuvanticity and I SCOM formation by structurally diversified saponins, Vaccine, Vol. 10, No. 9, 572-577, 1992 KITAGAWA Isao et al, Saponin and sapogenol. XXXVIII. Structure of soyasapo nin A2, a bidesmoside of soyasapogenol A, from, Chem. Pharm. Bull. U.S.A., Vol. 33, No. 2,596-608,1985 (58) Fields investigated (Int. Cl. 7 , DB name) A61K 39/39 A61K 39/245 A61K 35/78 C07J 63/00 CA (STN) EDLINE (STN) EMBASE (STN ) BIOSIS (STN)
Claims (13)
る、ソヤサポゲノールＡを基本骨格とするオレアナン型
サポニンの少なくとも１種を免疫賦活剤として含有する
ことを特徴とするアジュバント。1. A compound of the general formula (Wherein R 1 and R 2 each represent a sugar chain group), characterized in that it contains at least one oleanane-type saponin having soyasapogenol A as a basic skeleton as an immunostimulant.
なくとも１種のオレアナン型サポニンである請求項１記
載のアジュバント。2. The oleanane-type saponin has the formula: Soyasaponin A 1 represented by the formula and the formula In at least one Oleanane type saponin in a claim 1, wherein the adjuvant is selected from among soyasaponin A 2 represented.
ゲノールＢを基本骨格とするオレアナン型サポニンの少
なくとも１種を免疫賦活剤として含有することを特徴と
するアジュバント。3. A compound of the general formula (Wherein R represents a sugar chain group) An adjuvant comprising, as an immunostimulant, at least one oleanane-type saponin having soyasapogenol B as a basic skeleton.
なくとも１種のオレアナン型サポニンである請求項３記
載のアジュバント。4. The oleanane-type saponin has the formula: Soyasaponin I represented by the formula: Soyasaponin II and a compound represented by the formula The adjuvant according to claim 3, which is at least one oleanane-type saponin selected from soyasaponins III represented by the following formula:
ゲノールＥを基本骨格とするオレアナン型サポニンの少
なくとも１種を免疫賦活剤として含有することを特徴と
するアジュバント。5. A compound of the general formula (Wherein R represents a sugar chain group) An adjuvant comprising, as an immunostimulant, at least one oleanane-type saponin having soyasapogenol E as a basic skeleton.
記載のアジュバント。6. The oleanane-type saponin has the formula: 6. Dehydrosoyasaponin I represented by the formula:
The adjuvant as described.
科植物の種子から抽出される単離精製前のソヤサポニン
分画を含有する請求項１〜６のいずれかに記載のアジュ
バント。7. The adjuvant according to claim 1, wherein the oleanane-type saponin contains a soyasaponin fraction extracted from seeds of legumes before isolation and purification.
ントを、少なくとも１種類の他のアジュバント組成物と
を組み合わせたソヤサポニン・コンビネーションアジュ
バント。8. A soyasaponin combination adjuvant in which the adjuvant according to claim 1 is combined with at least one other adjuvant composition.
ントを、リン酸アルミニウムゲルと組み合わせたソヤサ
ポニン・アルミニウムゲル・コンビネーションアジュバ
ント。9. A soyasaponin-aluminum gel combination adjuvant wherein the adjuvant according to claim 1 is combined with an aluminum phosphate gel.
バントを、Ｗ／Ｏ型オイルベース乳剤と組み合わせたソ
ヤサポニン・Ｗ／Ｏ・コンビネーションアジュバント。10. A soyasaponin / W / O combination adjuvant in which the adjuvant according to claim 1 is combined with a W / O type oil-based emulsion.
バントを、Ｏ／Ｗ型オイルベース乳剤と組み合わせた、
ソヤサポニン・Ｏ／Ｗ・コンビネーションアジュバン
ト。11. An adjuvant according to claim 1, which is combined with an O / W type oil-based emulsion.
Soyasaponin / O / W / combination adjuvant.
バントとリシントキソイド抗原を含有することを特徴と
するリシントキソイドワクチン。A ricin toxoid vaccine comprising the adjuvant according to any one of claims 1 to 7 and a ricin toxoid antigen.
バントと豚ヘルペス不活化ウイルス抗原（ＰＲＶ抗原）
を含有することを特徴とするＰＲＶウイルスワクチン。13. An adjuvant according to claim 1 and a swine herpes inactivated virus antigen (PRV antigen).
