JP3327469B2 - 核酸の生物学的不活性化法 - Google Patents
核酸の生物学的不活性化法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は核酸の生物学的不活性化法に関する。生物工
学的製造法で生成し、使用した遺伝子操作した微生物に
より汚染されている物質（残留発酵液、水洗液など）は
容器に集められ天然の細菌、酵母又は腐生性カビによる
自己消化及び／又は計画的汚染により分解される。
学的製造法で生成し、使用した遺伝子操作した微生物に
より汚染されている物質（残留発酵液、水洗液など）は
容器に集められ天然の細菌、酵母又は腐生性カビによる
自己消化及び／又は計画的汚染により分解される。
生物工学的製造法は生物学的物質及び活性化合物（特
にタンパク質、多糖類、抗生物質、アミノ酸、ビタミ
ン、アルコール）を得るため使用が増加している。現在
では異種生物中でタンパク質を生成させることが分子生
物学的技術により可能である。この関係で微生物、植
物、動物及びヒト遺伝子を各々の場合他の宿主細胞で発
現することが可能である。今日タンパク質合成のため圧
倒的に使用されているのはエシェリキア・コリ（Escher
ichia coli）、バチルス・サブチリス（Bacillus subti
lis）及びストレプトミセス・リビダンス（Streptomyce
s lividans）のような細菌及びサッカロミセス・セレビ
シエー（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パスト
リス（Pichia pastoris）及びクルイフェロミセス・ラ
クチス（Kluyveromyces lactis）のような酵母である。
しかしながら動物細胞、例えばモルモット卵細胞〔CHO
細胞〕、マウス細胞例えば〔C127i細胞〕及びヒト細胞
も異種遺伝子発現に使用される。活性化合物の生産は発
酵槽で行うのが好ましく、何故ならこれらにより近代的
制御技術により合成を制御することができるからであ
る。生成物は細胞から得られるか又は培養液中に分泌さ
れる。
にタンパク質、多糖類、抗生物質、アミノ酸、ビタミ
ン、アルコール）を得るため使用が増加している。現在
では異種生物中でタンパク質を生成させることが分子生
物学的技術により可能である。この関係で微生物、植
物、動物及びヒト遺伝子を各々の場合他の宿主細胞で発
現することが可能である。今日タンパク質合成のため圧
倒的に使用されているのはエシェリキア・コリ（Escher
ichia coli）、バチルス・サブチリス（Bacillus subti
lis）及びストレプトミセス・リビダンス（Streptomyce
s lividans）のような細菌及びサッカロミセス・セレビ
シエー（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パスト
リス（Pichia pastoris）及びクルイフェロミセス・ラ
クチス（Kluyveromyces lactis）のような酵母である。
しかしながら動物細胞、例えばモルモット卵細胞〔CHO
細胞〕、マウス細胞例えば〔C127i細胞〕及びヒト細胞
も異種遺伝子発現に使用される。活性化合物の生産は発
酵槽で行うのが好ましく、何故ならこれらにより近代的
制御技術により合成を制御することができるからであ
る。生成物は細胞から得られるか又は培養液中に分泌さ
れる。
大量の細胞物質が発酵終期に生成し、それらは特に主
として天然及び同種核酸（DNAとRNA）のみならず、宿主
細胞のゲノムに組み込まれた組換えプラスミドDNA又は
外来DNAを含むことがすべての製造法に共通している。
これまでこの組み換えDNAの環境への放出の可能な危険
性を評価することは困難を伴ってのみ可能であった。従
って予防的方針に基づいて、法的な要求と規制が多くの
国の関係当局と施設（例えば、ドイツ連邦共和国、ベル
リン連邦保険局、生物学的安全性に関する中央委員会
（ZKBS）（Federal Republic of Germany the Central
Committee for Blological Safety（ZKBS）of the Fede
ral Board of Health in Berlin））から発されてお
り、それは環境への可能性のある危険に対する予防措置
として通常は液体である廃棄物質、従って製造工程の後
に存在する核酸のすべての不活性化を求めている。
として天然及び同種核酸（DNAとRNA）のみならず、宿主
細胞のゲノムに組み込まれた組換えプラスミドDNA又は
外来DNAを含むことがすべての製造法に共通している。
これまでこの組み換えDNAの環境への放出の可能な危険
性を評価することは困難を伴ってのみ可能であった。従
って予防的方針に基づいて、法的な要求と規制が多くの
国の関係当局と施設（例えば、ドイツ連邦共和国、ベル
リン連邦保険局、生物学的安全性に関する中央委員会
（ZKBS）（Federal Republic of Germany the Central
Committee for Blological Safety（ZKBS）of the Fede
ral Board of Health in Berlin））から発されてお
り、それは環境への可能性のある危険に対する予防措置
として通常は液体である廃棄物質、従って製造工程の後
に存在する核酸のすべての不活性化を求めている。
核酸は物理的に例えば加熱により不活性化することが
できる。これは大量のエネルギーを必要とし、従って経
費的に厳しい方法である。一方核酸は化学的に不活性化
することができる。例えば、特許願WO第89/03226号はDN
Aをパーカルボン酸、アルカリ金属過酸化物又はアルカ
リ金属パーオキソモノスルフェートの存在下で加熱処理
することにより化学的に不活性化する方法を提言してい
る。同様な不活性化方法はクエン酸の使用に基づく。後
の方法も他の化学的方法もいずれも使用者の健康に潜在
的な危険を与え、及び／又は残留する最終生成物は環境
に有害であるという欠点を持つ。両方法において、適当
な化学物質の添加により比較的低い温度（例えば80℃）
で核酸の完全な不活性化を達成することが可能である。
できる。これは大量のエネルギーを必要とし、従って経
費的に厳しい方法である。一方核酸は化学的に不活性化
することができる。例えば、特許願WO第89/03226号はDN
Aをパーカルボン酸、アルカリ金属過酸化物又はアルカ
リ金属パーオキソモノスルフェートの存在下で加熱処理
することにより化学的に不活性化する方法を提言してい
る。同様な不活性化方法はクエン酸の使用に基づく。後
の方法も他の化学的方法もいずれも使用者の健康に潜在
的な危険を与え、及び／又は残留する最終生成物は環境
に有害であるという欠点を持つ。両方法において、適当
な化学物質の添加により比較的低い温度（例えば80℃）
で核酸の完全な不活性化を達成することが可能である。
本発明は核酸を室温で生物学的に不活性化する方法を
提供する。これらの方法は有効であり、費用効率的であ
り環境的に受諾可能である。それらは特異的酵素（ヌク
レアーゼ、すなわちDNアーゼ及びRNアーゼ）による核酸
の分解、及びこれらの酵素の特に培養液又は廃水に存在
するか又は添加した微生物による形成に基づく。
提供する。これらの方法は有効であり、費用効率的であ
り環境的に受諾可能である。それらは特異的酵素（ヌク
レアーゼ、すなわちDNアーゼ及びRNアーゼ）による核酸
の分解、及びこれらの酵素の特に培養液又は廃水に存在
するか又は添加した微生物による形成に基づく。
ここに示す方法論的段階はDNアーゼ（組換えDNAを含
む）を動物細胞の溶解により放出することができる発酵
液と廃水を用いて実施した。
む）を動物細胞の溶解により放出することができる発酵
液と廃水を用いて実施した。
特に、核酸で汚染された生成物質（残留発酵液、細
胞、水洗液など）を容器に集め、室温で撹拌しながらあ
る時間計画的にインキュベートする方法が記述されてい
る。容器に入り込んだDNアーゼ（例えば細胞溶解又は微
生物分泌による放出）は組換えプラスミドDNAを含むDNA
を短時間に完全に分解することができる。廃水捕集容器
を不完全にからにすることは微生物群がそれらの構成を
保持することを意味する。それらは容器を再び廃水で満
たした場合、廃水が利用可能なエネルギー源例えばDNA
を含んでいると更に増殖してDNアーゼを分泌することが
できる。
胞、水洗液など）を容器に集め、室温で撹拌しながらあ
る時間計画的にインキュベートする方法が記述されてい
る。容器に入り込んだDNアーゼ（例えば細胞溶解又は微
生物分泌による放出）は組換えプラスミドDNAを含むDNA
を短時間に完全に分解することができる。廃水捕集容器
を不完全にからにすることは微生物群がそれらの構成を
保持することを意味する。それらは容器を再び廃水で満
たした場合、廃水が利用可能なエネルギー源例えばDNA
を含んでいると更に増殖してDNアーゼを分泌することが
できる。
従って、廃水中に存在する組換え並びに宿主特異的核
酸はヌクレアーゼにより完全に分解され、廃水の加熱又
は化学的不活性化を必要としない。又、微生物は廃水捕
集容器から組換えDNAを取り込まず、従ってDNアーゼ活
性の不存在下では廃水中で必然的に安定な組換えDNAは
上述の微生物中で発現も複製もしないことも認めた。
酸はヌクレアーゼにより完全に分解され、廃水の加熱又
は化学的不活性化を必要としない。又、微生物は廃水捕
集容器から組換えDNAを取り込まず、従ってDNアーゼ活
性の不存在下では廃水中で必然的に安定な組換えDNAは
上述の微生物中で発現も複製もしないことも認めた。
核酸を分解する微生物の増殖は室温においても、及び
酵素導入、培養液の撹拌及び他の手段のような通常の発
酵条件を伴わなくても起こる。それでも、微生物の発育
速度を増加し、高い細胞密度を実現するため、廃水を例
えば通常の室温より高い温度で発酵させることが可能で
ある。
酵素導入、培養液の撹拌及び他の手段のような通常の発
酵条件を伴わなくても起こる。それでも、微生物の発育
速度を増加し、高い細胞密度を実現するため、廃水を例
えば通常の室温より高い温度で発酵させることが可能で
ある。
廃水から分離しDNアーゼ分泌菌と同定した微生物を廃
水外で増殖させ、濃縮した形で廃水に添加してインキュ
ベーション段階前にDNアーゼ活性を増加させることもで
きる。
水外で増殖させ、濃縮した形で廃水に添加してインキュ
ベーション段階前にDNアーゼ活性を増加させることもで
きる。
更に、分泌されるDNアーゼをコードする遺伝子をクロ
ーン化し、更に所望の生成物に発現させて、生産工程の
間にもDNアーゼを形成させ分泌させて、次いで培養液次
に廃水中の遊離DNAを分解することも可能である。
ーン化し、更に所望の生成物に発現させて、生産工程の
間にもDNアーゼを形成させ分泌させて、次いで培養液次
に廃水中の遊離DNAを分解することも可能である。
又、単離したDNアーゼを廃水に添加することも可能で
ある。この方法においては、DNアーゼを遊離のタンパク
質分子として、又は別の担体物質もしくは微小担体のい
ずれかに結合させた固定化酵素として適用することがで
き、それら自身を細胞発酵に使用することができる。廃
水に本来存在する微生物フローラの選択は触媒活性、半
減期、基質特異性、至適pHなどの点で種々な性質を持つ
広範囲のスペクトルのDNアーゼが核酸分解のため存在す
ることを可能にする。
ある。この方法においては、DNアーゼを遊離のタンパク
質分子として、又は別の担体物質もしくは微小担体のい
ずれかに結合させた固定化酵素として適用することがで
き、それら自身を細胞発酵に使用することができる。廃
水に本来存在する微生物フローラの選択は触媒活性、半
減期、基質特異性、至適pHなどの点で種々な性質を持つ
広範囲のスペクトルのDNアーゼが核酸分解のため存在す
ることを可能にする。
これらの新しく開発された方法による組換えDNAの酵
素的分解は核酸不活性化の物理的又は化学的方法を上回
る利点を持つ。これらの方法は薬剤を使用する人と環境
に対して受入れられない薬剤を必要としない。これらの
方法はかなり経費効率がよく、労働集約的な点がより少
なく、妨害の影響をより受けにくく、また作業者の保護
の点で例えば加熱特に高圧加熱による核酸の不活性化よ
りかなり信頼性が高い。微生物は組換えDNAを取り込む
ことがなく、従って組換えDNAの複製又は発現のいずれ
も起こることがない。反対に、組換えDNAは完全に代謝
される。すなわち組換えDNAはこの方法によりその微生
物群組成が通常のバイオトープ又は浄化プラントのバイ
オマスと本質的に異ならない天然のバイオマスに変換さ
れる。
素的分解は核酸不活性化の物理的又は化学的方法を上回
る利点を持つ。これらの方法は薬剤を使用する人と環境
に対して受入れられない薬剤を必要としない。これらの
方法はかなり経費効率がよく、労働集約的な点がより少
なく、妨害の影響をより受けにくく、また作業者の保護
の点で例えば加熱特に高圧加熱による核酸の不活性化よ
りかなり信頼性が高い。微生物は組換えDNAを取り込む
ことがなく、従って組換えDNAの複製又は発現のいずれ
も起こることがない。反対に、組換えDNAは完全に代謝
される。すなわち組換えDNAはこの方法によりその微生
物群組成が通常のバイオトープ又は浄化プラントのバイ
オマスと本質的に異ならない天然のバイオマスに変換さ
れる。
従って本発明は自己消化及び／又は分泌により放出さ
れるRNアーゼ及び／又はDNアーゼに露出することからな
る核酸を不活性化する方法に関する。好ましい方法では
無菌条件下で発酵中に放出されるヌクレアーゼ及び／又
は非無菌的条件下で発酵後に微生物により放出されるヌ
クレアーゼを使用する。特に好ましい方法では精製した
ヌクレアーゼ又はヌクレアーゼ放出微生物、特にブタペ
スト条約により第DSM 5650号としてジャーマン・ミクロ
オルガニズム・コレクション（German Microorganism C
ollection）に寄託されている腐生性カビAW 13の添加を
伴う。更に本発明はペシロミセス・リラシヌス（Paecil
omyces lilacinus）と同定された上述の腐生性カビAW 1
3自身に関し、前記カビはその種の他の核酸分泌株も含
む。
れるRNアーゼ及び／又はDNアーゼに露出することからな
る核酸を不活性化する方法に関する。好ましい方法では
無菌条件下で発酵中に放出されるヌクレアーゼ及び／又
は非無菌的条件下で発酵後に微生物により放出されるヌ
クレアーゼを使用する。特に好ましい方法では精製した
ヌクレアーゼ又はヌクレアーゼ放出微生物、特にブタペ
スト条約により第DSM 5650号としてジャーマン・ミクロ
オルガニズム・コレクション（German Microorganism C
ollection）に寄託されている腐生性カビAW 13の添加を
伴う。更に本発明はペシロミセス・リラシヌス（Paecil
omyces lilacinus）と同定された上述の腐生性カビAW 1
3自身に関し、前記カビはその種の他の核酸分泌株も含
む。
実施例 次の実施例は組換えヒトエリスロポエチン（EPO）の
通常の製造プラントに関する。「古典的」原理に基づく
製造プラントは発酵槽、廃水捕集槽及び殺菌プラントか
らなる。発酵液中の細胞成分と担体物質は沈降により分
離する。次いで上澄液を抜き出し、過して清澄にす
る。更に過後上澄液をヒトエリスロポエチンを得るた
め精製工程にかけ、一方固体成分、すなわちフィルター
の細胞と担体残渣を焼却により廃棄する。精製工程から
の廃液は廃液捕集槽に移送する。培養液を抜き出した後
細胞と担体沈降物は水道水と共に排出し、廃液捕集槽に
移送する。次いで発酵槽を水道水で満たし、120℃に20
分間加熱する。80℃に冷却後、この水を同様に廃液捕集
槽に移送する。発酵槽を更に洗浄することにより発生す
る追加の廃液は同様に廃液捕集槽に移送する。このよう
にして廃液捕集槽中の廃液はEPO精製工程及び発酵槽の
洗浄による廃液で構成される。発酵槽の洗浄に水道水を
使用しているのですべての廃水混合物は動物細胞にとっ
て非生理的な状態を示す。廃水捕集槽中の液体が特定の
水準まで到達すると廃水を30分間撹拌し、次いで殺菌槽
にポンプ移送する。殺菌槽中で液体を120℃に加熱し、2
0分間この温度に保つ。次いで不活性化した廃水を80℃
に冷却し、次に10倍量の水道水と混合し、下水道に廃棄
する。
通常の製造プラントに関する。「古典的」原理に基づく
製造プラントは発酵槽、廃水捕集槽及び殺菌プラントか
らなる。発酵液中の細胞成分と担体物質は沈降により分
離する。次いで上澄液を抜き出し、過して清澄にす
る。更に過後上澄液をヒトエリスロポエチンを得るた
め精製工程にかけ、一方固体成分、すなわちフィルター
の細胞と担体残渣を焼却により廃棄する。精製工程から
の廃液は廃液捕集槽に移送する。培養液を抜き出した後
細胞と担体沈降物は水道水と共に排出し、廃液捕集槽に
移送する。次いで発酵槽を水道水で満たし、120℃に20
分間加熱する。80℃に冷却後、この水を同様に廃液捕集
槽に移送する。発酵槽を更に洗浄することにより発生す
る追加の廃液は同様に廃液捕集槽に移送する。このよう
にして廃液捕集槽中の廃液はEPO精製工程及び発酵槽の
洗浄による廃液で構成される。発酵槽の洗浄に水道水を
使用しているのですべての廃水混合物は動物細胞にとっ
て非生理的な状態を示す。廃水捕集槽中の液体が特定の
水準まで到達すると廃水を30分間撹拌し、次いで殺菌槽
にポンプ移送する。殺菌槽中で液体を120℃に加熱し、2
0分間この温度に保つ。次いで不活性化した廃水を80℃
に冷却し、次に10倍量の水道水と混合し、下水道に廃棄
する。
実施例 １ 培養した動物細胞の上澄液中におけるDNアーゼによるDN
Aの分解 動物細胞の発酵中連続的な細胞の死があり、その結果
核酸とタンパク質が放出される。組換えDNAを使用する
製造工程において、発酵中及び発酵後の組換えDNAの所
在を監視することが重要である。本発明者等はpCESプラ
スミドDNA（欧州特許願第267 678号参照）を含み、EPO
を生産するマウスセルライン3T1の発酵の培養上澄液中
のDNA含量は極めて低い（＜100pg/m）ことを見出し
た。更に研究した結果、これらの細胞の発酵の培養上澄
液はDNアーゼ活性を含むことが明らかになった。天然の
DNアーゼ活性は極めて高いので、培養上澄液中の10μｇ
・pCES DNA/mが室温で６時間のインキュベーション後
完全に分解されることが可能であった（図参照）。これ
がサザンブロットハイリダイゼーションにより培養上澄
液中にさえ大きさが14.3kbのpCESプラスミド分子も他の
より小さい断片も検出されなかった理由である。
Aの分解 動物細胞の発酵中連続的な細胞の死があり、その結果
核酸とタンパク質が放出される。組換えDNAを使用する
製造工程において、発酵中及び発酵後の組換えDNAの所
在を監視することが重要である。本発明者等はpCESプラ
スミドDNA（欧州特許願第267 678号参照）を含み、EPO
を生産するマウスセルライン3T1の発酵の培養上澄液中
のDNA含量は極めて低い（＜100pg/m）ことを見出し
た。更に研究した結果、これらの細胞の発酵の培養上澄
液はDNアーゼ活性を含むことが明らかになった。天然の
DNアーゼ活性は極めて高いので、培養上澄液中の10μｇ
・pCES DNA/mが室温で６時間のインキュベーション後
完全に分解されることが可能であった（図参照）。これ
がサザンブロットハイリダイゼーションにより培養上澄
液中にさえ大きさが14.3kbのpCESプラスミド分子も他の
より小さい断片も検出されなかった理由である。
実施例 ２ 廃水中のDNアーゼによるDNAの分解 実施例１で述べた発酵プラントから発生するすべての
廃水は、現在法令と当局の要求により廃水補集槽に集
め、次いで不活性化プラントで高圧加熱する。これには
補集槽の約30％又はそれ以上が満たされた後、毎時最小
の時間範囲で高圧殺菌用殺菌プラントにポンプ輸送する
ことが必要である。しかしながら、補集槽は不完全にし
かからにならず、廃水の約10〜20％が残留する。次いで
この廃水は導入される新しい廃水と混合される。発酵の
培養上澄液における（実施例１参照）と同様なDNA分解
試験を廃水補集槽の試料についても実施した。再び、各
々の場合において少なくとも10μｇのDNA/m/6時間のD
Nアーゼ活性が認められた。
廃水は、現在法令と当局の要求により廃水補集槽に集
め、次いで不活性化プラントで高圧加熱する。これには
補集槽の約30％又はそれ以上が満たされた後、毎時最小
の時間範囲で高圧殺菌用殺菌プラントにポンプ輸送する
ことが必要である。しかしながら、補集槽は不完全にし
かからにならず、廃水の約10〜20％が残留する。次いで
この廃水は導入される新しい廃水と混合される。発酵の
培養上澄液における（実施例１参照）と同様なDNA分解
試験を廃水補集槽の試料についても実施した。再び、各
々の場合において少なくとも10μｇのDNA/m/6時間のD
Nアーゼ活性が認められた。
このように処理した10μｇのプラスミドDNAの受容能
のあるE.coli細菌中の形質転換能に激しい減少が認めら
れ（２×108クローン／μｇ・DNA）、廃水の組成により
完全に除くことができる（表参照）。
のあるE.coli細菌中の形質転換能に激しい減少が認めら
れ（２×108クローン／μｇ・DNA）、廃水の組成により
完全に除くことができる（表参照）。
DNAアーゼ活性は実験的に水道水で処理することによ
り、細胞から放出することができる。これはほぼ発酵装
置を水道水で清浄にする場合の条件に相当する。
り、細胞から放出することができる。これはほぼ発酵装
置を水道水で清浄にする場合の条件に相当する。
廃水中のDNアーゼ活性は10mMのEDTAの存在で阻害する
ことができる。EDTAは液体のDNアーゼの生物学的活性に
必須の二価荷電イオンを捕獲してキレートを形成する。
このことがEDTAが存在しても例えばMg2+及びZn2+の濃度
が十分であることに注意しなければならない理由であ
る。
ことができる。EDTAは液体のDNアーゼの生物学的活性に
必須の二価荷電イオンを捕獲してキレートを形成する。
このことがEDTAが存在しても例えばMg2+及びZn2+の濃度
が十分であることに注意しなければならない理由であ
る。
少量の細胞断片が廃水中に入り込むので、それからDN
Aを単離し分析した。DNAが細胞タンパク質により比較的
保護される断片中においても、断片のみが検出され、完
全なpCESプラスミド分子を検出することはできなかっ
た。
Aを単離し分析した。DNAが細胞タンパク質により比較的
保護される断片中においても、断片のみが検出され、完
全なpCESプラスミド分子を検出することはできなかっ
た。
実施例 ３ 廃水からの微生物の分離 捕集槽（実施例２参照）中の廃水はもはや無菌的では
ないので、廃水中の微生物の蓄積の可能性を研究した。
30℃でLB寒天でインキュベーションした場合微生物数
（コロニー形成単位）は105/mであり、測定可能な微
生物数はYPD寒天で104/m及びYNB寒天で109であること
が認められた。
ないので、廃水中の微生物の蓄積の可能性を研究した。
30℃でLB寒天でインキュベーションした場合微生物数
（コロニー形成単位）は105/mであり、測定可能な微
生物数はYPD寒天で104/m及びYNB寒天で109であること
が認められた。
