JP3355038B2 - 白血球分類方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、白血球分類方法に関
し、より詳細には、異なる試薬により処理した白血球を
別々に測定することにより、白血球を５分類する白血球
分類方法に関する。
し、より詳細には、異なる試薬により処理した白血球を
別々に測定することにより、白血球を５分類する白血球
分類方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】これま
でに、白血球分類を行う多くの装置、方法が発表されて
きた。これらの装置では、血液を溶血剤や染色液等で適
当に処理し、物理的及び／又は電気的特性、あるいは光
学的特性に基づいて分類計数を行っている。また、汎用
的に使用されているフローサイトメータでも、白血球分
類が可能なことはよく知られている。
でに、白血球分類を行う多くの装置、方法が発表されて
きた。これらの装置では、血液を溶血剤や染色液等で適
当に処理し、物理的及び／又は電気的特性、あるいは光
学的特性に基づいて分類計数を行っている。また、汎用
的に使用されているフローサイトメータでも、白血球分
類が可能なことはよく知られている。
【０００３】例えば、赤血球を溶解し、白血球を蛍光染
料を用いて染色し、染色された白血球からの蛍光を検出
することによって白血球を分類する方法がある。また、
白血球のサブタイプのうち好塩基球を検出し、他の白血
球のサブタイプを別の検出系で測定し、それぞれの計数
値をもとにして、白血球を５分類する方法が知られてい
る。
料を用いて染色し、染色された白血球からの蛍光を検出
することによって白血球を分類する方法がある。また、
白血球のサブタイプのうち好塩基球を検出し、他の白血
球のサブタイプを別の検出系で測定し、それぞれの計数
値をもとにして、白血球を５分類する方法が知られてい
る。
【０００４】上記のような白血球を５分類できる従来の
装置は、高価であり、また大型の装置である。特に、従
来のフローサイトメータは光源や光電子倍増管（ＰＭ
Ｔ）が高価であり、また光源としてアルゴンレーザを使
用することから、メンテナンス費用が必要であるととも
に、光軸調整なども常に必要である。また、上記の白血
球を５分類する方法では２つの検出系が必要であり、装
置の構成が複雑になる。
装置は、高価であり、また大型の装置である。特に、従
来のフローサイトメータは光源や光電子倍増管（ＰＭ
Ｔ）が高価であり、また光源としてアルゴンレーザを使
用することから、メンテナンス費用が必要であるととも
に、光軸調整なども常に必要である。また、上記の白血
球を５分類する方法では２つの検出系が必要であり、装
置の構成が複雑になる。
【０００５】例えば、従来の２つの角度の前方散乱光を
検出する場合に使用されてきたビームスプリッタとピン
ホールの組み合わせによる検出装置においては、検出さ
れる２つの角度の制限は、ピンホールの形状に依存して
いる。本発明は上記に鑑みなされたものであり、安価で
簡単な構成の装置で、白血球を少なくとも５分類する方
法を提供することを目的としている。
検出する場合に使用されてきたビームスプリッタとピン
ホールの組み合わせによる検出装置においては、検出さ
れる２つの角度の制限は、ピンホールの形状に依存して
いる。本発明は上記に鑑みなされたものであり、安価で
簡単な構成の装置で、白血球を少なくとも５分類する方
法を提供することを目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段及び作用】本発明の方法に
よれば、(i) （ａ）赤血球を溶解しうるが白血球の細胞
膜の一部に損傷を与えるのに十分な量の少なくとも１種
類のイオン性界面活性剤と、（ｂ）白血球内のカチオン
荷電成分と結合して白血球間に形態的差異を与えるのに
十分な量の少なくとも１種類のアニオン基を有する有機
化合物と、（ｃ）ノニオン界面活性剤と、（ｄ）ｐＨ調
整用の緩衝剤とからなる白血球４分類用試薬を全血試料
の一部に加え、細胞の大きさ情報と形態情報とを測定し
て、白血球を少なくともリンパ球、単球及び好酸球にそ
れぞれ対応する３集団と、好中球及び好塩基球に対応す
る１集団との４集団に分類計数し、 (ii)好塩基球測定用試薬を全血試料の他の一部に加え、
少なくとも細胞の大きさ情報を測定して好塩基球を分類
計数し、 (iii) それぞれ得られた計数値に基づいて、白血球を少
なくとも５分類する白血球分類方法が提供される。
よれば、(i) （ａ）赤血球を溶解しうるが白血球の細胞
膜の一部に損傷を与えるのに十分な量の少なくとも１種
類のイオン性界面活性剤と、（ｂ）白血球内のカチオン
荷電成分と結合して白血球間に形態的差異を与えるのに
十分な量の少なくとも１種類のアニオン基を有する有機
化合物と、（ｃ）ノニオン界面活性剤と、（ｄ）ｐＨ調
整用の緩衝剤とからなる白血球４分類用試薬を全血試料
の一部に加え、細胞の大きさ情報と形態情報とを測定し
て、白血球を少なくともリンパ球、単球及び好酸球にそ
れぞれ対応する３集団と、好中球及び好塩基球に対応す
る１集団との４集団に分類計数し、 (ii)好塩基球測定用試薬を全血試料の他の一部に加え、
少なくとも細胞の大きさ情報を測定して好塩基球を分類
計数し、 (iii) それぞれ得られた計数値に基づいて、白血球を少
なくとも５分類する白血球分類方法が提供される。
【０００７】本発明の白血球分類方法の工程(i) におい
て用いられる白血球４分類用試薬のうち、（ａ）のイオ
ン性界面活性剤は、カチオン性界面活性剤及び両性界面
活性剤の少なくとも１種を含有する。カチオン性界面活
性剤としては、４級アンモニウム塩型界面活性剤又はピ
リジニウム塩型界面活性剤が好ましい。４級アンモニウ
ム塩型及びピリジニウム塩型界面活性剤は、
て用いられる白血球４分類用試薬のうち、（ａ）のイオ
ン性界面活性剤は、カチオン性界面活性剤及び両性界面
活性剤の少なくとも１種を含有する。カチオン性界面活
性剤としては、４級アンモニウム塩型界面活性剤又はピ
リジニウム塩型界面活性剤が好ましい。４級アンモニウ
ム塩型及びピリジニウム塩型界面活性剤は、
【０００８】
【化１】
【０００９】〔Ｒ1 及びＲ1’は炭素数６〜１８のアル
キル又はアルケニル基、Ｒ2 及びＲ3は炭素数１〜４の
アルキル又はアルケニル基、Ｒ4 は炭素数１〜４のアル
キル及びアルケニル基又はベンジル基、Ｘはハロゲン原
子である。〕で表される全炭素数９〜３０の界面活性剤
が挙げられる。Ｒ1 及びＲ1’の炭素数６〜１８のアル
キル又はアルケニル基としては、ヘキシル、オクチル、
デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキセニル、ヘプテ
ニル等を挙げることができるが、とりわけオクチル、デ
シル、ドデシル等の直鎖のアルキル基が好ましい。ま
た、Ｒ2 及びＲ3 の炭素数１〜４のアルキル、アルケニ
ル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ブ
テニル等を挙げることができるが、とりわけ、メチル、
エチル、プロピル等の炭素数１〜３のアルキル基が好ま
しい。さらに、Ｒ4 の炭素数１〜４のアルキル及びアル
ケニル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチ
ル、ブテニル等を挙げることができるが、とりわけ、メ
チル、エチル、プロピル等の炭素数１〜３のアルキル基
が好ましい。
キル又はアルケニル基、Ｒ2 及びＲ3は炭素数１〜４の
アルキル又はアルケニル基、Ｒ4 は炭素数１〜４のアル
キル及びアルケニル基又はベンジル基、Ｘはハロゲン原
子である。〕で表される全炭素数９〜３０の界面活性剤
が挙げられる。Ｒ1 及びＲ1’の炭素数６〜１８のアル
キル又はアルケニル基としては、ヘキシル、オクチル、
デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキセニル、ヘプテ
ニル等を挙げることができるが、とりわけオクチル、デ
シル、ドデシル等の直鎖のアルキル基が好ましい。ま
た、Ｒ2 及びＲ3 の炭素数１〜４のアルキル、アルケニ
ル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ブ
テニル等を挙げることができるが、とりわけ、メチル、
エチル、プロピル等の炭素数１〜３のアルキル基が好ま
しい。さらに、Ｒ4 の炭素数１〜４のアルキル及びアル
ケニル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチ
ル、ブテニル等を挙げることができるが、とりわけ、メ
チル、エチル、プロピル等の炭素数１〜３のアルキル基
が好ましい。
【００１０】また、両性界面活性剤としては、例えば、
下記式
下記式
【００１１】
【化２】
【００１２】〔Ｒ1 "、Ｒ2 "及びＲ3 "は上記定義Ｒ1、
Ｒ2、Ｒ3とそれぞれ同じ。〕で表される全炭素数９〜３
０の両性界面活性剤が挙げられる。上記の（ａ）のイオ
ン性界面活性剤は、赤血球を溶解しうるが白血球の細胞
膜の一部に損傷を与えるのに十分な量で使用される。具
体的には、約３０〜５０００ｍｇ／ｌ、より好ましくは
約５０〜３０００ｍｇ／ｌ、さらに好ましくは約１００
〜２０００ｍｇ／ｌであるが、界面活性剤の種類により
適宜調整することができる。各界面活性剤の好適な使用
量を表１に示す。なお、これら界面活性剤は１種又は１
種以上を組み合わせて使用することもできる。
Ｒ2、Ｒ3とそれぞれ同じ。〕で表される全炭素数９〜３
０の両性界面活性剤が挙げられる。上記の（ａ）のイオ
ン性界面活性剤は、赤血球を溶解しうるが白血球の細胞
膜の一部に損傷を与えるのに十分な量で使用される。具
体的には、約３０〜５０００ｍｇ／ｌ、より好ましくは
約５０〜３０００ｍｇ／ｌ、さらに好ましくは約１００
〜２０００ｍｇ／ｌであるが、界面活性剤の種類により
適宜調整することができる。各界面活性剤の好適な使用
量を表１に示す。なお、これら界面活性剤は１種又は１
種以上を組み合わせて使用することもできる。
【００１３】
【表１】
【００１４】つまり、イオン性界面活性剤は、特に白血
球に対して後述する有機化合物を通過できる程度の細孔
を開ける程度の溶血力でよく、細胞を裸核化するような
強力な溶血力は必要ではない。従って、通常使用される
カチオン性界面活性剤（例えば、ＬＴＡＣ，ＭＴＡＢ，
ＣＴＡＣ）が使用可能であるが、溶血力を抑制するため
に、通常、白血球を裸核化する際に用いられる量より
も、はるかに少ない量が好適である。また、細胞膜の一
部を引き抜くだけでよいために、溶血力の小さい界面活
性剤も使用できる。界面活性剤の溶血作用は、疎水基の
炭素数と比例関係にあり、炭素数が多いほど溶血力は強
くなることから、溶血力の低い、例えばＤＴＡＢ，ＯＴ
ＡＢなどのカチオン性界面活性剤あるいは両性界面活性
剤が好適に用いられる。
球に対して後述する有機化合物を通過できる程度の細孔
を開ける程度の溶血力でよく、細胞を裸核化するような
強力な溶血力は必要ではない。従って、通常使用される
カチオン性界面活性剤（例えば、ＬＴＡＣ，ＭＴＡＢ，
ＣＴＡＣ）が使用可能であるが、溶血力を抑制するため
に、通常、白血球を裸核化する際に用いられる量より
も、はるかに少ない量が好適である。また、細胞膜の一
部を引き抜くだけでよいために、溶血力の小さい界面活
性剤も使用できる。界面活性剤の溶血作用は、疎水基の
炭素数と比例関係にあり、炭素数が多いほど溶血力は強
くなることから、溶血力の低い、例えばＤＴＡＢ，ＯＴ
ＡＢなどのカチオン性界面活性剤あるいは両性界面活性
剤が好適に用いられる。
【００１５】上記白血球４分類用試薬は、イオン性界面
活性剤の他に、さらに、白血球内のカチオン荷電成分と
結合して白血球間に、形態的差異を与えるアニオン基を
有する（ｂ）有機化合物を含有する。すなわち、疎水性
基（例えば芳香族からなる基、炭素数６以上の炭化水素
からなる基及び炭素数６以上の複素環等）と酸性官能基
（アニオン基：カルボキシル基、スルホン酸基等）とを
有し、かつ水溶液中で陰電荷を帯び、白血球と結合する
ことにより白血球の形態を変化させる物質を挙げること
ができる。その種類については、特に限定されるもので
はなく、ほとんど全ての酸性色素が使用可能である。ま
た、吸光度や蛍光強度を測定する必要がないため、色素
以外の有機化合物も使用可能である。酸性色素の例とし
ては、アミドブラック[Colour Index No. 20470]、アリ
ザリンシアニングリーンＦ[CI No. 61570]、アシッドグ
リーン２７[CI No. 61580]、アシッドブルー６２[CI N
o.62045]、ダイレクトレッド３１[CI No. 29100]、ブリ
リアント・サルファフラビン[CI No. 56205]、アリザリ
ンイエローＲ[CI No. 14030]、アシッドブルー１２９[C
I No. 62058]、アシッドグリーン２５[CI No. 61570]、
クロモトロープ２Ｒ[CI No. 16570]、コーマシー・ブリ
リアントブルーＲ２５０[CI No. 42660]、カルミン酸[C
I No. 75470]、コーマシー・ブリリアントブルーＧ２５
０[CI No. 42655]、カルモイシンＢ[CI No. 14720]、ダ
イレクトブルー８６[CI No. 74180]、エチルレッド [２
−（４−ジエチルアミノフェニルアゾ）ベンゾイックア
シッド] 、パラ・ロザリニン[CI No. 42500]、ビオラミ
ンＲ[CI No. 45190]、アシッド・イエロー３４[CI No.
18890]、アシッド・オレンジ５１[CI No. 26550]、ブリ
リアント・クロセインＭＯＯ[CI No. 27290]、グイネア
グリーンＢ[CI No. 42085]、アシッドブルー２９[CI N
o. 20460]、ロダミンＢ[CI No. 45170]、スルホロダミ
ンＢ[CI No. 45100]、リザミングリーンＢ[CI No. 4409
0]、アシッドブルー９[CI No. 42090]、ファーストグリ
ーンＦＣＦ[CI No. 42053]、アゾカルミンＢ[CI No. 50
090]、アニリンブルー[CI No. 42780]、アルファズリン
Ａ[CI No. 42080]、アリザリンバイオレット３Ｒ[CI N
o. 61710]、アシッドブルー４１[CI No. 62130]、バイ
ブリッヒスカーレット[CI No. 26905]、エリスロシンＢ
[CI No.45430]、メチルレッド[CI No. 13020]、メチル
オレンジ[CI No. 13025]、オレンジＩ[CI No. 14600]等
の酸性色素から選ばれた少なくとも１つが挙げられる。
また、色素以外の有機化合物の例としては、疎水性の官
能基と酸性官能基とを有する芳香族有機酸、炭素数６以
上の炭化水素及び複素環を有する酸等が使用できる。具
体的には、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸又
はその塩類、６−（ｐ−トルイジノ）−２−ナフタレン
スルホン酸又はその塩類、クロモトロプ酸、フタル酸、
ナフタレンスルホン酸等を挙げることができる。これら
有機化合物の使用量は、使用する界面活性剤の種類等に
より適宜選択できるが、５０〜５０００ｍｇ／ｌが好ま
しく、さらに、１００〜３０００ｍｇ／ｌが好ましい。
活性剤の他に、さらに、白血球内のカチオン荷電成分と
結合して白血球間に、形態的差異を与えるアニオン基を
有する（ｂ）有機化合物を含有する。すなわち、疎水性
基（例えば芳香族からなる基、炭素数６以上の炭化水素
からなる基及び炭素数６以上の複素環等）と酸性官能基
（アニオン基：カルボキシル基、スルホン酸基等）とを
有し、かつ水溶液中で陰電荷を帯び、白血球と結合する
ことにより白血球の形態を変化させる物質を挙げること
ができる。その種類については、特に限定されるもので
はなく、ほとんど全ての酸性色素が使用可能である。ま
た、吸光度や蛍光強度を測定する必要がないため、色素
以外の有機化合物も使用可能である。酸性色素の例とし
ては、アミドブラック[Colour Index No. 20470]、アリ
ザリンシアニングリーンＦ[CI No. 61570]、アシッドグ
リーン２７[CI No. 61580]、アシッドブルー６２[CI N
o.62045]、ダイレクトレッド３１[CI No. 29100]、ブリ
リアント・サルファフラビン[CI No. 56205]、アリザリ
ンイエローＲ[CI No. 14030]、アシッドブルー１２９[C
I No. 62058]、アシッドグリーン２５[CI No. 61570]、
クロモトロープ２Ｒ[CI No. 16570]、コーマシー・ブリ
リアントブルーＲ２５０[CI No. 42660]、カルミン酸[C
I No. 75470]、コーマシー・ブリリアントブルーＧ２５
０[CI No. 42655]、カルモイシンＢ[CI No. 14720]、ダ
イレクトブルー８６[CI No. 74180]、エチルレッド [２
−（４−ジエチルアミノフェニルアゾ）ベンゾイックア
シッド] 、パラ・ロザリニン[CI No. 42500]、ビオラミ
ンＲ[CI No. 45190]、アシッド・イエロー３４[CI No.
