JP3347314B2 - マウス接着分子オクルディン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、マウスのタイトジ
ャンクション（tight junction、以下「TJ」と記す）の
膜タンパク質オクルディンのアミノ酸配列およびそれを
コードするDNAに関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】多細胞
動物において、隣接する細胞との接着の情報は、細胞の
増殖、分化、炎症、癌転移などの生命現象の調節、維持
に深く関係している。接着に関与している細胞間接着分
子は細胞表面で集合して、接着のための特殊に分化した
膜領域をつくることが多い。とくに、上皮細胞におい
て、カドヘリンなどの細胞間接着分子は、その細胞質ド
メインで細胞骨格と強く結合していることが知られてい
る。このような膜領域は、細胞間接着装置と呼ばれ、主
として次の４つに分類されている。gap junction（G
J）、adherens junction（AJ）、desmosome およびtigh
tjunction（TJ）である。

【０００３】これら接着装置は、最初電子顕微鏡下で同
定されたものであるが、構成タンパク質の解明研究によ
り、その生理学的病理学的意義の重要性が大きな注目の
的となっている。いわゆる接着分子と呼ばれるタンパク
質がこれら接着装置中に特異的に存在し、AJの接着分子
はカドヘリンであり現在までN−カドヘリン、P−カドヘ
リンなどいく種類ものカドヘリンが同定されている（Ta
keichi, M. et al.,Science, 251, 1451-1455, 199
1）。desmosome の接着分子としてはデスモグレン、デ
スモコリンであり、最近の研究により、その構造がカド
ヘリンに類似していることが判明した（Buxton, R. S.
et al., J. Cell Biol., 121, 481-484, 1993)。GJの接
着分子はコネキシンと呼ばれ、4個所の細胞膜貫通部位
を保有し、N末端C末端とも膜の細胞質側に出ていること
がわかっている。

【０００４】TJは、上皮細胞と内皮細胞に特有の細胞間
接着装置で、そこでは隣り合う細胞の細胞膜が完全に密
着してみえる。TJは個々の細胞の周囲を取り巻いてい
て、細胞層をはさんだ管腔側と基底膜側との間の水溶性
分子の透過を遮る、あるいは調節するバリアとして機能
している。また、細胞膜をapical側とbasolateral 側に
仕切るフェンスとして働き、イオンチャンネル、ポンプ
などの膜タンパク質や、脂質の細胞膜上での極性をもっ
た分布を維持しているともいわれている（Schneeberge
r, E.E. et al.,Am. J. Physiol., 262,L647-L661, 199
2）。これらの機能により、細胞層をはさんだ両側で異
なる溶液組成からなる環境がつくられ、その細胞層の極
性が保たれるのであり、TJは多細胞生物においてきわめ
て基本的な重要な構造の1つといえる。

【０００５】しかしながら、TJの分子構築の解析は他の
接着装置に比べて遅れており、これまでTJの接着分子そ
のものが同定されていなかったために、TJに関する分子
生物学的研究を進めるうえで大きな障害となっていた。

【０００６】本発明者はラット肝臓からのAJ分離法を確
立し、この分離したAJからラディキシン、ZO−1など多
くのタンパク質を同定してきた（Tsukita, Sh. et al.,
Curr. Opin. Cell Biol., 4, 834-839, 1992）。ZO−1
に関する研究およびAJとTJの組織学的知見から、AJ中の
タンパク質はTJのタンパク質も含んでいることが予想さ
れた。そこで、ニワトリ（chic）肝臓よりAJを分離し、
このAJを抗原とするモノクローナル抗体を作製しTJと特
異的に反応する抗体を用いて、TJ構成タンパク質の構造
解析を行った。その結果、公知のタンパク質と類似しな
い新規構成タンパク質の構造解析に成功し、オクルディ
ンと命名した（Furuse, M. et al., J.Cell Biol., 12
3, 1777-1788, 1993) 。

【０００７】このニワトリオクルディンは504個のアミ
ノ酸からなる56KDaのタンパク質で、最大の特徴はN末端
部半分に4ヶ所の膜貫通領域を有し、N末端とC末端を細
胞質に向け、細胞外に2つのループを持つタンパク質で
ある。

【０００８】その後の研究によりオクルディンが、細胞
レベルおよび生体全体レベルにおいてTJ生理機能の解析
に重要な因子であることが推察され、非常に大きな注目
を集めた。

【０００９】しかしながらニワトリというヒトとかなり
かけ離れた種の起源であることから、それ以上全く研究
は進展せず、TJの生理機構の解明および医学的解析のた
めにはヒト等の哺乳動物由来オクルディンの構造解析が
待望された。この目的のためにこの分野において世界的
な競争が行われていたにも拘わらず、未だヒト等の哺乳
動物オクルディンの解明は成功していない。

【００１０】上記現状に鑑み、本発明の目的は、マウス
のオクルディンのアミノ酸配列およびそれをコードする
DNAを提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】Roy らはヒトneuronal a
poptosis inhibitory protein （NAIP）の遺伝子を報告
したが、その中でNAIP遺伝子の欠失体において、ニワト
リオクルディンのＣ末端部と類似の塩基配列を保有する
DNA断片が存在することを報告した（Roy, N.etal.,Cel
l,80,167-178,1995）。そこで本発明者は、この配列が
実際にオクルディンのヒト相同体の一部をコードしてい
るか否かを決定するために、ニワトリオクルディンとの
類似塩基配列からプライマーを選択し、ヒト腸管上皮T8
4細胞株のcDNAライブラリーをPCRの鋳型として鋭意スク
リーニングした結果、ヒトオクルディンの全構造解析に
成功した。さらにマウスのオクルディン解析も完成さ
せ、抗オクルディンモノクロナール抗体を作成し、組織
染色により、TJの膜貫通型タンパク質であることを確認
した。