捕集槽中の微生物数は新たな廃水を導入した後確かに
変動するが、先きに測定した値は廃水中の有機物質が貧
弱な培養条件下（無撹拌、無通気）でかつ洗浄剤添加の
場合においてもかなりの微生物が確実に増殖するために
十分であることを示した。
変動するが、先きに測定した値は廃水中の有機物質が貧
弱な培養条件下（無撹拌、無通気）でかつ洗浄剤添加の
場合においてもかなりの微生物が確実に増殖するために
十分であることを示した。
廃水から分離した微生物が組換えDNAを取り込み、複
製することが可能か否かを研究した。いかなる微生物の
コロニーハイブリダイゼーションによってもpCESプラス
ミド又はその断片が検出されなかった。
製することが可能か否かを研究した。いかなる微生物の
コロニーハイブリダイゼーションによってもpCESプラス
ミド又はその断片が検出されなかった。
組換え核酸は溶解したマウス細胞から放出されるの
で、次にDNアーゼを分泌することができる微生物の廃水
からの分離を試みた。廃水の0.01、0.05及び0.1mをへ
らでLB寒天（混合物１）とYPD寒天（混合物２）に塗り
広げ、30℃にインキュベートした。DNAをほぼ唯一のエ
ネルギー及び炭素源として含む培地中で廃水からDNアー
ゼ活性を持つ微生物を蓄積する試みも行った。次の培地
はこの目的のために作った。
で、次にDNアーゼを分泌することができる微生物の廃水
からの分離を試みた。廃水の0.01、0.05及び0.1mをへ
らでLB寒天（混合物１）とYPD寒天（混合物２）に塗り
広げ、30℃にインキュベートした。DNAをほぼ唯一のエ
ネルギー及び炭素源として含む培地中で廃水からDNアー
ゼ活性を持つ微生物を蓄積する試みも行った。次の培地
はこの目的のために作った。
このDNA培地を1mの廃水と混合し、30℃で４日間イ
ンキュベートした。培地は混濁し、顕微鏡下で種々の微
生物が確認された。この混合物から0.01及び0.05mの
試料を除き、LB寒天にへらで塗り広げた（混合物３）。
すべての混合物で微生物を分離し、それを純粋培養とす
ることができた。
ンキュベートした。培地は混濁し、顕微鏡下で種々の微
生物が確認された。この混合物から0.01及び0.05mの
試料を除き、LB寒天にへらで塗り広げた（混合物３）。
すべての混合物で微生物を分離し、それを純粋培養とす
ることができた。
混合物１（LB寒天）:AW1、AW2、AW3、AW4、AW5、AW8、A
W9 混合物２（YPD寒天）:AW10、AW11、AW12、AW13 混合物３（DNA培地）:AW6、AW7 実施例 ４ 純粋培養にした７つの微生物の確認 異なるコロニーモルフォオロジーと色を持つ13の微生
物を純粋培養にした。それらのすべてはYPD又はLB培地
の寒天平板上で発育した。分離株AW10は黒い気菌糸のカ
ビであり、YPD及びLB液体培養で発育せず、それ以上研
究しなかった。分離株AW1、AW2、AW4、AW6及びAW12は最
初に研究した後、それらが明らかに種々な培地で発育す
る際DNアーゼを分泌しなかったので廃棄した。分離株AW
3は同様に液体培養でDNアーゼを分泌しなかったが、ネ
ガチブ対照として以後の実験に含めた。
W9 混合物２（YPD寒天）:AW10、AW11、AW12、AW13 混合物３（DNA培地）:AW6、AW7 実施例 ４ 純粋培養にした７つの微生物の確認 異なるコロニーモルフォオロジーと色を持つ13の微生
物を純粋培養にした。それらのすべてはYPD又はLB培地
の寒天平板上で発育した。分離株AW10は黒い気菌糸のカ
ビであり、YPD及びLB液体培養で発育せず、それ以上研
究しなかった。分離株AW1、AW2、AW4、AW6及びAW12は最
初に研究した後、それらが明らかに種々な培地で発育す
る際DNアーゼを分泌しなかったので廃棄した。分離株AW
3は同様に液体培養でDNアーゼを分泌しなかったが、ネ
ガチブ対照として以後の実験に含めた。
LB寒天に発育した分離株コロニーの記述： AW3:黄色 AW5:無色 AW6:カビ状の外観、侵蝕された縁辺部、盛り上がったコ
ロニー、ベージュ色 AW7:白色、光沢あり AW8:オレンジ色 AW11:ベージュ色 AW13:白色気菌糸、一週間後グレーになり、全平板上に
発育（この場合YPD培地で分析） YPD培地に30℃で発育した分離株の光学顕微鏡下の記
述： AW3:細菌、球菌様、細胞は凝集してクラスターとなる AW5:細胞、球菌株、細胞は増殖して双球菌又は連鎖状球
菌となる。
ロニー、ベージュ色 AW7:白色、光沢あり AW8:オレンジ色 AW11:ベージュ色 AW13:白色気菌糸、一週間後グレーになり、全平板上に
発育（この場合YPD培地で分析） YPD培地に30℃で発育した分離株の光学顕微鏡下の記
述： AW3:細菌、球菌様、細胞は凝集してクラスターとなる AW5:細胞、球菌株、細胞は増殖して双球菌又は連鎖状球
菌となる。
AW6:酵母状細胞、円形ないしわずかに卵形、場合により
小鎖を形成、分岐形態もとる AW7:細菌、球菌様、生育してクラスターになり、AW3とA
W5より大 AW8:細菌、球形ないし卵形細胞、増殖してクラスター形
成 AW11:大きい酵母状細胞、円形、単一又は二連、分岐せ
ず AW13:寒天平板上で白色気菌糸を形成する腐生性カビ、
分岐した菌糸、YPD上で極めて密に増殖 実施例 ５ 分泌したDNアーゼの検出 300mのエルレンマイヤーフラスコ中で30mのLB培
地又はYPD培地に８つの分離株を植菌し、30℃、120rpm
でインキュベートした。70時間インキュベーション後、
細胞を遠心沈殿し、上澄液のDNA活性を測定した。
小鎖を形成、分岐形態もとる AW7:細菌、球菌様、生育してクラスターになり、AW3とA
W5より大 AW8:細菌、球形ないし卵形細胞、増殖してクラスター形
成 AW11:大きい酵母状細胞、円形、単一又は二連、分岐せ
ず AW13:寒天平板上で白色気菌糸を形成する腐生性カビ、