18890]、アシッド・オレンジ５１[CI No. 26550]、ブリ
リアント・クロセインＭＯＯ[CI No. 27290]、グイネア
グリーンＢ[CI No. 42085]、アシッドブルー２９[CI N
o. 20460]、ロダミンＢ[CI No. 45170]、スルホロダミ
ンＢ[CI No. 45100]、リザミングリーンＢ[CI No. 4409
0]、アシッドブルー９[CI No. 42090]、ファーストグリ
ーンＦＣＦ[CI No. 42053]、アゾカルミンＢ[CI No. 50
090]、アニリンブルー[CI No. 42780]、アルファズリン
Ａ[CI No. 42080]、アリザリンバイオレット３Ｒ[CI N
o. 61710]、アシッドブルー４１[CI No. 62130]、バイ
ブリッヒスカーレット[CI No. 26905]、エリスロシンＢ
[CI No.45430]、メチルレッド[CI No. 13020]、メチル
オレンジ[CI No. 13025]、オレンジＩ[CI No. 14600]等
の酸性色素から選ばれた少なくとも１つが挙げられる。
また、色素以外の有機化合物の例としては、疎水性の官
能基と酸性官能基とを有する芳香族有機酸、炭素数６以
上の炭化水素及び複素環を有する酸等が使用できる。具
体的には、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸又
はその塩類、６−（ｐ−トルイジノ）−２−ナフタレン
スルホン酸又はその塩類、クロモトロプ酸、フタル酸、
ナフタレンスルホン酸等を挙げることができる。これら
有機化合物の使用量は、使用する界面活性剤の種類等に
より適宜選択できるが、５０〜５０００ｍｇ／ｌが好ま
しく、さらに、１００〜３０００ｍｇ／ｌが好ましい。
【００１６】また、上記白血球４分類用試薬は、さら
に、（ｃ）ノニオン界面活性剤を含有する。ノニオン界
面活性剤としては、特に限定されるものではなく、一般
に可溶化剤として用いられているほとんど全てのノニオ
ン性界面活性剤を使用することができる。具体的には、
ポリオキシエチレングリコール（ＰＯＥ）、ポリプロピ
レングリコール（ＰＯＰ）、ポリオキシエチレングリコ
ール−ポリプロピレングリコール（ＰＯＥ−ＰＯＰ）ブ
ロック共重合体を親水基として有するノニオン性界面活
性剤が好適である。１種類のノニオン性界面活性剤を使
用した場合には、イオン性界面活性剤と前記有機化合物
との結合により形成される不溶化物及び細胞構成成分と
イオン性界面活性剤との結合により形成される不溶化物
を可溶化する効果と共に、白血球をも溶解する副作用が
でる場合がある。この場合には、複数のノニオン性界面
活性剤、例えば、親水基の付加重合モル数の異なるノニ
オン性界面活性剤を組み合わせることが好ましい。ある
いは、親油基の構造の異なるノニオン性界面活性剤を組
み合わせて使用すると副作用を抑制することができる。
不溶化物を可溶化するのに必要なノニオン性界面活性剤
の量は、用いるイオン性界面活性剤の種類によって異な
るが、０．５〜１０ｇ／リットル、好ましくは１〜８ｇ
／リットルである。
に、（ｃ）ノニオン界面活性剤を含有する。ノニオン界
面活性剤としては、特に限定されるものではなく、一般
に可溶化剤として用いられているほとんど全てのノニオ
ン性界面活性剤を使用することができる。具体的には、
ポリオキシエチレングリコール（ＰＯＥ）、ポリプロピ
レングリコール（ＰＯＰ）、ポリオキシエチレングリコ
ール−ポリプロピレングリコール（ＰＯＥ−ＰＯＰ）ブ
ロック共重合体を親水基として有するノニオン性界面活
性剤が好適である。１種類のノニオン性界面活性剤を使
用した場合には、イオン性界面活性剤と前記有機化合物
との結合により形成される不溶化物及び細胞構成成分と
イオン性界面活性剤との結合により形成される不溶化物
を可溶化する効果と共に、白血球をも溶解する副作用が
でる場合がある。この場合には、複数のノニオン性界面
活性剤、例えば、親水基の付加重合モル数の異なるノニ
オン性界面活性剤を組み合わせることが好ましい。ある
いは、親油基の構造の異なるノニオン性界面活性剤を組
み合わせて使用すると副作用を抑制することができる。
不溶化物を可溶化するのに必要なノニオン性界面活性剤
の量は、用いるイオン性界面活性剤の種類によって異な
るが、０．５〜１０ｇ／リットル、好ましくは１〜８ｇ
／リットルである。
【００１７】上記白血球４分類用試薬は、さらに、
（ｄ）ｐＨ調整用の緩衝剤を含有している。緩衝剤とし
ては、通常、ｐＨを一定に維持するために用いる物であ
れば特に限定されるものではなく、所定のｐＨ±２．０
にｐＫａをもつ緩衝剤を使用することができる。具体的
にはＭＥＳ、ＴＲＩＳ，ＨＥＰＥＳ、コハク酸、フタル
酸、クエン酸緩衝液等が挙げられる。本発明において
は、ｐＨ５〜１１の範囲に調製されることが好ましい。
この際の使用量は、５〜１００ｍＭ程度である。
（ｄ）ｐＨ調整用の緩衝剤を含有している。緩衝剤とし
ては、通常、ｐＨを一定に維持するために用いる物であ
れば特に限定されるものではなく、所定のｐＨ±２．０
にｐＫａをもつ緩衝剤を使用することができる。具体的
にはＭＥＳ、ＴＲＩＳ，ＨＥＰＥＳ、コハク酸、フタル
酸、クエン酸緩衝液等が挙げられる。本発明において
は、ｐＨ５〜１１の範囲に調製されることが好ましい。
この際の使用量は、５〜１００ｍＭ程度である。
【００１８】さらに、上記白血球４分類用試薬は、アル
コール又は金属塩類を含有していてもよい。アルコール
としては、特に限定されるものではなく、工業的に安価
で入手容易なアルコールが好ましい。例えば、メチルア
ルコール、エチルアルコール等のアルカノール、フェネ
チルアルコール、２−フェノキシエタノール等の芳香環
を有するアルコールなどを挙げることができる。この際
の使用量は、メチルアルコールでは、試薬組成物全量に
対して５〜２０％程度の量が好ましく、大まかな目安と
して炭素数が１つ増えるごとに約半分の量が好ましい。
また、２−フェノキシエタノールでは、０．０５〜１％
が好ましい。金属塩類としては、特に限定されるもので
はなく、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化
リチウム等のアルカリ金属塩が好適である。アルカリ金
属塩は、通常必要ないが、後述するように電気抵抗信号
を用いて、測定を行う装置では、試料の電気伝導度を、
測定を行うのに好適な値に調整するために必要である。
この際の使用量は、溶液の電気伝導度が５〜２０ｍＳ／
ｃｍの範囲にする量が好ましい。
コール又は金属塩類を含有していてもよい。アルコール
としては、特に限定されるものではなく、工業的に安価
で入手容易なアルコールが好ましい。例えば、メチルア
ルコール、エチルアルコール等のアルカノール、フェネ
チルアルコール、２−フェノキシエタノール等の芳香環
を有するアルコールなどを挙げることができる。この際
の使用量は、メチルアルコールでは、試薬組成物全量に
対して５〜２０％程度の量が好ましく、大まかな目安と
して炭素数が１つ増えるごとに約半分の量が好ましい。
また、２−フェノキシエタノールでは、０．０５〜１％
が好ましい。金属塩類としては、特に限定されるもので
はなく、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化
リチウム等のアルカリ金属塩が好適である。アルカリ金
属塩は、通常必要ないが、後述するように電気抵抗信号
を用いて、測定を行う装置では、試料の電気伝導度を、
測定を行うのに好適な値に調整するために必要である。
この際の使用量は、溶液の電気伝導度が５〜２０ｍＳ／
ｃｍの範囲にする量が好ましい。
【００１９】上記白血球４分類用試薬は、水又は水性媒
体に上記イオン性界面活性剤と、有機化合物と、ノニオ
ン界面活性剤と、緩衝剤とが、所望の量で含有されてい
るものであり、この白血球分析用試薬を、血液試料１容
量に対して２〜１００容量で用いることが好ましい。本