【００１２】本発明は、マウスのオクルディンアミノ酸
配列、それをコードするDNA、抗オクルディン抗体およ
びそれらを利用する遺伝子解析法に関するものであっ
て、 1)配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するマウスオク
ルディンをコードする、配列番号２に記載のDNA、 2)配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、マウスオ
クルディン、 3)マウスオクルディンのアミノ酸配列のうち1若しくは
数個のアミノ酸が、付加、欠失若しくは置換されたアミ
ノ酸配列を有するオクルディン改変体、及びこれら改変
体をコードするDNA、 4)マウスオクルディンおよびそれらの改変体をコードす
るDNAのいずれかを含有するベクター、 5)前記ベクターを保持する形質転換体、 6)前記の形質転換体を培養し、発現産物を回収すること
を含む、オクルディンタンパク質の製造方法、 7)配列番号２に記載の塩基配列の全部または一部を含む
ものからなるDNAプローブ、 8)配列番号２に記載の塩基配列の一部を含むものからな
るDNAプライマー、 9)マウスオクルディンタンパク質と特異的に結合するポ
リクロナール抗体またはモノクロナール抗体、 10)抗オクルディン抗体を用いることを特徴とする生体
資料中のオクルディンの測定法方および測定試薬、 11)上記DNAプライマー又はDNAプローブを用いることを
特徴とする生体試料中のオクルディン遺伝子の解析方
法、 12)オクルディンを発現している細胞と被検物質を共存
させた後、該細胞のオクルディン遺伝子の発現量をDNA
プライマー又はDNAプローブを用いて解析することを特
徴とする、オクルディンの発現に影響を与える薬物のス
クリーニング方法、 13)オクルディンDNAをノックアウトした実験動物、に関
する。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明者が哺乳動物オクルディン
相同体の同定に成功したことにより、TJの構成や機能を
構造的に且つ機能的に分子レベルで試験することができ
る。種々のタイプの培養したマウス細胞を使用して、オ
クルディン遺伝子発現を調節するかまたはアンチセンス
プローブ若しくは抗体でオクルディンの機能を阻害する
ことによって、TJのバリヤーおよびフェンス機能並びに
これに関与する調節メカニズムを実験的に分析すること
ができる。例えば、オクルディンcDNAの過剰発現によっ
て、フリーズフラクチャーレプリカに見られるTJストラ
ンド数が増加し、バリヤー機能が付随的に向上するかど
うかを今や決定することができる。さらに本発明によ
り、TJの機能に影響を及ぼす薬物の簡便なスクリーニン
グ法の樹立を可能にした。例えば、オクルディンを発現
している種種の細胞を用い、検体と反応させた後、細胞
のオクルディン遺伝子又はオクルディンタンパク質の発
現量を測定することにより、TJの機能に影響を及ぼす薬
物をスクリーニングすることができる。遺伝子の解析
は、DNAプローブ又はプライマーなどを用いて行うこと
ができる。例えば、検体試料から常法によりRNAまたはD
NAを抽出し、必要に応じて前処理後、メンブレンまたは
ゲル上で電気泳動を行った後、ラベルしたDNAプローブ
とハイブリダイズさせるノザンブロット法又はサザンブ
ロット法、ゲノムDNAやcDNAを鋳型として、適切な位置
に相当する約20塩基程度のプライマーを用いて目的DNA
を増幅させるPCR法など公知の方法で行うことができ
る。オクルディンタンパク質は、例えば抗体を用いて定
量することができる。

【００１４】また、種々のタイプの突然変異およびオク
ルディン遺伝子ノックアウトマウスを作成することによ
って、TJ形成が種々の器官の形態形成にどのように関与
しているのか、そしてTJの機能不全が炎症や腫瘍転移の
ような種々の病理学的状態に関係があるのかどうかを知
ることが可能となる。TJ機能、特にそのバリヤー機能の
調節の可能性も医薬品の透過性に関連して興味がある。
かくして、脳上皮細胞中でのオクルディン合成の上方ま
たは下方調節によって血液−脳関門を調節することが可
能であろう。腸からの医薬品吸収を調節するためには腸
上皮細胞内でのTJ機能の調節が必要である。このよう
に、TJの機能を調節する薬物をスクリーニングして効果
を有する物質を投与することにより、医薬品の吸収調
節、特に脳内への移行を調節することが可能となる。こ
のように本発明は、血液−脳関門を中心とする生理的機
構の解明、病態の解析、診断、治療に大きく期待され
る。

【００１５】本発明のＤＮＡは、その一部をプライマー
またはプローブとして用いることにより、オクルディン
タンパク質の遺伝子解析や遺伝子の発現の解析に利用す
ることができる。一部とは、プライマーまたはプローブ
として使用するオリゴヌクレオチドが本発明のDNA配列
をもとに少なくとも10個の対応する塩基配列を含むもの
からなり、好ましくは少なくとも15個の塩基配列、さら
に好ましくは約20〜30個の塩基配列を含むものからなる
対応するポリヌクレオチドを意味する。またプローブと
しては、さらに高分子のもの、全DNAも使用することが
できる。

【００１６】オクルディンの機能を調節する手段の一つ
として、アンチセンスDNA又はアンチセンスRNAを用いる
方法がある。DNA複製、転写、翻訳などの遺伝子発現の
各段階において、遺伝子の情報が読みとられなくして発
現の流れを遮断する方法であって、この遮断に核酸ある
いはそのアナログを用いる方法がアンチセンス法である
（Wickstrome, E., ed., Prospects for Antisense Nuc
leic Acid TheraphyofCancer and AIDs.Wiley-Liss, Ne
w York, 1991）。本発明のオクルディンDNAを解明した
ことにより、アンチセンス法によりオクルディンの機能
を抑制させる手段を可能とした。DNAオリゴマーの長さ
は二重鎖形成能、膜透過性、塩基配列特異性が関係し、
少なくとも６個、好ましくは少なくとも10 mer,通常15
から30 merを用いることができる。配列は本発明DNA配
列に基づいて適宜選択し、実験確認することができる。
通常、オリゴマーの安定性を増すために、リン酸基、糖
部分、3', 5'末端に化学修飾を施させる（Cook, P.D.,
Anticancer Drig Des., 5,585, 1991）。代表的アナロ
グはヌクレオシド間のホスホジエステル基の酸素原子の
一つを硫黄原子に置換したオリゴホスホロサイオエー
ト、メチル基に置換したオリゴメチルホスホネートであ
って、いずれもヌクレアーゼに対してきわめて安定とな
る。その他ハイブリッド二重鎖の安定性を増すためにア
クリジンやポリリジンを結合させたオリゴマー、Ｎ-メ
チルチミジレートを含むオリゴマーなどが用いられる。
これらオリゴマーは公知の化学合成法により合成するこ
とができる。また、本発明DNAから導かれるアンチセン
スRNAも利用できる。