A PRV virus vaccine comprising:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02042499A JP3282603B2 (en) | 1999-01-28 | 1999-01-28 | Adjuvants and vaccines using them |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02042499A JP3282603B2 (en) | 1999-01-28 | 1999-01-28 | Adjuvants and vaccines using them |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000219638A JP2000219638A (en) | 2000-08-08 |
| JP3282603B2 true JP3282603B2 (en) | 2002-05-20 |
Family
ID=12026668
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02042499A Expired - Fee Related JP3282603B2 (en) | 1999-01-28 | 1999-01-28 | Adjuvants and vaccines using them |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3282603B2 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008112707A1 (en) * | 2007-03-13 | 2008-09-18 | Peros Systems Technologies, Inc. | Immunoactive compositions for improved oral delivery of vaccines and therapeutic agents |
| WO2023172034A1 (en) * | 2022-03-07 | 2023-09-14 | 기초과학연구원 | Pharmaceutical composition for preventing and treating enveloped viruses, comprising extracts of codonopsis sp., aster sp. and/or polygala sp. plants |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001501640A (en) | 1996-10-05 | 2001-02-06 | スミスクライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | vaccine |
-
1999
- 1999-01-28 JP JP02042499A patent/JP3282603B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001501640A (en) | 1996-10-05 | 2001-02-06 | スミスクライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | vaccine |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＢＯＭＦＯＲＤ Ｒ．ｅｔ ａｌ，Ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ ａｎｄ ＩＳＣＯＭ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓａｐｏｎｉｎｓ，Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．９，５７２−５７７，１９９２ |
| ＫＩＴＡＧＡＷＡ Ｉｓａｏ ｅｔ ａｌ，Ｓａｐｏｎｉｎ ａｎｄ ｓａｐｏｇｅｎｏｌ．ＸＸＸＶＩＩＩ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓｏｙａｓａｐｏｎｉｎ Ａ２，ａ ｂｉｓｄｅｓｍｏｓｉｄｅ ｏｆ ｓｏｙａｓａｐｏｇｅｎｏｌ Ａ，ｆｒｏｍ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，米国，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．２，５９６−６０８，１９８５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2000219638A (en) | 2000-08-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0606317B1 (en) | Saponin-antigen conjugates and the use thereof | |
| US5679354A (en) | Matrix with immunomodulating activity | |
| Fleck et al. | Adjuvant activity of Quillaja brasiliensis saponins on the immune responses to bovine herpesvirus type 1 in mice | |
| EP1539231B1 (en) | Iscom preparation and use thereof | |
| EP0362279B1 (en) | Saponin adjuvant | |
| JPH10508301A (en) | Saponin preparation and its use in ISCOM | |
| Magedans et al. | Foamy matters: An update on Quillaja saponins and their use as immunoadjuvants | |
| EP3792272A1 (en) | Vaccines with higher carbohydrate antigen density and novel saponin adjuvant | |
| EP0765333B1 (en) | Quillaja saponin adjuvant and vaccine formulation containing same | |
| JP3282603B2 (en) | Adjuvants and vaccines using them | |
| US12497429B2 (en) | Saponin-based vaccine adjuvants | |
| da Silva et al. | Pulcherrimasaponin, from the leaves of Calliandra pulcherrima, as adjuvant for immunization in the murine model of visceral leishmaniasis | |
| US12419950B2 (en) | Saponin-based vaccine adjuvants | |
| US6241995B1 (en) | Polygala senega compositions and methods of use | |
| US4749567A (en) | Method and product for increasing fertility in sheep using milk protein conjugates | |
| da Silva et al. | A new complex triterpenoid saponin from Calliandra pulcherrima with haemolytic activity and adjuvant effect | |
| AU2004228631B2 (en) | Cholesterol-containing compounds and their use as immunogens against Borrelia burgdorferi | |
| JP3282583B2 (en) | Adjuvant composition, vaccine using the same and novel saponin | |
| KR102754266B1 (en) | Water-soluble RGB propolis composition having immune system regulation and activation function with red propolis, green propolis and brown propolis and its manufacturing method | |
| HK40061148A (en) | Saponin-based vaccine adjuvants | |
| Eleutério | Synthesis of Active Analogs of Adjuvant Quillaja Saponins in Order to Dertermine the Structure-activity Correlation: Studies Towards the Synthesis of QS-21 | |
| Tebogo | Separation and characterization of saponins from the bark extract of the South American soap bark tree; Quillaja saponaria Molina:(potential immuno-adjuvant active compounds) | |
| KENSIL et al. | JOURNAL OF IMMUNOLOGY zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLK Copyright zyxwvutsrqponmlkjihgfedcb |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |