JP3337178B2

JP3337178B2 - クローバーイエローベインウイルスプロテアーゼ

Info

Publication number: JP3337178B2
Application number: JP30380994A
Authority: JP
Inventors: 亘高橋; 伸記芹澤
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1994-07-13
Filing date: 1994-12-07
Publication date: 2002-10-21
Anticipated expiration: 2017-10-21
Also published as: JPH0880194A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、クローバーイエローベ
インウイルス（以下CYVVと略す）の成熟化を行うプロテ
アーゼであるところの核内封入体a （Nuclear Inclusio
n-a ：以下NIa と略す）に関し、また該プロテアーゼを
コードする遺伝子に関する。本発明で得られた遺伝子と
外来性の有用タンパク質遺伝子を特異的切断配列を介し
て同じ読み枠で接続することにより、該有用タンパク質
を菌体内にて直接生産することが可能となる。

【０００２】さらに、該遺伝子を宿主微生物細胞等で発
現させ NIa を精製し、特異的アミノ酸配列を切断する
プロテアーゼとして用いることも可能である。

【０００３】

【従来の技術】ポチウイルスは、約10,000塩基よりなる
一本鎖RNA をゲノムとして持ち、ナス科等の植物に感染
するウイルスで、ウイルスゲノムの中には、1 本の非常
に長いタンパク質の読み枠が存在する［Dougherty.W.G
and Hiebert,E.(1980). Virology 101:466-474. 、Alli
son,R. et al.(1986). Virology 154:9-20. ］。ウイル
ス機能タンパクは、この読み枠中に存在する2 種類のプ
ロテアーゼにより切断され、各々のタンパク質としての
機能を持つようになる［Dougherty.W.G and Carringto
n,J.C. (1988). Ann.Rev.Phytopath. 26:23-143. ］。
ポチウイルスの一種であるタバコエッチウイルス（toba
cco etch virus:TEV）では、感染細胞核内においてトリ
パン青で染色される封入体（Nuclear inclusion ）が存
在する。さらにこの封入体は二種類のタンパク質よりな
っており、そのうち一方がウイルスの持っているプロテ
アーゼ（nuclear inclusion-a:NIa ）であることが判明
している（J. Virol., 61:2540-2548 (1987)）。

【０００４】TEV やタバコベインモットリングウイルス
（tobacco vein mottling virus:TVMV）で、ウイルスゲ
ノム全ヌクレオチド配列が決定され、アミノ酸配列のホ
モロジー検索の結果、NIa のゲノム上の存在位置が決定
された（Virology, 154:9-20(1986):Nucleic Acid Re
s., 14:5417-5430 (1986) ）。NIa は、ウイルスゲノム
から翻訳されたタンパク質重合体のある特定の配列を認
識し切断する。この特定配列とは、Gln-Gly 、Gln-Ser
、Gln-Ala の何れかであり、該プロテアーゼはこれら
のアミノ酸配列間のペプチド結合を切断する。

【０００５】本発明に用いたCYVVはポチウイルスグルー
プに属するウイルスであるが、ウイルスの分子生物学的
性状は、ゲノム３’末端側に存在する外被タンパクの遺
伝子構造［Uyeda, I. et al. (1991). Intervirol. 32:
234-245.] が知られているのみで、NIa 領域ゲノムの遺
伝子構造は、未だ解明されていない。また、NIa 自体が
単離されたとの報告例もない。

【０００６】一方、遺伝子操作技術において外来タンパ
ク質を生産する際に、該外来タンパク質をコードする遺
伝子が発現されず生産効率が極めて低くなることがあ
る。このような場合に、通常の遺伝子操作技術に従い制
御遺伝子の下流に該タンパク質の構造遺伝子を結合した
だけでは、目的の外来タンパク質を大量に発現させるの
は困難である。

【０００７】また、大腸菌等の宿主において目的の外来
タンパク質と大腸菌由来のタンパク質との融合タンパク
質を発現させ最終的に目的の外来のタンパク質を生産す
る方法においては、発現後この融合タンパク質を一旦精
製し、精製後プロテアーゼを添加し切断反応を起こし、
さらに反応後再び所望の目的タンパク質を精製する必要
があり、全体として煩雑な操作が必要とされる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記プ
ロテアーゼCYVVNIa をコードするＤＮＡを所望のタンパ
ク質をコードするＤＮＡと接続してこれらを含む形質転
換ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することによ
り、または、上記プロテアーゼCYVVNIa をコードするＤ
ＮＡを含む形質転換ベクター及び所望のタンパク質をコ
ードするＤＮＡを含む形質転換ベクターを用いて宿主細
胞を形質転換することにより、所望のタンパク質が宿主
細胞内で直接生産されることを見いだした。また、別途
に生産した NIa が試験管内で当該切断配列を持ったタ
ンパク質を切断することを見いだし、本発明を完成し
た。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、（１）分子中に配列表の配列番号２に示されるアミノ酸
配列のアミノ酸番号4 〜437のアミノ酸配列を含み、基
質ペプチド中の Gln-Ala、Gln-Gly または Gln-Ser間の
ペプチド結合を特異的に加水分解するプロテアーゼ活性
を有するタンパク質、または、該アミノ配列の一つもし
くは二つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入もしくは置換
されているアミノ酸配列を含み、該プロテアーゼ活性を
有するタンパク質、（２）分子中に配列表の配列番号２に示されるアミノ酸
配列のアミノ酸番号4 〜437のアミノ酸配列を含み、基
質ペプチド中の Gln-Ala、Gln-Gly または Gln-Ser間の
ペプチド結合を特異的に加水分解するプロテアーゼ活性
を有するタンパク質、（３）（１）記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、（４）（２）記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、（５）分子中に配列表の配列番号１に示されるヌクレオ
チド配列のヌクレオチド番号10〜1311のヌクレオチド配
列を含む、請求項３または４記載のＤＮＡ、（６）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列
のヌクレオチド番号10〜1311のヌクレオチド配列と70％
以上のヌクレオチド配列相同性を有する配列を含み、基
質ペプチド中の Gln-Ala、Gln-Gly または Gln-Ser 間
のペプチド結合を特異的に加水分解するプロテアーゼ活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（７）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列
のヌクレオチド番号10〜1311のヌクレオチド配列と55％
以上のヌクレオチド配列相同性を有する配列を含み、基
質ペプチド中の Gln-Ala、Gln-Gly または Gln-Ser 間
のペプチド結合を特異的に加水分解するプロテアーゼ活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（８）（５）記載のＤＮＡとハイブリダイズし、基質ペ
プチド中の Gln-Ala、Gln-Gly または Gln-Ser 間のペ
プチド結合を特異的に加水分解するプロテアーゼ活性を
有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（９）（５）記載のＤＮＡと、60〜70℃、6 × SSC 条
件下でハイブリダイズし、基質ペプチド中の Gln-Ala、
Gln-Gly または Gln-Ser 間のペプチド結合を特異的に
加水分解するプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコ
ードする（８）記載のＤＮＡ、（１０）（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、
（８）または（９）記載のＤＮＡを含むことから成る組
換えＤＮＡベクター、（１１）（１０）記載の組換えＤＮＡベクターにより形
質転換された宿主細胞、（１２）形質転換された宿主細胞が大腸菌である（１
１）記載の宿主細胞、（１３）［Ｉ］Ｎ末端側よりＣ末端側の方向へ以下の構成成分が
ペプチド結合しているタンパク質であって：（１）または（２）記載のプロテアーゼ、 Gln-Ala、Gln-Gly または Gln-Serのいずれか一つか
ら選択されるリンカー、ペプチド構成成分Ｘ、［ＩＩ］構成成分の自己触媒作用により、Ala-Ｘ、Gl
y-Ｘまたは Ser- Ｘのいずれか一つより選択されるペ
プチドを生成することを特徴とするタンパク質、（１４）［Ｉ］Ｎ末端側よりＣ末端側の方向へ以下の構成成分が
ペプチド結合しているタンパク質であって：（１）または（２）記載のプロテアーゼ、 Gln-Ala、Gln-Gly または Gln-Serのいずれか一つか
ら選択されるリンカー、 Pro- Ｙ₁ （ただし、Ｙ₁ は任意のペプチド構成成分
を表す。）、［ＩＩ］構成成分の自己触媒作用により、Ala-Pro-Ｙ
₁ 、Gly-Pro-Ｙ₁ またはSer-Pro- Ｙ₁ のいずれかより
選択されるペプチドを生成し、次いで、アミノペプチダ
ーゼＰの触媒作用により Pro- Ｙ₁ を生成することを特
徴とするタンパク質、（１５）［Ｉ］Ｎ末端側よりＣ末端側の方向へ以下の構成成分が
ペプチド結合しているタンパク質であって：（１）または（２）記載のプロテアーゼ、 Gln-Ala、Gln-Gly または Gln-Serのいずれか一つか
ら選択されるリンカー、 Pro- Ｙ₂ （ただし、Ｙ₂ は任意のペプチド構成成分
を表す。）、［ＩＩ］構成成分の自己触媒作用により、Ala-Pro-Ｙ
₂ 、Gly-Pro-Ｙ₂ またはSer-Pro- Ｙ₂ のいずれかより
選択されるペプチドを生成し、次いで、アミノペプチダ
ーゼＰの触媒作用により Pro- Ｙ₂ を生成し、次いでプ
ロリンイミノペプチダーゼの触媒作用によりＹ₂ を生成
することを特徴とするタンパク質、（１６）［Ｉ］Ｎ末端側よりＣ末端側の方向へ以下の構成成分が
ペプチド結合しているタンパク質であって：（１）または（２）記載のプロテアーゼ、 Gln-Ala、Ｚ（ただし、Ｚは任意のペプチド構成成分を表
す。）、［ＩＩ］構成成分の自己触媒作用により、Ala-Ｚを生
成し、次いで、アラニンアミノペプチダーゼの触媒作用
によりＺを生成することを特徴とするタンパク質、（１７）（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、
（８）または（９）記載のＤＮＡの3'末端側に、 Gln-A
la、Gln-Gly または Gln-SerをコードするＤＮＡを介し
て異種タンパク質をコードするＤＮＡを同じタンパク質
の読み枠となるように接続したＤＮＡ、（１８）（１７）記載のＤＮＡを含むことから成る組換
えＤＮＡベクター、（１９）（１８）記載の組換えＤＮＡベクターにより形
質転換された宿主細胞、（２０）形質転換された宿主細胞が大腸菌である（１
９）記載の宿主細胞、（２１）以下の３段階の工程：［Ｉ］Ｎ末端側よりＣ末端側の方向へ以下の構成成分：（１）または（２）記載のプロテアーゼ、 Gln-Ala、Gln-Gly または Gln-Serのいずれか一つか
ら選択されるリンカー、ペプチド構成成分Ｘ、がペプチド結合しているタンパ
ク質をコードするＤＮＡを含むことから成る組換えＤＮ
Ａ発現ベクターにより宿主細胞を形質転換する工程、［ＩＩ］該宿主細胞を培養し、該宿主細胞内において構
成成分の自己触媒作用により、Ala-Ｘ、Gly-Ｘまたは
Ser- Ｘのいずれか一つより選択されるペプチドを生
成せしめる工程、［ＩＩＩ］該宿主細胞又は該宿主細胞の培養液より、Al
a-Ｘ、Gly-Ｘまたは Ser- Ｘのいずれか一つより選択
されるペプチドを単離、精製する工程、より成るAla-
Ｘ、Gly-Ｘまたは Ser- Ｘのいずれか一つより選択さ
れるペプチドの製造法、（２２）以下の３段階の工程：［Ｉ］Ｎ末端側よりＣ末端側の方向へ以下の構成成分：（１）または（２）記載のプロテアーゼ、 Gln-Ala、Gln-Gly または Gln-Serのいずれか一つか
ら選択されるリンカー、 Pro- Ｙ₁ （ただし、Ｙ₁ は任意のペプチド構成成分
を表す。）、がペプチド結合しているタンパク質をコー
ドするＤＮＡを含むことから成る組換えＤＮＡ発現ベク
ターにより宿主細胞を形質転換する工程、［ＩＩ］該宿主細胞を培養し、該宿主細胞内において構
成成分の自己触媒作用により、Ala-Pro-Ｙ₁ 、Gly-Pr
o-Ｙ₁ または Ser-Pro- Ｙ₁ のいずれか一つより選択
されるペプチドを生成せしめ、さらに、宿主細胞由来ま
たは外来のベクターより発現されるアミノペプチダーゼ
Ｐの触媒作用により Pro- Ｙ₁ を生成せしめる工程、［ＩＩＩ］該宿主細胞又は該宿主細胞の培養液より、Pr
o-Ｙ₁ を単離、精製する工程、より成るPro-Ｙ₁ の製造
法、（２３）以下の３段階の工程：［Ｉ］Ｎ末端側よりＣ末端側の方向へ以下の構成成分：（１）または（２）記載のプロテアーゼ、 Gln-Ala、Gln-Gly または Gln-Serのいずれか一つか
ら選択されるリンカー、 Pro- Ｙ₂ （ただし、Ｙ₂ は任意のペプチド構成成分
を表す。）、がペプチド結合しているタンパク質をコー
ドするＤＮＡを含むことから成る組換えＤＮＡ発現ベク
ターにより宿主細胞を形質転換する工程、［ＩＩ］該宿主細胞を培養し、該宿主細胞内において構
成成分の自己触媒作用により、Ala-Pro-Ｙ₂ 、Gly-Pr
o-Ｙ₂ または Ser-Pro- Ｙ₂ のいずれか一つより選択
されるペプチドを生成せしめ、次いで、宿主細胞由来ま
たは外来のベクターより発現されるアミノペプチダーゼ
Ｐの触媒作用により Pro- Ｙ₂ を生成せしめ、さらに、
宿主細胞由来または外来のベクターより発現されるプロ
リンイミノペプチダーゼの触媒作用によりＹ₂ を生成す
る工程、［ＩＩＩ］該宿主細胞又は該宿主細胞の培養液より、Ｙ
₂ を単離、精製する工程、より成るＹ₂ の製造法、（２４）以下の３段階の工程：［Ｉ］Ｎ末端側よりＣ末端側の方向へ以下の構成成分：（１）または（２）記載のプロテアーゼ、 Gln-Ala、Ｚ（ただし、Ｚは任意のペプチド構成成分を表
す。）、がペプチド結合しているタンパク質をコードす
るＤＮＡを含むことから成る組換えＤＮＡ発現ベクター
により宿主細胞を形質転換する工程、［ＩＩ］該宿主細胞を培養し、該宿主細胞内において構
成成分の自己触媒作用により、Ala-Ｚを生成せしめ、
さらに、宿主細胞由来または外来のベクターより発現さ
れるアラニンアミノペプチダーゼの触媒作用によりＺを
生成する工程、［ＩＩＩ］該宿主細胞又は該宿主細胞の培養液より、Ｚ
を単離、精製する工程、より成るＺの製造法、（２５）宿主細胞が大腸菌である（２１）、（２２）、
（２３）、（２４）または（２５）記載の製造法、（２６）試験管内にて、（１）または（２）記載のプロ
テアーゼの触媒作用により、 Gln-Ala、Gln-Gly または
Gln-Serのいずれか一つ及びペプチド構成成分Ｘがペプ
チド結合しているタンパク質より、Ala-Ｘ、Gly-Ｘまた
は Ser- Ｘのいずれか一つより選択されるペプチドを
生成せしめ、反応液よりAla-Ｘ、Gly-Ｘまたは Ser- Ｘ
のいずれか一つより選択されるペプチドを単離、精製
することより成る、Ala-Ｘ、Gly-Ｘまたは Ser- Ｘの
いずれか一つより選択されるペプチドの製造法、（２７）試験管内にて、（１）または（２）記載のプロ
テアーゼの触媒作用により、 Gln-Ala、Gln-Gly または
Gln-Serのいずれか一つ及び Pro- Ｙ₁ （ただし、Ｙ₁
は任意のペプチド構成成分を表す。）がペプチド結合し
ているタンパク質より、Ala-Pro-Ｙ₁ 、Gly-Pro-Ｙ₁ ま
たは Ser-Pro- Ｙ₁ のいずれか一つより選択されるペプ
チドを生成せしめ、さらに、アミノペプチダーゼＰの触
媒作用により Pro- Ｙ₁ を生成せしめ、反応液より、Pr
o-Ｙ₁ を単離、精製することより成る、Pro-Ｙ₁ の製造
法、（２８）試験管内にて、（１）または（２）記載のプロ
テアーゼの触媒作用により、 Gln-Ala、Gln-Gly または
Gln-Serのいずれか一つ及び Pro- Ｙ₂ （ただし、Ｙ₂
は任意のペプチド構成成分を表す。）がペプチド結合し
ているタンパク質より、Ala-Pro-Ｙ₂ 、Gly-Pro-Ｙ₂ ま
たは Ser-Pro- Ｙ₂ のいずれか一つより選択されるペ
プチドを生成せしめ、次いで、アミノペプチダーゼＰの
触媒作用により Pro- Ｙ₂ を生成せしめ、さらに、プロ
リンイミノペプチダーゼの触媒作用によりＹ₂ を生成せ
しめ、反応液より、Ｙ₂ を単離、精製することより成る
Ｙ₂ の製造法、（２９）試験管内にて、（１）または（２）記載のプロ
テアーゼの触媒作用により、Gln-Ala 及びＺ（ただ
し、Ｚは任意のペプチド構成成分を表す。）がペプチド
結合しているタンパク質より、Ala-Ｚを生成せしめ、次
いで、アラニンアミノペプチダーゼの触媒作用によりＺ
を生成せしめ、反応液より、Ｚを単離、精製することよ
り成るＺの製造法、に関するものである。本発明の第１
の目的は、（１）または（２）記載のタンパク、これら
のタンパク等をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むこと
から成るＤＮＡベクター、及び該ベクターにより形質転
換された宿主細胞を提供することにある。

【００１０】本発明の第２の目的は、上記のＤＮＡの下
流に、特異的切断アミノ酸配列、即ち Gln-Ala、Gln-Gl
y または Gln-Serをコードするヌクレオチド配列を介し
て、目的タンパクをコードするヌクレオチド配列を同じ
読み枠で接続したＤＮＡ、及び該ＤＮＡによりコードさ
れるタンパク、該ＤＮＡを含むことから成るＤＮＡベク
ターを提供することにある。該ベクターは、宿主細胞内
で自己増殖可能であること、即ち、自己増殖するに必要
なヌクレオチド配列を含むことを要するものである。

【００１１】さらに、本発明の第３の目的は、上記ＤＮ
Ａを含み宿主細胞内で自立増殖可能な組換えベクターに
より形質転換された宿主細胞を提供することにある。

【００１２】さらに、本発明の第４の目的は、上記ＤＮ
Ａを含み、宿主細胞内で自己増殖可能な組換えベクター
により形質転換された宿主細胞を、該ＤＮＡの発現可能
な条件下で培養して、Ala 、Gly 、またはSer がN 末端
に付加した目的タンパクの生産方法を提供するものであ
る。

【００１３】更に、Pro をN 末端に有する目的タンパ
ク、N 末端が任意のアミノ酸残基である目的タンパクを
直接生産する方法を提供するものである。

【００１４】本発明のＤＮＡは、例えばタンパクのプロ
セシングによりウイルスが増殖することが知られている
ポチウイルスグループウイルスよりＲＮＡゲノムを分離
し、それを基に作成することが好ましく、ウイルス材料
としては更にクローバーイエローベインウイルス［Uyed
a,I.et al.(1975) Ann.Phytopath.Soc.Japan 41:92-20
3］が好適である。

【００１５】本発明の第５の目的は、上記ＤＮＡを含み
宿主細胞内で自己増殖可能な組換えベクターにより形質
転換された宿主細胞を、該ＤＮＡの発現可能な条件下で
培養しNIa を産生させ、次いで、該タンパクを回収する
ことを特徴とする、該タンパクの製造方法を提供するこ
とにある。

【００１６】本発明のＤＮＡは、例えば、感染植物より
精製したCYVV粒子からゲノムＲＮＡを調製した後、既知
の方法により2 本鎖cDNAに変換することによって得られ
る。前記ゲノムＲＮＡの供給源となるウイルスは、本発
明に於いては、ポチウイルスグループ・クローバーイエ
ローベインウイルス（例えば、 American Type Culture
Collection No. PV 123 ; Clover yellow vein viru
s）が好適である。

【００１７】本発明に於いてクローバーイエローベイン
ウイルスとは、ソラマメに壊疽を起こすウイルスを指
す。

【００１８】一般に、ポチウイルスは、病原性を異にす
る多くの種類が知られている。ウイルス外被タンパクの
血清学的関係とアミノ酸配列の相同性から、アミノ酸の
一次構造の相同性が90% 以上のウイルスを同じ系統(Str
ain ）とし、70% 以下のウイルスを異種（Distinct mem
bers）として考えられ［Shukla,D.D. and Ward,C.W.(19
89). Arch.Virol. 106:171-200. ］ている。本発明で用
いているCYVVの外被タンパク［Uyeda,I. et al.(1991).
Intervirol. 32:234-245.］の諸性状から判断すると、
CYVVはポチウイルスグループ内では、独立したウイルス
として位置づけられる。従って、外被タンパクアミノ酸
の一次構造が90% 以上の相同性を持つか、或いは抗CYVV
抗血清（例えば、American Type Culture Collection
No.PV123 : clover yellow vein virus antiserum ）
を用いたELISA 法で陽性を示すウイルスをクローバーイ
エローベインウイルスの同一系統と見なすことができ
る。ウイルス感染植物としては、インゲンマメ（Phaseo
lus vulgaris）、ソラマメ（Vicia faba）、エンドウマ
メ（Pisum sativum ）等も採用し得るが、ソラマメ好ま
しくは、早生ソラマメが好適である。

【００１９】CYVVウイルス粒子の精製法としては、感染
植物体を好適な緩衝液で破砕搾汁し、クロロフォルム等
の有機溶媒処理と分画遠心分離法を繰り返すことにより
精製し、蔗糖密度勾配遠心分離法を併用することにより
純粋なウイルス粒子として分離する方法が好適である。

【００２０】上記のようにして得られたウイルス粒子が
CYVVであることは、このウイルス粒子を電子顕微鏡で確
認するか、或いは、該ウイルス粒子をソラマメに塗沫接
種することにより、病徴の発現として確認できる。

【００２１】上記の如くして得られたウイルス粒子より
ゲノムＲＮＡを抽出する方法として、グアニジンチオシ
アネート・フェノール法、グアニジンチオシアネート・
トリフルオロセシウム法、フェノール・SDS 法等も採用
し得るが、アルカリ蔗糖密度勾配遠心分離法［Doughert
y,W.G. and Hiebert,E. (1980) Viology 101:466-474.
］が好適である。

【００２２】上記の如くして得られたゲノムＲＮＡが、
プロテアーゼをコードしているかどうかは、ゲノムＲＮ
Ａを無細胞翻訳系に於いてタンパクに翻訳させ、全翻訳
産物中に存在する該プロテアーゼ領域による自己分解を
抗ウイルス外被タンパク抗体により分子量の変化を追跡
することにより検出することができる。

【００２３】例えば、アフリカツメガエル（Xenopus la
evis）の卵母細胞にゲノムＲＮＡを注入して翻訳させた
り［Gurdon,J.B.(1972).Nature 233:177-182. ］、或い
はウサギ網状赤血球ライゼート系や小麦胚芽ライゼート
系［Schleif,R.F. and Wensink,P.C.(1981). in "Pract
ical Methods in Molecular Biology" Springer-Verla
g,NY.］を使用し翻訳させ、抗外被タンパク抗体を用い
て翻訳産物の分解を経時的に追跡することができる。

【００２４】前述の如くして得たゲノムＲＮＡを鋳型と
して、逆転写酵素を用いて1 本鎖cDNAを合成した後、こ
の1 本鎖cDNAから二本鎖cDNAを合成することができる。
この方法としてはS1ヌクレアーゼ法［Efstratiadis,A.
et al.(1976). Cell 7:279-288. ］、Okayama-Berg法
［Okayama,H. and Berg,P.(1982). Mol.Cell.Biol. 2:1
61-170. ］等が採用し得るが、本発明ではGubler-Hoffm
an法［Gubler,U. and Hoffman,B.J.(1983). Gene 25:26
3-269.］が好適である。

【００２５】この様にして得られた二本鎖cDNAをクロー
ニングベクターに組み込み、得られた組換えベクターを
大腸菌等の微生物に導入して形質転換させて、テトラサ
イクリン耐性或いはアンピシリン耐性を指標として形質
転換体を選択することができる。宿主細胞の形質転換
は、Hanahan 法［Hanahan,D.(1983).J.Mol.Biol. 166:5
57-580. ］、即ちCaCl₂ やMgCl₂ またはRbClを共存させ
て調製したコンピテント細胞に、該組換えＤＮＡベクタ
ーを加える方法により実施することができる。尚、ベク
ターとしてプラスミドを用いる場合としては、上記の薬
剤耐性遺伝子を有することが必要であり、またプラスミ
ド以外のラムダ系のファージを用いることができる。

【００２６】上記により得られる形質転換株から、目的
のNIa のＤＮＡを有する株を選択する方法としては、例
えば以下に示す各種方法を採用できる。

【００２７】（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを
用いるスクリーニング法目的蛋白のアミノ酸配列の全部
または一部が解明されている（該配列は、複数個連続し
た特異的配列であれば、目的蛋白のどの領域のものでも
よい）場合、該アミノ酸に対応するオリゴヌクレオチド
を合成し（この場合コドン使用頻度を用いて導いたヌク
レオチド配列または考えられるヌクレオチド配列を組合
せた複数個のヌクレオチド配列のどちらでもよく、また
後者の場合、イノシンを含ませてその種類を減らすこと
もできる）、これをプローブ（³²P 、³⁵S あるいはビオ
チン等で標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性
固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズ
させ、得られたポジティブ株を検索して、これを選択す
る。

【００２８】（２）ポリメラーゼ連鎖反応により作製し
たプローブを用いるスクリーニング法目的蛋白のアミノ酸配列の全部または一部が解明されて
いる場合、該アミノ酸の一部に対応するセンスストラン
ドとアンチセンスストランドのオリゴヌクレオチドを合
成し、これらを組合せてポリメラーゼ連鎖反応(Saiki,
R.K.et al.(1988) Science 239,487-491)を行ない、目
的のNIa をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用
いる鋳型ＤＮＡとしては、NIa を発現しているウィルス
ゲノムＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮＡを用
いることができる。このようにして調製したＤＮＡ断片
を³²P 、³⁵S あるいはビオチン等で標識し、これをプロ
ーブとして用いてコロニーハイブリダイゼーションまた
はプラークハイブリダイゼーションを行なうことにより
目的のクローンを選択する。

【００２９】（３）他の動物細胞でNIa を産生させてス
クリーニングする方法形質転換株を培養し、遺伝子を増幅させ、その遺伝子を
動物細胞にトランスフェクトし（この場合、自己複製可
能で転写プロモーター領域を含むプラスミドもしくは動
物細胞の染色体に組み込まれ得るようなプラスミドのい
ずれでもよい）、遺伝子にコードされた蛋白を産生さ
せ、その細胞抽出物のNIa 活性を測定するか、またはNI
a に対する抗体を用いてNIa を検出することにより、元
の形質転換株より目的のNIa をコードするｃＤＮＡを有
する株を選択する。

【００３０】（４）NIa に対する抗体を用いて選択する
方法 CYVV感染植物から、核内封入体（NIa とNIb の混合物）
を精製するか、あるいは、あらかじめ、ｃＤＮＡを発現
ベクターに組込み、形質転換株内で蛋白を産生させ、NI
a に対する抗体および該抗体に対する２次抗体を用い
て、所望のNIa を発現している株を検出し、目的の株を
選択する。

【００３１】（５）セレクティブ・ハイブリダイゼーシ
ョン・トランスレーションの系を用いる方法形質転換株から得られるｃＤＮＡを、ニトロセルロース
フィルター等にブロットし、NIa を発現している細胞か
らのｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ｃＤＮＡに結
合したｍＲＮＡを解離させ、回収する。回収されたｍＲ
ＮＡを蛋白翻訳系、例えばアフリカツメガエルの卵母細
胞への注入や、ウサギ網状赤血球ライゼートや小麦胚芽
等の無細胞系で蛋白に翻訳させ、その蛋白のNIa 活性を
調べるか、またはNIa に対する抗体を用いて検出して、
目的の株を選択する。

【００３２】得られた目的の形質転換株よりCYVVタンパ
クをコードするＤＮＡを採取する方法は、公知の方法
［Maniatis,T. et al.(1982). in "Molecular Cloning
A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laborator
y,NY.］に従い実施できる。例えば細胞よりベクターＤ
ＮＡに相当する画分を分離し、該プラスミドＤＮＡより
該タンパクをコードするＤＮＡ領域を切り出すことによ
り行い得る。

【００３３】このようにして得られるＤＮＡの配列の決
定は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法［Maxa
m,A.M. and Gilbert,W.(1980). in "Methods in Enzymo
logy" 65:499-276. ］やM13 ファージを用いるジデオキ
シヌクレオチド鎖終結法［Messing,J. and Vieira,J.(1
982). Gene 19:269-276.］等により行うことができる。

【００３４】このようにして得られた本発明のタンパク
をコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込むことによ
り、原核生物または真核生物の宿主細胞を形質転換させ
ることができる。更に、これらベクターに適当なプロモ
ーターおよび形質発現に関わる配列を導入することによ
り、各々の宿主細胞に於いて遺伝子を発現させることが
可能である。

