JP3356280B2 - 哺乳動物免疫不全ウイルスの検出 - Google Patents
哺乳動物免疫不全ウイルスの検出Info
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Description
【発明の詳細な説明】 この発明は、哺乳動物免疫不全ウイルスの検出方法に
関し、とりわけ、そのようなウイルスに対する抗体の検
出のためのイムノアッセイに使用するのに適したペプチ
ドに関する。
関し、とりわけ、そのようなウイルスに対する抗体の検
出のためのイムノアッセイに使用するのに適したペプチ
ドに関する。
背景技術および従来技術 1981年にヒト後天性免疫不全症候群（AIDS）が認識さ
れて以来、その原因ウイルス、以前はヒトＴ細胞リンパ
趣向性ウイルスタイプIII（human T−cell lymphotropi
c virus type III）（HTLV−III）またはリンパ節障害
関連ウイルス（lymphadenopathy−associated virus）
（LAV）として知られていたヒト免疫不全ウイルス（HI
V）に対して鋭意研究がなされてきている。いまや、HIV
特異的な抗体がAIDSまたはAIDS関連症候群の殆どの患者
の血清中のみならず該ウイルスに暴露された非症候性の
個体の血清中にも存在することがわかっている。
れて以来、その原因ウイルス、以前はヒトＴ細胞リンパ
趣向性ウイルスタイプIII（human T−cell lymphotropi
c virus type III）（HTLV−III）またはリンパ節障害
関連ウイルス（lymphadenopathy−associated virus）
（LAV）として知られていたヒト免疫不全ウイルス（HI
V）に対して鋭意研究がなされてきている。いまや、HIV
特異的な抗体がAIDSまたはAIDS関連症候群の殆どの患者
の血清中のみならず該ウイルスに暴露された非症候性の
個体の血清中にも存在することがわかっている。
さらに最近では、HIV−２として知られる変種ウイル
スもAIDSを引き起こし得ることがわかってきている。HI
Vウイルスによりコードされる種々のポリペプチドを利
用したELISAなどのイムノアッセイ法が、診断およびス
クリーニングに広範に用いられてきている。たいていの
場合、これらポリペプチドはウイルス材料から直接調製
するか、または組換えDNA技術を用いたインビトロ発現
系から得られるものであるが、そのような材料は理想的
ではない。ウイルス調製物から得た材料は生存能力のあ
るウイルスによって汚染されているかもしれず、それゆ
え、そのような材料を用いる人には危険が伴う。組換え
由来の材料は非HIVタンパク質で汚染されているかもし
れず、その結果、特異性が失われる可能性がある。
スもAIDSを引き起こし得ることがわかってきている。HI
Vウイルスによりコードされる種々のポリペプチドを利
用したELISAなどのイムノアッセイ法が、診断およびス
クリーニングに広範に用いられてきている。たいていの
場合、これらポリペプチドはウイルス材料から直接調製
するか、または組換えDNA技術を用いたインビトロ発現
系から得られるものであるが、そのような材料は理想的
ではない。ウイルス調製物から得た材料は生存能力のあ
るウイルスによって汚染されているかもしれず、それゆ
え、そのような材料を用いる人には危険が伴う。組換え
由来の材料は非HIVタンパク質で汚染されているかもし
れず、その結果、特異性が失われる可能性がある。
この問題を克服する試みにおいて、HIVのポリペプチ
ドが化学的な合成手段を用いて製造されている；種々の
HIV抗原のペプチド断片が、ジェネティック・システム
ズ・コーポレーション（Genetic Systems Corporatio
n）によるオーストラリア特許出願第597884（57733/8
6）号、および米国特許第4735896号および第4879212号
（ともにユナイティッド・バイオメディカル（United B
iomedical Inc.）による）に開示されている。とりわ
け、これら３つの明細書には、gp41糖タンパク質の保存
された免疫優性（immunodominant）領域、HIV−１の主
要なエンベロープタンパク質の領域が開示されている。
HIV−２のgp36タンパク質の類似の領域も合成されてい
る。これら領域（エンベロープタンパク質の経膜部分に
対応する）は、HIV−１およびHIV−２の優先的な診断を
可能にし、非常に高い感度と特異性のアッセイを提供す
る。
ドが化学的な合成手段を用いて製造されている；種々の
HIV抗原のペプチド断片が、ジェネティック・システム
ズ・コーポレーション（Genetic Systems Corporatio
n）によるオーストラリア特許出願第597884（57733/8
6）号、および米国特許第4735896号および第4879212号
（ともにユナイティッド・バイオメディカル（United B
iomedical Inc.）による）に開示されている。とりわ
け、これら３つの明細書には、gp41糖タンパク質の保存
された免疫優性（immunodominant）領域、HIV−１の主
要なエンベロープタンパク質の領域が開示されている。
HIV−２のgp36タンパク質の類似の領域も合成されてい
る。これら領域（エンベロープタンパク質の経膜部分に
対応する）は、HIV−１およびHIV−２の優先的な診断を
可能にし、非常に高い感度と特異性のアッセイを提供す
る。
レトロウイルス感染、とりわけ免疫不全疾患の関連す
るレトロウイルス感染に関する研究は、免疫不全ウイル
スが哺乳動物種の間に広く広がっていることを示してい
る。たとえば、サル免疫不全ウイルス（SIV株）がマカ
ーク、ギボン、およびチンパンジーなどの種々の旧世界
のサル種で見つかっている。同様のウイルスがウシ科の
動物（ウシ免疫不全ウイルス、BIV）およびネコ科の動
物（ネコ免疫不全ウイルス、FIV）に感染することもわ
かっている。FIVは家庭のネコから最初に単離されたレ
トロウイルスであり、HIV−１と同じグループに属する
ことが示されている（ペダーゾン（Pederson,N.C.）ら;
Science（1987）235 790）。このウイルスは、試験した
すべての国の家庭のネコで見つかっており、AIDS患者で
認められているのと類似の健康状態と関係している；し
かしながら、認められる感染は、家庭のネコで通常みら
れるもののみである。クリプトコッカス症などの真菌感
染はとりわけ共通しており、症候処置によく対応してい
る。FIVはHIVを有するヒトにみられるような破局的な感
染には至らないが、また該ウイルスはその発見までに少
なくとも20年間ネコ集団中に存在したと思われるが、感
染は非常に広範囲にわたっており、有意の苦痛および苦
悩を引き起こす。他の長期間での意味合いがあるのかも
しれない。
るレトロウイルス感染に関する研究は、免疫不全ウイル
スが哺乳動物種の間に広く広がっていることを示してい
る。たとえば、サル免疫不全ウイルス（SIV株）がマカ
ーク、ギボン、およびチンパンジーなどの種々の旧世界
のサル種で見つかっている。同様のウイルスがウシ科の
動物（ウシ免疫不全ウイルス、BIV）およびネコ科の動
物（ネコ免疫不全ウイルス、FIV）に感染することもわ
かっている。FIVは家庭のネコから最初に単離されたレ
トロウイルスであり、HIV−１と同じグループに属する
ことが示されている（ペダーゾン（Pederson,N.C.）ら;
Science（1987）235 790）。このウイルスは、試験した
すべての国の家庭のネコで見つかっており、AIDS患者で
認められているのと類似の健康状態と関係している；し
かしながら、認められる感染は、家庭のネコで通常みら
れるもののみである。クリプトコッカス症などの真菌感
染はとりわけ共通しており、症候処置によく対応してい
る。FIVはHIVを有するヒトにみられるような破局的な感