【００１７】本発明のオクルディンタンパク質の全部ま
たは一部（部分）をエピトープとして用い、抗体の作
成、およびその抗体を用いる研究用、診断用試薬として
利用することができる。エピトープとは、ポリペプチド
の抗原決定基を意味し、一般に少なくとも６個のアミノ
酸で構成され、６個のアミノ酸で構成されるポリペプチ
ドが抗体と結合することは公知である（公表特許公報60
-500684 号）。本タンパク質の抗原ペプチドは、本発明
のアミノ酸配列に基づいて、連続してなる少なくとも6
個のアミノ酸、好ましくは連続してなる少なくとも8個
のアミノ酸、より好ましくは連続してなる少なくとも約
15個のアミノ酸、さらに好ましくは連続してなる少なく
とも約20個のアミノ酸からなるポリペプチドを意味す
る。本発明のオクルディンはそのアミノ酸配列から、ニ
ワトリオクルディンと同様にＮ末端部半分に４カ所の膜
貫通領域を有し、N末端とC末端を細胞質に向け、細胞外
に２つのループを持つタンパク質である。ヒトオクルデ
ィンの場合、アミノ酸89〜135位および196〜243位部分
が細胞外に位置すると予想されることから、抗原部位を
目的に応じて選択することにより、各種の抗体を作成す
ることができ、それらを使い分けることによりTJの機能
解明手段、抗体によるTJ機能抑制手段として利用するこ
とができる。また、部分ペプチドは、部分ペプチドと結
合性を有する化合物のスクリーニング手段として利用す
ることも可能である。

【００１８】本発明のオクルディンのアミノ酸配列にお
いて、1若しくは数個のアミノ酸が、付加、欠失若しく
は置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本発明
に含まれる。 (1) cDNAライブラリーの作製およびオクルディンの構
造解析 RNAの調製は、ヒトまたは動物の細胞（株）を原料とし
て、例えばグアニジンチオシアネート、界面活性剤、キ
レート剤および還元剤の混合溶液にて抽出を行った後、
フェノール抽出、有機溶媒分画（Chamezynski et al.,
Anal, Biochem., 162, 156, 1987）、次いで密度勾配超
遠心操作により行うことができる。得られた RNAを鋳型
として用い、ランダムプライマー、逆転写酵素、DNA ポ
リメラーゼ等を用いるcDNA合成法（Gubler, U. et al.,
Gene, 25, 263, 1983）などの常法により、2本鎖 DNA
を調製し、得られた2本鎖 DNAを、常法に従い、バクテ
リオファージ、例えばλzap 、λgtllなどに組み込みcD
NAライブラリーを作製することができる。また市販のcD
NAライブラリーを使用することも可能である。

【００１９】次いで、Roy らの報告の中で、ニワトリオ
クルディンＣ末端部と類似した塩基配列をもとに適切に
プライマー部位を選択し、常法の PCR法により DNAを増
幅させ、サブクローニングすることにより、オクルディ
ンDNA 由来と予想されるDNA断片を得ることができる。
次いで、この断片をプローブとしてcDNAライブラリーを
スクリーニングし、単離したクローンの塩基配列を解析
することによりオクルディン全長cDNAを得ることができ
る。塩基配列の構造は、マキサム・ギルバート法（Maxa
m, A. M. and Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 74, 560, 1977） あるいはジデオキシ法（Sanger,
F., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 74, 5463, 1977）に
よって決められる。その塩基配列をもとにアミノ酸配列
が演繹される。これら遺伝子の操作は通常行われる公知
の方法により実施することができ、例えばMolecular Cl
oning. A Laboratory Manual., T.Manitisら編集（198
9）,Cold Spring Harbor Laboratoryに記載の方法に準
じて行うことができる。 (2) 抗体の調製 本発明のモノクローナル抗体の調製はマウスのオクルデ
ィンを抗原とし、必要に応じてキャリアー蛋白との複合
体を作り、これを動物に接種して免疫する。上記免疫動
物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞を
骨髄腫細胞と融合し、オクルディンに強い特異性を示す
抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより調
製される。その操作は従来既知の方法に準ずればよい。

【００２０】免疫抗原としては天然精製品、遺伝子組換
手法あるいは化学合成手法による生産品などいずれも使
用できる。遺伝子組換手法によるオクルディンの調製
は、オクルディンをコードするｃＤＮＡをオクルディン
の発現に適したベクターのプロモター下流に制限酵素と
ＤＮＡリガーゼを用いる公知の方法により再結合して組
換え発現ベクターを作製することでできる。ベクターは
宿主内で複製、増幅可能であれば特に限定されない。プ
ロモーターおよびターミネーターに関してもオクルディ
ンをコードする塩基配列の発現に用いられる宿主に対応
したものであれば特に限定されず、宿主に応じて適切な
組み合わせも可能である。このようにして得られた組換
え発現ベクターはコンピテント細胞法（J. Mol. Biol.,
53, 154,1970）、リン酸カルシウム法（Science, 221,
551, 1983 ）などにより宿主に導入し、形質転換体が
作製される。宿主としては大腸菌および動物細胞などが
用いられ、得られた形質転換体はその宿主に応じた適切
な培地中で培養される。培養は通常20℃〜45℃、pH５〜
８の範囲で行われ、必要に応じて通気、攪拌が行われ
る。培養物からのオクルディンの分離、精製は公知の分
離、精製法を適宜組み合わせて実施すれば良い。これら
の公知の方法としては塩析、溶媒沈殿法、透析ゲル炉過
法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティクロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーなどが挙げられる。

【００２１】免疫抗原オクルディンは全構造を保有して
いることが好ましいが、部分構造を有するフラグメント
あるいはペプチドであってもよく、オクルディンの全ア
ミノ酸配列から適宜選択することができる。フラグメン
トあるいはペプチドの調製は化学合成法、上記遺伝子組
換法あるいは天然物の分解の方法などが用いられる。

【００２２】抗原とキャリア蛋白の複合体の調製は種々
の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒ
ド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル等が使用
できる。キャリア蛋白は牛血清アルブミン、サイログロ
ブリン、ヘモシアニン等の常用されているものでよく、
通常1〜5倍量の割合でカップリングさせる方法が用いら
れる。

【００２３】免疫される動物としてはマウス、ラット、
ウサギ、モルモットなどがあげられ、接種方法は皮下、
筋肉あるいは腹腔内に投与される。投与に際しては完全
フロイントアジュバンドや不完全フロイントアジュバン
ドと混和して投与してもよく、投与は通常2〜5週毎に1
回ずつ行われる。免疫された動物の脾臓あるいはリンパ
節から得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞と細胞融合さ
せられハイブリドーマとして単離される。骨髄腫細胞と
してはマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用され、
抗体産生細胞と同種由来のものであることが好ましい
が、異種間においても可能な場合もある。