【００３５】原核細胞の宿主としては、例えば大腸菌
（Esherichia coli ）、や枯草菌（Bacillus subtilis
）等が挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞
内で形質発現させるには、宿主と適合し得る種由来のレ
プリコン、即ち複製起点およびlac UV5 等のプロモータ
ー配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形
質転換すれば良い。またベクターは、形質転換細胞に表
現形質（表現型）による選択性を付与することができる
配列を持つものが望ましい。

【００３６】例えば大腸菌としては、E.coli K12株由来
のJM109 株等がよく用いられ、ベクターとしては、一般
にpBR322やpUC 系のプラスミドがよく用いられるが、こ
れらに限定されず、公知の各種の菌株およびベクターが
いずれも使用できる。プロモーターとしては、大腸菌に
於いてはラクトースプロモーター（lac ）やトリプトフ
ァン・ラクトースプロモーター（trc ）等が挙げられる
が、これらに限定されない。

【００３７】枯草菌としては、例えば207-25株が好まし
く、ベクターとしてはpTUB228 ［Ohmura,K.et al.(198
4). J.Biochem. 95:87-93. ］等が用いられるが、これ
に限定されない。プロモーターとしては、枯草菌α−ア
ミラーゼ遺伝子の調節配列がよく用いられ、更に必要に
応じてα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコード
するＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外への分泌
も可能となる。

【００３８】真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆
虫、酵母、植物等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞として
は、例えばサルの細胞であるCOS 細胞［Gluzman,Y.(198
1). Cell 23:175-182.］等が用いられる。

【００３９】昆虫細胞としては、ヤガ科の毛虫（Spodop
tera frugiperda ）由来細胞［Smith,G.E.et al.(198
3). Mol.Cell.Biol. 3:2156-2165. ］等が用いられる。
酵母としては、パン酵母（Saccharomycse cerevisiae）
や分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe ）等が用いら
れる。植物細胞としては、タバコ（Nicotiana tabacu
m）やイネ（Oryza sativa）等が用いられる。ここに例
示した細胞が一般に宿主細胞としてよく用いられている
が、これらに限定されない。

【００４０】脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通
常は発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモー
ター、ＲＮＡスプライスィング部位、ポリアデニル化部
位および転写終結配列等を有するものを使用でき、これ
には更に必要により複製起点を有してもよい。該発現ベ
クターの例としては、SV40の初期プロモーターを有する
pSV2dhfr［Subramani,S. et al.(1981). Mol.Cell.Bio.
1:854-864. ］等を例示できるが、これに限定されな
い。

【００４１】また、昆虫細胞の発現系としては、ヤガ科
毛虫培養細胞が例示できる。発現ベクターとしては、例
えば発現しようとする遺伝子の上流にバキュロウイルス
（Baculovirus ）のポリヘドリン（Polyhedrin）プロモ
ーター、ポリアデニル化部位および相同組換えを行うに
必要なAcMNPV（Acutographa californica nuclear poly
hedrosis virus）ゲノムの一部を有するものを使用で
き、pBacPAK8［Matuura,Y. et al.(1987). J.Gen.Viro
l. 68:1233-1250. ］が例示できるが、これに限定され
ない。

【００４２】また真核微生物としては酵母が一般によく
用いられており、パン酵母（S. cerevisiae ）が例示で
きる。酵母の発現ベクターとしては、例えばアルコール
脱水素酵素遺伝子のプロモーター［Bennetzen,J.L. and
Hall,B.D.(1982). J.Biol.Chem. 257:3018-3025. ］
や、カルボキシルペプチダーゼ−Y ［Ichikawa,K. et a
l.(1993). Biosci.Biotech.Biochem. 57:1686-1690. ］
等を利用できる。更に必要によりカルボキシルペプチダ
ーゼ−Y のシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配
列を連結することにより、細胞外への分泌も可能となる
が、これに限定されない。

【００４３】植物の発現ベクターとしては、例えばカリ
フラワーモザイクウイルスの初期プロモーターである35
s プロモーターと根頭癌腫病菌（Agrobacterium tumefa
ciens ）のノパリン合成遺伝子ポリアデニル化配列を有
し、更に根頭癌腫病菌による遺伝子導入配列を有したpB
I121［Jefferson,R.A. et al.(1987). EMBO J. 6:3901-
3907. ］が使用できるがこれに限定されない。植物細胞
には根頭癌腫病菌感染或いはエレクトロポーレーション
法等により導入し得る。

【００４４】宿主細胞として、大腸菌を用いる場合を例
に挙げると、発現ベクターとしては、trc プロモーター
を有し、大腸菌K12 株由来菌株、例えばJM109 株等に於
いて自立増殖が可能であるpKK388-1（クローンテック社
製）を用いることができる。発現ベクターは、ルビジウ
ム法等ごく一般に用いられている大腸菌の形質転換法に
基づき、容易に大腸菌に導入できる。かくして得られた
菌株を、一般によく用いられるLB培地等に接種し、一定
培養後、プロモーターの誘導剤であるイソプロピル−β
−ガラクトピラノシド（IPTG）を添加しtrc プロモータ
ーを活性化する。その後一定時間培養の後、超音波破砕
機などで菌体を破砕しすることにより、発現タンパクを
菌体から抽出できる。尚、本発明に於いて、Pro をN 末
端に有する目的タンパクを生産する場合は、宿主として
大腸菌を用いなければらない。

【００４５】上記により、形質転換体の細胞内に生産さ
れる本発明のタンパクを含む画分は、該タンパクの物理
的性質や化学的性質等を利用した各種公知の分離操作法
により、分離・精製することができる。かかる方法とし
ては、具体的には例えば通常のタンパク沈澱剤による処
理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾
過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィー（HPLC）等の各種クロマトグラフ
ィー、透析法、これらの組み合わせ等を例示できる。

【００４６】上記のようにして精製した該NIa タンパク
のプロテアーゼ活性を測定する方法としては、精製該NI
a タンパクを、該タンパクの切断配列を含む基質タンパ
クに作用させる方法を例示できる。即ち、該NIa タンパ
クの天然の基質であるウイルス外被タンパクと、核内封
入体b （NIb ）の融合タンパクをコードする遺伝子（Do
ugherty, W.G. et al. (1988). EMBO J. 7:1281-1287）
を、ウイルスゲノムcDNAより分離し、発現ベクターに挿
入する。得られた発現ベクターを、好適な宿主細胞に導
入し、融合タンパクを生産する。生産したタンパクを、
通常のタンパク沈澱剤による処理や各種クロマトグラフ
ィーを組み合わせ、融合タンパクを分離精製する。この
様にして分離精製した基質タンパクを該プロテアーゼと
好適な緩衝液中に於いて、好適な温度下で反応させ、反
応産物を回収する。回収した反応産物を電気泳動した
後、抗外被タンパク抗体を用いたウエスタンブロッティ
ングを行なうことにより、バンドの移動度の違いとして
プロテアーゼ活性を確認できる。尚、本法に於いて基質
タンパクとしては、プロテアーゼの切断配列を含む合成
オリゴペプチドを用いてもよい。

【００４７】また、本発明のタンパクの活性は、該タン
パクを精製すること無く確認できる。即ち、上記の様に
trc プロモーター下流に該タンパクをコードする遺伝子
をつなぎ、さらに該タンパクの切断配列、例えば Gln-A
la、 Gln-Ser或いは、Gln-Gly のアミノ酸をコードする
ヌクレオチド配列を挟んで、該遺伝子と同じタンパクの
読み枠でCYVV外被タンパク等をつなぐことにより測定で
きる。即ち、上記と同様に発現させた大腸菌タンパク
を、抗CYVV外被タンパク抗体等を用いたウエスタンブロ
ッティング法により、バンドの移動度の差として検出で
きる。プロテアーゼの活性があった場合は、融合体より
速い移動度を示すバンドとして検出できる。

【００４８】この様にして切断が確認されたバンドをゲ
ルから回収し、常法によりアミノ末端配列の解析をする
ことにより、所望するペプチド結合部位で切断されたか
を解析できる。

【００４９】尚、該プロテアーゼを使用して所望のタン
パクを製造する方法としては、所望とするタンパクをGS
T 等のタンパクとの融合体として一旦生産させた後、試
験管内で該プロテアーゼを作用させ切断し、所望とする
タンパクを製造する方法、所望とするタンパクを、直接
該プロテアーゼとの融合体として宿主細胞内で発現させ
た後、同宿主細胞内で自己切断により所望とするタンパ
クを製造する方法、があげられる。

【００５０】上記方法により、容易に高収率、高純度で
所望のNIa タンパクを製造でき、こようにして得られる
本発明の組換えNIa は、プロテアーゼとして使用し得
る。

【００５１】配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配
列のアミノ酸番号4 〜437 から成るNIa タンパクのアミ
ノ酸配列の中の、一つ若しくは二つ以上の部位に於い
て、一つ若しくは二つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入
若しくは、置換されているタンパクでもNIa と同様のプ
ロテアーゼ活性を有することがある。これらのタンパク
も本発明に包含される。

【００５２】例えば、インターロイキン2 （IL-2）遺伝
子のシステインに相当するヌクレオチド配列をセリンに
相当するヌクレオチド配列に変換して得られたタンパク
がIL-2活性を保持することも既に公知となっている［Wa
ng,A. et al.(1984).Science224:1431-1433. ］。それ
故に、それら天然に存在するか或いは人為的に合成され
たタンパクがNIa 活性を有する限りそれ等のタンパク及
び該タンパクをコードする同効のヌクレオチド配列から
成るＤＮＡもすべて本発明に含まれる。

【００５３】このような同効のヌクレオチド配列から成
るＤＮＡとして、（３）、（６）、（７）、（８）また
は（９）記載のＤＮＡが挙げられる。

【００５４】この様な本発明の各種のＤＮＡは、上記NI
a タンパクの情報に基づいて、例えばフォスファイト・
トリエステル法［Hunkapiller,M. et al.(1984). Natur
e 310:105-111.］等の常法に従い、核酸の化学合成によ
り製造することもできる。［Grantham,R. et al.(198
1).Nucleic Acids Res. 9:r43-r74.］。更に、これらヌ
クレオチド配列コドンの一部改変は、常法に従い、所望
の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドから成るプ
ライマーを利用した部位特異的変異体合成法［(site sp
ecific mutagenesis),Mark,D.F.et al.(1984).Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA.81:5662-5666. ］等に従うことができ
る。

【００５５】尚、所望アミノ酸に対するコドンは、それ
自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば使用す
る宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定でき
る。また、あるＤＮＡが（５）記載のＤＮＡとハイブリ
ダイズするか否かは、例えば、目的とするＤＮＡをラン
ダムプライマー法［Feinberg, A. P. and Vogelstein,
B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13. ］やニックトラ
ンスレーション法［Maniatis,T. et al. (1982). in "M
olecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring
Harbor Laboratory, NY.］等に従い、［α−³²P ］dCTP
等で標識したプローブを用いてハイブリダイゼーション
を行いしらべることができる。ハイブリダイゼーション
に用いるＤＮＡは、公知の方法、例えば、ニトロセルロ
ース膜やナイロン膜等に吸着させ、加熱あるいは紫外線
等により固相化させる。その後、6 × SSCと 5% デンハ
ート溶液、 0.1% SDS を含むプレハイブリダイゼーショ
ン溶液に浸し、55℃で４時間以上保温する。その後先に
作成したプローブを同様のプレハイブリダイゼーション
溶液に最終比活性 1 × 10⁶ cpm/ml となるように加
え、60℃で一晩保温する。その後、室温下で 6 × SSC
で５分間の洗浄を５回繰り返し、その後 57 ℃で 20
分間洗浄し、オートラジオグラフィーを行うことによ
り、ハイブリダイズしたか否かを判定することができ
る。

【００５６】かくして得られたNIa またはその同効物
（以下、「NIa 類」と呼ぶ。）を用いて所望とするタン
パクを製造する方法としては、細胞内直接切断法と細胞
外切断法が挙げられる。

【００５７】［細胞内直接切断法］NIa 類をコードする
ＤＮＡを、切断配列であるGln-GlyGln-Ser或いは Gln-A
laを挟んで、所望のタンパクをコードするＤＮＡと同じ
読み枠で接続する。得られた融合体タンパクをコードす
るＤＮＡを、生産しようとする宿主細胞で好適に発現を
もたらすプロモーターとターミネーターを有するベクタ
ーに挿入する。得られたベクターを、目的とする細胞に
好適な方法で導入し、形質転換体を得る。形質転換体で
発現した融合体タンパクは、NIa 類のプロテアーゼ活性
により自己切断し、目的蛋白質のＮ末端側にGly 、Ser
または Alaがペプチド結合したペプチドを細胞内で発現
し得る。

【００５８】この場合、目的蛋白質としては、いずれの
ものも使用し得るが、好適には IL-11 である。

【００５９】更に本切断法では、宿主細胞由来または外
来のベクターより発現されるアミノペプチダーゼＰの触
媒作用により、上記Ｎ末端のGly、 Serまたは Ala をさ
らに切断することにより、N 末端に Pro 残基を有する
タンパクを発現し得る。

【００６０】すなわち、Pro から始まる目的タンパクを
コードするDNA を、切断配列であるGln-Ala、Gln-Gly
またはGln-Ser を挟んで接続する。得られた融合タンパ
クをコードする DNA を好適に発現させるプロモーター
とーターミネーターを有するベクターに挿入する。この
ようにして作成した発現ベクターを目的とする宿主細胞
に導入して形質転換体を得る。得られた形質転換体を、
使用したプロモーターに好適な誘導剤で誘導する。例え
ば、IPTG プロモーターを使用する場合は、誘導剤とし
て IPTG を使用することが好ましい。

【００６１】誘導された細胞内では、初めに NIa と目
的タンパクの融合体が発現する。この後、この融合体の
N 末端領域に存在する NIa のプロテアーゼ活性によ
り自己切断が起こり、N 末端に切断配列由来の Ala、 Se
r、または Gly 残基が余分に付加されているタンパク
が生産される。

【００６２】更に、細胞内に蓄積されたこれらのタンパ
クの N 末端のアミノ酸残基は、宿主細胞がアミノペプ
チダーゼＰ（3.4.11.9）を保有する場合には該アミノペ
プチダーゼＰにより除去することができ、この反応によ
りN 末端が Pro で始まるタンパクを宿主細胞内で製造
することができる。

【００６３】該宿主細胞がアミノペプチダーゼＰを有さ
ない場合は、アミノペプチダーゼＰをコードする遺伝子
を含む発現ベクターを該宿主細胞に導入し、該アミノペ
プチダーゼＰを発現することにより、同様の方法でN 末
端が Pro で始まるタンパクを宿主細胞内で製造するこ
とができる。なお、アミノペプチダーゼはそれ自体公知
のタンパクであり、この酵素タンパクをコードする遺伝
子は、当業者に周知の方法で得ることができる。