分岐した菌糸、YPD上で極めて密に増殖 実施例 ５ 分泌したDNアーゼの検出 300mのエルレンマイヤーフラスコ中で30mのLB培
地又はYPD培地に８つの分離株を植菌し、30℃、120rpm
でインキュベートした。70時間インキュベーション後、
細胞を遠心沈殿し、上澄液のDNA活性を測定した。
0.03mの試料を０、６、10及び16時間後採取し、0.0
05mのSTOP混液（100mM EDTA、20％シュクロース、指
示薬としてブロモフェノールブルー）と混合し、−20℃
で凍結し、次いで0.8％アガロースゲルで90Vで３時間分
画した（実験Ａ）。実験Ｂでは分析用試料を０、８及び
24時間後に採取した。
05mのSTOP混液（100mM EDTA、20％シュクロース、指
示薬としてブロモフェノールブルー）と混合し、−20℃
で凍結し、次いで0.8％アガロースゲルで90Vで３時間分
画した（実験Ａ）。実験Ｂでは分析用試料を０、８及び
24時間後に採取した。
細胞外DNアーゼ活性は分離株AW5、AW6、AW7、AW8、AW
11及びAW13の培養上澄液で検出された。ある場合、DNア
ーゼ活性はLB培地又はYPD培地で培養した場合異なっ
た。例えば、分離株AW6はYPD培地で培養した場合LB培地
で培養した場合より多量のDNアーゼを分泌した。これと
は反対に、分離株８はLB培地で培養した場合の方がより
多量のDNアーゼを分泌した。一方、分離株AW3は上述の
実験条件でLB培地又はYPD培地のいずれで発育した場合
もDNアーゼ活性は検出されなかった。最高のDNアーゼ活
性は与えられた条件下で分離株AW13で検出された。LB及
びYPD培地でこの微生物は環状プラスミドDNA及び線状ラ
ムダDNAを短時間に完全に分解することができるDNアー
ゼ（一つ又は複数）を多量に分泌した。
11及びAW13の培養上澄液で検出された。ある場合、DNア
ーゼ活性はLB培地又はYPD培地で培養した場合異なっ
た。例えば、分離株AW6はYPD培地で培養した場合LB培地
で培養した場合より多量のDNアーゼを分泌した。これと
は反対に、分離株８はLB培地で培養した場合の方がより
多量のDNアーゼを分泌した。一方、分離株AW3は上述の
実験条件でLB培地又はYPD培地のいずれで発育した場合
もDNアーゼ活性は検出されなかった。最高のDNアーゼ活
性は与えられた条件下で分離株AW13で検出された。LB及
びYPD培地でこの微生物は環状プラスミドDNA及び線状ラ
ムダDNAを短時間に完全に分解することができるDNアー
ゼ（一つ又は複数）を多量に分泌した。
実施例 ６ 廃水中における分離株AW13のDNアーゼの分泌 分離株AW13はDNアーゼをYPD及びLB培地で発育する場
合のみならず、EPOの生産で生成する廃水中でも生産す
る。
合のみならず、EPOの生産で生成する廃水中でも生産す
る。
300mの廃水を121℃で20分間オートクレーブ殺菌
し、50μの２日培養のAW13培養（YPDで発育）を植菌
した。24時間後と96時間後に1mの培養液を除き、遠心
分離し、上澄液のDNアーゼ活性をプラスミドDNAとラム
ダDNAを基質として試験した。実験計画は実施例５に記
述した通りである。試料採取は０時間、3.5時間及び７
時間後に行った。対照としてDNAをオートクレーブ殺菌
した廃水中でインキュベートした。AW13が発育した廃水
は高いDNアーゼ活性を含んでいた。プラスミド及びラム
ダDNAの両方が分解された。
し、50μの２日培養のAW13培養（YPDで発育）を植菌
した。24時間後と96時間後に1mの培養液を除き、遠心
分離し、上澄液のDNアーゼ活性をプラスミドDNAとラム
ダDNAを基質として試験した。実験計画は実施例５に記
述した通りである。試料採取は０時間、3.5時間及び７
時間後に行った。対照としてDNAをオートクレーブ殺菌
した廃水中でインキュベートした。AW13が発育した廃水
は高いDNアーゼ活性を含んでいた。プラスミド及びラム
ダDNAの両方が分解された。
pCESプラスミドDNAの10μｇの試料を1mの廃水に添
加し、EDTA（2mM）添加又は無添加で室温で１分間又は
６時間インキュベートした。次いで10μを除き、E.co
li DH5株の受容能のある細菌中に形質転換した。種々な
試料（１−４）は異なる組成の廃水を異なる水準に満た
した捕集槽から採取した廃水に相当する。
加し、EDTA（2mM）添加又は無添加で室温で１分間又は
６時間インキュベートした。次いで10μを除き、E.co
li DH5株の受容能のある細菌中に形質転換した。種々な
試料（１−４）は異なる組成の廃水を異なる水準に満た
した捕集槽から採取した廃水に相当する。
pCES DNAの10μｇの試料を種々な時間に捕集槽から採
取した1mの廃水中でインキュベートした。次いで10μ
を除き、アガロースゲル上で分画した。ゲルをニトロ
セルローズへブロットし、pCESプラスミドの800塩基対
（bp）の放射能ラベルした断片をハイブリダイズし、次
いで露出した。Ｘ線フィルムのシグナルを定量的に評価
し、インキュベーション時間に対してプロットした。結
果を図面で示す。
取した1mの廃水中でインキュベートした。次いで10μ
を除き、アガロースゲル上で分画した。ゲルをニトロ
セルローズへブロットし、pCESプラスミドの800塩基対
（bp）の放射能ラベルした断片をハイブリダイズし、次
いで露出した。Ｘ線フィルムのシグナルを定量的に評価
し、インキュベーション時間に対してプロットした。結
果を図面で示す。
添付図面は10μg/mのpCESプラスミドDNAを室温で捕集
槽からの廃水中でインキュベートした場合のpCESプラス
ミドDNAの経時的変化を表すものである。
槽からの廃水中でインキュベートした場合のpCESプラス
ミドDNAの経時的変化を表すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/14 (Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:79） Ｃ１２Ｒ 1:79） (Ｃ１２Ｎ 9/16 (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:79） Ｃ１２Ｒ 1:79） (Ｃ１２Ｎ 9/22 (Ｃ１２Ｎ 9/22 Ｃ１２Ｒ 1:79） Ｃ１２Ｒ 1:79） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/00 - 1/38 C12N 9/16 C12N 9/22 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (8)
- 【請求項１】ペシロミセス・リラシヌス（Paecilomyces
lilacinus）から自己消化及び／又は分泌により放出さ
れるRNアーゼ及び／又はDNアーゼに露出することからな
る核酸特に組換え核酸の不活性化法。 - 【請求項２】無菌条件下で発酵中に放出されるRNアーゼ
及び／又はDNアーゼを使用する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】非無菌条件下で発酵後微生物により放出さ
れるRNアーゼ及び／又はDNアーゼを使用する請求項１記
載の方法。 - 【請求項４】精製したRNアーゼ及び／又はDNアーゼを添
加する請求項１記載の方法。 - 【請求項５】担体物質に固定化した精製したRNアーゼ及
び／又はDNアーゼを添加する請求項１記載の方法。 - 【請求項６】活性ヌクレアーゼは細胞培養に使用する微
小担体に固定化された酵素として含まれる請求項５記載
の方法。 - 【請求項７】予め純粋培養し、外部で増殖したRNアーゼ
及び／又はDNアーゼ放出微生物を添加する請求項１記載
の方法。 - 【請求項８】ペシロミセス・リラシヌスがジャーマン・
ミクロオルガニズム・コレクション（German Micro org
anism Collection）にDSM 5650号で寄託されているペシ
ロミセス・リラシヌスAW 13である請求項１記載の方
法。
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|---|---|---|---|
| DE3939771A DE3939771A1 (de) | 1989-12-01 | 1989-12-01 | Verfahren zur biologischen inaktivierung von nukleinsaeuren |
| DE3939771.8 | 1989-12-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=6394597
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| EP (1) | EP0430270B1 (ja) |
| JP (1) | JP3327469B2 (ja) |
| KR (1) | KR100260472B1 (ja) |
| AT (1) | ATE133705T1 (ja) |
| AU (1) | AU648281B2 (ja) |
| CA (1) | CA2031286C (ja) |
| DE (2) | DE3939771A1 (ja) |
| DK (1) | DK0430270T3 (ja) |
| ES (1) | ES2084637T3 (ja) |
| GR (1) | GR3019086T3 (ja) |
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| MC2115A1 (fr) * | 1987-12-15 | 1991-07-05 | Gene Shears Pty Ltd | Ribozynes |
| CH682541A5 (de) * | 1992-06-23 | 1993-10-15 | Urs Viktor Dr Wirth | Biochemische Inaktivierung von RNA-Viren. |
| US5464744A (en) * | 1992-09-24 | 1995-11-07 | Norval B. Galloway | Methods and compositions for reducing false positive signals in an RNA amplification system |
| CA2137728C (en) * | 1993-12-14 | 1998-07-14 | William E. Keating | Enzymatic removal of non-target nucleic acid from biological samples |
| US5747328A (en) * | 1996-02-28 | 1998-05-05 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Microbial system for formaldehyde sensing and remediation |
| US6242244B1 (en) | 1996-02-28 | 2001-06-05 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Microbial system for formaldehyde sensing and remediation |
| DE19826758C1 (de) * | 1998-06-15 | 1999-10-21 | Soft Gene Gmbh | Darstellung von linearen kovalent geschlossenen DNA-Molekülen als Expressionskonstrukte |