【００２４】細胞融合の操作は既知の方法、たとえばケ
ーラーとミルスタインの方法（Nature, 256, 495, 197
5）に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレ
ングリコールやセンダイウイルスなどが挙げられるが、
通常20〜50％程度の濃度のポリエチレングリコール（平
均分子量1000〜4000）を用いて20〜40℃、好ましくは30
〜37℃の温度下、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は
通常1:1〜10:1程度、約1〜10分間程度反応させることに
より細胞融合を実施することができる。

【００２５】抗オクルディン抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニングには種々の免疫化学的方法が使用でき
る。たとえば、オクルディンをコートしたマイクロプレ
ートを用いるＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunosorben
t assay ）法、抗免疫グロブリン抗体をコートしたマイ
クロプレートを用いるＥＩＡ（Enzyme immunoassay）
法、オクルディンを含むサンプルを電気泳動後ニトロセ
ルロース転写膜を用いるウエスタンブロット法などがあ
げられる。

【００２６】このようなウエルから更に例えば限界希釈
法によってクローニングを行いクローンを得る。ハイブ
リドーマの選別、育種は通常HAT（ヒポキサンチン、ア
ミノプテリン、チミジン）を添加して、10〜20％牛胎児
血清を含む動物細胞用培地（例、RPMI 1640）で行われ
る。このようにして得られたクローンはあらかじめブリ
スタンを投与したBALB/Cマウスの腹腔内へ移植し、10〜
14日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取
し、抗体精製の原料とすることができる。また、該クロ
ーンを培養し、その培養物を抗体精製の原料とすること
もできる。モノクローナル抗体の回収は免疫グロブリン
の精製法として既知の方法を用いればよく、たとえば、
硫安分画法、PEG分画法、エタノール分画法、陰イオン
交換体の利用、さらにアフィニティクロマトグラフィー
などの手段により容易に達成することができる。

【００２７】本発明によって得られた抗オクルディンモ
ノクローナル抗体を用いる免疫学的方法により生体試料
中のオクルディンの定性、定量を行うことができる。免
疫学的方法としては、生体試料を必要に応じて適切に処
理、たとえば細胞の分離、抽出操作などした試料につい
て、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、凝集法、競合
法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することがで
きる。免疫組織染色法は、例えば標識化抗体を用いる直
接法、該抗体に対する抗体の標識化されたものを用いる
間接法などにより行ないうる。標識化剤としては螢光物
質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質
はいずれも使用できる。

【００２８】本発明のモノクローナル抗体はFc'あるい
はFc領域を除去したFab'あるいはFab画分、あるいはそ
の重合体を用いてもよい。またそのキメラ抗体、ヒト化
抗体、ヒト抗体であってもよい。

【００２９】

【実施例】以下の実施例により本発明を詳細に且つ具体
的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。

【００３０】参考例1．ヒトオクルディンの構造解析 ヒトNAIP欠損遺伝子の一部に見られる、ニワトリオクル
ディンC末端部と類似している塩基配列をもとに、配列
番号５および６に記載のオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして用い、PCRを実施した。λgt11 cDNA ライブラ
リーはヒト腸管上皮細胞下部T84を原料としてpoly(A)+R
NA を精製し、TimeSaver cDNA synthesis kit（商品
名、ファルマシア LKBバイオテクノロジ−社製）および
GIGAPACK IIPackaging Extract （ストラテジ−ン社）
を用いて作製した。このライブラリーをPCRの鋳型とし
て上記二つのプライマーを用いてPCRを実施した結果、3
63bpcDNA断片が得られた。

【００３１】この DNA断片を DIG labeling kit （商品
名、ベ−リンガ−マンハイム社製）を用いて DIGラベル
した後、これをプローブとして同ライブラリーをスクリ
ーニングした。その結果、３個のcDNAクローンを単離
し、これらのインサ−ト部位を切り出し、pBluescript
SK(-) にサブクロ−ニングした。このうち、phＯc6とph
Ｏc16 のクローンが全ORFを含むと予想されたので、こ
の二つのクローン両鎖の塩基配列を解析した結果、ヒト
オクルディン全構造をコ−ドする塩基配列であることを
確認した。塩基配列は7-deaza Sequenase Version Deox
y Terminator CycleSequencing Kit（商品名、アプライ
ドバイオシステム社製）を用いて決定した。配列番号４
に塩基配列を、それから演繹されるアミノ酸配列を配列
番号３に示した。なお、ヒトオクルディンcDNAを含有す
る Esherichia Coli JM 109は1996年3月15日、受託番号
FERM BP-5477として通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所（あて名： 日本国茨城県つくば市東1丁
目1番3号（郵便番号305））に寄託された。

【００３２】実施例1. マウスオクルディンの構造解析 マウスオクルディンの構造を、参考例１と同じ手法によ
り、マウス肺細胞から作製した、λgt10 cDNA ライブラ
リーを用いて決定した。マウスオクルディンの塩基配列
およびアミノ酸配列は、配列番号２および１に示した。

【００３３】実施例2. 脳血管細胞におけるオクルディ
ンの発現 脳血管内皮細胞は、末梢血管内皮細胞と異なり、高電気
抵抗ＴＪを有しており、高電気抵抗TJは脳−血液関門を
形成していると考えられていることから、高電気抵抗TJ
を有する培養豚脳血管内皮細胞（PBEC）と低電気抵抗TJ
を有する培養豚大動脈内皮細胞（PAEC）のオクルディン
の分布、発現を検討した。

【００３４】豚オクルディンcDNA断片は、ヒトオクルデ
ィンDNA配列（配列番号４）の1359-1391位センス鎖（配
列番号５）および1692-1721位アンチセンス鎖（配列番
号６）をプライマーとしてPCR法により増幅し363塩基断
片を調製した。該断片の塩基配列の解析に基づく、その
コードするアミノ酸配列はヒト及びマウスオクルディン
のアミノ酸配列と高い相同性を示し、豚オクルディンの
cDNAであることを確認した。³²Pラベルした該断片をプ
ローブとして使用した。