【００６４】また、このように宿主細胞内においてN 末
端が Pro で始まるタンパクを製造する場合、必要に応
じて培養時間を延長することが好ましい。

【００６５】さらに、N 末端が Pro で始まるタンパク
の該Pro 残基は、宿主細胞由来または外来の発現ベクタ
ーにより発現されるプロリンイミノペプチダーゼ（3.4.
11.5）の触媒作用により、除去することができ、この反
応により、N 末端が任意のアミノ酸残基で始まるタンパ
クを宿主細胞内で製造することができる。プロリンイミ
ノペプチダーゼはそれ自体公知のタンパクであり、この
酵素タンパクをコードする遺伝子は、当業者に周知の方
法で得ることができ、該遺伝子をコードする発現ベクタ
ーもの構築方法及び該ベクターの宿主細胞への導入方法
も当業者に周知である。

【００６６】また、前述の方法により、目的蛋白質のＮ
末端側に Alaがペプチド結合したペプチドを細胞内で発
現し得るが、この Ala 残基は、宿主細胞由来または外
来の発現ベクターにより発現されるアラニンアミノペプ
チダーゼ（3.4.11.14 ）の触媒作用により、除去するこ
とができ、この反応により、N 末端が任意のアミノ酸残
基で始まるタンパクを宿主細胞内で発現することができ
る。アラニンアミノペプチダーゼはそれ自体公知のタン
パクであり、この酵素タンパクをコードする遺伝子は、
当業者に周知の方法で得ることができ、該遺伝子をコー
ドする発現ベクターもの構築方法及び該ベクターの宿主
細胞への導入方法も当業者に周知である。

【００６７】かくして細胞内で製造された目的タンパク
は、前述した方法で単離、精製することができる。

【００６８】［細胞外切断法］NIa 類をコードするＤＮ
Ａを、好適な宿種細胞で安定に増殖し、異種蛋白質を発
現し得るベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入
し、形質転換体を得る。得られた形質転換体で発現した
NIa 類をイオン交換カラム、ゲル濾過カラム或いは逆相
カラム等を組み合わせ精製する。或いは、グルタチオン
-S- トランスフェラーゼやマルトース結合タンパクとの
融合体として発現させ、グルタチオンカラムやマルトー
スカラムにて分離精製し、その後エンテロキナーゼやフ
ァクターＸａで切断後、NIa 類として精製し、使用する
こともできる。

【００６９】一方、切断を目的とするタンパクは、その
アミノ酸配列内に Gln - Gly、Gln- Ser 若しくは Gln
- Alaのペプチド結合を有するものであれば、そのタン
パク自体を基質として用いることも可能であり、また
は、精製を容易にするためグルタチオン-S- トランスフ
ェラーゼタンパクやマルトース結合タンパク等と Gln -
Gly、Gln - Ser 若しくは Gln - Ala を挟んだ融合体
を作成し、これを基質として用いることもできる。この
基質タンパクと精製したNIa 類を好適な緩衝液中で反応
させる事により、タンパクを試験管内で切断することが
でき、この結果、Ｎ末端に、Gly、 Ser または Ala を
有する目的タンパクを得ることができる。さらに、前述
のアミノペプチダーゼＰ、プロリンイミノペプチダー
ゼ、アラニンアミノペプチダーゼを使用することによ
り、Ｎ末端に Pro や任意のアミノ酸を残基を有する目
的アミノ酸を得ることができる。これらの得られた目的
タンパクは、前述の方法により単離、精製することがで
きる。

【００７０】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれに限定されない。

【００７１】ウイルス精製材料ウイルスの増殖は、第2 葉が展開したソラマメ（早生そ
らまめ）に、凍結保存した病葉（CYVV-No.30分離株：Uy
eda,I. et al.(1975). Ann.Phytopath.Soc.Japan 41:19
2-203 ）を10倍量の接種用緩衝液（0.1M トリス塩酸緩
衝液、pH7.0 、0.05M EDTA、1% 2- メルカプトエタノー
ル）で磨砕し、得られた汁液をカーボランダム（400 メ
ッシュ）散布葉にガラスへらで塗沫接種した。接種後8
〜10日目に、網目状のモザイク症状が現れた頂葉を刈り
取りウイルス精製材料とした。

【００７２】ウイルス粒子の精製ウイルス感染葉を挽き肉機で破砕し、さらに3 倍量の抽
出緩衝液（0.1M トリス塩酸緩衝液、0.05M EDTA、1% 2
- メルカプトエタノール、pH7.0 ）を加え、乳鉢で磨砕
した。磨砕液をステンレス製の撹拌羽を装着したモータ
ーで1 時間ゆっくりと室温で撹拌し、二重ガーゼで汁液
を絞り出した。尚、以後の操作は、すべて4 ℃下で行っ
た。粗汁液に1 ／2 倍量のクロロフォルムを加え、ワー
ニングブレンダーで激しく撹拌した後、6,000xg の遠心
分離を15分間行った。遠心分離後の水層を集め、これに
最終濃度4%になるようにポリエチレングリコール（PEG
#6,000）を加え、氷上で1 時間撹拌し、さらに氷上で1
時間静置した。この汁液を6,000xg の遠心分離15分間に
供し、沈澱をウイルス画分として回収した。得られた沈
澱を、50mlの0.5M尿素を含む10mMリン酸緩衝液（pH7.4
）に懸濁し、さらに等量の四塩化炭素を加え、5 分間
激しく撹拌した。撹拌後、3,000xg 、10分間の遠心分離
を行い水層を得た。この分画についてHitachi RP-30 ロ
ーターを用いて4 下、30,000rpm 、90分間の超遠心分離
を行い、沈澱をウイルス画分として回収した。この沈澱
を1%トリトンX100（Triton X100 ）を含む10mMリン酸緩
衝液（pH7.4 ）に懸濁し、4 ℃下、8,000xg 、1 分間の
遠心分離を行い上清画分を回収した。得られた上清を、
10mMリン酸緩衝液（pH7.4 ）で作製した10〜40% 蔗糖密
度勾配カラムチューブ（40%:10ml、30%:10ml、20%:10m
l、10%:10ml。4 ℃下一晩静置する）に重層し、Hitachi
PRS25 ローターを用いて、4 ℃下、23,000rpm 、120
間超遠心分離を行った。遠心分離後の蔗糖密度勾配カラ
ムチューブは、OD_260nm 検出装置を装着したフラクショ
ネーター（Model UA-2：ISCO社製）で分画した。OD
_260nm に吸光を持つ蔗糖密度約20〜30% 付近をウイルス
画分とした。回収したウイルス画分を10mMリン酸緩衝液
（pH7.4 ）で2 倍に希釈後、Hitachi RP-65ローターを
用いて、4 ℃下、40,000rpm 、90分間の遠心分離を行っ
た。得られた沈澱を10mMリン酸緩衝液（pH7.4 ）に懸濁
し、精製ウイルス溶液とした。

【００７３】ウイルスRNA の単離 CYVVのゲノムRNA は約10,000塩基より成り、さらに3'末
端側がポリアデニル化されているため、通常のフェノー
ルSDS 法や、グアニジンチオシアネート法では、完全長
のRNA を無駄なく抽出する事が難しい。そこでウイルス
ゲノムRNA は、アルカリ蔗糖密度勾配遠心分離法により
調製した。即ち、ウイルス2mg を含むウイルス溶液500
μl に対し、等量の分解液500 μl ［200mM 炭酸アンモ
ニウム、2%SDS 、2mM EDTA、400 μg ／mlベントナイ
ト、20μg ／mlプロテアーゼＫ（pH9.0 ）］を加え室温
で20分間静置した。その後1xSSC （0.15M NaCl、0.015M
クエン酸3 ナトリウム、pH7.0 ）を緩衝液とした0%か
ら33.4% までの蔗糖密度勾配カラムチューブ（33.4%:1.
4ml 、30.4%:7.6ml 、27%:7.0ml 、23%:6.3ml 、18.7%:
5ml 、12%:3.2ml 、0%:2.7ml。重層後、4 ℃下一晩静置
する）に重層し、Hitachi RPS-27ローターで15℃下、2
4,000rpm 、9 時間超遠心分離した。遠心分離後のチュ
ーブの下端に穴を開け蔗糖密度勾配を分画した。ウイル
スゲノムRNA 画分は、各画分の260nm の吸光値を測定し
する事により特定した。尚、ウイルスゲノムRNA はこれ
により、蔗糖濃度20〜30% 付近に沈降した。かくして約
25μg のゲノムRNA を得た。

【００７４】cDNA合成前述の方法で精製したゲノムRNA を鋳型としてcDNAの合
成を行った。cDNAは、cDNA Synthesis Sistem Plus（ア
マシャム社製）を用いて行った。Sephadex G50（登録商
標、ファルマシア社製）カラムで精製したcDNAに、ター
ミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（BRL
社製）とdCTPにより5'末端側にポリC 鎖を付加した。制
限酵素PstIにより開環され予め二つの末端部分にポリG
鎖が付加されているプラスミドpBR322（BRL 社製）と混
合し、65℃下5 分間保温の後57℃下、2 時間保温した。
その後徐冷し、プラスミド側のポリG 鎖にcDNA側のポリ
C鎖をアニーリングさせた。

【００７５】形質転換プラスミドpBR322とアニーリングしたcDNAは、塩化カル
シウム法により大腸菌HB101 株に導入した。LB液体培地
（10g バクトトリプトン、5gバクトイーストエクストラ
クト、5g塩化ナトリウム、蒸留水で1 リットルとする）
で一晩振蕩培養した大腸菌HB101 株を、50mlの新しい
LB液体培地へ0.5ml 接種し、OD_550nmが0.5 になるまで3
7℃下で振蕩培養した。菌体を4 ℃下、5,000xg 、5 分
間の遠心分離により回収し、沈澱を25mlのトリス−カル
シウム緩衝液（10mMトリス、50mM塩化カルシウム、塩酸
でpH7.4 に調製する）に穏やかに懸濁して、氷上で5 分
間静置した。その後再び4,000xg で4 分間遠心分離し、
沈澱を5ml のトリス−カルシウム緩衝液に懸濁し、氷上
で2 時間静置した。これをコンピテントセルとした。ア
ニーリングしたDNA 100 μl と、コンピテントセル 200
μl とを混ぜ、氷上で30分間静置した。静置後、42℃下
で2 分間保温し、1ml のLB液体培地を添加し37℃下1 時
間振蕩培養した。その後12.5μg ／mlのテトラサイクリ
ン塩酸塩と1.5%寒天を含むLB固形培地上にまいた。37℃
下一晩培養し、cDNAクローンライブラリーを得た。

【００７６】pNS51 の選抜 cDNA組換えプラスミドの解析は、アルカリSDS 法で行っ
た。即ち、cDNA組換えプラスミドを含むテトラサイクリ
ン耐性、アンピシリン感受性バクテリアコロニーを2ml
をLB液体培地に接種し、37℃下で一晩振蕩培養した。1
0,000xgの遠心分離により菌体を回収し、70μl の溶菌
緩衝液（0.17g 蔗糖、250 μl 1Mトリス塩酸緩衝液
（pH8.0 ）、200 μl 0.5MEDTA（pH8.0 ）を再蒸留水
で20mlとする）に懸濁し、16μl のリゾチーム溶液（10
mg／ml）を加え5 秒間懸濁の後、室温で5 分間静置し
た。160 μl のアルカリSDS 溶液（0.2M水酸化ナトリウ
ム、1%SDS ）を加え、チューブを数回インバージョンし
て撹拌し、氷上で5 分間静置した。5M酢酸カリウム120
μl を加え再び氷上で5 分間静置し、10,000xg、5 分間
遠心分離した。遠心分離後の上清を新しいチューブに移
し、250 μl のイソプロパノールを加え、氷上で30分間
静置した。10,000xg、5 分間の遠心分離の後、沈澱を10
0 μl のTE緩衝液［10mM トリス、5mM EDTA（pH8.0
）］に溶解し、等量のフェノール・クロロフォルム・
イソアミルアルコール（25:24:1 ）を加え、激しく撹拌
の後遠心分離した（以下この操作をフェノール抽出とす
る）。得られた水層に3M酢酸ナトリウム（pH5.2 ）とエ
タノール250 μl を加え、ドライアイス上に10分間放置
した後10,000xg、5 分間の遠心分離で核酸画分を回収し
た（以下この操作をエタノール沈澱とする）。この沈澱
を50μl のRNaseA溶液（10μg ／mlTE緩衝液）に溶解
し、37℃下で1 時間保温した。保温後30μl のPEG 溶液
（2.5M塩化ナトリウム、20% ポリエチレングリコール #
8,000 ）を加え、氷上に1 時間静置した。10,000xgの遠
心分離でDNA 画分を回収し、その後2 回のエタノール沈
澱を繰り返し、精製プラスミドDNA とした。

【００７７】精製プラスミドDNA を制限酵素PstIにより
切断し、1%アガロースゲル電気泳動をTBE （100mM トリ
ス、100mM ホウ酸、1mM EDTA）で行った。電気泳動後の
ゲルは、常法［Southern,E.M.(1975). J.Mol.Biol. 89:
503-517.］に従い、サザーンブロットハイブリダイゼー
ションを行った。即ち、泳動後のゲルを変性液（1.5M塩
化ナトリウム、0.5M水酸化ナトリウム）に40分間振蕩
し、次いで中和緩衝液［0.5Mトリス、3M塩化ナトリウム
（pH7.4 ）］に移し、2 時間振蕩した。振蕩後のゲルを
20xSSC（3M塩化ナトリウム、0.3Mクエン酸三ナトリウ
ム、pH7.0 ）を含んだスポンジ上に移し、ハイボンド-N
膜（商標登録：アマシャム社製）に転写した。転写後
のハイボンド-N膜を1xSSC で10分間振蕩し、80℃下で1
時間乾燥しDNA を固定化した。その後プレハイブリダイ
ゼーション液［5ml ホルムアミド、1ml 50x デンハー
ト溶液(1% ポリビニルピロリドン、1%牛血清アルブミ
ン、1%フィコール400)、2.5ml 20xSSC、100 μl イ
ーストtRNA(50mg ／ml) 、100μl 10%SDS 、1.3ml
再蒸留水］に入れ、50℃下で3 時間保温した。

【００７８】プローブは、ウイルスゲノムRNA をMg²⁺で
切断し用いた。即ち、1 μg ウイルスRNA 溶液16μl に
4 μl の5x分解緩衝液（125 μl 1Mグリシン(pH9.0)
、25μl 1M塩化マグネシウム、再蒸留水850 μl ）
を加え37℃下で3 時間保温し、エタノール沈澱により回
収した分解RNA 溶液5 μl （100ng ）を70℃下、5 分間
加熱急冷し変性させた。この変性RNA 溶液に4 μl の5x
標識緩衝液［25μl 1Mトリス塩酸緩衝液(pH7.9) 、5
μl 1M塩化マグネシウム、2.5 μl 1M チオスレイト
ール(DTT) 、9.2 μl 再蒸留水］と1 μl の[ γー³²P]
ATP(0.37MBq)、10μl 再蒸留水を加え、これに20U のT4
ポリヌクレオチドキナーセ［宝酒造（株）製］を加え、
37℃下30分間保温した。未反応の[ γー³²P] ATP は、5
回エタノール沈澱を繰り返すことにより除いた。