染には至らないが、また該ウイルスはその発見までに少
なくとも20年間ネコ集団中に存在したと思われるが、感
染は非常に広範囲にわたっており、有意の苦痛および苦
悩を引き起こす。他の長期間での意味合いがあるのかも
しれない。
たとえば、FIV抗体は、動物園の集団および自由に分
布する動物の両方において、ライオン、ジャガー、ヒョ
ウおよびピューマなどの大きなネコ科の動物に広く分布
することが最近わかってきた（バー（Barr M.C.）、カ
ル（Calle P.R.）ら;J.Zoo and Wildlife Med.（1989）
20 285;サビン（Sabine M.）およびウォーカー（Walker
C.）;Today's Life Science、1991 ３ 34）。サビンお
よびウォーカーによるオーストラリアの研究では動物園
の動物と家庭のネコとの接触を排除することはできない
が、バーおよびカルらによる研究における合衆国の動物
園のネコ科の動物は家庭のネコおよび他の感染した外国
産のネコのいずれとも接触をもっていなかった。家庭の
ネコにおけるFIV感染の明示とは対照的に、大きなネコ
科の動物では該ウイルスと臨床的疾患との間にいかなる
相関関係をも示さなかった。多くの大きなネコ科の動物
種が滅亡の危機に瀕しているという事実を考慮すると
き、野性集団の健康および成育効率に対してFIV感染が
有意の影響を及ぼしているか否かを決定することは非常
に重要である。
布する動物の両方において、ライオン、ジャガー、ヒョ
ウおよびピューマなどの大きなネコ科の動物に広く分布
することが最近わかってきた（バー（Barr M.C.）、カ
ル（Calle P.R.）ら;J.Zoo and Wildlife Med.（1989）
20 285;サビン（Sabine M.）およびウォーカー（Walker
C.）;Today's Life Science、1991 ３ 34）。サビンお
よびウォーカーによるオーストラリアの研究では動物園
の動物と家庭のネコとの接触を排除することはできない
が、バーおよびカルらによる研究における合衆国の動物
園のネコ科の動物は家庭のネコおよび他の感染した外国
産のネコのいずれとも接触をもっていなかった。家庭の
ネコにおけるFIV感染の明示とは対照的に、大きなネコ
科の動物では該ウイルスと臨床的疾患との間にいかなる
相関関係をも示さなかった。多くの大きなネコ科の動物
種が滅亡の危機に瀕しているという事実を考慮すると
き、野性集団の健康および成育効率に対してFIV感染が
有意の影響を及ぼしているか否かを決定することは非常
に重要である。
FIVは抗原の面ではHIVと関係しないが、またFIVタン
パク質はHIVのタンパク質とは類似していないが、HIVア
ッセイの開発の過程で得られた経験によりFIVアッセイ
の開発も迅速になることが可能となった。p26抗原を利
用したFIVのためのELISA試験キットが市販されている
（“ペットチェック（Pet Chek）";イデックス・コーポ
レーション（I dexx Corporation））。HIV感染の場合
のように、FIVの感染には、宿主体内でのウイルスの持
続的な存在とともに抗体の産生が続くことがわかってい
る。しかしながら、この試験を用いると、ヒトにおいて
HIVウイルスの類似の試験で認められるものに比べて偽
陰性が一層頻繁に起こることがわかった。
パク質はHIVのタンパク質とは類似していないが、HIVア
ッセイの開発の過程で得られた経験によりFIVアッセイ
の開発も迅速になることが可能となった。p26抗原を利
用したFIVのためのELISA試験キットが市販されている
（“ペットチェック（Pet Chek）";イデックス・コーポ
レーション（I dexx Corporation））。HIV感染の場合
のように、FIVの感染には、宿主体内でのウイルスの持
続的な存在とともに抗体の産生が続くことがわかってい
る。しかしながら、この試験を用いると、ヒトにおいて
HIVウイルスの類似の試験で認められるものに比べて偽
陰性が一層頻繁に起こることがわかった。
家庭のネコにおいてFIVは、ヒトにおけるHIVと同様の
仕方でＴ細胞に影響を与える。この理由から、FIVは、
たとえばワクチンや治療剤の試験においてAIDSの実験モ
デルとして提唱されている。FIVの迅速で正確な診断が
そのような目的には必須である。
仕方でＴ細胞に影響を与える。この理由から、FIVは、
たとえばワクチンや治療剤の試験においてAIDSの実験モ
デルとして提唱されている。FIVの迅速で正確な診断が
そのような目的には必須である。
FIVの４つの株についてヌクレオチド配列が報告され
ている。これら公知の単離物において一つの配列が保存
されているが、いずれかの末端において変異が存在す
る。FIVペタルマ（Petaluma）およびFIV−PPRと呼ばれ
る合衆国由来の２つの株が以下の文献に記載されてい
る：オルムステッド（Olmsted,R.A.）、バーンズ（Barn
es,A.K.）、ヤマモト（Yamamoto,J.K.）、ヒルシュ（Hi
rsch,V.M.）、パーセル（Purcell,R.H.）およびジョン
ソン（Johnson,P.R.）（1988）ネコ免疫不全ウイルスの
モレキュラークローニング、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
6:2448−2452;オルムステッド、ヒルシュ、パーセルお
よびジョンソン（1989）ネコ免疫不全ウイルスのヌクレ
オチド配列分析：ゲノム組成および他のレンチウイルス
との関係、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8088−8092;タ
ルボット（Talbott,R.L.）、スパーガー（Sparger,E.
E.）、ラブラス（Lovelace,K.M.）、フィッチュ（Fitc
h,W.M.）、ピーターセン（Petersen,N.C.）、ルシウ（L
uciw,P.A.）およびエルダー（Elder,J.H.）（1989）、
ネコ免疫不全ウイルスのヌクレオチド配列およびゲノム
組成、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5743−5747、または
FIV TM1およびFIV TM2と呼ばれる日本由来の２つの株
は、マキ（Maki,N.）、ミヤザワ（Miyazawa,T.）、フカ
サワ（Fukasawa,T.）、フカサワ（Fukasawa,M.）、ハセ
ガワ（Hasegawa,A.）、ハヤミ（Hayami,M.）、ミキ（Mi
ki,K.）およびミカミ（Mikami,T.）（1992）Arch.Viro
l.123:29−45、ネコ免疫不全ウイルス単離物の分子的特
徴付けおよび不均一性、に記載されている。
ている。これら公知の単離物において一つの配列が保存
されているが、いずれかの末端において変異が存在す
る。FIVペタルマ（Petaluma）およびFIV−PPRと呼ばれ
る合衆国由来の２つの株が以下の文献に記載されてい
る：オルムステッド（Olmsted,R.A.）、バーンズ（Barn
es,A.K.）、ヤマモト（Yamamoto,J.K.）、ヒルシュ（Hi
rsch,V.M.）、パーセル（Purcell,R.H.）およびジョン
ソン（Johnson,P.R.）（1988）ネコ免疫不全ウイルスの
モレキュラークローニング、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
6:2448−2452;オルムステッド、ヒルシュ、パーセルお
よびジョンソン（1989）ネコ免疫不全ウイルスのヌクレ
オチド配列分析：ゲノム組成および他のレンチウイルス
との関係、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8088−8092;タ
ルボット（Talbott,R.L.）、スパーガー（Sparger,E.
E.）、ラブラス（Lovelace,K.M.）、フィッチュ（Fitc
h,W.M.）、ピーターセン（Petersen,N.C.）、ルシウ（L
uciw,P.A.）およびエルダー（Elder,J.H.）（1989）、
ネコ免疫不全ウイルスのヌクレオチド配列およびゲノム
組成、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5743−5747、または
FIV TM1およびFIV TM2と呼ばれる日本由来の２つの株
は、マキ（Maki,N.）、ミヤザワ（Miyazawa,T.）、フカ
サワ（Fukasawa,T.）、フカサワ（Fukasawa,M.）、ハセ
ガワ（Hasegawa,A.）、ハヤミ（Hayami,M.）、ミキ（Mi
ki,K.）およびミカミ（Mikami,T.）（1992）Arch.Viro
l.123:29−45、ネコ免疫不全ウイルス単離物の分子的特
徴付けおよび不均一性、に記載されている。
これら単離物のenvタンパク質は、経膜領域に下記配
列を有する： ウシ免疫不全ウイルス（BIV）は、AIDSを引き起こすH
IVに近縁であり、HIVおよびFIVと同様、レンチウイルス
群の成員である（ガーベイ（Garvey,K.J.）ら;Virology
（1990）175 391−409）。それは、抗原的はHIVと交差
反応し、培養ヒト細胞に感染することができる。レンチ
ウイルスは、乳を介して吸乳動物に容易に伝播する。ご
く最近にBIVは化学的に特徴付けがなされ、それゆえ、
同定および単離が可能となった。ウシの群れにおける慢
性的な疾患との関連性についての研究が米国において進
行中である（ウエットストーン（Whetstone,C.A.）ら;A
rch.Virol.1991（印刷中））。
列を有する： ウシ免疫不全ウイルス（BIV）は、AIDSを引き起こすH
IVに近縁であり、HIVおよびFIVと同様、レンチウイルス
群の成員である（ガーベイ（Garvey,K.J.）ら;Virology
（1990）175 391−409）。それは、抗原的はHIVと交差
反応し、培養ヒト細胞に感染することができる。レンチ
ウイルスは、乳を介して吸乳動物に容易に伝播する。ご
く最近にBIVは化学的に特徴付けがなされ、それゆえ、
同定および単離が可能となった。ウシの群れにおける慢
性的な疾患との関連性についての研究が米国において進
行中である（ウエットストーン（Whetstone,C.A.）ら;A
rch.Virol.1991（印刷中））。
BIVは白血球の比率の大きな増大を引き起こし、この
ためウシ白血病ウイルス（BLV）により引き起こされる
癌と間違えられることがある。BIVは、ファンデルマー
テン（VanDerMaaten）らがウシビスナウイルスと名付け
たウイルスをウシにおいて発見した（ファンデルマーテ
ンら;Journal of the National Cancer Institute（197
2）49 1649−1657）1972年に最初に発見された。該ウイ
ルスが培養中のヒト細胞に感染すること（ジョージアド
（Georgiades,J.A.）ら;J.Gen.Virol.（1978）38 375−
381）、該ウイルスがHIVと抗原的に交差反応すること
（アンボルスキー（Amborski,G.F.）ら;Veterinary Mic
robiology（1989）20 247−253）、および該ウイルスが
ビスナよりもHIVに系統発生論的に近いこと（ゴンダ（G
onda,M.A.）ら;Mature（ロンドン）（1987）330 388−3
91）が発見された後、その名前はウシ免疫不全ウイルス
と変えられた。
ためウシ白血病ウイルス（BLV）により引き起こされる
癌と間違えられることがある。BIVは、ファンデルマー
テン（VanDerMaaten）らがウシビスナウイルスと名付け
たウイルスをウシにおいて発見した（ファンデルマーテ
ンら;Journal of the National Cancer Institute（197
2）49 1649−1657）1972年に最初に発見された。該ウイ
ルスが培養中のヒト細胞に感染すること（ジョージアド
（Georgiades,J.A.）ら;J.Gen.Virol.（1978）38 375−
381）、該ウイルスがHIVと抗原的に交差反応すること
（アンボルスキー（Amborski,G.F.）ら;Veterinary Mic
robiology（1989）20 247−253）、および該ウイルスが
ビスナよりもHIVに系統発生論的に近いこと（ゴンダ（G
onda,M.A.）ら;Mature（ロンドン）（1987）330 388−3
91）が発見された後、その名前はウシ免疫不全ウイルス
と変えられた。
HIVの存在は、真菌感染、微生物感染およびウイルス
感染、並びに免疫系により通常制御されている癌の影響
を悪化させるので、BIVは慢性疾患およびウシの幾つか
の癌において同様の影響を有するように思われる。米国
農務省により出版されたばかりの論文において、“成育
の悪い（poor doers）”一つのウシ集団において78頭の
うち34頭がBIVに対する抗体を有することがわかり、南
部米国の８つの州からの1997頭の主として乳牛の調査に
おいて４％BIVの罹患率が決定された（ウエットストー
ンら;Journal of Virology（1990）64 3557−3561）。
感染、並びに免疫系により通常制御されている癌の影響
を悪化させるので、BIVは慢性疾患およびウシの幾つか
の癌において同様の影響を有するように思われる。米国
農務省により出版されたばかりの論文において、“成育
の悪い（poor doers）”一つのウシ集団において78頭の
うち34頭がBIVに対する抗体を有することがわかり、南
部米国の８つの州からの1997頭の主として乳牛の調査に
おいて４％BIVの罹患率が決定された（ウエットストー
ンら;Journal of Virology（1990）64 3557−3561）。
他の種におけるレンチウイルスの場合のように、BIV
の経済効果は間接的であろうし、他の微生物が関与して
いるかもしれないと考えるのは妥当な推測である。HIV
との関連に基づき、BIVの存在を示す明らかな条件は：
慢性的な悪い成長、慢性的な下痢、癌の経歴のあるウシ
集団、重篤なヨーネ病、持続的なマイコプラズマ感染、
およびバリのウシにおけるイエンブラナ病（Jembrana d
isease）である。BIVの罹患率が決定され疾患との関連
性が確定されるまでは、BIVを拡散させることの経済効
果、またはBIVを除去することの実行可能性および費用
を推定することは不可能である。効率的な試験および人
工的な飼育により、ヤギおよびヒツジの群れから関節炎
脳炎ウイルスを比較的低コストで除去することは比較的
に簡単であった。
の経済効果は間接的であろうし、他の微生物が関与して
いるかもしれないと考えるのは妥当な推測である。HIV
との関連に基づき、BIVの存在を示す明らかな条件は：
慢性的な悪い成長、慢性的な下痢、癌の経歴のあるウシ
集団、重篤なヨーネ病、持続的なマイコプラズマ感染、
およびバリのウシにおけるイエンブラナ病（Jembrana d
isease）である。BIVの罹患率が決定され疾患との関連
性が確定されるまでは、BIVを拡散させることの経済効
果、またはBIVを除去することの実行可能性および費用
を推定することは不可能である。効率的な試験および人
工的な飼育により、ヤギおよびヒツジの群れから関節炎
脳炎ウイルスを比較的低コストで除去することは比較的
に簡単であった。
BIVの他の可能な経済効果は、とりわけウシ海綿様脳
症（BSE）（狂牛病（mad cow disease））がイギリスの
牛産業に打撃を与えたヨーロッパにおいて、遅発性ウイ
ルス（slow virus）に対する公衆の恐怖である。AIDSウ
イルスに関連するレンチウイルスが乳を介して伝播し得
るという事実が知られたなら、ウシ集団がBIVフリーで
あると言明されることに対する公衆の強い要求が現れる
であろうと思われる。単に“BIVが存在しないことおよ
びおそらくヒトには有害な影響はないであろうこと”を
宣言するだけでは、もはや産業にとって充分ではないで
あろう。英国ではBSEの拡散の制御に失敗したがために2
0,000頭以上のウシが屠殺されている。
症（BSE）（狂牛病（mad cow disease））がイギリスの
牛産業に打撃を与えたヨーロッパにおいて、遅発性ウイ
ルス（slow virus）に対する公衆の恐怖である。AIDSウ
イルスに関連するレンチウイルスが乳を介して伝播し得
るという事実が知られたなら、ウシ集団がBIVフリーで
あると言明されることに対する公衆の強い要求が現れる
であろうと思われる。単に“BIVが存在しないことおよ
びおそらくヒトには有害な影響はないであろうこと”を
宣言するだけでは、もはや産業にとって充分ではないで
あろう。英国ではBSEの拡散の制御に失敗したがために2
0,000頭以上のウシが屠殺されている。
それゆえ、ウシ集団の大スケールのスクリーニングに
使用するのに適した、ウシにおけるBIVに対する抗体の
検出のための迅速で経済的な試験に対して緊急の必要性
が存在する。このタイプの試験キットは、BIVが根源的
な原因かどうかを調べるために慢性的な不健康の発生率
の高いウシ集団をスクリーニングするうえで特に有用で
あり、また、これまでBIVフリーであったウシ集団の地
理的領域または国にBIVが輸入されることを防ぐために
動物をスクリーニングするうえで有用である。
使用するのに適した、ウシにおけるBIVに対する抗体の
検出のための迅速で経済的な試験に対して緊急の必要性
が存在する。このタイプの試験キットは、BIVが根源的
な原因かどうかを調べるために慢性的な不健康の発生率
の高いウシ集団をスクリーニングするうえで特に有用で
あり、また、これまでBIVフリーであったウシ集団の地
理的領域または国にBIVが輸入されることを防ぐために
動物をスクリーニングするうえで有用である。
BIVおよびFIVの両方のための現在利用できる試験系で
は、全ウイルスに由来するかまたは組換え由来タンパク
質に由来するポリペプチド物質、またはそのようなポリ
ペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体を利
用している。たとえば、イデックス・コーポレーション
による国際特許出願第WO90/1357号および第WO90/06510
号（その全開示が参照のため本明細書中に引用される）
を参照。それゆえ、費用を削減した人に対する危険を回
避するため、合成ペプチド抗原を利用した迅速で便利で
経済的なアッセイに対する緊急の必要性が存在する。血
液試料の不必要な操作（それ自体、該物質を操作する人
に危険を与え得る）を回避するため、全血試料で行うこ
とのできるアッセイが特に有利である。そのようなアッ
セイは、アジェン・リミッティッド（Agen Limited）に
よる我々の以前のオーストラリア特許出願第22224/88号
および第24182/88号に記載されており、SimpliREDの名
称で市場に出されている。
は、全ウイルスに由来するかまたは組換え由来タンパク
質に由来するポリペプチド物質、またはそのようなポリ
ペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体を利
用している。たとえば、イデックス・コーポレーション
による国際特許出願第WO90/1357号および第WO90/06510
号（その全開示が参照のため本明細書中に引用される）
を参照。それゆえ、費用を削減した人に対する危険を回
避するため、合成ペプチド抗原を利用した迅速で便利で
経済的なアッセイに対する緊急の必要性が存在する。血
液試料の不必要な操作（それ自体、該物質を操作する人
に危険を与え得る）を回避するため、全血試料で行うこ
とのできるアッセイが特に有利である。そのようなアッ
セイは、アジェン・リミッティッド（Agen Limited）に
よる我々の以前のオーストラリア特許出願第22224/88号
および第24182/88号に記載されており、SimpliREDの名
称で市場に出されている。
我々は、いまや、哺乳動物免疫不全ウイルスのエンベ
ロープタンパク質の経膜部分の高度に保存された領域中
の免疫優性領域を同定することができることを予期せず
見いだした。この配列は、通常のポリペプチド合成法を
用いて合成することができ、該ウイルスに向けられた抗
体を検出するためのイムノアッセイにおいて用いること
ができる。この知見は、これらタンパク質における差異
が知られていることおよび異なる種からの免疫不全ウイ
ルスの抗原性における差異が知られていることを考慮す
ると驚くべきことである。
ロープタンパク質の経膜部分の高度に保存された領域中
の免疫優性領域を同定することができることを予期せず
見いだした。この配列は、通常のポリペプチド合成法を
用いて合成することができ、該ウイルスに向けられた抗
体を検出するためのイムノアッセイにおいて用いること
ができる。この知見は、これらタンパク質における差異
が知られていることおよび異なる種からの免疫不全ウイ
ルスの抗原性における差異が知られていることを考慮す
ると驚くべきことである。
発明の簡単な記載 本発明の一つの態様によれば、哺乳動物免疫不全ウイ
ルスのエンベロープタンパク質の免疫優性領域のジスル
フィドループペプチドが提供される。
ルスのエンベロープタンパク質の免疫優性領域のジスル
フィドループペプチドが提供される。
好ましくは、このペプチドは、有蹄動物かまたはネコ
科動物のいずれかに感染する免疫不全ウイルスに由来す
る。この明細書の目的のためには、“有蹄動物”は、ウ
ングラータ（Ungulata）科の全部、たとえばウシ、バッ
ファロー、スイギュウおよびヤクを含むウシ科動物；ヒ
ツジ；ヤギ；ウマ；ラクダ；トナカイ、アカシカ、ダマ
ジカおよびノロを含むシカ；アンテロープ；ラマ；アル
パカ；ビクーニャ；およびグアナコを包含するものであ
る。“ネコ科動物”なる語は、家庭のネコ、ライオン、
トラ、ジャガー、ヒョウ、ピューマ、オセロットなどを
含むネコ目の全成員を包含するものと理解されるべきで
ある。
科動物のいずれかに感染する免疫不全ウイルスに由来す
る。この明細書の目的のためには、“有蹄動物”は、ウ
ングラータ（Ungulata）科の全部、たとえばウシ、バッ
ファロー、スイギュウおよびヤクを含むウシ科動物；ヒ
ツジ；ヤギ；ウマ；ラクダ；トナカイ、アカシカ、ダマ
ジカおよびノロを含むシカ；アンテロープ；ラマ；アル
パカ；ビクーニャ；およびグアナコを包含するものであ
る。“ネコ科動物”なる語は、家庭のネコ、ライオン、
トラ、ジャガー、ヒョウ、ピューマ、オセロットなどを
含むネコ目の全成員を包含するものと理解されるべきで
ある。
免疫不全ウイルスがFIVの場合、該ペプチドは、下
記： のようにFIVペタルマ株のenv gp40タンパク質のアミノ
酸680〜711、または該配列内の８またはそれ以上、好ま
しくは10〜20、さらに好ましくは20〜25、最も好ましく
は25〜35アミノ酸の配列からなるのが好ましい。
記： のようにFIVペタルマ株のenv gp40タンパク質のアミノ
酸680〜711、または該配列内の８またはそれ以上、好ま
しくは10〜20、さらに好ましくは20〜25、最も好ましく
は25〜35アミノ酸の配列からなるのが好ましい。
免疫不全ウイルスがBIVの場合、該ペプチドは、下
記： のようにenv gp42タンパク質のアミノ酸625〜660、また
は該配列内の８またはそれ以上、好ましくは10〜20、さ
らに好ましくは20〜25、最も好ましくは25〜35アミノ酸
からなるのが好ましい。
記： のようにenv gp42タンパク質のアミノ酸625〜660、また
は該配列内の８またはそれ以上、好ましくは10〜20、さ
らに好ましくは20〜25、最も好ましくは25〜35アミノ酸
からなるのが好ましい。
FIVおよびBIVの両方に対して、対応する領域を包含す
る他の単離物を用いることもできる。
る他の単離物を用いることもできる。
上記配列は、表１に示すように、１文字のアミノ酸コ
ードで表してある。
ードで表してある。
本発明によるペプチドは、BIVやFIVなどの適当なウイ
ルスの配列に由来する対応DNA配列を利用した組換えDNA
法を用いて合成することもできるが、通常の固相ペプチ
ド合成法を用いて化学的に合成するのが好ましい。
ルスの配列に由来する対応DNA配列を利用した組換えDNA
法を用いて合成することもできるが、通常の固相ペプチ
ド合成法を用いて化学的に合成するのが好ましい。
本発明の第二の側面に従い、哺乳動物免疫不全ウイル
スのエンベロープタンパク質の免疫優性領域のジスルフ
ィドループペプチドに対して向けられたポリクローナル
またはモノクローナル抗体が提供される。そのような抗
体は、当該技術分野でよく知られた種々の通常の方法に
より調製することができる。使用できる抗体としては、
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、またはＦ
（ab）、Ｆ（ab）２、Fv、単鎖Fv、またはVHフラグメン