【００３５】培養細胞からのmRNAの調製はRNA分離キッ
ト（ストラタジーン社（Stratagene）製）を使用し、ア
ガロースゲル電気泳動後ニトロセルロース膜に転写し、
高ストリンジェント条件下でプローブとハイブリダイズ
させた。その結果、オクルディンmRNAはPBECにおいて訳
2.4kbに強いバンドが認められたが、PAECにおいては、
同位置に非常に弱いバンドしか認められなかった。

【００３６】ついで哺乳類オクルディンを特異的に認識
するモノクローナル抗体として抗マウスオクルディン抗
体を、及びTJ関連タンパク質ZO−1にたいする抗体を用
いオクルディンの発現を比較した。

【００３７】ラット抗マウスオクルディン抗体は、マウ
スオクルディンとグルタチオン−S−トランスフェラー
ゼ融合タンパク質を抗原として作製し、該抗体の検出は
FITC標識羊抗ラットIgG抗体を用いた。培養細胞の破砕
抽出物の同一タンパク質量を一次元ゲル電気泳動後、イ
ムノプロット法で検出したところ、PBECにおいては約58
KDの位置に強く検出されたが、PAECにおいては、それに
比較してかなり弱く検出された。

【００３８】一方、ZO-1の発現は２つの細胞で明らかな
差は認めなかった。免疫染色ではイムノブロットと同様
にPBECではオクルディンは高度に発現し、細胞間に連続
性にZO−1と同一の局在を示した。一方、PAECではまた
オクルディンの検出は困難であり、ZO−1は細胞間に不
連続に局在した。これらの結果はPBECにおけるオクルデ
ィンの相対的に高度な発現は高電気抵抗TJの形成に必要
であることが示唆され、オクルディンがTJ構成タンパク
質であることを立証したものである。