【００７９】得られたプローブを最終濃度5x10⁵cpm／ml
になるようにハイブリダイゼーション溶液［5ml ホルム
アミド、2ml 50%デキストラン硫酸 200 μl 50xデン
ハート溶液、2.5ml 20xSSC、50μl イーストtRNA(5
0mg ／ml) 、100 μl 10%SDS 、1.3ml 再蒸留水］に
加え、プレハイブリダイゼーションの終わったハイボン
ド-N膜を本溶液に移した。50℃下一晩保温しハイブリダ
イゼーションを行ったハイボンド-N膜は、60℃下、0.1%
SDS を含む2xSSC で30分振蕩し、洗浄した。この操作を
3 回繰り返し、さらに室温で0.1%SDS を含む0.1xSSC で
1 時間振蕩洗浄し乾燥した。オートラジオグラフィーの
結果、ウイルスゲノムRNA とハイブリッドした塩基数約
6,500 ベースペア（bp）の挿入断片を持つpNS51 を得
た。

【００８０】ヌクレオチド配列の決定 pNS51 にクローニングされているcDNAの制限酵素地図を
作製するため、プラスミドpNS51 を制限酵素BamHI 、Ec
oRI 、Hind 、KpnI、NcoI、PstI、SalI、SphI、SacI、
SmaI、XhoI、XbaIそれぞれ或いは、2 種類の組み合わせ
により切断し、制限酵素地図を作製した。作製した制限
酵素地図を図1 に示した。

【００８１】制限酵素SalIとPstI切断により得られる各
断片をM13mp19 RF DNAに挿入した。即ちpNS51 を制限酵
素PstIとSalIにより二重に切断し、その後5%ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を1xTBE 条件下で行った。電気泳
動後のゲルを1 μg ／ml濃度のエチジウムブロミドで染
色し、紫外線下でバンドを確認した。各DNA バンドを含
むゲルを剃刀で切りとり、セントリコン-30 （アミコン
社製）を装着したエレクトロリリューター（アミコン社
製）で電気的に溶出した。その後、DNA ライゲーション
キット［宝酒造（株）製］を用いて予めSalIのみまたは
PstIとSalIで切断した後アルカリフォスファターゼ処理
したM13mp19 に、各断片を挿入した。

【００８２】T4 DNAリガーゼでpNS51 の各制限酵素断片
を挿入した組換えM13mp19 RF-DNAは、塩化ルビジウム法
により大腸菌JM109 株に導入した。M9最少寒天培地［10
xM9塩溶液（0.145M リン酸水素二ナトリウム、0.172M
リン酸二水素カリウム、0.187M 塩化アンモニウム、0.
137M 塩化ナトリウム、pH7.0 ）10ml、1M 硫酸マグネ
シウム 100μl 、20% グルコース 1ml、1%チアミン塩酸
塩 50 μl 、0.01M 塩化カルシウム 1ml、再蒸留水13ml
を混合し濾過滅菌後、3%バクトアガー50mlを加えシャー
レにまく］に培養したJM109 株の単一コロニーをSOB 液
体培地（バクトトリプトン10g 、バクトイーストエクス
トラクト2.5g、5M 塩化ナトリウム 100μl 、1M 塩化
カリウム 125μl を加え蒸留水で500ml とする。オート
クレーブ後、1M 塩化マグネシウム5ml と1M 硫酸マグ
ネシウム5ml を加える）で一晩振蕩培養した。一晩培養
した大腸菌JM109 株を、50mlの新しいSOB 液体培地へ0.
6ml 接種し、OD_600nm が0.5 になるまで37℃下で振蕩培
養した。菌体を4 ℃下、5,000xg 、10分間の遠心分離に
より回収し、沈澱を25mlのTFB1緩衝液［1M MES(pH6.2)5
ml、塩化ルビジウム 6.045g 、塩化カルシウム・二水塩
0.735g 、塩化マンガン・四水塩 4.94g、酢酸でpH5.8
とし再蒸留水で500ml にし濾過滅菌する］に穏やかに懸
濁して、氷上で20分間静置した。その後再び3,000xg で
5 分間遠心分離し、沈澱を2ml のTFB2緩衝液［1M MOPS
1ml 、塩化カルシウム・2 水塩 1.102g 、塩化ルビジウ
ム 0.12g、グリセロール 15ml 、酢酸でpH6.5 とし再蒸
留水で100ml にした後濾過滅菌する］に懸濁し、氷上で
20分間静置しコンピテントセルとして用いた。ライゲー
ションしたDNA 1 〜10μl と、コンピテントセル100 μ
l とを混ぜ、氷上で1 時間静置した。静置後、42℃下で
1.5 分間保温し、500 μl のSOC 液体培地（SOC 5ml 、
20% グルコース 90 μl ）を添加し37℃下1 時間振蕩培
養した。振蕩培養後の菌懸濁液に0.8%寒天を含む2xYT
（16g バクトトリプトン、5g バクトイーストエクスト
ラクト、5g 塩化ナトリウム、再蒸留水で1lとする）培
地と、100mM IPTG 30 μl 、10% 5-ブロモ-4- クロロ-3
- インドリル- β- ガラクトシド（X-gal ）10μl 、指
示菌（JM109 株を2xYT培地で、37℃下、一晩振蕩培養し
た培養液）100 μl を加え、予め固化しておいた1.2%寒
天を含む2xYT固形培地に流し込み、固化後37℃下一晩培
養した。これにより白色プラークとして組換えファージ
を得た。

【００８３】各白色プラークを1/100 量の指示菌を含む
2xYT液体培地に接種し、37℃下一晩振蕩培養した。10,0
00xg、1 分間の遠心分離の後、上清はファージ溶液とし
て凍結または4 ℃下で保存した。一方、沈澱である菌体
を通常のプラスミド調製法と同様の方法で調製し、ファ
ージの複製中間体であるRF二本鎖DNA （以下RF-DNAとす
る）を回収し、挿入断片の有無を制限酵素切断により確
認した。

【００８４】これによりCYVVゲノム5'側のPstI-SalI 断
片を含んだ51PS5'／M13mp19 ゲノムの中間部であるSalI
／SalI断片を含んだ51SS／M13mp19 を得た。これらクロ
ーンファージより常法に従い、アルカリSDS 法と塩化セ
シウム密度勾配遠心分離法によりRF-DNAを精製した。精
製したDNA 5 μg を、初めに5'突出末端となるBamHIで
切断し、その後更に3'突出末端となるKpnIで切断した。
その後イレース−ａ−ベースシステム（プロメガ社製）
の添付プロトコールに従い、エキソヌクレアーゼを加
え、反応時間1 〜10分まで段階的に区切り、をM13mp19
に挿入されている各cDNA断片を5'側から段階的に削っ
た。尚、この際ベクター側は、3'突出末端となっている
ため、エキソヌクレアーゼの攻撃は受けない。その後、
S1ヌクレアーゼ処理によりDNA 末端を平滑化し、T4 DNA
リガーゼにより閉環した。

【００８５】T4 DNAリガーゼで閉環した組換えM13mp19
RF-DNAは、前述と同様、塩化ルビジウム法により大腸菌
JM109 株に導入した。これにより、各々様々な長さに削
られたcDNA挿入断片を持つ組換えファージが、白色プラ
ークとして得られた。

【００８６】得られた組換えファージサブクローンよ
り、常法に従いRF-DNAを抽出し、挿入断片長の違うクロ
ーンを選抜した。選抜したクローンを、指示菌を含む2x
YT液体培地に接種し、37℃下、一晩振蕩培養した。振蕩
培養液1.5ml を4 ℃下、10,000xg、5 分間の遠心分離を
行った。上清1ml を新しいチューブに移し、250 μl の
20%PEG水溶液（20% PEG #8,000、2.5M 塩化ナトリウ
ム）を加え撹拌の後、氷上で30分間静置した。4 ℃下、
10,000xg、5 分間の遠心分離の後、沈澱を100 μlのTE
に懸濁し、フェノール抽出とエタノール沈澱によりファ
ージゲノム一本鎖DNA （以下ssDNA とする）を回収し
た。

【００８７】核酸のヌクレオチド配列の決定は、各サブ
クローンファージより得られたファージssDNA を鋳型と
し、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法で行った。即ち、
前述のようにして得られたファージssDNA を、7-デアザ
- シークエネース・バージョン2.0 キットフォアdCTP
（USB 社）を用い、[ α-³²P]dCTP （比活性：〜220TBq
／mmol、アマシャム社製）で標識した。反応産物は、1x
TBE 緩衝液下、8M尿素を含む5%ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行った。ゲルを乾燥した後、オートラジオグ
ラフィーを行いヌクレオチド配列を解読した。

【００８８】pNS51 の5'-Pst - Sal 断片とM-Sal - Sa
l 断片のヌクレオチド配列解析により3,839 塩基を決定
した。

【００８９】得られた核酸のヌクレオチド配列よりポリ
ペプチドの読み枠（以下ORF とする）を探索したとこ
ろ、ウイルスゲノムの＋センス側に1 本のORF が検出さ
れた。検出されたORF を基にして、ポリペプチドの配列
を決定した。これと、既知のアミノ酸配列とをジーンバ
ンクを用いてホモロジー検索を行ったところ、TEV-HAT
と相同性が認めれらた。TEV やプラムポックスウイルス
或いは、動物ウイルスであるポリオウイルスなどのプロ
テアーゼを用いて成熟化するウイルスのプロテアーゼ
は、一般にGln - Ala 、Gln - Ser 、または Gln - Gly
間のペプチド結合を切断することが知られている（Wi
llink,J.and van Kammen,A.(1988).Arch.Virol. 98:1-2
6.）。また、CYVV-No.30の外被タンパクの切断部位の解
析（Uyeda,I. et al.(1991).Intervirology 32:234-24
5. ）から、得られた想定ポリペプチド配列中に3 箇所
切断配列が認められた。このうちアミノ酸配列上4 番目
のGlyより始まり437 番目のGln までのポリペプチド
を、CYVVのNIa と決定した。

【００９０】CYVV-NIaとIL-11 の融合体の作製本発明で提供した該DNA が以下の事を満足しているかを
証明するため、該DNAとヒト・インターロイキン１１
（以下、「IL-11 」という。）をコードするDNAをGln -
Ala をコードする遺伝子を介し、同じ読み枠で接続し
た。

【００９１】証明すべき事は、第一に、該DNA はプロテ
アーゼ活性を持つNIa をコードする遺伝子であるか否
か、第二に、該プロテアーゼが所望のアミノ酸配列を切
断するか否か、第三に、NIa のプロテアーゼ活性が、所
望する異種タンパクとの融合体の状態で、ウイルス感染
細胞内と同様に作用するか否か、第四に、切断され生産
された異種タンパクが本来の構造、即ち活性を保持して
いるか否か、である。

【００９２】NIa 自身は、ウイルスの前駆体タンパクよ
り切断されてできるため、NIa シストロンには、開始コ
ドンがない。それ故、NIa 遺伝子の5'末端に開始コドン
であるATG を付加する必要がある。さらに、NIa 遺伝子
の3'末端をIL-11 と同じORFで接続する必要がある。こ
れらの問題を解決するため、NIa 遺伝子の中央部に存在
する制限酵素XhoI切断部位を利用して、ポリメラーゼ連
鎖反応（PCR ）法によりNIa を改変した。

【００９３】NIa の5'側（NIa5' ）断片の5'端に開始コ
ドンに相当するATG とクローニングのための制限酵素Nc
oI切断配列を付加するためにPCR プライマーを作製し
た。作製した配列は、5'GTCCATGGGGAAAAGTAAGAGAACA 3'
（NSATG とする：配列番号３）。5'ACTCTGAGACCGTGCTCG
AG 3' （NSX1とする：配列番号４）である。プラスミド
pNS51 DNA 1 μg に対して、合成したこれらのプライマ
ー各1 μg 、dNTPミックス（25mM dATP 、25mM dCTP 、
25mM dGTP 、25mM dTTP ）0.8 μl 、10xTaq緩衝液（酵
素に予め添付された緩衝液：プロメガ社製）それぞれを
加え、再蒸留水で100 μl とした後にTaq DNA ポリメラ
ーゼ5Uを加え、PCR を行った。PCR プログラムは、92℃
1 分間、37℃1 分間、72℃2 分間を20回繰り返し、さら
に92℃1 分間、37℃1 分間、72℃30分間を1 回行った。
PCR 後の増幅されたDNA 産物は、フェノール抽出とエタ
ノール沈澱の後、5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行い、DNA バンドをゲルと共に切り出した。切りだした
ゲルを、予めセントリコン-30 （アミコン社製）を装着
したセントリリューター（アミコン社製）を用い、電気
溶出を行った。溶出後、セントリコンを4 ℃下7,500xg
で45分間の遠心分離により溶出DNA 断片を濃縮回収し
た。得られたDNA 濃縮液を、フェノール抽出とエタノー
ル沈澱により更に精製した。

【００９４】プラスミドpKK388-1（クローンテック社
製）のSacI切断部位をXhoI切断部位に置換したプラスミ
ド1 μg を、予め制限酵素NcoIとXhoIで切断し、アルカ
リンフォスファターゼ・カウフインテスティン［Alkali
ne Phosphatase Calf intestine : 以下CIAPとする：宝
酒造（株）製］で脱リン酸化した。回収DNA を、予めNc
oIとXhoIで切断し脱リン酸化した100ng のpKK388-1とラ
イゲーションキット［宝酒造（株）製］を用いて連結し
た後、大腸菌JM109 でクローニングした。これによりpK
K388-1のtrc プロモーター下流に順方向に挿入されたプ
ラスミドpKNI5'を得た（図2 ）。

【００９５】分泌シグナル配列を含むIL-11 の前駆体
（Pre-IL11）のcDNAを含むプラスミドpCD20-2 ［Kawash
ima,I. et al.(1991). FEBS L. 283:199-202. ］を制限
酵素BamHI とApaIで切断し、IL-11 前駆体（Pre-IL11）
とSV40プロモーターを持った領域を切り出した。この断
片を一旦、pBLUESCRIPT II SK+のBamHI とApaI部位にク
ローニングし、再び制限酵素XhoIとKpnIで切断した。こ
れによりIL-11 成熟体（Mat-IL11）のN 末端を欠いたタ
ンパクをコードする遺伝子を単離できる。得られたN 末
端を欠くMat-IL11 DNA断片を、予め制限酵素XhoIとKpnI
で切断しCIAP処理したpKNI5'に再びT4ライゲースで組み
込み、pKNI5IL を作製した（図3 ）。 NIa のC 末端側
の特異配列とMat-IL11をAla を挟んで同じ読み枠でつな
ぐため、4種類のPCR プライマーを合成した。即ち、5'A
GGAAAAGAGTTCCTCGAGC 3' （NSX2とする：配列番号
５）、5'AATTGTTCATTCCAAGCACCTGGGCCACCACCTGGC 3'
（NSJ001Pとする：配列番号６）、5'GCCAAGTGGTGGCCCAG
GTGCTTGGAATGAACAATT 3' （NSJ002N とする：配列番号
７）、5'TTGTCAGCACACCTGGGAGCTGTAGAGCTC3'（ILSAC と
する：配列番号８）である。