トを含む免疫学的に機能を有するそのフラグメントが挙
げられる。フラグメントは、通常の方法または組換えDN
A法により調製することができる。
スのエンベロープタンパク質の免疫優性領域のジスルフ
ィドループペプチドに対して向けられたポリクローナル
またはモノクローナル抗体が提供される。そのような抗
体は、当該技術分野でよく知られた種々の通常の方法に
より調製することができる。使用できる抗体としては、
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、またはＦ
（ab）、Ｆ（ab）２、Fv、単鎖Fv、またはVHフラグメン
トを含む免疫学的に機能を有するそのフラグメントが挙
げられる。フラグメントは、通常の方法または組換えDN
A法により調製することができる。
本発明の第三の側面に従い、上記ペプチドを包含する
試薬を使用する工程からなる、該ウイルスに暴露された
哺乳動物からの生物学的試料中の哺乳動物免疫不全ウイ
ルスに対する抗体を検出するためのイムノアッセイが提
供される。好ましくは、該イムノアッセイは試験キット
の形態で提供される。
試薬を使用する工程からなる、該ウイルスに暴露された
哺乳動物からの生物学的試料中の哺乳動物免疫不全ウイ
ルスに対する抗体を検出するためのイムノアッセイが提
供される。好ましくは、該イムノアッセイは試験キット
の形態で提供される。
そのようなアッセイには、たとえば、ELISA、粒子凝
集アッセイ、自己赤血球凝集アッセイ、他の凝集アッセ
イ、ラジオイムノアッセイ、および蛍光イムノアッセイ
が含まれる。本発明の特に好ましい態様において、該ア
ッセイは、オーストラリア特許出願第22224/88号および
第24182/88号（その全開示が参照のため本明細書中に引
用される）に記載されているように、直接または間接の
全血凝集アッセイである。
集アッセイ、自己赤血球凝集アッセイ、他の凝集アッセ
イ、ラジオイムノアッセイ、および蛍光イムノアッセイ
が含まれる。本発明の特に好ましい態様において、該ア
ッセイは、オーストラリア特許出願第22224/88号および
第24182/88号（その全開示が参照のため本明細書中に引
用される）に記載されているように、直接または間接の
全血凝集アッセイである。
本発明の第四の側面に従い、上記ペプチドに対して向
けられた抗体からなる、哺乳動物免疫不全ウイルスのた
めの免疫吸着体が提供される。
けられた抗体からなる、哺乳動物免疫不全ウイルスのた
めの免疫吸着体が提供される。
本発明はFIVおよびBIVに言及して特に記載してある
が、本発明はその範囲内に他の哺乳動物免疫不全ウイル
スのenvタンパク質の経膜部分の対応免疫優性領域を包
含することが明らかに理解されるであろう。
が、本発明はその範囲内に他の哺乳動物免疫不全ウイル
スのenvタンパク質の経膜部分の対応免疫優性領域を包
含することが明らかに理解されるであろう。
さらに、HIV−１およびHIV−２と同様に、FIV、BIVま
たは他の哺乳動物免疫不全ウイルスのサブタイプのペプ
チドも本発明は包含することが理解されるであろう。
たは他の哺乳動物免疫不全ウイルスのサブタイプのペプ
チドも本発明は包含することが理解されるであろう。
さらに、上記で言及した特定のペプチドは、特定され
た配列を含む約35のアミノ酸からなるが、適当な抗体に
より認識されるコンフォメーションが保存される限り、
本発明のペプチドが類似体または該配列中に列挙された
アミノ酸の保存的な置換体を包含することは理解される
べきである。また、該配列は、上記配列のいずれの末端
に対してもアミノ酸がさらに付加することによって伸長
することができること（とりわけ、適当なenvタンパク
質の公知の配列に由来する伸長）、または該配列はいず
れかの末端からアミノ酸を欠失させることにより修飾す
ることができることが理解されるべきである。
た配列を含む約35のアミノ酸からなるが、適当な抗体に
より認識されるコンフォメーションが保存される限り、
本発明のペプチドが類似体または該配列中に列挙された
アミノ酸の保存的な置換体を包含することは理解される
べきである。また、該配列は、上記配列のいずれの末端
に対してもアミノ酸がさらに付加することによって伸長
することができること（とりわけ、適当なenvタンパク
質の公知の配列に由来する伸長）、または該配列はいず
れかの末端からアミノ酸を欠失させることにより修飾す
ることができることが理解されるべきである。
発明の詳細な記載 つぎに、本発明を下記非限定的実施例のみを参照し、
また添付の図面を参照して記載する。
また添付の図面を参照して記載する。
添付の図面中、図１は合成FIVペプチド抗原およびFIV
陽性の抗血清を用いたELISAアッセイの結果を示す。
陽性の抗血清を用いたELISAアッセイの結果を示す。
実施例１ ペプチドの合成 Boc−アミノ酸を用いたアプライドバイオシステムズ
自動化ペプチド合成機を用い（ケンプ（Kemp,B.E.）
ら、Science（1988）241 1352−1354）、固相合成のメ
リフィールド（Merrifield）法を用いて上記FIV（680−
711）およびBIV（625−660）を合成した。当業者によく
知られているように、たとえばFmocや他の保護アミノ酸
誘導体を用いる方法などの別の化学的方法を用いること
もできる。
自動化ペプチド合成機を用い（ケンプ（Kemp,B.E.）
ら、Science（1988）241 1352−1354）、固相合成のメ
リフィールド（Merrifield）法を用いて上記FIV（680−
711）およびBIV（625−660）を合成した。当業者によく
知られているように、たとえばFmocや他の保護アミノ酸
誘導体を用いる方法などの別の化学的方法を用いること
もできる。
４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂を用い、ペプチ
ドをカルボキシ末端アミノとして調製した。このペプチ
ドを固相樹脂から開裂させ、同時に無水フッ化水素で処
理した脱保護した。遊離になったペプチドを、そのアミ
ノ酸組成に応じてカチオンまたはアニオン交換クロマト
グラフィーのいずれかにより、ついで0.1％トリフルオ
ロ酢酸かまたは0.1M重炭酸アンモニウムのいずれかの中
での逆相クロマトグラフィーにより精製した（ケンプお
よびピアソン（Pearson R.B.）；タンパク質リン酸化
（ハンター（T.Hunter）およびセフトン（B.M.Sefto
n））中の“プロテインキナーゼのためのペプチド基質
の設計および使用”、Methods in Enzymology、1991 20
0 121−134）。
ドをカルボキシ末端アミノとして調製した。このペプチ
ドを固相樹脂から開裂させ、同時に無水フッ化水素で処
理した脱保護した。遊離になったペプチドを、そのアミ
ノ酸組成に応じてカチオンまたはアニオン交換クロマト
グラフィーのいずれかにより、ついで0.1％トリフルオ
ロ酢酸かまたは0.1M重炭酸アンモニウムのいずれかの中
での逆相クロマトグラフィーにより精製した（ケンプお
よびピアソン（Pearson R.B.）；タンパク質リン酸化
（ハンター（T.Hunter）およびセフトン（B.M.Sefto
n））中の“プロテインキナーゼのためのペプチド基質
の設計および使用”、Methods in Enzymology、1991 20
0 121−134）。
この手順に従って合成したペプチドは、それぞれFIV
およびBIVに対する抗体に対して高度に反応性であり、
自己赤血球凝集、粒子凝集、エンザイムイムノアッセイ
およびラジオイムノアッセイを含む種々のイムノアッセ
イに用いることができる。
およびBIVに対する抗体に対して高度に反応性であり、
自己赤血球凝集、粒子凝集、エンザイムイムノアッセイ
およびラジオイムノアッセイを含む種々のイムノアッセ
イに用いることができる。
これら配列を有するペプチドは、内部のジスルフィド
結合を含んでいる。これらペプチドは、酸化形または還
元形のいずれか、または結合基または保護基とともに用
いることができる。たとえば、これらペプチドは、担体
分子と結合させることができる。
結合を含んでいる。これらペプチドは、酸化形または還
元形のいずれか、または結合基または保護基とともに用
いることができる。たとえば、これらペプチドは、担体
分子と結合させることができる。
BIV p26抗原からのペプチドは、比較目的のために同
様の方法を用いて合成し、FIVについて以前に行われた
ように（WO 90/1357参照）エピトープの存在についてス