発明の白血球分類方法の工程(ii)において用いられる好
塩基球測定試薬としては、特に限定されるものではない
が、例えば、（１）ポリオキシエチレンの付加重合モル
数が３〜１０の少なくとも１種のノニオン性界面活性剤
と、（２）少なくとも１種のカチオン性界面活性剤と、
（３）ｐＨを２．５〜４．０にするための緩衝剤とから
なる白血球分析用試薬があげられる。
体に上記イオン性界面活性剤と、有機化合物と、ノニオ
ン界面活性剤と、緩衝剤とが、所望の量で含有されてい
るものであり、この白血球分析用試薬を、血液試料１容
量に対して２〜１００容量で用いることが好ましい。本
発明の白血球分類方法の工程(ii)において用いられる好
塩基球測定試薬としては、特に限定されるものではない
が、例えば、（１）ポリオキシエチレンの付加重合モル
数が３〜１０の少なくとも１種のノニオン性界面活性剤
と、（２）少なくとも１種のカチオン性界面活性剤と、
（３）ｐＨを２．５〜４．０にするための緩衝剤とから
なる白血球分析用試薬があげられる。
【００２０】上記好塩基球測定試薬に含有される（１）
ノニオン性界面活性剤としては、以下の構造式で表され
るものを用いることができる。 Ｒ1a−Ｒ2a−（ＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ）n −Ｈ [式中、Ｒ1aは炭素数８〜１８のアルキル基又はアルケ
ニル基、Ｒ2aは−Ｏ−又は−（Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ−、ｎは
ポリオキシエチレンの平均付加重合モル数で３〜１０の
実数] 。
ノニオン性界面活性剤としては、以下の構造式で表され
るものを用いることができる。 Ｒ1a−Ｒ2a−（ＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ）n −Ｈ [式中、Ｒ1aは炭素数８〜１８のアルキル基又はアルケ
ニル基、Ｒ2aは−Ｏ−又は−（Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ−、ｎは
ポリオキシエチレンの平均付加重合モル数で３〜１０の
実数] 。
【００２１】上記式において、炭素数８〜１８のアルキ
ル基又はアルケニル基としては、例えば、オクチル、ノ
ニル、デシル、ウンデシル、ラウリル（ドデシル）、ト
リデシル、ミリスチル（テトラデシル）、ペンタデシ
ル、セチル（ヘキサデシル）、ヘプタデシル、ステアリ
ル（オクタデシル）等を挙げることができる。中でも、
ドデシルが好ましい。
ル基又はアルケニル基としては、例えば、オクチル、ノ
ニル、デシル、ウンデシル、ラウリル（ドデシル）、ト
リデシル、ミリスチル（テトラデシル）、ペンタデシ
ル、セチル（ヘキサデシル）、ヘプタデシル、ステアリ
ル（オクタデシル）等を挙げることができる。中でも、
ドデシルが好ましい。
【００２２】ノニオン性界面活性剤の具体的な例として
は、ポリオキシエチレン（４．２）ドデシルエーテル
（ＢＬ４．２、日光ケミカルズ（株））、ポリオキシエ
チレン（９）ドデシルエーテル（ＢＬ９、日光ケミカル
ズ（株））、ポリオキシエチレン（５）ドデシルエーテ
ル（日光ケミカルズ（株））、ポリオキシエチレン
（５．５）セチルエーテル（日光ケミカルズ（株））、
ポリオキシエチレン（７）セチルエーテル（日光ケミカ
ルズ（株））、ポリオキシエチレン（７）オレイルエー
テル（日光ケミカルズ（株））等を挙げることができ
る。
は、ポリオキシエチレン（４．２）ドデシルエーテル
（ＢＬ４．２、日光ケミカルズ（株））、ポリオキシエ
チレン（９）ドデシルエーテル（ＢＬ９、日光ケミカル
ズ（株））、ポリオキシエチレン（５）ドデシルエーテ
ル（日光ケミカルズ（株））、ポリオキシエチレン
（５．５）セチルエーテル（日光ケミカルズ（株））、
ポリオキシエチレン（７）セチルエーテル（日光ケミカ
ルズ（株））、ポリオキシエチレン（７）オレイルエー
テル（日光ケミカルズ（株））等を挙げることができ
る。
【００２３】ノニオン性界面活性剤は、３００〜２００
００ｍｇ／ｌの濃度で使用でき、より好ましくは５００
〜１００００ｍｇ／ｌである。具体的には、ポリオキシ
エチレン（３〜１０）ドデシルエーテルを５００〜８０
００ｍｇ／ｌで使用することが好ましい。濃度が低すぎ
る場合、好塩基球以外の顆粒球を完全に裸核化できず、
濃度が高すぎる場合は、カチオン性界面活性剤による好
塩基球以外の顆粒球の裸核化を阻害する。上記以外のノ
ニオン性界面活性剤では、例えば、ポリオキシエチレン
の付加重合モル数が大きすぎる場合、好塩基球以外の顆
粒球を完全に裸核化できない。また、ポリオキシエチレ
ンの付加重合モル数が小さすぎる場合、水に溶解しにく
くなり使用が困難になる。
００ｍｇ／ｌの濃度で使用でき、より好ましくは５００
〜１００００ｍｇ／ｌである。具体的には、ポリオキシ
エチレン（３〜１０）ドデシルエーテルを５００〜８０
００ｍｇ／ｌで使用することが好ましい。濃度が低すぎ
る場合、好塩基球以外の顆粒球を完全に裸核化できず、
濃度が高すぎる場合は、カチオン性界面活性剤による好
塩基球以外の顆粒球の裸核化を阻害する。上記以外のノ
ニオン性界面活性剤では、例えば、ポリオキシエチレン
の付加重合モル数が大きすぎる場合、好塩基球以外の顆
粒球を完全に裸核化できない。また、ポリオキシエチレ
ンの付加重合モル数が小さすぎる場合、水に溶解しにく
くなり使用が困難になる。
【００２４】また、（２）カチオン性界面活性剤として
は、以下の構造を有する四級アンモニウム塩とピリジニ
ウム塩型界面活性剤とからなる群から選ばれるカチオン
性界面活性剤の少なくとも１種を含有する。
は、以下の構造を有する四級アンモニウム塩とピリジニ
ウム塩型界面活性剤とからなる群から選ばれるカチオン
性界面活性剤の少なくとも１種を含有する。
【００２５】
【化３】
【００２６】[式中Ｒ1bは炭素数１０〜１８のアルキル
基又はアルケニル基、Ｒ2b、Ｒ3b又はＲ4bは炭素数１〜
３のアルキル基又はアルケニル基、Ｘはハロゲン] 又は
基又はアルケニル基、Ｒ2b、Ｒ3b又はＲ4bは炭素数１〜
３のアルキル基又はアルケニル基、Ｘはハロゲン] 又は
【化４】 [式中Ｒ1cは上記Ｒ1bと同意味、Ｘは上記と同意味] 上記式において、炭素数１０〜１８のアルキル基又はア
ルケニル基としては、例えば、デシル、ウンデシル、ラ
ウリル（ドデシル）、トリデシル、ミリスチル（テトラ
デシル）、ペンタデシル、セチル（ヘキサデシル）、ヘ
プタデシル、ステアリル（オクタデシル）等を挙げるこ
とができる。中でも、デシル、ラウリル、ミリスチル、
セチル又はステアリル等が好ましい。
ルケニル基としては、例えば、デシル、ウンデシル、ラ
ウリル（ドデシル）、トリデシル、ミリスチル（テトラ
デシル）、ペンタデシル、セチル（ヘキサデシル）、ヘ
プタデシル、ステアリル（オクタデシル）等を挙げるこ
とができる。中でも、デシル、ラウリル、ミリスチル、
セチル又はステアリル等が好ましい。
【００２７】また、炭素数１〜３のアルキル基又はアル
ケニル基としては、メチル、エチル、プロピル、エチニ
ル、プロピニル等が挙げられる。カチオンの具体例とし
ては、デシルトリメチルアンモニウム、ラウリルトリメ
チルアンモニウム、ミスチルトリメチルアンモニウム、
セチルトリメチルアンモニウム、セチルジメチルエチル
アンモニウム、ラウリルジメチルエチルアンモニウム、
ミスチルジメチルアンモニウム、ラウリルピリジニウ
ム、セチルピリジニウム等が挙げられる。
ケニル基としては、メチル、エチル、プロピル、エチニ
ル、プロピニル等が挙げられる。カチオンの具体例とし
ては、デシルトリメチルアンモニウム、ラウリルトリメ
チルアンモニウム、ミスチルトリメチルアンモニウム、
セチルトリメチルアンモニウム、セチルジメチルエチル
アンモニウム、ラウリルジメチルエチルアンモニウム、
ミスチルジメチルアンモニウム、ラウリルピリジニウ
ム、セチルピリジニウム等が挙げられる。