【００９６】第一回目のPCR は、pNS51 DNA を鋳型と
し、プライマーNSX2とプライマーNSJ002N の組み合わせ
で行う反応である（CNI3区と云う）。これとは別に、pC
D20-2DNA を鋳型とし、プライマーNSJ001P とILSAC の
組み合わせの反応も行った（5'IL区と云う）。PCR のプ
ログラムは、92℃1 分間、37℃1 分間、72℃2 分間を20
回繰り返し、さらに92℃1 分間、37℃1 分間、72℃30分
間を1 回行った。それぞれのPCR 後の産物は、フェノー
ル抽出とエタノール沈澱の後、5%ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行い、増幅されたDNA バンドをゲルと共に
切り出した。切りだしたゲルから、前述の方法により電
気的にDNA を回収した（図4 ）。

【００９７】得られた二つのDNA 断片は、一回目のPCR
で用いたプライマーNSJ001P NSJ002N の部分、即ちCIN3
DNA断片の3'末端側と5'IL DNA断片の5'末端側であり、
ヌクレオチド配列に部分的に相同性がある。従って、両
DNA 断片とプライマーNSX2およびプライマーILSAC を用
いて再びPCR を行うと、相同性部分がハイブリダイズ
し、そこをつなぎ目とした両DNA の融合DNA が得られる
（図5 ）。そこで回収したCIN3 DNA断片と5'IL DNA断片
を混合し、NSX2とILSAC だけをプライマーとして再びPC
R を行った。PCR のプログラムは、92℃1 分間、37℃1
分間、72℃2 分間を10回繰り返し、次いで92℃1 分間、
45℃1 分間、72℃2 分間を20回繰り返した。その後92℃
1 分間、55℃分間、72℃30分間行い、フェノール処理と
エタノール沈澱を行った後、5%ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行いCNI3と5'ILが融合したCNI3IL DNA断片を
得た。上述の方法を図 5 に示した。

【００９８】CNI3IL DNA断片を制限酵素XhoIで切断し、
予め制限酵素XhoIで切断しCIAPにより脱リン酸化処理を
行ったpKNI5' に、T4 DNAライゲースを用いてPCR 断片
を挿入し、大腸菌JM109 株でクローニングした。CNI3IL
断片が正方向に挿入されたクローンを選抜するため、得
られたクローンよりプラスミドを抽出し、プライマーNS
X2とプライマーILSAC を用いてPCR を行った。これによ
り正方向に挿入されたクローンのプラスミドからのみDN
A バンドが検出される。この方法により、NIaとMat-IL1
1が切断配列Gln - Ala を挟んで、同じタンパクの読み
枠でつながっているプラスミドpKSUN9を得た（図6 ）。

【００９９】Ala-IL11 の菌体内での生産 pKSUN9が大腸菌内で機能し、構築した組換え遺伝子が、
発現しているかどうかを、ウエスタンブロティング法に
より確認した。即ち、プラスミドpKSUN9を保持する大腸
菌（以後KSUN9 株とする）を42μg ／mlのアンピシリン
をLB培地5ml で37℃一晩振蕩培養した。次いで新しいLB
培地250ml （同量のアンピシリンを含む）に2.5ml のKS
UN9 振蕩培養液を加え、37℃下でOD_600nm が1.0 になる
まで振蕩培養した。OD_600nm が1.0 に達した培養液に、
IPTGを最終濃度0.1mM となるように添加し、28℃下で12
時間振蕩培養した。但し、Pro から始まる成熟体IL-11
を産生させる場合は、OD_600nm が1.0 に達した培養液
に、IPTGを最終濃度1mM となるように添加し、28℃下で
36時間以上振蕩培養した。

【０１００】生産物のウエスタンブロッティングによる
確認誘導剤（IPTG）を添加してから12時間振蕩培養した培養
液或いは、36時間振蕩培養した培養液2ml から、4 ℃
下、3,000xg 、5 分間の遠心分離により菌体を回収し、
100 μl の20mMホウ酸緩衝液（pH9.0 ）に菌体を懸濁し
た。菌体は、レンジ8 で2 分間、超音波破砕機［ハンデ
ィーソニックUR-20P：トミー精工（株）製］で処理し破
砕した。破砕液を4 ℃下、10,000xg、10分間遠心分離
し、上清を可溶性タンパク画分とした。得られた可溶性
画分5 μl をレムリ法［Laemmli,U.K.(1970). Nature 2
27:680-685. ］に基づくSDS を含む12% ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行った。電気泳動後のゲルは、トラ
ンスファー緩衝液（25mM トリス、192mM グリシン、20
% メタノール）で5 分間振蕩し、トランス−ブロット−
SDセミ−ドライトランスファーセル（バイオラッドラボ
ラトリー社製）を用い、15V 、1 時間処理によりPVDF膜
（トランス−ブロットトランスファーメディウム：バイ
オラッドラボラトリー社製）に転写した。転写したPVDF
膜をPBS-Tw（80mMリン酸水素二ナトリウム、20mM リン
酸二水素ナトリウム、100mM 塩化ナトリウム、0.1%ツイ
ーン20）で10分間洗浄した。5%スキムミルク［雪印
（株）製］を含むPBS-TwにPVDF膜を移し、37℃下で1 時
間のブロッキングを行った。ブロッキング後のPVDF膜
は、PBS-Tw中で10分間の洗浄1 回と5 分間の洗浄2 回の
後、PBS-Twで10,000倍希釈した抗IL-11 ウサギ血清に移
し、37℃下で20分間保温した。PBS-Tw中で10分間の洗浄
1 回と5 分間の洗浄2 回の後、PBS-Twで5,000 倍希釈し
たホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ウサギIg
G ・ヤギ抗体（アマシャム社製）中に移し、37℃下で20
分間保温した。その後、再びPBS-Tw中で10分間の洗浄1
回と5 分間の洗浄を4 回行った。洗浄の終わったPVDF膜
はECL ディテクション・リェージェント（アマシャム社
製）に移した。抗IL-11 抗体に反応したバンドは、PVDF
膜をX 線フィルムと30秒乃至5 分間接触させることによ
り検出した。

【０１０１】ウエスタンブロッティングの結果、12時間
振蕩培養した菌体と36時間振蕩培養した菌体どちらから
も、分子量約50KDa と分子量約23KDa のシグナルバンド
が検出された。このうち低分子側の23KDa のバンドは、
対照として用いたIL-11 成熟体と殆ど同じ移動度を示し
た。この23KDa のシグナルバンドは、NIa とIL-11 の融
合体からNIa のプロテアーゼ活性により、特異的配列で
あるGln - Alaで切断されたILー11 であるものと思われ
た。尚、この際検出された両23KDa タンパクの内、12時
間振蕩培養した菌体から得られたタンパクを、以下23KD
a-ONとし、36時間振蕩培養した菌体から得られたタンパ
クを23KDa-36hrとする。

【０１０２】23KDa-ONと23KDa-36hr タンパクの精製 23KDa-ONと23KDa-36hr タンパクのN 末端のアミノ酸配
列を決定するため、これら23KDa タンパクの精製を行っ
た。23KDa-ONでは、0.1mM のIPTG誘導でを行い28℃下12
時間振蕩培養した250ml 培養液から、同様に、23KDa-36
hrでは、1mM のIPTG誘導でを行い28℃下36時間振蕩培養
した250ml 培養液から、4 ℃下、5,000xg 、15分間の遠
心分離により菌体を回収した。回収した菌体を20mMホウ
酸緩衝液（pH9.0 ）10mlに懸濁し、フレンチプレスと超
音波破砕機により菌体を破砕した。4 ℃下、15,000xg、
30分間の遠心分離により可溶性タンパク画分（上清画
分）を回収した。

【０１０３】上記のようにして得られた菌体可溶性タン
パク画分を、以下の条件によりファルマシア社製のFPLC
を用いた弱イオン交換カラムクロマトグラフィーに供し
た。

【０１０４】カラム：CMトヨパールパック650M［2.2 x
20cm、東ソー（株）製］溶離緩衝液：A=10mM ホウ酸−水酸化ナトリウム(pH9.
0) 、13mM 塩化カリウム B=10mM ホウ酸−水酸化ナトリウム(pH9.0) 、13mM 塩
化カリウム、400mM 塩化ナトリウム流速：2.5ml ／1 分間画分容積：5ml ／1 チューブ濃度勾配：溶離液 A→溶離液 B （直線濃度勾配）、120 分間溶出した各画分は、酵素結合抗体二重サンドウィッチ法
（ELISA ）により、IL-11 が含まれる画分を特定した。

【０１０５】ELISA 法は以下のように行った。即ち、1
μg ／mlの抗IL-11 マウスモノクロナール抗体を含む50
mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6 ）を、96ウエル・イム
ノプレート（マキシソープ：ヌンク社製）の各ウエルに
100 μl ずつ分注し、37℃下で1 時間保温した。その
後、各ウエルをPBS-T （4g 塩化ナトリウム、0.1g リ
ン酸二水素カリウム、1.45g リン酸水素二ナトリウム・
12水塩、0.1g 塩化カリウム、0.1g アジ化ナトリウ
ム、再蒸留水で1 リットルとする、pH7.4 ）で4 回洗浄
し、各画分をPBS-T で100 倍に希釈し、各ウエルに100
μl ずつ分注した。37℃下1 時間保温の後、同様にPBS-
T で洗浄し、PBS-T で1 μg ／mlに希釈した抗IL-11 ウ
サギIgG を各ウエルに100 μl ずつ分注した。再び37℃
下1 時間の保温と、PBS-T による洗浄の後、PBS-T によ
り3,000 希釈したアルカリンフォスファターゼ標識抗ウ
サギIgG ・ヤギ抗体（ギブコビーアールエル社製）10
0 μlずつを各ウエルに分注した。再び37℃下1 時間の
保温と、PBS-T による洗浄を行い、次に基質液（塩酸に
よりpHを9.8 に調製した10% ジエタノールアミン水溶液
に0.01% になるようにパラニトロフェニルフォスフェー
トを溶解）を各ウエルに100 μl ずつ分注した。室温で
30分〜1 時間保温し、吸光度405nm で各ウエルの発色を
測定し、目的の画分を特定した。

【０１０６】特定した目的画分（画分No.19 〜25）を集
め、セントプレップ−10（アミコン社製）で100 倍に濃
縮し、レムリ法に基づきSDS 存在下12% ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行った。その後、ウエスタンブロッ
ティングで行ったと同様に電気的にPVDF膜に転写した。
但し、この際にPVDF膜としてプロブロット膜（アプライ
ドバイオシステム社製）を用いた。転写後の膜は、十分
に再蒸留水で洗浄した。転写したPVDF膜をクマシーブリ
リアントブルーR250で染色し、50% メタノールで脱色
後、ウエスタンブロティングで抗IL-11 抗体と反応する
タンパクに相当するバンド部分を切りとり、プロテイン
シークエンサー（アプライドバイオシステム社製）でN
末端のアミノ酸配列を解析した。その結果抗IL-11 抗体
と反応した23KDa-ON のバンドのN 末端配列は次の通り
であった。

【０１０７】Ala-Pro-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-（配列番号
９）この配列は、成熟体IL-11 タンパクのアミノ酸配列の-1
位から+6位のアミノ酸配列に相当する。このことから12
時間区より得られた抗IL-11 抗体に反応する23KDa タン
パクは、NIa とIL-11 融合体よりNIa の特異的切断配列
であるGln-Ala のペプチド結合がNIa のプロテアーゼ活
性により切断されてできたAla-IL-11 であるものと思わ
れた。

【０１０８】一方、36時間区より同様に得られた抗IL-1
1 抗体に反応する23KDa-36hrのN 末端アミノ酸配列は、
次の通りであった。

【０１０９】Pro-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-（配列番号
１０）この配列は、成熟体IL-11 の+1位より+7位のアミノ酸配
列に相当する。この結果と先に23KDa-ONで得られた結果
を総合すると以下のようになる。

【０１１０】IPTGによる誘導でNIa とIL-11 の融合体が
大腸菌内で発現した。

【０１１１】発現誘導後12時間の培養で、発現したNIa
とIL-11 融合体は、NIa のプロテアーゼ活性により特異
的切断配列であるGln-Ala の間のペプチド結合が切断さ
れた。

【０１１２】NIa によるペプチド結合の切断により、成
熟体IL-11 のN 末端にAla が余分に付加されたAla-IL11
が大腸菌内で発現した。

【０１１３】Ala-IL11の発現が確認されて更に24時間培
養することにより、Ala-IL11のN 末端に存在したAla 残
基が外れたIL-11 に成熟した。

【０１１４】以上の事より、36時間培養後に得られた23
KDa タンパクはN 末端がPro で始まる成熟型IL-11 であ
ると結論づけられた。

【０１１５】この結果より、NIa との融合体であったIL
-11 は、NIa の特異的プロテアーゼ活性により、一旦両
タンパクの接続部位にあるGln-Ala の間で切断されたの
ち、さらに培養を続けることにより、大腸菌内の因子に
よってN 末端のAla が除去されPro から始まるタンパク
に成熟した事が確認された。

【０１１６】発現したAla-IL11或いは成熟体IL-11 の生
物活性は、脂肪細胞化抑制因子（Adipogenesis inhibit
ory factor: AGIFとする）活性を指標として測定した。
尚、IL-11 が脂肪細胞化抑制活性を有する事は、一般に
知られている［Kawashima,I.et al.(1991). FEBS L. 28
3:199-202. ］。

【０１１７】本発明に用いられたAGIF活性の測定方法
は、次の通りである。測定に用いた細胞はマウス胚性繊
維芽細胞株3T3-L1［Green,H. and Kehinde,O. (1974).
Cell 1:113-116. ］であり、ATCCから購入した。細胞の
培養はすべて10%CO₂-90%大気の加湿混合気中、37℃で行
った。細胞の継代を培養は、培地A ［10% 非働化FBS
（ハイクロン社製）および10mMヘペス（HEPES 、pH7.2
）を含有するDMEM（ダルベッコ変法イーグル培地：4.5
g／リットルのグルコースを含む）］を用いて行った。3
T3-L1細胞の脂肪細胞化への分化誘導は、ルビン等の方
法［Rubin,C.S et al.(1978). J.Biol.Chem. 253:7570-
7578. ］を参考にして行った。