【００３９】 配列表 配列番号：１ 配列の長さ：５２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：マウス（肺細胞） 配列の記述 Met Ser Val Arg Pro Phe Glu Ser Pro Pro Pro Tyr Arg Pro Asp Glu 1 5 10 15 Phe Lys Pro Asn His Tyr Ala Pro Ser Asn Asp Met Tyr Gly Gly Glu 20 25 30 Met His Val Arg Pro Met Leu Ser Gln Pro Ala Tyr Ser Phe Tyr Pro 35 40 45 Glu Asp Glu Ile Leu His Phe Tyr Lys Trp Thr Ser Pro Pro Gly Val 50 55 60 Ile Arg Ile Leu Ser Met Leu Ile Ile Val Met Cys Ile Ala Ile Phe 65 70 75 80 Ala Cys Val Ala Ser Thr Leu Ala Trp Asp Arg Gly Tyr Gly Thr Gly 85 90 95 Leu Phe Gly Gly Ser Leu Asn Tyr Pro Tyr Ser Gly Phe Gly Tyr Gly 100 105 110 Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr Gly Gly 115 120 125 Tyr Thr Asp Pro Arg Ala Ala Lys Gly Phe Leu Leu Ala Met Ala Ala 130 135 140 Phe Cys Phe Ile Ala Ser Leu Val Ile Phe Val Thr Ser Val Ile Arg 145 150 155 160 Ser Gly Met Ser Arg Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Ile Val Ile Ile Val 165 170 175 Ser Ala Ile Leu Gly Ile Met Val Phe Ile Ala Thr Ile Val Tyr Ile 180 185 190 Met Gly Val Asn Pro Thr Ala Gln Ala Ser Gly Ser Met Tyr Gly Ser 195 200 205 Gln Ile Tyr Met Ile Cys Asn Gln Phe Tyr Thr Pro Gly Gly Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Val Asp Gln Tyr Leu Tyr His Tyr Cys Val Val Asp Pro Gln 225 230 235 240 Glu Ala Ile Ala Ile Val Leu Gly Phe Met Ile Ile Val Ala Phe Ala 245 250 255 Leu Ile Ile Phe Phe Ala Val Lys Thr Arg Arg Lys Met Asp Arg Tyr 260 265 270 Asp Lys Ser Asn Ile Leu Trp Asp Lys Glu His Ile Tyr Asp Glu Gln 275 280 285 Pro Pro Asn Val Glu Glu Trp Val Lys Asn Val Ser Ala Gly Thr Gln 290 295 300 Asp Met Pro Pro Pro Pro Ser Asp Tyr Ala Glu Arg Val Asp Ser Pro 305 310 315 320 Met Ala Tyr Ser Ser Asn Gly Lys Val Asn Gly Lys Arg Ser Tyr Pro 325 330 335 Glu Ser Phe Tyr Lys Ser Thr Pro Leu Val Pro Glu Val Ala Gln Glu 340 345 350 Ile Pro Leu Thr Leu Ser Val Asp Asp Phe Arg Gln Pro Arg Tyr Ser 355 360 365 Ser Asn Gly Asn Leu Glu Thr Pro Ser Lys Arg Ala Pro Thr Lys Gly 370 375 380 Lys Ala Gly Lys Gly Lys Arg Thr Asp Pro Asp His Tyr Glu Thr Asp 385 390 395 400 Tyr Thr Thr Gly Gly Glu Ser Cys Glu Glu Leu Glu Glu Asp Trp Val 405 410 415 Arg Glu Tyr Pro Pro Ile Thr Ser Asp Gln Gln Arg Gln Leu Tyr Lys 420 425 430 Arg Asn Phe Asp Ala Gly Leu Gln Glu Tyr Lys Ser Leu Gln Ala Glu 435 440 445 Leu Asp Asp Val Asn Lys Glu Leu Ser Arg Leu Asp Lys Glu Leu Asp 450 455 460 Asp Tyr Arg Glu Glu Ser Glu Glu Tyr Met Ala Ala Ala Asp Glu Tyr 465 470 475 480 Asn Arg Leu Lys Gln Val Lys Gly Ser Ala Asp Tyr Lys Ser Lys Arg 485 490 495 Asn Tyr Cys Lys Gln Leu Lys Ser Lys Leu Ser His Ile Lys Arg Met 500 505 510 Val Gly Asp Tyr Asp Arg Arg Lys Pro 515 520 配列番号：２ 配列の長さ：２８３９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：マウス（肺細胞） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：２２３．．１７８５ 配列の記述 GGAGTTTCAG GTGAATGGGT CACCGAGGGA GGAGGCTGGC CACGCCACAC CTCGTCGCTA 60 GTGCCCACCT CCCGGCCCCT CTTTCCTTAG GCGACAGCGG TGGAGTTGCG GGAGAGCGGT 120 CCAGCGCACG GAGCAACCGG CTAGGGGCTC GGCAGGTTCG CTTATCTTGG GAGCCTGGAC 180 ATTTTGCTCA TCATAAAGAT TAGGTGACCA GTGACATCAG CCATGTCCGT GAGGCCTTTT 240 GAAAGTCCAC CTCCTTACAG ACCTGATGAA TTCAAACCCA ATCATTATGC ACCAAGCAAT 300 GACATGTATG GCGGAGAGAT GCATGTCCGG CCGATGCTCT CTCAGCCAGC GTACTCTTTT 360 TATCCGGAAG ATGAAATTCT TCACTTCTAC AAATGGACGT CGCCCCCAGG GGTGATCCGG 420 ATCCTGTCTA TGCTCATTAT TGTGATGTGC ATCGCCATAT TTGCCTGTGT GGCTTCCACA 480 CTTGCTTGGG ACAGAGGCTA TGGGACAGGG CTCTTTGGAG GAAGCCTAAA CTACCCTTAT 540 AGTGGCTTTG GCTACGGAGG TGGCTATGGA GGCGGCTATG GAGGCTATGG CTATGGCTAT 600 GGCGGATATA CAGACCCAAG AGCAGCCAAA GGCTTCCTGT TGGCCATGGC AGCCTTCTGC 660 TTCATCGCTT CCTTAGTAAT ATTTGTGACC AGTGTTATAA GATCTGGAAT GTCCAGGACA 720 AGAAGATATT ACTTGATCGT GATCATAGTC AGCGCTATCC TGGGCATCAT GGTGTTTATT 780 GCCACGATCG TGTACATAAT GGGAGTGAAC CCGACGGCCC AGGCTTCTGG ATCTATGTAC 840 GGCTCACAGA TATATATGAT CTGCAACCAG TTTTATACTC CTGGAGGTAC TGGTCTCTAC 900 GTGGATCAAT ATTTGTATCA CTACTGTGTG GTTGATCCCC AGGAGGCTAT AGCCATTGTC 960 CTGGGGTTCA TGATTATCGT GGCTTTTGCT TTAATCATCT TTTTTGCTGT GAAAACCCGA 1020 AGAAAGATGG ATCGGTATGA TAAGTCCAAT ATTTTGTGGG ATAAGGAACA CATTTATGAT 1080 GAACAGCCCC CCAATGTTGA AGAGTGGGTT AAAAATGTGT CTGCAGGCAC ACAGGACATG 1140 CCTCCACCCC CATCTGACTA TGCGGAAAGA GTTGACAGTC CAATGGCCTA CTCCTCCAAT 1200 GGCAAAGTGA ATGGCAAGCG ATCATACCCA GAGTCTTTCT ATAAGTCAAC ACCTCTGGTG 1260 CCTGAAGTGG CCCAGGAGAT TCCTCTGACC TTGAGTGTGG ATGACTTCAG GCAGCCTCGG 1320 TACAGCAGCA ATGGTAACCT AGAGACACCT TCTAAAAGGG CTCCCACGAA GGGGAAAGCA 1380 GGAAAGGGCA AGAGGACGGA CCCTGACCAC TATGAAACAG ACTACACGAC AGGTGGGGAG 1440 TCCTGCGAGG AGCTGGAGGA GGACTGGGTC AGGGAATATC CACCTATCAC TTCAGATCAA 1500 CAAAGACAAC TCTACAAGAG AAATTTTGAT GCAGGTCTGC AGGAGTATAA GAGCTTACAG 1560 GCAGAACTAG ACGACGTCAA TAAAGAGCTC TCTCGTCTAG ATAAAGAGCT GGATGACTAC 1620 AGAGAGGAGA GTGAAGAGTA CATGGCTGCT GCTGATGAAT ATAATAGACT AAAGCAAGTT 1680 AAGGGATCTG CAGATTATAA AAGTAAGAGG AATTACTGCA AGCAGTTGAA GAGCAAATTA 1740 TCGCACATCA AGAGGATGGT GGGAGACTAT GACAGACGGA AACCTTAGAG AGATGCCAGT 1800 TGCGGGAGAA GGGAGAGGTG CATCTGCCTG CACGATGTCT CTGCAATTCT CTCCAGAGGC 1860 AAACTGACTT TGGACTCTAA TCTGGGAAGT TAAAACTTTG TGATCATTAC AAAGTTTCCA 1920 TGGCTTTAAT TCCATCAGTT TCCTATCTCC AGTATTGAAG CATTTTATAA ATGGCTTTTG 1980 ATAATTGACT GGGCTGAACA CTCCAATTAA GGATTTTACA GTTTCAACAT TGATTCTTGT 2040 ATTAAGAATT AAAATGTTGC TTGAGGTTTT AAATGTCAAG AAAGGTCCTG GTGTGAGCTG 2100 TGATGTGTGT GAGCTGTGAT GTGAAGGTTC ACACGCCAGG CAGCGTGTTC CTCCAGGTAG 2160 ACCGTCTAAT CAATCTTTGC AGCAGCCCTC AGGTGACTGT TATTTAGAAT CAGGTTGTTT 2220 TTGGTTTTCC AGACAGGGTT TCTCTGTGTA GCCCTGGCTG ACCTAGAACT TACGCTGTAG 2280 ACCAGGCTGG CCTTGAACTC ACACAGCTCC TCTGAGTGCT GGTGCAGGAG TTAACGTCGT 2340 GGACCGGTAT CATCACTTTT CCTGCGGTGA CTTCTCCAAA CTGAAACTGC TAAGGCAGTT 2400 TTGGCTAAGT CTGTTTTATG ACTGCAAATG ACAGCATTCC TGCCTTTGTA TTTCAGGGGA 2460 AATACGATAC ATTATATCGG CCATGTTCCC CACCACTGTT TTTCTTATAT TGACTTTTAA 2520 CAAATGAATA GGATTATTTT TGGCTTTACA TTTTTTCCTA ACACTTAAGA TCATATAAAA 2580 TTAACAAATA TGTGAAATTT AAGAATTGTA AATATATATT TACGTTTGAA AGATGATTTT 2640 AAATCCAGGG TTAAAGTGCT TTTTATCTTG TATAGTTTAC ATGCTTTTTT