【００２８】さらに、ハロゲンとしては、フッ素、塩
素、臭素、ヨウ素等が挙げられる。上記のカチオン性界
面活性剤は、赤血球、血小板をほぼ完全に溶解し、少な
くとも好塩基球以外の顆粒球をほぼ裸核化させるのに充
分な濃度で使用される。この濃度は、例えば、通常の光
学顕微鏡で裸核化の状態を観察することによって、好適
な濃度が簡単に決定される。具体的には、約１００ｍｇ
／ｌ〜１００００ｍｇ／ｌ、より好ましくは３００ｍｇ
／ｌ〜５０００ｍｇ／ｌの濃度であるが、カチオン性界
面活性剤の種類により、適宜調製することができる。少
なすぎると、赤血球、血小板を完全に溶解できず、ま
た、過剰量のカチオン性界面活性剤の存在は、単核球の
裸核化をも促進するため好ましくない。
素、臭素、ヨウ素等が挙げられる。上記のカチオン性界
面活性剤は、赤血球、血小板をほぼ完全に溶解し、少な
くとも好塩基球以外の顆粒球をほぼ裸核化させるのに充
分な濃度で使用される。この濃度は、例えば、通常の光
学顕微鏡で裸核化の状態を観察することによって、好適
な濃度が簡単に決定される。具体的には、約１００ｍｇ
／ｌ〜１００００ｍｇ／ｌ、より好ましくは３００ｍｇ
／ｌ〜５０００ｍｇ／ｌの濃度であるが、カチオン性界
面活性剤の種類により、適宜調製することができる。少
なすぎると、赤血球、血小板を完全に溶解できず、ま
た、過剰量のカチオン性界面活性剤の存在は、単核球の
裸核化をも促進するため好ましくない。
【００２９】各カチオン性界面活性剤種類及びその好適
な量を表２に示す。なお、これらの界面活性剤は１種又
はそれ以上を組み合わせて使用することもできる。
な量を表２に示す。なお、これらの界面活性剤は１種又
はそれ以上を組み合わせて使用することもできる。
【００３０】
【表２】
【００３１】カチオン性界面活性剤の種類は特に限定さ
れるものではないが、前述の構造式で示されるカチオン
性界面活性剤が好適である。カチオン性界面活性剤の溶
血力は、その主鎖の長さに依存している。主鎖の長いも
のは、溶血力が強く、従って少量で効果が得られる。上
記好塩基球測定試薬のpHは、（３）緩衝剤によって２．
５〜４．０、好ましくは３．０〜４．０の範囲に保たれ
る。pHが2.5 未満の場合、幼若顆粒球、単核球が裸核化
しやすくなり、各白血球を弁別することが困難になる。
pHが4.0 を越える場合は、白血球を収縮、裸核化させる
ことが困難になり、かつ、赤血球、血小板の収縮、溶解
が困難になる。本試薬で用いられる緩衝剤は特に限定さ
れず、pKa が２．０〜５．０の範囲にある緩衝剤が好適
に使用できる。例えば、クエン酸、リンゴ酸、ジグリコ
ール酸、コハク酸、ギ酸、酒石酸などが好適に使用でき
る。
れるものではないが、前述の構造式で示されるカチオン
性界面活性剤が好適である。カチオン性界面活性剤の溶
血力は、その主鎖の長さに依存している。主鎖の長いも
のは、溶血力が強く、従って少量で効果が得られる。上
記好塩基球測定試薬のpHは、（３）緩衝剤によって２．
５〜４．０、好ましくは３．０〜４．０の範囲に保たれ
る。pHが2.5 未満の場合、幼若顆粒球、単核球が裸核化
しやすくなり、各白血球を弁別することが困難になる。
pHが4.0 を越える場合は、白血球を収縮、裸核化させる
ことが困難になり、かつ、赤血球、血小板の収縮、溶解
が困難になる。本試薬で用いられる緩衝剤は特に限定さ
れず、pKa が２．０〜５．０の範囲にある緩衝剤が好適
に使用できる。例えば、クエン酸、リンゴ酸、ジグリコ
ール酸、コハク酸、ギ酸、酒石酸などが好適に使用でき
る。
【００３２】緩衝剤の濃度は特に限定されず、pHを所定
のpH範囲に調整できる濃度が使用できる。通常５〜５０
ｍＭが好適に使用される。本発明で用いる好塩基球測定
用試薬においては、上記に示したノニオン性界面活性
剤、カチオン性界面活性剤及び緩衝剤を適宜選択し、所
望の割合で混合することにより調製することができる。
中でも、DTAB，ＢＬ４．２及びクエン酸を組み合わせた
試薬、LTAC，ＢＬ４．２及びクエン酸を組み合わせた試
薬、MTAB，ＢＬ４．２及びクエン酸を組み合わせた試
薬、CTAC，ＢＬ４．２及びクエン酸を組み合わせた試
薬、STAC，ＢＬ４．２及びクエン酸を組み合わせた試
薬、CDMEB,ＢＬ４．２及びクエン酸を組み合わせた試
薬、CPyC，ＢＬ４．２及びクエン酸を組み合わせた試
薬、DTAB，ＢＬ９及びクエン酸を組み合わせた試薬、LT
AC，ＢＬ９及びクエン酸を組み合わせた試薬、MTAB，Ｂ
Ｌ９及びクエン酸を組み合わせた試薬、CTAC，ＢＬ９及
びクエン酸を組み合わせた試薬、STAC，ＢＬ９及びクエ
ン酸を組み合わせた試薬、CDMEB,ＢＬ９及びクエン酸を
組み合わせた試薬、CPyC，ＢＬ９及びクエン酸を組み合
わせた試薬、DTAB，ＢＬ４．２及びコハク酸を組み合わ
せた試薬、LTAC，ＢＬ４．２及びコハク酸を組み合わせ
た試薬、MTAB，ＢＬ４．２及びコハク酸を組み合わせた
試薬、CTAC，ＢＬ４．２及びコハク酸を組み合わせた試
薬、STAC，ＢＬ４．２及びコハク酸を組み合わせた試
薬、CDMEB,ＢＬ４．２及びコハク酸を組み合わせた試
薬、CPyC，ＢＬ４．２及びコハク酸を組み合わせた試
薬、DTAB，ＢＬ９及びコハク酸を組み合わせた試薬、LT
AC，ＢＬ９及びコハク酸を組み合わせた試薬、MTAB，Ｂ
Ｌ９及びコハク酸を組み合わせた試薬、CTAC，ＢＬ９及
びコハク酸を組み合わせた試薬、STAC，ＢＬ９及びコハ
ク酸を組み合わせた試薬、CDMEB,ＢＬ９及びコハク酸を
組み合わせた試薬、CPyC，ＢＬ９及びコハク酸を組み合
わせた試薬等が好ましい。
のpH範囲に調整できる濃度が使用できる。通常５〜５０
ｍＭが好適に使用される。本発明で用いる好塩基球測定
用試薬においては、上記に示したノニオン性界面活性
剤、カチオン性界面活性剤及び緩衝剤を適宜選択し、所
望の割合で混合することにより調製することができる。
中でも、DTAB，ＢＬ４．２及びクエン酸を組み合わせた
試薬、LTAC，ＢＬ４．２及びクエン酸を組み合わせた試
薬、MTAB，ＢＬ４．２及びクエン酸を組み合わせた試
薬、CTAC，ＢＬ４．２及びクエン酸を組み合わせた試
薬、STAC，ＢＬ４．２及びクエン酸を組み合わせた試
薬、CDMEB,ＢＬ４．２及びクエン酸を組み合わせた試
薬、CPyC，ＢＬ４．２及びクエン酸を組み合わせた試
薬、DTAB，ＢＬ９及びクエン酸を組み合わせた試薬、LT
AC，ＢＬ９及びクエン酸を組み合わせた試薬、MTAB，Ｂ
Ｌ９及びクエン酸を組み合わせた試薬、CTAC，ＢＬ９及
びクエン酸を組み合わせた試薬、STAC，ＢＬ９及びクエ
ン酸を組み合わせた試薬、CDMEB,ＢＬ９及びクエン酸を
組み合わせた試薬、CPyC，ＢＬ９及びクエン酸を組み合
わせた試薬、DTAB，ＢＬ４．２及びコハク酸を組み合わ
せた試薬、LTAC，ＢＬ４．２及びコハク酸を組み合わせ
た試薬、MTAB，ＢＬ４．２及びコハク酸を組み合わせた
試薬、CTAC，ＢＬ４．２及びコハク酸を組み合わせた試
薬、STAC，ＢＬ４．２及びコハク酸を組み合わせた試
薬、CDMEB,ＢＬ４．２及びコハク酸を組み合わせた試
薬、CPyC，ＢＬ４．２及びコハク酸を組み合わせた試
薬、DTAB，ＢＬ９及びコハク酸を組み合わせた試薬、LT
AC，ＢＬ９及びコハク酸を組み合わせた試薬、MTAB，Ｂ
Ｌ９及びコハク酸を組み合わせた試薬、CTAC，ＢＬ９及
びコハク酸を組み合わせた試薬、STAC，ＢＬ９及びコハ
ク酸を組み合わせた試薬、CDMEB,ＢＬ９及びコハク酸を
組み合わせた試薬、CPyC，ＢＬ９及びコハク酸を組み合
わせた試薬等が好ましい。
【００３３】また、上記好塩基球測定用試薬において
は、さらに金属塩を加えてもよい。通常、金属塩は必要
ないが、電気インピーダンス信号を検出することによっ
て測定を行う装置を用い、試料の電気伝導度が低い場合
に測定を行うために好適な値に調整するために必要とな
るからである。使用することができる金属塩としては、
特に限定されるものではなく、例えば、塩化ナトリウ