【０１１８】3T3-L1細胞の脂肪細胞への形態変化の抑制
作用測定法 3T3-L1細胞を培地A に1.0x10⁴ 細胞／1ml の密度で懸濁
し、これを48ウエル・マルチクラスター・ディッシュ
（コースター社製）に1 ウエル当たり0.5ml ずつ分注
し、培養を行った。培養3 日後には、細胞はコンフルエ
ントに達する。その後、培地を新鮮な培地A に交換し、
更に2 日間培養を行った後、培地を脂肪細胞化誘導培地
である培地B ［10mM HEPES(pH7.2) 、3%非働化FBS 、5
μg ／mlウシ・インスリン（シグマ社製）、8 μg ／ml
d- ビオチン（シグマ社製）、4 μg／ml パントテン
酸（シグマ社製）,1.0μM テキサメタゾン（シグマ社
製）および0.5mM イソブチルメチルキサンチン（アルド
チッチ社製）を含有するDMEM（4.5g／リットルのグルコ
ースを含有）］に交換した。この時、同時にサンプルを
添加した。その後、2 日毎に新鮮な培地B に交換し、サ
ンプルも添加し直した。培地B とサンプルを添加し始め
てから4 〜7 日目に培地を脂肪細胞維持培地である培地
C ［5%非働化FBS 、10mM HEPES(pH7.2) および100ng ／
ml ウシ・インスリンを含有するDMEM（4.5g／リットル
のグルコースを含有）］に交換した。

【０１１９】培地C 中で2 日間培養後、細胞を5%ホルム
アルデヒドで固定し、オイルレッドO とヘマトキシリン
を用いて細胞内に蓄積された脂肪粒と細胞核を各々染色
した。顕微鏡写真を撮影後、写真より赤色に染色された
脂肪粒を蓄積している細胞数と、ヘマトキシリンで染色
された有核細胞の数を数え、下記の計算式から脂肪細胞
化率を算定した。

【０１２０】脂肪細胞化率（％）＝100 ｘ脂肪粒蓄積細
胞数／有核細胞数尚、細胞の固定法、オイルレッドO 染色およびヘマトキ
シリン染色は、実験書［三友善夫、高山昇二郎 ”臨床
検査講座”12巻「病理学」(1982)、医歯薬出版］に従い
行った。

【０１２１】LPL 抑制作用の測定法 Beutler らの方法［Beutler,B.A. et al.(1985). J.Imm
unol. 135:3972-3977.］を参考にして以下のように行っ
た。「3T3-L1細胞の脂肪細胞への形態変化の抑制作用の
測定法」の項に示した方法を用いて脂肪細胞化した3T3-
L1細胞を調製した。ただし、脂肪細胞への分化誘導中に
はサンプルは加えない。次に培地を新鮮な培地C に交換
し、サンプルを添加した。18時間培養後、培地を除き、
細胞をPBS(-)［phosophate buffer saline、日水製薬
（株）製］で2 回洗浄した。次に培地D ［5%非働化FBS
、10mM HEPES(pH7.2) 、100ng ／mlウシ・インスリン
および10U ／mlヘパリンナトリウム（ノボインダクトリ
ー社製）を含有するDMEM（4.5g／リットルのグルコース
を含有）］を各ウエル300 μl ずつ加えて1 時間培養し
た後、この培養上清を100 μl 取り、LPL 活性の測定に
用いた。LPL 抑制作用の測定は、1 サンプルにつきトリ
プリケートで行い、平均値を求めた。

【０１２２】LPL 活性の測定は、Nilsson-EhleとSchotz
の方法［Nilsson-Ehle,P. and Schotz,M.C. (1976). J.
Lipid Res. 17:536-541.］に従った。上記のようにして
調製した100 μl の培養上清を等量の基質溶液：13mM
グリセロール・トリ［9,10(n)-³H］オレイン酸（51.8KB
q ／μmol 、アマシャム社製）、1.3mg ／ml L- α−フ
ォスファチジルコリン・ジステアロイル（シグマ社
製）、20mg／ml ウシ血清アルブミン（シグマ社製）、
135mM トリス塩酸［Tris-HCl（pH8.1 ）、シグマ社
製］、16.5%(v ／v)グリセロール、16.5%(v ／v)非働化
FBS ：と混合し、37℃下、120 分間反応させた。1.05ml
の0.1M炭酸カリウム−ホウ酸緩衝液（pH10.5）と3.25ml
のメタノール：クロロフォルム：ヘプタン＝141:125:10
0(v ／v)を加え反応を停止させ、強く撹拌した後、3,00
0xg で15分間遠心分離した。水−メタノール層の³Hカウ
ントを液体シンチレーションカウンターにて測定する。
LPL 活性の1 単位は、1 μmol の脂肪酸を1 分間に生成
する活性として定義した。尚、基質溶液中の13mMグリセ
ロール・トリ［9,10(n)-³H］オレイン酸は、アマシャム
社製のクリセロール・トリ［9,10(n)-³H］オレイン酸
（37.0GBq ／mol ）をトリオレイン（シグマ社製）で希
釈した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより
精製する事により調製した。

【０１２３】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：1320 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA アンチセンス：No 起源生物名：クローバーイエローベインウイルス配列の特徴 1 - 1320 E CDS 10 - 1311 E mat-peptide 配列 AAG TTC CAA GGG AAA AGT AAG AGA ACA AGA CAA AAG TTG AAG TTC AGA 48 Lys Phe Gln Gly Lys Ser Lys Arg Thr Arg Gln Lys Leu Lys Phe Arg 1 5 10 15 GCG GCA AGA GAC ATG AAG GAT CGT TAT GAA GTG CAT GCC GAT GAG GGG 96 Ala Ala Arg Asp Met Lys Asp Arg Tyr Glu Val His Ala Asp Glu Gly 20 25 30 ACT TTA GTG GAA AAT TTT GGA ACT CGT TAT TCA AAG AAA GGC AAG ACA 144 Thr Leu Val Glu Asn Phe Gly Thr Arg Tyr Ser Lys Lys Gly Lys Thr 35 40 45 AAA GGT ACT GTT GTG GGT TTG GGT GCA AAA ACA AGA CGG TTC ACT AAC 192 Lys Gly Thr Val Val Gly Leu Gly Ala Lys Thr Arg Arg Phe Thr Asn 50 55 60 ATG TAT GGT TTT GAC CCC ACG GAG TAT TCA TTT GCT AGG TAT CTT GAT 240 Met Tyr Gly Phe Asp Pro Thr Glu Tyr Ser Phe Ala Arg Tyr Leu Asp 65 70 75 80 CCA ATC ACG GGT GCA ACA TTG GAT GAA ACC CCA ATT CAC AAT GTA AAT 288 Pro Ile Thr Gly Ala Thr Leu Asp Glu Thr Pro Ile His Asn Val Asn 85 90 95 TTG GTT GCT GAG CAT TTT GGC GAC ATA AGG CTT GAT ATG GTT GAC AAG 336 Leu Val Ala Glu His Phe Gly Asp Ile Arg Leu Asp Met Val Asp Lys 100 105 110 GAG TTA CTT GAC AAA CAG CAC TTA TAC CTC AAG AGA CCA ATA GAA TGT 384 Glu Leu Leu Asp Lys Gln His Leu Tyr Leu Lys Arg Pro Ile Glu Cys 115 120 125 TAC TTT GTA AAG GAT GCT GGT CAG AAG GTG ATG AGG ATT GAT CTA ACA 432 Tyr Phe Val Lys Asp Ala Gly Gln Lys Val Met Arg Ile Asp Leu Thr 130 135 140 CCC CAC AAC CCA TTG TTG GCA AGC GAT GTT AGC ACA ACC ATA ATG GGT 480 Pro His Asn Pro Leu Leu Ala Ser Asp Val Ser Thr Thr Ile Met Gly 145 150 155 160 TAT CCT GAG AGA GAA GGT GAA CTC CGT CAA ACT GGA AAG GCA AGG TTA 528 Tyr Pro Glu Arg Glu Gly Glu Leu Arg Gln Thr Gly Lys Ala Arg Leu 165 170 175 GTC GAC CCA TCA GAG TTG CCC GCG CGG AAT GAG GAT ATT GAT GCA GAG 576 Val Asp Pro Ser Glu Leu Pro Ala Arg Asn Glu Asp Ile Asp Ala Glu 180 185 190 TTT GAG AGT CTA AAT CGC ATA AGT GGT TTG CGC GAC TAT AAT CCC ATT 624 Phe Glu Ser Leu Asn Arg Ile Ser Gly Leu Arg Asp Tyr Asn Pro Ile 195 200 205 TCA CAA AAT GTT TGC TTG CTA ACA AAT GAG TCA GAA GGC CAT AGA GAG 672 Ser Gln Asn Val Cys Leu Leu Thr Asn Glu Ser Glu Gly His Arg Glu 210 215 220 AAG ATG TTT GGA ATT GGA TAT GGT TCA GTG ATC ATT ACA AAT CAA CAT 720 Lys Met Phe Gly Ile Gly Tyr Gly Ser Val Ile Ile Thr Asn Gln His 225 230 235 240 CTG TTC AGA AGG AAT AAT GGG GAG TTA TCA ATT CAA TCC AAG CAT GGC 768 Leu Phe Arg Arg Asn Asn Gly Glu Leu Ser Ile Gln Ser Lys His Gly 245 250 255 TAC TTC AGA TGC CGC AAC ACC ACA AGC TTG AAG ATG CTG CCT TTG GAG 816 Tyr Phe Arg Cys Arg Asn Thr Thr Ser Leu Lys Met Leu Pro Leu Glu 260 265 270 GGA CAT GAC ATT TTG TTG ATT CAG TTA CCA AGG GAC TTT CCA GTG TTT 864 Gly His Asp Ile Leu Leu Ile Gln Leu Pro Arg Asp Phe Pro Val Phe 275 280 285 CCA CAA AAG ATT CGC TTT AGG GAG CCA AGA GTG GAT GAC AAA ATT GTT 912 Pro Gln Lys Ile Arg Phe Arg Glu Pro Arg Val Asp Asp Lys Ile Val 290 295 300 TTG GTC AGC ACA AAT TTC CAG GAA AAG AGT TCC TCG AGC ACG GTC TCA 960 Leu Val Ser Thr Asn Phe Gln Glu Lys Ser Ser Ser Ser Thr Val Ser 305 310 315 320 GAG TCC AGT AAC ATT TCA AGA GTG CAG TCA GCC AAT TTC TAC AAG CAT 1008 Glu Ser Ser Asn Ile Ser Arg Val Gln Ser Ala Asn Phe Tyr Lys His 325 330 335 TGG ATC TCA ACA GTA GCA GGA CAC TGT GGA AAC CCT ATG GTT TCG ACT 1056 Trp Ile Ser Thr Val Ala Gly His Cys Gly Asn Pro Met Val Ser Thr 340 345 350 AAA GAT GGA TTT ATT GTA GGT ATC CAC AGT CTT GCT TCA TTG ACA GGC 1104 Lys Asp Gly Phe Ile Val Gly Ile His Ser Leu Ala Ser Leu Thr Gly 355 360 365 GAC GTT AAC ATC TTC ACA AGC TTT CCG CCG CAG TTT GAG AAC AAA TAT 1152 Asp Val Asn Ile Phe Thr Ser Phe Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Tyr 370 375 380 CTA CAG AAG CTC AGT GAA CAC ACA TGG TGT AGT GGA TGG AAA CTA AAT 1200 Leu Gln Lys Leu Ser Glu His Thr Trp Cys Ser Gly Trp Lys Leu Asn 385 390 395 400 CTT GGA AAG ATT AGT TGG GGT GGA ATC AAC ATT GTG GAG GAT GCA CCT 1248 Leu Gly Lys Ile Ser Trp Gly Gly Ile Asn Ile Val Glu Asp Ala Pro 405 410 415 GAA GAG CCC TTT ATA ACA TCC AAG ATG GCA AGC CTT CTT AGT GAT TTG 1296 Glu Glu Pro Phe Ile Thr Ser Lys Met Ala Ser Leu Leu Ser Asp Leu 420 425 430 AAT TGT TCA TTC CAA GCA AGT GCG 1320 Asn Cys Ser Phe Gln Ala Ser Ala 435 440 配列番号：２配列の長さ：440 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源生物名：クローバーイエローベインウイルス配列の特徴 4 - 437 E mat-peptide 配列 Lys Phe Gln Gly Lys Ser Lys Arg Thr Arg Gln Lys Leu Lys Phe Arg 1 5 10 15 Ala Ala Arg Asp Met Lys Asp Arg Tyr Glu Val His Ala Asp Glu Gly 20 25 30 Thr Leu Val Glu Asn Phe Gly Thr Arg Tyr Ser Lys Lys Gly Lys Thr 35 40 45 Lys Gly Thr Val Val Gly Leu Gly Ala Lys Thr Arg Arg Phe Thr Asn 50 55 60 Met Tyr Gly Phe Asp Pro Thr Glu Tyr Ser Phe Ala Arg Tyr Leu Asp 65 70 75 80 Pro Ile Thr Gly Ala Thr Leu Asp Glu Thr Pro Ile His Asn Val Asn 85 90 95 Leu Val Ala Glu His Phe Gly Asp Ile Arg Leu Asp Met Val Asp Lys 100 105 110 Glu Leu Leu Asp Lys Gln His Leu Tyr Leu Lys Arg Pro Ile Glu Cys 115 120 125 Tyr Phe Val Lys Asp Ala Gly Gln Lys Val Met Arg Ile Asp Leu Thr 130 135 140 Pro His Asn Pro Leu Leu Ala Ser Asp Val Ser Thr Thr Ile Met Gly 145 150 155 160 Tyr Pro Glu Arg Glu Gly Glu Leu Arg Gln Thr Gly Lys Ala Arg Leu 165 170 175 Val Asp Pro Ser Glu Leu Pro Ala Arg Asn Glu Asp Ile Asp Ala Glu 180 185 190 Phe Glu Ser Leu Asn Arg Ile Ser Gly Leu Arg Asp Tyr Asn Pro Ile 195 200 205 Ser Gln Asn Val Cys Leu Leu Thr Asn Glu Ser Glu Gly His Arg Glu 210 215 220 Lys Met Phe Gly Ile Gly Tyr Gly Ser Val Ile Ile Thr Asn Gln His 225 230 235 240 Leu Phe Arg Arg Asn Asn Gly Glu Leu Ser Ile Gln Ser Lys His Gly 245 250 255 Tyr Phe Arg Cys Arg Asn Thr Thr Ser Leu Lys Met Leu Pro Leu Glu 260 265 270 Gly His Asp Ile Leu Leu Ile Gln Leu Pro Arg Asp Phe Pro Val Phe 275 280 285 Pro Gln Lys Ile Arg Phe Arg Glu Pro Arg Val Asp Asp Lys Ile Val 290 295 300 Leu Val Ser Thr Asn Phe Gln Glu Lys Ser Ser Ser Ser Thr Val Ser 305 310 315 320 Glu Ser Ser Asn Ile Ser Arg Val Gln Ser Ala Asn Phe Tyr Lys His 325 330 335 Trp Ile Ser Thr Val Ala Gly His Cys Gly Asn Pro Met Val Ser Thr 340 345 350 Lys Asp Gly Phe Ile Val Gly Ile His Ser Leu Ala Ser Leu Thr Gly 355 360 365 Asp Val Asn Ile Phe Thr Ser Phe Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Tyr 370 375 380 Leu Gln Lys Leu Ser Glu His Thr Trp Cys Ser Gly Trp Lys Leu Asn 385 390 395 400 Leu Gly Lys Ile Ser Trp Gly Gly Ile Asn Ile Val Glu Asp Ala Pro 405 410 415 Glu Glu Pro Phe Ile Thr Ser Lys Met Ala Ser Leu Leu Ser Asp Leu 420 425 430 Asn Cys Ser Phe Gln Ala Ser Ala 435 440 配列番号：３配列の長さ：25 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA 配列 GTCCATGGGG AAAAGTAAGA GAACA 25 配列番号：４配列の長さ：20 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA 配列 ACTCTGAGAC CGTGCTCGAG 20 配列番号：５配列の長さ：20 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA 配列 AGGAAAAGAG TTCCTCGAGC 17 配列番号：６配列の長さ：36 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA 配列 AATTGTTCAT TCCAAGCACC TGGGCCACCA CCTGGC 36 配列番号：７配列の長さ：36 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA 配列 GCCAAGTGGT GGCCCAGGTG CTTGGAATGA ACAATT 36 配列番号：８配列の長さ：30 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA 配列 TTGTCAGCAC ACCTGGGAGC TGTAGAGCTC 25 配列番号：９配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質 Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly 7 1 5 配列番号：１０配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質 Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro 7 1 5