クリーニングする。
様の方法を用いて合成し、FIVについて以前に行われた
ように（WO 90/1357参照）エピトープの存在についてス
クリーニングする。
実施例２ FIVの合成ペプチド（680−711）を用いたELI
SAアッセイ 炭酸緩衝液中または30％酢酸中の0.25〜1gのペプチド
でマイクロタイタープレートのウエルをコーティングし
た。試験血清をウエル中で1:100の希釈にてインキュベ
ートした。第二の試薬はプロテインＡ−西洋ワサビペル
オキシダーゼであった。反応液をABTSで20分間展開し、
マイクロタイタープレートリーダーで405nmにて読み取
った。結果を以下のようにして定義した： “陽性”結果は0.3より大きい光学密度を有してい
た； “近接した（close）”結果は0.2と0.5の間の光学密
度を有していた； “強い”結果は1.0と3.0の間の光学密度を有してい
た。
SAアッセイ 炭酸緩衝液中または30％酢酸中の0.25〜1gのペプチド
でマイクロタイタープレートのウエルをコーティングし
た。試験血清をウエル中で1:100の希釈にてインキュベ
ートした。第二の試薬はプロテインＡ−西洋ワサビペル
オキシダーゼであった。反応液をABTSで20分間展開し、
マイクロタイタープレートリーダーで405nmにて読み取
った。結果を以下のようにして定義した： “陽性”結果は0.3より大きい光学密度を有してい
た； “近接した（close）”結果は0.2と0.5の間の光学密
度を有していた； “強い”結果は1.0と3.0の間の光学密度を有してい
た。
感染したネコからの力価は通常800〜1600であった
が、6400までの範囲であった。
が、6400までの範囲であった。
粗製のペプチド抗原を用いて得られた結果を図１にま
とめて示す。１μｇのペプチドおよび1:100の血清希釈
を標準として選択して通常のスクリーニングに使用し
た。
とめて示す。１μｇのペプチドおよび1:100の血清希釈
を標準として選択して通常のスクリーニングに使用し
た。
西オーストラリアで単離したウイルスの試料で皮下注
射することにより、８匹の子猫をFIVで実験的に感染さ
せ、接種後にELISAを用いて試験した。２週間ですべて
の子猫は血清陰性であったが、４週間後には血清陽性で
あった。力価は６週間後にピークに達し、400〜6400の
範囲であった。
射することにより、８匹の子猫をFIVで実験的に感染さ
せ、接種後にELISAを用いて試験した。２週間ですべて
の子猫は血清陰性であったが、４週間後には血清陽性で
あった。力価は６週間後にピークに達し、400〜6400の
範囲であった。
実施例３ FIV p26タンパク質についてのELISAアッセイ
との比較 36アミノ酸のペプチドを用いたELISAを、FIV p26抗原
に基づく市販のELISA（“Pet Chek";イデックス・コー
ポレーション）と比較した。この比較は、表２にまとめ
たように、幾つかの不一致の結果を示した。
との比較 36アミノ酸のペプチドを用いたELISAを、FIV p26抗原
に基づく市販のELISA（“Pet Chek";イデックス・コー
ポレーション）と比較した。この比較は、表２にまとめ
たように、幾つかの不一致の結果を示した。
上記16の不一致の結果のうち14は、一方または両方の
試験に基づいてカットオフ値に近いものであった。これ
ら結果は、優れた感度（Pet Chekアッセイでは示されな
かった陽性反応を検出することができたという点で）お
よび優れた特異性（Pet Chekアッセイは偽陽性の結果を
示したと思われる点で）の両方を示した。
試験に基づいてカットオフ値に近いものであった。これ
ら結果は、優れた感度（Pet Chekアッセイでは示されな
かった陽性反応を検出することができたという点で）お
よび優れた特異性（Pet Chekアッセイは偽陽性の結果を
示したと思われる点で）の両方を示した。
実施例４ 全血凝集アッセイ オーストラリア特許出願第22224/88号および第24182/
88号に記載されているように、またウイルソン（Wilso
n,K.M.）ら、J.Immunol.Methods、1991 138 119−128に
も記載されているように（その全開示を参照のため本明
細書中に引用する）、ネコ血液試料を全血凝集アッセイ
を用いても試験した。本発明の合成FIVペプチドおよび
ネコ赤血球細胞に対して向けられた抗体を用いることに
より、この方法をFIVおよびネコ血液と使用するのに適
合させた。この抗体は、通常の方法を用いて免疫するこ
とにより調製した。
88号に記載されているように、またウイルソン（Wilso
n,K.M.）ら、J.Immunol.Methods、1991 138 119−128に
も記載されているように（その全開示を参照のため本明
細書中に引用する）、ネコ血液試料を全血凝集アッセイ
を用いても試験した。本発明の合成FIVペプチドおよび
ネコ赤血球細胞に対して向けられた抗体を用いることに
より、この方法をFIVおよびネコ血液と使用するのに適
合させた。この抗体は、通常の方法を用いて免疫するこ
とにより調製した。
FIVのための全血凝集アッセイ試験キット 成分： 1.抗赤血球抗体:H74.53.4Cl/180 吸光係数1.0 2.抗ペプチド抗体 ａ）アフィニティーカラムおよび西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ標識： K20.83.4D4/4−91 IgG1、吸光係数1.65 ｂ）陽性コントロール:K21.83.1B5/25 IgM 3.FIVペプチド FIV 680−711（gp40）の主要なコートタンパク質の免
疫優性領域に対応 （ａ）赤血球結合分子H74.53.4Cl/180の調製 ネコ赤血球細胞に対して向けられた抗体を、通常の免
疫およびスクリーニング手順を用いて調製した。マウス
をネコ赤血球細胞で免疫し、免疫した動物の脾臓細胞を
マウスミエローマ細胞と融合することによりモノクロー
ナル抗体を製造した。これら抗体をスピン凝集アッセイ
によりスクリーニングした。スピン凝集は、ファイアッ
ト（Wyatt）とストリート（Street）の方法（Aust J Me
d Lab Sci、４ 48−50）の変法により行った。50μｌの
細胞培養上澄み液を50μｌの１％赤血球細胞懸濁液とマ
イクロタイタープレート中で混合した。この実施例で
は、グリコホリンには結合したが凝集はしなかった抗体
を選択した。384のウエルのうち、50の主要なクローン
を選択した。その後に吸光研究を行い（50のネコ全血試
料）、モノクローナル抗体H74.53.4Cl/180（4Cl/180）
を選択した。
ダーゼ標識： K20.83.4D4/4−91 IgG1、吸光係数1.65 ｂ）陽性コントロール:K21.83.1B5/25 IgM 3.FIVペプチド FIV 680−711（gp40）の主要なコートタンパク質の免
疫優性領域に対応 （ａ）赤血球結合分子H74.53.4Cl/180の調製 ネコ赤血球細胞に対して向けられた抗体を、通常の免
疫およびスクリーニング手順を用いて調製した。マウス
をネコ赤血球細胞で免疫し、免疫した動物の脾臓細胞を
マウスミエローマ細胞と融合することによりモノクロー
ナル抗体を製造した。これら抗体をスピン凝集アッセイ
によりスクリーニングした。スピン凝集は、ファイアッ
ト（Wyatt）とストリート（Street）の方法（Aust J Me
d Lab Sci、４ 48−50）の変法により行った。50μｌの
細胞培養上澄み液を50μｌの１％赤血球細胞懸濁液とマ
イクロタイタープレート中で混合した。この実施例で
は、グリコホリンには結合したが凝集はしなかった抗体
を選択した。384のウエルのうち、50の主要なクローン
を選択した。その後に吸光研究を行い（50のネコ全血試
料）、モノクローナル抗体H74.53.4Cl/180（4Cl/180）
を選択した。
完全な抗体をProsep A製造法により精製した。精製し
たモノクローナル抗体4Cl/180を１％w/wペプチドで37℃
にて40分間消化した。この抗体を1/10 12％酢酸でpH3.5
まで酸性にした。3.5Mトリス緩衝液（pH8.0）を添加し
てpHを８まで上げることにより反応を停止させ、Ｆ（a
b）２フラグメントをS200ゲル濾過クロマトグラフィー
により精製した。
たモノクローナル抗体4Cl/180を１％w/wペプチドで37℃
にて40分間消化した。この抗体を1/10 12％酢酸でpH3.5
まで酸性にした。3.5Mトリス緩衝液（pH8.0）を添加し