ム、塩化カリウム、塩化リチウムなどのアルカリ金属塩
が好適である。この際の使用量は、溶液の電気伝導度が
３〜２０ｍＳ／ｃｍの範囲にする量が好ましい。
は、さらに金属塩を加えてもよい。通常、金属塩は必要
ないが、電気インピーダンス信号を検出することによっ
て測定を行う装置を用い、試料の電気伝導度が低い場合
に測定を行うために好適な値に調整するために必要とな
るからである。使用することができる金属塩としては、
特に限定されるものではなく、例えば、塩化ナトリウ
ム、塩化カリウム、塩化リチウムなどのアルカリ金属塩
が好適である。この際の使用量は、溶液の電気伝導度が
３〜２０ｍＳ／ｃｍの範囲にする量が好ましい。
【００３４】さらに、上記好塩基球測定用試薬を用いて
白血球を分類するには、本発明の試薬と血液試料とを混
合するだけの簡単な操作で測定試料を調製することがで
きる。試薬と血液試料との混合は、試薬を構成する成分
と血液試料とがほぼ同時に接触することが好ましいが、
試薬の構成成分の種類又は濃度等により、順次血液試料
と混合してもよい。血液試料と本発明の試薬との混合比
は特に限定されないが、１：２〜１：１００程度の比率
で混合することが好適である。反応はほぼ瞬時に進行
し、混合後約１０秒から少なくとも１２０秒程度まで安
定して測定することができる。反応温度は、１０〜４０
℃程度までは特に問題なく測定することができる。反応
温度が高い場合は、幾分短い時間で、低い場合は、幾分
長い時間で反応を行うことが必要である。
白血球を分類するには、本発明の試薬と血液試料とを混
合するだけの簡単な操作で測定試料を調製することがで
きる。試薬と血液試料との混合は、試薬を構成する成分
と血液試料とがほぼ同時に接触することが好ましいが、
試薬の構成成分の種類又は濃度等により、順次血液試料
と混合してもよい。血液試料と本発明の試薬との混合比
は特に限定されないが、１：２〜１：１００程度の比率
で混合することが好適である。反応はほぼ瞬時に進行
し、混合後約１０秒から少なくとも１２０秒程度まで安
定して測定することができる。反応温度は、１０〜４０
℃程度までは特に問題なく測定することができる。反応
温度が高い場合は、幾分短い時間で、低い場合は、幾分
長い時間で反応を行うことが必要である。
【００３５】また、本発明の方法において用いる好塩基
球測定用試薬は、上記した試薬の他に、例えば、ポリオ
キシエチレン付加重合モル数１２〜３０のノニオン性界
面活性剤とカチオン性界面活性剤からなるｐＨ３．０〜
４．０の好塩基球測定用試薬（特開平３−２０６６７号
公報）及び希薄酸と水溶性界面活性剤からなるｐＨ１．
８〜２．３の水溶液からなる好塩基球測定用試薬（特開
昭６１−８８８９６号公報）等を用いることができる。
球測定用試薬は、上記した試薬の他に、例えば、ポリオ
キシエチレン付加重合モル数１２〜３０のノニオン性界
面活性剤とカチオン性界面活性剤からなるｐＨ３．０〜
４．０の好塩基球測定用試薬（特開平３−２０６６７号
公報）及び希薄酸と水溶性界面活性剤からなるｐＨ１．
８〜２．３の水溶液からなる好塩基球測定用試薬（特開
昭６１−８８８９６号公報）等を用いることができる。
【００３６】本発明で用いられる白血球４分類用試薬及
び好塩基球測定用試薬は、それぞれ上記の組成に限定さ
れるものではないが、各々の試薬で処理された血液試料
が、同じ測定パラメータで測定ができることが好まし
い。また、計数の信頼性を向上させるためには、少なく
とも白血球数が両方の試薬を用いたときに測定できるこ
とが好ましい。
び好塩基球測定用試薬は、それぞれ上記の組成に限定さ
れるものではないが、各々の試薬で処理された血液試料
が、同じ測定パラメータで測定ができることが好まし
い。また、計数の信頼性を向上させるためには、少なく
とも白血球数が両方の試薬を用いたときに測定できるこ
とが好ましい。
【００３７】上記白血球４分類用試薬を加えた全血試料
の一部は、細胞の大きさ情報と形態情報とが測定され、
白血球を少なくともリンパ球、単球及び好酸球にそれぞ
れ対応する３集団と、好中球及び好塩基球に対応する１
集団との４集団に分類計数される。また、上記好塩基球
測定用試薬を加えた全血試料の他の一部は、少なくとも
細胞の大きさ情報が測定され、好塩基球が分類計数され
る。細胞の大きさ情報と形態情報を測定する方法、又は
細胞の大きさ情報のみを測定する方法は、特に限定され
ないが、例えば、低角散乱光及び広角散乱光の両方、あ
るいは、少なくとも低角散乱光を測定する方法が挙げら
れる。低角散乱光は、細胞の大きさ情報を反映し、広角
散乱光は、形態情報を反映する。細胞の大きさ情報を反
映する他の測定パラメータとしては、電気抵抗が挙げら
れる。また、形態情報を反映する他の測定パラメータと
しては、側方（９０°）散乱光が挙げられる。測定パラ
メータを低角散乱光と広角散乱光の組み合わせにする
と、図３に示したような簡単な装置を使用できるので好
ましい。測定する順序は、白血球４分類試薬で処理され
た血液試料を測定した後、好塩基球測定試薬で処理され
た血液試料を測定してもよいし、あるいはその逆でもよ
い。
の一部は、細胞の大きさ情報と形態情報とが測定され、
白血球を少なくともリンパ球、単球及び好酸球にそれぞ
れ対応する３集団と、好中球及び好塩基球に対応する１
集団との４集団に分類計数される。また、上記好塩基球
測定用試薬を加えた全血試料の他の一部は、少なくとも
細胞の大きさ情報が測定され、好塩基球が分類計数され
る。細胞の大きさ情報と形態情報を測定する方法、又は
細胞の大きさ情報のみを測定する方法は、特に限定され
ないが、例えば、低角散乱光及び広角散乱光の両方、あ
るいは、少なくとも低角散乱光を測定する方法が挙げら
れる。低角散乱光は、細胞の大きさ情報を反映し、広角
散乱光は、形態情報を反映する。細胞の大きさ情報を反
映する他の測定パラメータとしては、電気抵抗が挙げら
れる。また、形態情報を反映する他の測定パラメータと
しては、側方（９０°）散乱光が挙げられる。測定パラ
メータを低角散乱光と広角散乱光の組み合わせにする
と、図３に示したような簡単な装置を使用できるので好
ましい。測定する順序は、白血球４分類試薬で処理され
た血液試料を測定した後、好塩基球測定試薬で処理され
た血液試料を測定してもよいし、あるいはその逆でもよ
い。
【００３８】全血試料と、白血球４分類試薬とを混合す
ることにより、赤血球は溶解し、さらに白血球のサブタ
イプ間に形態的差異が生じる。この結果、２つの散乱光
を測定することによって、少なくとも白血球を少なくと
もリンパ球、単球及び好酸球にそれぞれ対応する３集団
と、好中球及び好塩基球に対応する１集団との４集団に
分類計数される。
ることにより、赤血球は溶解し、さらに白血球のサブタ
イプ間に形態的差異が生じる。この結果、２つの散乱光
を測定することによって、少なくとも白血球を少なくと
もリンパ球、単球及び好酸球にそれぞれ対応する３集団
と、好中球及び好塩基球に対応する１集団との４集団に
分類計数される。
【００３９】一方、全血試料と好塩基球測定試薬とを混
合することにより、赤血球は溶解し、好塩基球はほとん
ど変化せずに残り、他の白血球は収縮する。この結果、
少なくとも大きさ情報を反映する低角散乱光を測定する
ことによって、白血球を好塩基球と、好塩基球以外の白
血球との２種類に分類することができる。なお、白血球
数が多い場合や、幼若顆粒球が出現した検体等では、好
塩基球と、好塩基球以外の白血球との境界が不明瞭とな
るとともに、左方移動の情報も得られないので、細胞の
大きさ情報と形態情報との両方を測定することが好まし
い。また、好塩基球測定試薬のうち、（１）ポリオキシ
エチレンの付加重合モル数が３〜１０の少なくとも１種
のノニオン性界面活性剤と、（２）少なくとも１種のカ
チオン性界面活性剤と、（３）ｐＨを２．５〜４．０に
するための緩衝剤とからなる白血球分析用試薬を使用し
た場合には、少なくとも、好塩基球、単核球（リンパ球
及び単球）、好塩基球以外の顆粒球の３つに分類するこ
とができ、幼若顆粒球も分類計数できるので、特に好ま