【０１２４】

【発明の効果】本発明のクローバーイエローベインウイ
ルス由来核内封入体ａ遺伝子は、大腸菌内で安定に保持
され発現し得る。さらに発現した核内封入体ａタンパク
は、特異的プロテアーゼとしての活性を保持しており、
その活性は、プロテアーセと外来タンパクとの融合体の
状態でも働き得る。従ってN 末端アミノ酸がAla 、Ser
又は Glyで始まるポリペプチド、並びにN 末端アミノ酸
が Pro で始まるポリペプチド又はN 末端が任意のアミ
ノ酸残基である目的タンパクを容易に大量に発現するこ
とが可能となった。

【０１２５】

【図面の簡単な説明】

【図１】CYVV-cDNA から単離した NIa 領域の cDNA の
制限酵素地図。

【図２】NIa の５’領域を含むプラスミド pKNI5' の構
築図。

【図３】IL-11 遺伝子の一部と NIa の５’領域を含む
プラスミドpKNI5IL の構築図。

【図４】NIa 遺伝子の３’末端と、IL-11 遺伝子５’末
端が融合した CIN3 DNA断片と 5'IL DNA 断片の作製に
用いたプライマー図。

【図５】 PCR 法による CIN3 DNA 断片と IL5' DNA 断
片の融合図。

【図６】プラスミド pKSUN9 の作製図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/09 C07K 14/08 C12P 21/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】分子中に配列表の配列番号2に示されるア
ミノ酸配列のアミノ酸番号4〜437のアミノ酸配列を含
み、基質ペプチド中のGln-Ala、Gln-GlyまたはGln-Ser
間のペプチド結合を特異的に加水分解するプロテアーゼ
活性を有するタンパク質、または、該アミノ酸配列の一
つもしくは二つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入もしく
は置換されているアミノ酸配列を含み、該プロテアーゼ
活性を有するタンパク質。
【請求項２】分子中に配列表の配列番号２に示されるア
ミノ酸配列のアミノ酸番号4〜437のアミノ酸配列を含
み、基質ペプチド中のGln-Ala、Gln-GlyまたはGln-Ser
間のペプチド結合を特異的に加水分解するプロテアーゼ
活性を有するタンパク質。
【請求項３】請求項１記載のタンパク質をコードするＤ
ＮＡ。
【請求項４】請求項２記載のタンパク質をコードするＤ
ＮＡ。
【請求項５】分子中に配列表の配列番号1に示されるヌ
クレオチド配列のヌクレオチド番号10〜1311のヌクレオ
チド配列を含む、請求項３または４記載のＤＮＡ。
【請求項６】請求項３乃至５のいずれか１つに記載のＤ
ＮＡを含むことから成る組換えＤＮＡベクター。
【請求項７】請求項６記載の組換えＤＮＡベクターによ
り形質転換された宿主細胞。
【請求項８】形質転換された宿主細胞が大腸菌である請
求項７記載の宿主細胞。
【請求項９】［Ｉ］Ｎ末端側よりＣ末端側の方向へ以下
の構成成分がペプチド結合しているタンパク質であっ
て：請求項１または２記載のプロテアーゼ、 Gln-Ala、Gln-GlyまたはGln-Serのいずれか一つから
選択されるリンカー、ペプチド構成成分Ｘ、 [ＩＩ]構成成分の自己触媒作用により、Ala-Ｘ、Gly-
ＸまたはSer-Ｘのいずれか一つより選択されるペプチド
を生成することを特徴とするタンパク質。
【請求項１０】［Ｉ］Ｎ末端側よりＣ末端側の方向へ以
下の構成成分がペプチド結合しているタンパク質であっ
て：請求項１または２記載のプロテアーゼ、 Gln-Ala、Gln-GlyまたはGln-Serのいずれか一つから
選択されるリンカー、 Pro-Ｙ₁（ただし、Ｙ₁は任意のペプチド構成成分を表
す。）、［ＩＩ］構成成分の自己触媒作用により、Ala-Pro-Ｙ
₁、Gly-Pro-Ｙ₁またはSer-Pro-Ｙ₁のいずれか一つより
選択されるペプチドを生成し、次いで、アミノペプチダ
ーゼＰの触媒作用によりPro-Ｙ₁を生成することを特徴
とするタンパク質。
【請求項１１】［Ｉ］Ｎ末端側よりＣ末端側の方向へ以
下の構成成分がペプチド結合しているタンパク質であっ
て：請求項１または２記載のプロテアーゼ、 Gln-Ala、Gln-GlyまたはGln-Serのいずれか一つから
選択されるリンカー、 Pro-Ｙ₂（ただし、Ｙ₂は任意のペプチド構成成分を表
す。）、［ＩＩ］構成成分の自己触媒作用により、Ala-Pro-Ｙ
₂、Gly-Pro-Ｙ₂またはSer-Pro-Ｙ₂のいずれか一つより
選択されるペプチドを生成し、次いで、アミノペプチダ
ーゼＰの触媒作用によりPro-Ｙ₂を生成し、次いでプロ
リンイミノペプチダーゼの触媒作用によりＹ₂を生成す
ることを特徴とするタンパク質。
【請求項１２】［Ｉ］Ｎ末端側よりＣ末端側の方向へ以
下の構成成分がペプチド結合しているタンパク質であっ
て：請求項１または２記載のプロテアーゼ、 Gln-Ala、Ｚ（ただし、Ｚは任意のペプチド構成成分を表
す。）、［ＩＩ］構成成分の自己触媒作用により、Ala-Ｚを生
成し、次いで、アラニンアミノペプチダーゼの触媒作用
によりＺを生成することを特徴とするタンパク質。
【請求項１３】請求項３乃至５のいずれか１つに記載の
ＤＮＡの3'末端側に、Gln-Ala、Gln-GlyおよびGln-Ser
からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列
をコードするＤＮＡを介して異種タンパク質をコードす
るＤＮＡを同じタンパク質の読み枠となるように接続し
たＤＮＡ。
【請求項１４】請求項１３記載のＤＮＡを含むことから
成る組換えＤＮＡベクター。
【請求項１５】請求項１４記載の組換えＤＮＡベクター
により形質転換された宿主細胞。
【請求項１６】形質転換された宿主細胞が大腸菌である
請求項１５記載の宿主細胞。
【請求項１７】以下の３段階の工程：［Ｉ］Ｎ末端側よりＣ末端側の方向へ以下の構成成分：請求項１または２記載のプロテアーゼ、 Gln-Ala、Gln-GlyまたはGln-Serのいずれか一つから
選択されるリンカー、ペプチド構成成分Ｘ、がペプチド結合しているタンパク質をコードするＤＮＡ
を含むことから成る組換えＤＮＡ発現ベクターにより宿
主細胞を形質転換する工程、［ＩＩ］該宿主細胞を培養し、該宿主細胞内において構
成成分の自己触媒作用により、Ala-Ｘ、Gly-Ｘまたは
Ser-Ｘのいずれか一つより選択されるペプチドを生成せ
しめる工程、［ＩＩＩ］該宿主細胞又は該宿主細胞の培養液より、Al
a-Ｘ、Gly-ＸまたはSer-Ｘのいずれか一つより選択され
るペプチドを単離、精製する工程、より成るAla-Ｘ、Gly-ＸまたはSer-Ｘのいずれか一つよ
り選択されるペプチドの製造法。
【請求項１８】以下の３段階の工程：［Ｉ］Ｎ末端側よりＣ末端側の方向へ以下の構成成分：請求項１または２記載のプロテアーゼ、 Gln-Ala、Gln-GlyまたはGln-Serのいずれか一つから
選択されるリンカー、 Pro-Ｙ₁（ただし、Ｙ₁は任意のペプチド構成成分を表
す。）、がペプチド結合しているタンパク質をコードするＤＮＡ
を含むことから成る組換えＤＮＡ発現ベクターにより縮
主細胞を形質転換する工程、［ＩＩ］該宿主細胞を培養し、該宿主細胞内において構
成成分の自己触媒作用により、Ala-Pro-Ｙ₁、Gly-Pro
-Ｙ₁またはSer-Pro-Ｙ₁ のいずれか一つより選択され
るペプチドを生成せしめ、さらに、宿主細胞由来または
外来のベクターより発現されるアミノペプチダーゼＰの
触媒作用によりPro-Ｙ₁を生成せしめる工程、［ＩＩＩ］該宿主細胞又は該宿主細胞の培養液より、Pr
o-Ｙ₁を単離、精製する工程、より成るPro-Ｙ₁の製造法。
【請求項１９】以下の３段階の工程：［Ｉ］Ｎ末端側よりＣ末端側の方向へ以下の構成成分：請求項１または２記載のプロテアーゼ、 Gln-Ala、Gln-GlyまたはGln-Serのいずれか一つから
選択されるリンカー、 Pro-Ｙ₂（ただし、Ｙ₂は任意のペプチド構成成分を表
す。）、がペプチド結合しているタンパク質をコードするＤＮＡ
を含むことから成る組換えＤＮＡ発現ベクターにより宿
主細胞を形質転換する工程、［ＩＩ］該宿主細胞を培養し、該宿主細胞内において構
成成分の自己触媒作用により、Ala-Pro-Ｙ₂、Gly-Pro
-Ｙ₂またはSer-Pro-Ｙ₂ のいずれか一つより選択され
るペプチドを生成せしめ、次いで、宿主細胞由来または
外来のベクターより発現されるアミノペプチダーゼＰの
触媒作用によりPro-Ｙ₂を生成せしめ、さらに、宿主細
胞由来または外来のベクターより発現されるプロリンイ
ミノペプチダーゼの触媒作用によりＹ₂を生成する工
程、［ＩＩＩ］該宿主細胞又は該宿主細胞の培養液より、Ｙ
₂を単離、精製する工程、より成るＹ₂の製造法。
【請求項２０】以下の３段階の工程：［Ｉ］Ｎ末端側よりＣ末端側の方向へ以下の構成成分：請求項１または２記載のプロテアーゼ、 Gln-Ala、Ｚ（ただし、Ｚは任意のペプチド構成成分を表
す。）、がペプチド結合しているタンパク質をコードするＤＮＡ
を含むことから成る組換えＤＮＡ発現ベクターにより宿
主細胞を形質転換する工程、［ＩＩ］該宿主細胞を培養し、該宿主細胞内において構
成成分の自己触媒作用により、Ala-Ｚを生成せしめ、
さらに、宿主細胞由来または外来のベクターより発現さ
れるアラニンアミノペプチダーゼの触媒作用によりＺを
生成する工程、［ＩＩＩ］該宿主細胞又は該宿主細胞の培養液より、Ｚ
を単離、精製する工程、より成るＺの製造法。
【請求項２１】宿主細胞が大腸菌である請求項１７、１
８、１９および２０のいずれか一つに記載の製造法。
【請求項２２】試験管内にて、請求項１または２記載の
プロテアーゼの触媒作用により、Gln-Ala、Gln-Glyまた
はGln-Serのいずれか一つ及びペプチド構成成分Ｘがペ
プチド結合しているタンパク質より、Ala-Ｘ、Gly-Ｘま
たはSer-Ｘのいずれか一つより選択されるペプチドを
生成せしめ、反応液よりAla-Ｘ、Gly-ＸまたはSer-Ｘの
いずれか一つより選択されるペプチドを単離、精製する
ことより成る、Ala-Ｘ、Gly-ＸまたはSer-Ｘのいずれか
一つより選択されるペプチドの製造法。
【請求項２３】試験管内にて、請求項１または２記載の
プロテアーゼの触媒作用により、Gln-Ala、Gln-Glyまた
はGln-Serのいずれか一つ及びPro-Ｙ₁（ただし、Ｙ₁は
任意のペプチド構成成分を表す。）がペプチド結合して
いるタンパク質より、Ala-Pro-Ｙ₁、Gly-Pro-Ｙ₁または
Ser-Pro-Ｙ₁のいずれか一つより選択されるペプチドを
生成せしめ、さらに、アミノペプチダーゼＰの触媒作用
によりPro-Ｙ₁を生成せしめ、反応液より、Pro-Ｙ₁を単
離、精製することより成る、Pro-Ｙ₁の製造法。
【請求項２４】試験管内にて、請求項１または２記載の
プロテアーゼの触媒作用により、Gln-Ala、Gln-Glyまた
はGln-Serのいずれか一つ及びPro-Ｙ₂（ただし、Ｙ₂は
任意のペプチド構成成分を表す。）がペプチド結合して
いるタンパク質より、Ala-Pro-Ｙ₂、Gly-Pro-Ｙ₂または
Ser-Pro-Ｙ₂ のいずれか一つより選択されるペプチド
を生成せしめ、次いで、アミノペプチダーゼＰの触媒作
用によりPro-Ｙ₂を生成せしめ、さらに、プロリンイミ
ノペプチダーゼの触媒作用によりＹ₂を生成せしめ、反
応液より、Ｙ₂を単離、精製することより成るＹ₂の製造
法。
【請求項２５】試験管内にて、請求項１または２記載の
プロテアーゼの触媒作用により、Gln-Ala及びＺ（ただ
し、Ｚは任意のペプチド構成成分を表す。）がペプチド
結合しているタンパク質より、Ala-Zを生成せしめ、次
いで、アラニンアミノペプチダーゼの触媒作用によりＺ
を生成せしめ、反応液よりＺを単離、精製することより
成るＺの製造法。