てpHを８まで上げることにより反応を停止させ、Ｆ（a
b）２フラグメントをS200ゲル濾過クロマトグラフィー
により精製した。
Ｆ（ab）２フラグメントを最終濃度が10mMのメルカプ
トエチルアミンとともに37℃にて30分間インキュベート
して還元した。部分的に還元したFabフラグメントを、1
0mg/mlのDTNBとともに室温にて30分間反応させ、ついで
最終濃度が30mMのヨードアセトアミドを室温にて30分間
添加することにより安定化した。ついで、得られたFab
−TNB−AcフラグメントをウルトロゲルAcA44ゲル濾過ク
ロマトグラフィーにより精製した。
トエチルアミンとともに37℃にて30分間インキュベート
して還元した。部分的に還元したFabフラグメントを、1
0mg/mlのDTNBとともに室温にて30分間反応させ、ついで
最終濃度が30mMのヨードアセトアミドを室温にて30分間
添加することにより安定化した。ついで、得られたFab
−TNB−AcフラグメントをウルトロゲルAcA44ゲル濾過ク
ロマトグラフィーにより精製した。
（ｂ）FIVペプチドの調製： FIV 680−711（gp40）（上記配列）の主要なコートタ
ンパク質の免疫優性領域に対応するペプチドを、0.5Mジ
チオトレイトールで室温にて30分間還元した。10mM HCl
を添加して反応を停止させた。この混合物を、10mlの4
0:60アセトニトリル:HCl溶液で処理したSep−pak C18カ
ートリッジ（ミリポア・ウオーターズ）に適用した。還
元したペプチドをSep−pakに３回循環させ、20mlの10mM
HCLで洗浄し、ついで5mlの40:60アセトニトリル:HClで
溶出した。ついで、還元したペプチドを一夜、凍結乾燥
した。
ンパク質の免疫優性領域に対応するペプチドを、0.5Mジ
チオトレイトールで室温にて30分間還元した。10mM HCl
を添加して反応を停止させた。この混合物を、10mlの4
0:60アセトニトリル:HCl溶液で処理したSep−pak C18カ
ートリッジ（ミリポア・ウオーターズ）に適用した。還
元したペプチドをSep−pakに３回循環させ、20mlの10mM
HCLで洗浄し、ついで5mlの40:60アセトニトリル:HClで
溶出した。ついで、還元したペプチドを一夜、凍結乾燥
した。
（ｃ）ペプチドと抗体の結合およびFIV試薬の精製： 上記“b"のペプチドを6Mグアニジン−HCL中に溶解
し、上記（ａ）からの4Cl/180 Fab−TNB−Ac混合物と0.
5（1.0）:1.0ペプチド：抗体のモル比にて室温にて１分
間混合した。最終濃度が30mMのヨードアセトアミドを室
温にて30分間添加することにより反応を停止させた。
し、上記（ａ）からの4Cl/180 Fab−TNB−Ac混合物と0.
5（1.0）:1.0ペプチド：抗体のモル比にて室温にて１分
間混合した。最終濃度が30mMのヨードアセトアミドを室
温にて30分間添加することにより反応を停止させた。
ウルトロゲルAcA44ゲル濾過カラム上で最初の精製を
行って遊離のペプチドを除き、ついで抗ペプチド抗体カ
ラム（K20.83.4D4/4−91）上でアフィニティー精製を行
って遊離の4Cl/180抗体を除いた。ついで、ウルトロゲ
ルAcA44ゲル濾過カラム上で最終精製を行った。
行って遊離のペプチドを除き、ついで抗ペプチド抗体カ
ラム（K20.83.4D4/4−91）上でアフィニティー精製を行
って遊離の4Cl/180抗体を除いた。ついで、ウルトロゲ
ルAcA44ゲル濾過カラム上で最終精製を行った。
（ｄ）FIV試薬の調合およびアッセイ手順： リン酸緩衝食塩水（pH7.4;10μg/mlの２−NBA、0.5％
にべ、および0.5mg/mlの3Al/48 Fab/Acブロッカー抗体
を含有）中でFIV試薬を15μg/mlに調合した。
にべ、および0.5mg/mlの3Al/48 Fab/Acブロッカー抗体
を含有）中でFIV試薬を15μg/mlに調合した。
アッセイのため、凝固阻止処理した血液をプラスチッ
クスライド上に置き、25μｌのFIV試薬を加え、混合し
た。スライドを２分間振動させ、凝集を読み取った。表
３および表４は、それぞれFIV陽性試料およびFIV陰性試
料を試験した結果を示す。
クスライド上に置き、25μｌのFIV試薬を加え、混合し
た。スライドを２分間振動させ、凝集を読み取った。表
３および表４は、それぞれFIV陽性試料およびFIV陰性試
料を試験した結果を示す。
実施例５ FIVの合成ペプチド（680−711）を用いたELI
SAアッセイの感度および特異性 FIVの合成ペプチド（680−711）を用い、ELISAアッセ
イの感度および特異性を評価するためさらに研究を行っ
た。マイクロタイタープレートのウエルを炭酸緩衝液中
または30％酢酸中の１μｇのペプチドでコーティングし
た。試験血清をウエル中で1:100の希釈にてインキュベ
ートした。第二の試薬はプロテインＡ−西洋ワサビペル
オキシダーゼであった。2,2'−アジノジ−（３−エチル
ベンズチアゾリン）スルホン酸（シグマ）で20分間反応
を展開し、マイクロタイタープレートリーダーで420nm
にて読み取った。91の陽性試料および91の陰性試料を試
験した結果を表５に示す。結果は以下に定義する通りで
あった： “陰性”結果は0.5未満の光学密度を有していた； “近接した”結果は0.5と1.5の間の光学密度を有して
いた； “陽性”結果は1.5を越える光学密度を有していた。
SAアッセイの感度および特異性 FIVの合成ペプチド（680−711）を用い、ELISAアッセ
イの感度および特異性を評価するためさらに研究を行っ
た。マイクロタイタープレートのウエルを炭酸緩衝液中
または30％酢酸中の１μｇのペプチドでコーティングし
た。試験血清をウエル中で1:100の希釈にてインキュベ
ートした。第二の試薬はプロテインＡ−西洋ワサビペル
オキシダーゼであった。2,2'−アジノジ−（３−エチル
ベンズチアゾリン）スルホン酸（シグマ）で20分間反応
を展開し、マイクロタイタープレートリーダーで420nm
にて読み取った。91の陽性試料および91の陰性試料を試
験した結果を表５に示す。結果は以下に定義する通りで
あった： “陰性”結果は0.5未満の光学密度を有していた； “近接した”結果は0.5と1.5の間の光学密度を有して
いた； “陽性”結果は1.5を越える光学密度を有していた。
実施例７ BIVペプチド ELISAアッセイおよび全血凝集アッセイの両方を用
い、上記FIVについて記載したようにしてBIV gp42ペプ
チドを試験しBIV p26抗原と比較した。
い、上記FIVについて記載したようにしてBIV gp42ペプ
チドを試験しBIV p26抗原と比較した。
BIVタンパク質p25を比較のための試験抗原として選択
した。というのは、実験的な感染においては、それがウ
エスタンブロッティングによって検出される主要な抗原
であり、自然の感染においてはp26に対する抗体が全て
の自然に感染したウシに存在するからである（ウエット
ストーンら;Journal of Virology（1990）64 3557−356
1）。
した。というのは、実験的な感染においては、それがウ
エスタンブロッティングによって検出される主要な抗原
であり、自然の感染においてはp26に対する抗体が全て
の自然に感染したウシに存在するからである（ウエット
ストーンら;Journal of Virology（1990）64 3557−356
1）。
自然に感染したウシおよび実験的に感染させたウシの
両方からの血清を試験した。
両方からの血清を試験した。
全血凝集アッセイについては、ELISAアッセイにおい
て最も有用であると同定されたペプチドをウシ赤血球に
結合するモノクローナル抗体に結合させる。
て最も有用であると同定されたペプチドをウシ赤血球に
結合するモノクローナル抗体に結合させる。
発明の利点 本発明によるペプチドは、全ウイルスまたはウイルス
溶解液のいずれを用いる必要もなく化学的に合成または
組換えタンパク質発現により製造される。ペプチドの使
用は、ウイルス溶解液または不純なタンパク質調製物の
使用に比べ、汚染タンパク質のため、または検出には必
要でないウイルスタンパク質の本質的でない領域の存在
により引き起こされる非特異的な交差反応性のための偽
陽性の結果を回避する。本発明の好ましい態様のペプチ
ドは合成的に調製されるので、品質を制御することがで
き、それゆえ試験結果の再生性が保証される。この発明
のペプチドはまた、強い体液性免疫反応および細胞性免
疫反応を引き起こすことがわかった。たとえば、ヒツジ