しい。
合することにより、赤血球は溶解し、好塩基球はほとん
ど変化せずに残り、他の白血球は収縮する。この結果、
少なくとも大きさ情報を反映する低角散乱光を測定する
ことによって、白血球を好塩基球と、好塩基球以外の白
血球との２種類に分類することができる。なお、白血球
数が多い場合や、幼若顆粒球が出現した検体等では、好
塩基球と、好塩基球以外の白血球との境界が不明瞭とな
るとともに、左方移動の情報も得られないので、細胞の
大きさ情報と形態情報との両方を測定することが好まし
い。また、好塩基球測定試薬のうち、（１）ポリオキシ
エチレンの付加重合モル数が３〜１０の少なくとも１種
のノニオン性界面活性剤と、（２）少なくとも１種のカ
チオン性界面活性剤と、（３）ｐＨを２．５〜４．０に
するための緩衝剤とからなる白血球分析用試薬を使用し
た場合には、少なくとも、好塩基球、単核球（リンパ球
及び単球）、好塩基球以外の顆粒球の３つに分類するこ
とができ、幼若顆粒球も分類計数できるので、特に好ま
しい。
【００４０】従って、白血球４分類試薬で処理すること
によって得られた計数値と、好塩基球測定用試薬で処理
することによって得られた計数値とをもとにして、白血
球の５分類が可能となる。例えば、白血球４分類試薬に
よって、リンパ球、単球、好酸球の分類計数値を求め
る。また、好塩基球測定用試薬によって、好塩基球の分
類計数値を求める。好中球の分類計数値は、白血球分類
試薬で得られた好中球及び好塩基球の分類計数値から好
塩基球の分類計数値を差し引くことによって求められ
る。あるいは、上記に示した好塩基球測定用試薬を用い
た場合には、好塩基球以外の顆粒球の分類計数値から白
血球分類試薬で得られた好酸球の分類計数値を差し引く
ことによって好中球の分類計数値を求めることもでき
る。
によって得られた計数値と、好塩基球測定用試薬で処理
することによって得られた計数値とをもとにして、白血
球の５分類が可能となる。例えば、白血球４分類試薬に
よって、リンパ球、単球、好酸球の分類計数値を求め
る。また、好塩基球測定用試薬によって、好塩基球の分
類計数値を求める。好中球の分類計数値は、白血球分類
試薬で得られた好中球及び好塩基球の分類計数値から好
塩基球の分類計数値を差し引くことによって求められ
る。あるいは、上記に示した好塩基球測定用試薬を用い
た場合には、好塩基球以外の顆粒球の分類計数値から白
血球分類試薬で得られた好酸球の分類計数値を差し引く
ことによって好中球の分類計数値を求めることもでき
る。
【００４１】本発明の方法において、各試薬で処理した
全血試料は、蛍光を検出する必要がなく、さらに、共通
する測定パラメータで測定することができる。従って、
公知の白血球測定装置を用いることができるが、例え
ば、安価で簡単な装置である半導体レーザをもちいた小
型の分析装置を用いることが好ましい。このような半導
体レーザを用いた小型の分析装置によって、低角及び高
角前方散乱光の２つのパラメータを受光するのみで、白
血球を分類計数することができる。例えば、図３に半導
体レーザを用いた装置の一例を示す。検出部は、フロー
セル（ＣＥＬＬ）の前方にコンデンサレンズ（Ｌ２）及
びコリメータレンズ（Ｌ１）を介して、半導体レーザ
（ＬＤ）が直線的に配設されている。また、フローセル
（ＣＥＬＬ）の後方にはビームストッパ（ＢＳ）が併設
されたコンデンサレンズ（Ｌ３）を介してフォトダイオ
ード（ＰＤ）が、半導体レーザ（ＬＤ）及びフローセル
（ＣＥＬＬ）と直線的に配設されて構成されている。こ
の検出部の特徴としては、半導体レーザを使用している
こと、２角度散乱光の弁別を１個のフォトダイオード
（ＰＤ）センサー自身で行うこと、直線的な簡単な光学
的構造があげられる。
全血試料は、蛍光を検出する必要がなく、さらに、共通
する測定パラメータで測定することができる。従って、
公知の白血球測定装置を用いることができるが、例え
ば、安価で簡単な装置である半導体レーザをもちいた小
型の分析装置を用いることが好ましい。このような半導
体レーザを用いた小型の分析装置によって、低角及び高
角前方散乱光の２つのパラメータを受光するのみで、白
血球を分類計数することができる。例えば、図３に半導
体レーザを用いた装置の一例を示す。検出部は、フロー
セル（ＣＥＬＬ）の前方にコンデンサレンズ（Ｌ２）及
びコリメータレンズ（Ｌ１）を介して、半導体レーザ
（ＬＤ）が直線的に配設されている。また、フローセル
（ＣＥＬＬ）の後方にはビームストッパ（ＢＳ）が併設
されたコンデンサレンズ（Ｌ３）を介してフォトダイオ
ード（ＰＤ）が、半導体レーザ（ＬＤ）及びフローセル
（ＣＥＬＬ）と直線的に配設されて構成されている。こ
の検出部の特徴としては、半導体レーザを使用している
こと、２角度散乱光の弁別を１個のフォトダイオード
（ＰＤ）センサー自身で行うこと、直線的な簡単な光学
的構造があげられる。
【００４２】また、図３の装置で使用されるフォトダイ
オード（ＰＤ）の一例を図４に示す。図４はＰＤの外観
であり、図５はＰＤの受光センサーの配置を示す。ＰＤ
は、一般的なＰＤと同様のカンタイプの容器に入れられ
ている。中心部にある小さな円形のセンサー部分Ｃが前
方低角（１〜５°）散乱光を、その上部にある半円形の
センサー部分Ａが前方広角（６〜２０°）散乱光をそれ
ぞれ弁別検出する。それぞれのセンサー感度は、一般的
なＰＤと同程度の感度を有している。センサー部分が分
割されているため、２つの散乱光信号を同時に測定する
ことができる。
オード（ＰＤ）の一例を図４に示す。図４はＰＤの外観
であり、図５はＰＤの受光センサーの配置を示す。ＰＤ
は、一般的なＰＤと同様のカンタイプの容器に入れられ
ている。中心部にある小さな円形のセンサー部分Ｃが前
方低角（１〜５°）散乱光を、その上部にある半円形の
センサー部分Ａが前方広角（６〜２０°）散乱光をそれ
ぞれ弁別検出する。それぞれのセンサー感度は、一般的
なＰＤと同程度の感度を有している。センサー部分が分
割されているため、２つの散乱光信号を同時に測定する
ことができる。
【００４３】なお、上記の装置及びフォトダイオード以
外にも公知の装置及びフォトダイオードを用いることが
できる。また、細胞の大きさ情報は、低角散乱光を測定
しないで、電気抵抗を測定することによっても測定する
ことができる。
外にも公知の装置及びフォトダイオードを用いることが
できる。また、細胞の大きさ情報は、低角散乱光を測定
しないで、電気抵抗を測定することによっても測定する
ことができる。
【００４４】
【実施例】本発明の白血球分類方法の実施例を以下に示
す。実施例１ 白血球４分類用試薬として、 デシルトリメチルアンモニウムブロマイド １．５ｇ／ｌ ８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸マグネシウム塩 ２．０ｇ／ｌ ＨＣＯ−５０（ノニオン性界面活性剤、日光ケミカルズ（株）） ４ｇ／ｌ ＰＥＮ４６３０（ノニオン性界面活性剤、日光ケミカルズ（株）） １ｇ／ｌ フタル酸 ５０ｍＭ ２−フェノキシエタノール ２．５ｍｌ／ｌ 水酸化ナトリウム ｐＨ５．５になる量 塩化ナトリウム ３０ｍＭ を用いて、試薬を調製した。
す。実施例１ 白血球４分類用試薬として、 デシルトリメチルアンモニウムブロマイド １．５ｇ／ｌ ８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸マグネシウム塩 ２．０ｇ／ｌ ＨＣＯ−５０（ノニオン性界面活性剤、日光ケミカルズ（株）） ４ｇ／ｌ ＰＥＮ４６３０（ノニオン性界面活性剤、日光ケミカルズ（株）） １ｇ／ｌ フタル酸 ５０ｍＭ ２−フェノキシエタノール ２．５ｍｌ／ｌ 水酸化ナトリウム ｐＨ５．５になる量 塩化ナトリウム ３０ｍＭ を用いて、試薬を調製した。
【００４５】また、好塩基球測定用試薬として、 ミリスチルトリメチルアンモニウムブロマイド １ｇ／ｌ ＢＬ９（ノニオン性界面活性剤、日光ケミカルズ（株）） ４ｇ／ｌ クエン酸 １０ｍＭ 水酸化ナトリウム ｐＨ３．３になる量 を用いて、試薬を調製した。