TTTTTTTTGA 2700 TAACCCACTA GACCTTTCCA TTGTATCAGA GTATCCAATT ACATTTACAA TTATGACTTG 2760 AATTGTATTT CACAGGAATG CTCAAGTTTT GTACATATTT TATAAGGTAT TAAACCTGAT 2820 GTTCTCTTTC TAAAAAAAA 2839 配列番号：３ 配列の長さ：５２２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト（腸管上皮細胞株Ｔ８４） 配列の記述 Met Ser Ser Arg Pro Leu Glu Ser Pro Pro Pro Tyr Arg Pro Asp Glu 1 5 10 15 Phe Lys Pro Asn His Tyr Ala Pro Ser Asn Asp Ile Tyr Gly Gly Glu 20 25 30 Met His Val Arg Pro Met Leu Ser Gln Pro Ala Tyr Ser Phe Tyr Pro 35 40 45 Glu Asp Glu Ile Leu His Phe Tyr Lys Trp Thr Ser Pro Pro Gly Val 50 55 60 Ile Arg Ile Leu Ser Met Leu Ile Ile Val Met Cys Ile Ala Ile Phe 65 70 75 80 Ala Cys Val Ala Ser Thr Leu Ala Trp Asp Arg Gly Tyr Gly Thr Ser 85 90 95 Leu Leu Gly Gly Ser Val Gly Tyr Pro Tyr Gly Gly Ser Gly Phe Gly 100 105 110 Ser Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr 115 120 125 Gly Gly Tyr Thr Asp Pro Arg Ala Ala Lys Gly Phe Met Leu Ala Met 130 135 140 Ala Ala Phe Cys Phe Ile Ala Ala Leu Val Ile Phe Val Thr Ser Val 145 150 155 160 Ile Arg Ser Glu Met Ser Arg Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Ser Val Ile 165 170 175 Ile Val Ser Ala Ile Leu Gly Ile Met Val Phe Ile Ala Thr Ile Val 180 185 190 Tyr Ile Met Gly Val Asn Pro Thr Ala Gln Ser Ser Gly Ser Leu Tyr 195 200 205 Gly Ser Gln Ile Tyr Ala Leu Cys Asn Gln Phe Tyr Thr Pro Ala Ala 210 215 220 Thr Gly Leu Tyr Val Asp Gln Tyr Leu Tyr His Tyr Cys Val Val Asp 225 230 235 240 Pro Gln Glu Ala Ile Ala Ile Val Leu Gly Phe Met Ile Ile Val Ala 245 250 255 Phe Ala Leu Ile Ile Phe Phe Ala Val Lys Thr Arg Arg Lys Met Asp 260 265 270 Arg Tyr Asp Lys Ser Asn Ile Leu Trp Asp Lys Glu His Ile Tyr Asp 275 280 285 Glu Gln Pro Pro Asn Val Glu Glu Trp Val Lys Asn Val Ser Ala Gly 290 295 300 Thr Gln Asp Val Pro Ser Pro Pro Ser Asp Tyr Val Glu Arg Val Asp 305 310 315 320 Ser Pro Met Ala Tyr Ser Ser Asn Gly Lys Val Asn Asp Lys Arg Phe 325 330 335 Tyr Pro Glu Ser Ser Tyr Lys Ser Thr Pro Val Pro Glu Val Val Gln 340 345 350 Glu Leu Pro Leu Thr Ser Pro Val Asp Asp Phe Arg Gln Pro Arg Tyr 355 360 365 Ser Ser Gly Gly Asn Phe Glu Thr Pro Ser Lys Arg Ala Pro Ala Lys 370 375 380 Gly Arg Ala Gly Arg Ser Lys Arg Thr Glu Gln Asp His Tyr Glu Thr 385 390 395 400 Asp Tyr Thr Thr Gly Gly Glu Ser Cys Asp Glu Leu Glu Glu Asp Trp 405 410 415 Ile Arg Glu Tyr Pro Pro Ile Thr Ser Asp Gln Gln Arg Gln Leu Tyr 420 425 430 Lys Arg Asn Phe Asp Thr Gly Leu Gln Glu Tyr Lys Ser Leu Gln Ser 435 440 445 Glu Leu Asp Glu Ile Asn Lys Glu Leu Ser Arg Leu Asp Lys Glu Leu 450 455 460 Asp Asp Tyr Arg Glu Glu Ser Glu Glu Tyr Met Ala Ala Ala Asp Glu 465 470 475 480 Tyr Asn Arg Leu Lys Gln Val Lys Gly Ser Ala Asp Tyr Lys Ser Lys 485 490 495 Lys Asn His Cys Lys Gln Leu Lys Ser Lys Leu Ser His Ile Lys Lys 500 505 510 Met Val Gly Asp Tyr Asp Arg Gln Lys Thr 515 520 配列番号：４ 配列の長さ：２３７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：ヒト（腸管上皮細胞株Ｔ８４） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１６８．．１７３３ 配列の記述 CTCCCGCGTC CACCTCTCCC TCCCTGCTTC CTCTGGCGGA GGCGGCAGGA ACCGAGAGCC 60 AGGTCCAGAG CGCCGAGGAG CCGGTCTAGG ACGCAGCAGA TTGGTTTATC TTGGAAGCTA 120 AAGGGCATTG CTCATCCTGA AGATCAGCTG ACCATTGACA ATCAGCCATG TCATCCAGGC 180 CTCTTGAAAG TCCACCTCCT TACAGGCCTG ATGAATTCAA ACCGAATCAT TATGCACCAA 240 GCAATGACAT ATATGGTGGA GAGATGCATG TTCGACCAAT GCTCTCTCAG CCAGCCTACT 300 CTTTTTACCC AGAAGATGAA ATTCTTCACT TCTACAAATG GACCTCTCCT CCAGGAGTGA 360 TTCGGATCCT GTCTATGCTC ATTATTGTGA TGTGCATTGC CATCTTTGCC TGTGTGGCCT 420 CCACGCTTGC CTGGGACAGA GGCTATGGAA CTTCCCTTTT AGGAGGTAGT GTAGGCTACC 480 CTTATGGAGG AAGTGGCTTT GGTAGCTACG GAAGTGGCTA TGGCTATGGC TATGGTTATG 540 GCTATGGCTA CGGAGGCTAT ACAGACCCAA GAGCAGCAAA GGGCTTCATG TTGGCCATGG 600 CTGCCTTTTG TTTCATTGCC GCGTTGGTGA TCTTTGTTAC CAGTGTTATA AGATCTGAAA 660 TGTCCAGAAC AAGAAGATAC TACTTAAGTG TGATAATAGT GAGTGCTATC CTGGGCATCA 720 TGGTGTTTAT TGCCACAATT GTCTATATAA TGGGAGTGAA CCCAACTGCT CAGTCTTCTG 780 GATCTCTATA TGGTTCACAA ATATATGCCC TCTGCAACCA ATTTTATACA CCTGCAGCTA 840 CTGGACTCTA CGTGGATCAG TATTTGTATC ACTACTGTGT TGTGGATCCC CAGGAGGCCA 900 TTGCCATTGT ACTGGGGTTC ATGATTATTG TGGCTTTTGC TTTAATAATT TTCTTTGCTG 960 TGAAAACTCG AAGAAAGATG GACAGGTATG ACAAGTCCAA TATTTTGTGG GACAAGGAAC 1020 ACATTTATGA TGAGCAGCCC CCCAATGTCG AGGAGTGGGT TAAAAATGTG TCTGCAGGCA 1080 CACAGGACGT GCCTTCACCC CCATCTGACT ATGTGGAAAG AGTTGACAGT CCCATGGCAT 1140 ACTCTTCCAA TGGCAAAGTG AATGACAAGC GGTTTTATCC AGAGTCTTCC TATAAATCCA 1200 CGCCGGTTCC TGAAGTGGTT CAGGAGCTTC CATTAACTTC GCCTGTGGAT GACTTCAGGC 1260 AGCCTCGTTA CAGCAGCGGT GGTAACTTTG AGACACCTTC AAAAAGAGCA CCTGCAAAGG 1320 GAAGAGCAGG AAGGTCAAAG AGAACAGAGC AAGATCACTA TGAGACAGAC TACACAACTG 1380 GCGGCGAGTC CTGTGATGAG CTGGAGGAGG ACTGGATCAG GGAATATCCA CCTATCACTT 1440 CAGATCAACA AAGACAACTG TACAAGAGGA ATTTTGACAC TGGCCTACAG GAATACAAGA 1500 GCTTACAATC AGAACTTGAT GAGATCAATA AAGAACTCTC CCGTTTGGAT AAAGAATTGG 1560 ATGACTATAG AGAAGAAAGT GAAGAGTACA TGGCTGCTGC TGATGAATAC AATAGACTGA 1620 AGCAAGTGAA GGGATCTGCA GATTACAAAA GTAAGAAGAA TCATTGCAAG CAGTTAAAGA 1680 GCAAATTGTC ACACATCAAG AAGATGGTTG GAGACTATGA TAGACAGAAA ACATAGAAGG 1740 CTGATGCCAA GTTGTTTGAG AAATTAAGTA TCTGACATCT CTGCAATCTT CTCAGAAGGC 1800 AAATGACTTT GGACCATAAC CCCGGAAGCC AAACCTCTGT GAGCATCACA AAGTTTTGGT 1860 TGCTTTAACA TCATCAGTAT TGAAGCATTT TATAAATCGC TTTTGATAAT CAACTGGGCT 1920 GAACACTCCA ATTAAGGATT TTATGCTTTA AACATTGGTT CTTGTATTAA GAATGAAATA 1980 CTGTTTGAGG TTTTTAAGCC TTAAAGGAAG GTTCTGGTGT GAACTAAACT TTCACACCCC 2040 AGACGATGTC TTCATACCTA CATGTATTTG TTTGCATAGG TGATCTCATT TAATCCTCTC 2100 AACCACCTTT CAGATAACTG TTATTTATAA TCACTTTTTT CCACATAAGG AAACTGGGTT 2160 CCTGCAATGA AGTCTCTGAA GTGAAACTGC TTGTTTCCTA GCACACACTT TTGGTTAAGT 2220 CTGTTTTATG ACTTCATTAA TAATAAATTC CCTGGCCTTT CATATTTTAG CTACTATATA 2280 TGTGATGATC TACCAGCCTC CCTATTTTTT TTCTGTTATA TAAATGGTTA AAAGAGGTTT 2340 TTCTTAAATA ATAAAGATCA TGTAAAAGTA AAAAAAAAA 2379 配列番号：５ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の記述 TATGAGACAG ACTACACAAC TGGCGGCGAG TCC 配列番号：６ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の記述 ATCATAGTCT CCAACCATCT TCTTGATGTG