| MX2007013725A (es) | 2005-05-05 | 2008-04-09 | Sensient Flavors Inc | Produccion de beta-glucanos y mananos. |
| EP2146935A2 (en) * | 2007-04-12 | 2010-01-27 | Novozymes Biologicals, Inc. | Wastewater treatment using microbial strains |
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| CN106967769B (zh) * | 2017-03-23 | 2021-04-23 | 河南省农业科学院园艺研究所 | 提高淡紫紫孢菌产白灰制菌素的发酵培养基及培养方法 |
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| CN114854665B (zh) * | 2022-07-11 | 2022-09-23 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种淡紫拟青霉微菌核的生产方法及其应用 |
| CN115872529B (zh) * | 2022-11-30 | 2025-05-06 | 浙江大学 | 一种利用线虫降解水体中游离抗生素抗性基因的方法 |
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| US3887431A (en) * | 1972-11-29 | 1975-06-03 | Anheuser Busch | Yeast protein isolate with reduced nucleic acid content and process of making same |
| GB1530098A (en) * | 1976-08-02 | 1978-10-25 | Anheuser Busch | Process for reducing the ribonucleic acid content of yeast protein |
| US4487831A (en) * | 1982-05-19 | 1984-12-11 | Research Corporation | Process for the conversion of cellulose to glucose |
| US4562150A (en) * | 1983-03-09 | 1985-12-31 | Agency Of Industrial Science And Technolgy | Method for manufacture of cellulase |
| US4628029A (en) * | 1983-08-25 | 1986-12-09 | Parsons & Whittemore, Inc. | Method for the conversion of a cellulosic substrate to glucose using Microbispora bispora, strain Rutgers P&W |
| DE3418374A1 (de) * | 1984-05-17 | 1985-11-21 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Verfahren zur herstellung von cyclopropancarbonsaeuren |
| GB8431653D0 (en) * | 1984-12-14 | 1985-01-30 | Shell Int Research | Filterability of microbial broth |
| IL78703A (en) * | 1985-05-10 | 1993-02-21 | Benzon Alfred | Method of producing extracellular enzymes, the enzymes produced thereby and compositions containing them; a hybrid plasmid and a dna fragment comprising dna encoding the enzymes; a microorganism harbouring the plasmid; and a method for removing nucleic acids from biological materials |
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-
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- 1990-11-30 JP JP33085690A patent/JP3327469B2/ja not_active Expired - Lifetime
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- 1993-04-01 US US08/041,351 patent/US5369029A/en not_active Expired - Lifetime
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- 1996-02-22 GR GR960400502T patent/GR3019086T3/el unknown
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