【００４６】上記の白血球４分類用試薬１．０ｍｌに健
常人血３０μｌを加え、１０秒後に図３に示すフローサ
イトメータで前方低角散乱光と広角散乱光を測定した。
その結果を図１及び表３に示す。また、好塩基球測定用
試薬１．０ｍｌに健常人血３０μｌを加え、３０秒後に
図３に示すフローサイトメータで前方低角散乱光と広角
散乱光を測定した。その結果を図２及び表３に示す。
常人血３０μｌを加え、１０秒後に図３に示すフローサ
イトメータで前方低角散乱光と広角散乱光を測定した。
その結果を図１及び表３に示す。また、好塩基球測定用
試薬１．０ｍｌに健常人血３０μｌを加え、３０秒後に
図３に示すフローサイトメータで前方低角散乱光と広角
散乱光を測定した。その結果を図２及び表３に示す。
【００４７】
【表３】
【００４８】図１、図２及び表３から明らかなように、
白血球数、白血球４分類用試薬を用いた場合のリンパ球
及び単球の比率と好塩基球試薬を用いた場合のリンパ球
及び単球の比率、および、白血球４分類用試薬を用いた
場合の好塩基球、好中球及び好酸球の比率と好塩基球試
薬を用いた場合の好塩基球、好中球及び好酸球の比率
は、いずれも良好に一致している。
白血球数、白血球４分類用試薬を用いた場合のリンパ球
及び単球の比率と好塩基球試薬を用いた場合のリンパ球
及び単球の比率、および、白血球４分類用試薬を用いた
場合の好塩基球、好中球及び好酸球の比率と好塩基球試
薬を用いた場合の好塩基球、好中球及び好酸球の比率
は、いずれも良好に一致している。
【００４９】
【発明の効果】本発明の方法によれば、白血球４分類試
薬と、好塩基球測定試薬とを用いることにより、安価な
システムで迅速に白血球を５分類に計数することができ
る。また、白血球４分類測定と好塩基球測定を同じ検出
系で２回測定しているので、それぞれの細胞の比率、個
数を両測定で比較することにより、計数の信頼性を向上
させることができる。すなわち、両測定の結果に差が認
められたときには、何らかの警報を発することができ、
異常細胞の検知力を向上させることができる。
薬と、好塩基球測定試薬とを用いることにより、安価な
システムで迅速に白血球を５分類に計数することができ
る。また、白血球４分類測定と好塩基球測定を同じ検出
系で２回測定しているので、それぞれの細胞の比率、個
数を両測定で比較することにより、計数の信頼性を向上
させることができる。すなわち、両測定の結果に差が認
められたときには、何らかの警報を発することができ、
異常細胞の検知力を向上させることができる。
【図１】本発明の白血球分類方法において、白血球４分
類用試薬を用いて白血球を分類計数した場合の低角散乱
光と広角散乱光とを示すスキャッタグラムである。
類用試薬を用いて白血球を分類計数した場合の低角散乱
光と広角散乱光とを示すスキャッタグラムである。
【図２】本発明の白血球分類方法において、好塩基球測
定用試薬を用いて白血球を分類計数した場合の低角散乱
光と広角散乱光とを示すスキャッタグラムである。
定用試薬を用いて白血球を分類計数した場合の低角散乱
光と広角散乱光とを示すスキャッタグラムである。
【図３】本発明の白血球分類方法において好適に使用さ
れる測定装置の構成を示す概略図である。
れる測定装置の構成を示す概略図である。
【図４】図３の測定装置に使用されるフォトダイオード
を示す斜視図である。
を示す斜視図である。
【図５】図４のフォトダイオードの受光センサーの配置
を示す概略図である。
を示す概略図である。
Ｌｙｍ リンパ球 Ｍｏｎｏ 単球 ＧＲＡＮ 好中球＋好塩基球 Ｅｏ 好酸球 ＬＭ リンパ球＋単球 Ｂａｓｏ 好塩基球 ＧＲＡＮ２ 好中球＋好酸球 ＣＥＬＬ フローセル Ｌ１ コリメータレンズ Ｌ２ コンデンサレンズ Ｌ３ コンデンサレンズ ＬＤ 半導体レーザ ＰＤ フォトダイオード ＢＳ ビームストッパ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 坂田 孝 神戸市中央区港島中町７丁目２番１号 東亜医用電子株式会社内 (72)発明者 赤井 保正 神戸市中央区港島中町７丁目２番１号 東亜医用電子株式会社内 (56)参考文献 特開 平７−294518（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−181177（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−252556（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−252557（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−13969（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−20667（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−88896（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−137566（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−230854（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−4171（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−502931（ＪＰ，Ａ) 国際公開88／95804（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98
Claims (9)
- 【請求項１】 (i) （ａ）赤血球を溶解しうるが白血球
の細胞膜の一部に損傷を与えるのに十分な量の少なくと
も１種類のイオン性界面活性剤と、（ｂ）白血球内のカ
チオン荷電成分と結合して白血球間に形態的差異を与え
るのに十分な量の少なくとも１種類のアニオン基を有す
る有機化合物と、（ｃ）ノニオン界面活性剤と、（ｄ）
ｐＨ調整用の緩衝剤とからなる白血球４分類用試薬を全
血試料の一部に加え、細胞の大きさ情報と形態情報とを
測定して、白血球を少なくともリンパ球、単球及び好酸
球にそれぞれ対応する３集団と、好中球及び好塩基球に
対応する１集団との４集団に分類計数し、 (ii)好塩基球測定用試薬を全血試料の他の一部に加え、
少なくとも細胞の大きさ情報を測定して好塩基球を分類
計数し、 (iii) それぞれ得られた計数値に基づいて、白血球を少
なくとも５分類することを特徴とする白血球分類方法。 - 【請求項２】 細胞の大きさ情報を測定する工程が、低
角散乱光を測定することからなる請求項１記載の白血球
分類方法。 - 【請求項３】 低角散乱光の測定角度が１〜５°である
請求項２記載の白血球分類方法。 - 【請求項４】 形態情報を測定する工程が、広角散乱光
を測定することからなる請求項１記載の白血球分類方
法。 - 【請求項５】 広角散乱光の測定角度が６〜２０°であ
る請求項４記載の白血球分類方法。 - 【請求項６】 細胞の大きさ情報と形態情報とを測定す
る工程が、低角と広角の２つの散乱光を測定することか
らなる請求項１記載の白血球分類方法。 - 【請求項７】 測定する低角と広角の２つの散乱光の角
度が１〜５°および６〜２０°である請求項６記載の白
血球分類方法。 - 【請求項８】 ２つの角度の散乱光の検出を、１個のフ
ォトダイオード（ＰＤ）センサーで行う請求項６又は７
のいずれか１つに記載の白血球分類方法。 - 【請求項９】 工程(i) の少なくとも４集団の分類計数
と、工程(ii)の好塩基球の分類計数を、同一の検出器を
用いて行う請求項１記載の白血球分類方法。
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