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｍ 33/53 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (56)参考文献 Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．80、ｐｐ．167− 178（1995) Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎ ｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｖｏｌ．20、Ｎ ｏ．６、ｐ．585（1995) Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅ ｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．133, Ｎｏ．１，ｐｐ．43−47 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 C07K 14/47 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に記載のアミノ酸配列を有す
   るマウスオクルディンタンパク質をコードする、配列番
   号２に記載のＤＮＡ。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡを含有するベク
   ター。
3. 【請求項３】 請求項２に記載のベクターを保持する形
   質転換体。
4. 【請求項４】 配列番号１に記載のアミノ酸配列を有す
   るマウスオクルディンタンパク質。
5. 【請求項５】 請求項３に記載の形質転換体を培養し、
   発現産物を回収することを含む、請求項４に記載のタン
   パク質の製造方法。
6. 【請求項６】 配列番号２に記載の塩基配列の全部また
   は一部を含むものからなる、マウスオクルディンタンパ
   ク質をコードするＤＮＡプローブ。
7. 【請求項７】 配列番号２に記載の塩基配列の一部を含
   むものからなる、マウスオクルディンタンパク質をコー
   ドするＤＮＡプライマー。
8. 【請求項８】 請求項４に記載のタンパク質と特異的に
   結合するポリクロナール抗体またはモノクロナール抗
   体。
9. 【請求項９】 請求項７に記載のＤＮＡプライマーを用
   いることを特徴とする生体試料中の請求項１に記載のＤ
   ＮＡ遺伝子の解析方法。
10. 【請求項１０】 請求項６に記載のＤＮＡプローブを用
    いることを特徴とする生体試料中の請求項１に記載のＤ
    ＮＡ遺伝子の解析方法。
11. 【請求項１１】 オクルディンを発現している細胞と被
    検物質を共存させた後、該細胞のオクルディン遺伝子の
    発現量を、請求項９又は１０の方法により解析すること
    を特徴とする、オクルディンの発現に影響を与える薬物
    のスクリーニング方法
12. 【請求項１２】 請求項８に記載の抗体を含むことを特
    徴とする、生体試料中のオクルディン測定試薬。