を繰り返し免疫すると1:50000の力価で免疫血清が誘発
された。それゆえ、本発明のペプチドは免疫吸着体とし
て有用であることが期待される。
溶解液のいずれを用いる必要もなく化学的に合成または
組換えタンパク質発現により製造される。ペプチドの使
用は、ウイルス溶解液または不純なタンパク質調製物の
使用に比べ、汚染タンパク質のため、または検出には必
要でないウイルスタンパク質の本質的でない領域の存在
により引き起こされる非特異的な交差反応性のための偽
陽性の結果を回避する。本発明の好ましい態様のペプチ
ドは合成的に調製されるので、品質を制御することがで
き、それゆえ試験結果の再生性が保証される。この発明
のペプチドはまた、強い体液性免疫反応および細胞性免
疫反応を引き起こすことがわかった。たとえば、ヒツジ
を繰り返し免疫すると1:50000の力価で免疫血清が誘発
された。それゆえ、本発明のペプチドは免疫吸着体とし
て有用であることが期待される。
本発明は、一般的概念であって、本明細書の前記具体
的記載に限定されないことは明らかに理解されるであろ
う。
的記載に限定されないことは明らかに理解されるであろ
う。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ (72)発明者 ケンプ、ブルース・アーネスト オーストラリア国3101ビクトリア、キュ ー、ケレット・グローブ20番 (72)発明者 ヒルヤード、カーメル・ジュディス オーストラリア国4064クイーンズラン ド、パディントン、ガリバー・ストリー ト21番 (72)発明者 リラット、デニス・ブライアン オーストラリア国4114クイーンズラン ド、ウッドリッジ、ポープ・ストリート ３番 (72)発明者 バンドセン、ピーター・グレゴリー オーストラリア国4069クイーンズラン ド、フィッグ・ツリー・ポケット、ゲー ムズ・ストリート15番 (56)参考文献 国際公開90／13573（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/155 C07K 7/06 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (14)
- 【請求項１】哺乳動物免疫不全ウイルスのエンベロープ
タンパク質の免疫優性領域のペプチドであって、ジスル
フィドループを含み、下記配列： KVEAMEKFLYTAFAMQELGCNQNQFFCKIPLE を有するネコ免疫不全ウイルスのenv gp40タンパク質の
アミノ酸680−711からの８〜36連続アミノ酸からなり、
該配列中に列挙されたアミノ酸の類似体または保存的な
置換体を含んでいてよく、該配列のＮ−末端および／ま
たはＣ−末端にネコ免疫不全ウイルスのenv gp40タンパ
ク質に由来するアミノ酸がさらに付加することによって
伸長していてよく、または該配列のＮ−末端および／ま
たはＣ−末端からアミノ酸が欠失していてよいことを特
徴とするペプチド。 - 【請求項２】10〜20のアミノ酸からなる請求項１に記載
のペプチド。 - 【請求項３】20〜25のアミノ酸からなる請求項１に記載
のペプチド。 - 【請求項４】25〜35のアミノ酸からなる請求項１に記載
のペプチド。 - 【請求項５】２つのシステイン残基を含む請求項１ない
し４のいずれかに記載のペプチド。 - 【請求項６】請求項１〜５のいずれか１に記載のペプチ
ドの調製法であって、工程： （ｉ）該ペプチドの配列を用意し、ついで （ii）該配列を用い、組換えDNA法および化学的合成法
よりなる群から選ばれた方法により該ペプチドを製造す
る を含む方法。 - 【請求項７】化学的合成法を用いる工程からなることを
特徴とする、請求項１〜５のいずれか１に記載のペプチ
ドの調製法。 - 【請求項８】請求項１〜５のいずれか１に記載のペプチ
ドに対して向けられたポリクローナルまたはモノクロー
ナル抗体またはＦ（ab）、Ｆ（ab）２、Fv、単鎖Fvもし
くはVHフラグメントから選ばれるそのフラグメントまた
は抗体類似体。 - 【請求項９】哺乳動物免疫不全ウイルスに暴露された哺
乳動物からの生物学的試料中の該ウイルスに対する抗体
の検出のためのイムノアッセイであって、工程： （ｉ）該哺乳動物からの生理学的流体の試料を請求項１
〜５のいずれか１に記載のペプチドと接触させ、 （ii）未結合の試薬を除去し、 （iii）検出可能な標識に結合させた、哺乳動物免疫グ
ロブリンに結合しうる試薬を加え、 （iv）未結合の試薬を除去し、ついで （ｖ）結合した標識を検出する を含むイムノアッセイ。 - 【請求項１０】該アッセイが直接または間接の全血凝集
アッセイである請求項９に記載のイムノアッセイ。 - 【請求項１１】請求項９に記載のイムノアッセイを行う
ための試験キットであって、 （ｉ）請求項１〜５のいずれか１に記載のペプチド、お
よび （ii）検出可能な標識に結合させた、哺乳動物免疫グロ
ブリンに結合しうる試薬を含む試験キット。 - 【請求項１２】さらに陽性コントロール試料を含む請求
項11に記載の試験キット。 - 【請求項１３】請求項10に記載のイムノアッセイを行う
ための試験キットであって、 （ｉ）ネコ赤血球を認識する抗体または抗体フラグメン
トに請求項１〜５のいずれか１に記載のペプチドを結合
させた試薬、および （ii）陽性コントロールの溶液 を含む試験キット。 - 【請求項１４】請求項８に記載の抗体からなることを特
徴とする、哺乳動物免疫不全ウイルスに対する免疫吸着
体。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPK671191 | 1991-06-14 | ||
| AU6711 | 1991-06-14 | ||
| PCT/AU1992/000280 WO1992022573A1 (en) | 1991-06-14 | 1992-06-12 | Detection of mammalian immunodeficiency viruses |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07502484A JPH07502484A (ja) | 1995-03-16 |
| JP3356280B2 true JP3356280B2 (ja) | 2002-12-16 |
Family
ID=3775473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51101692A Expired - Lifetime JP3356280B2 (ja) | 1991-06-14 | 1992-06-12 | 哺乳動物免疫不全ウイルスの検出 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5591572A (ja) |
| EP (1) | EP0602046B2 (ja) |
| JP (1) | JP3356280B2 (ja) |
| AT (1) | ATE160358T1 (ja) |
| AU (1) | AU667669B2 (ja) |
| CA (1) | CA2111325C (ja) |
| DE (1) | DE69223250T3 (ja) |
| WO (1) | WO1992022573A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6228608B1 (en) * | 1991-02-28 | 2001-05-08 | Aquila Biopharmaceuticals, Inc. | Recombinant FIV glycoprotein 160 and P24 gag protein |
| GB9219936D0 (en) * | 1992-09-21 | 1992-11-04 | Pitman Moore Inc | Vaccines |
| FR2721031B1 (fr) * | 1994-06-09 | 1996-07-26 | Centre Nat Rech Scient | Fragment peptidique spécifique du virus de l'immunodéficience féline (VIF) et son utilisation comme réactif de diagnostic. |
| FR2732346B1 (fr) * | 1995-03-27 | 1997-05-30 | Centre Nat Rech Scient | Proteines mutees, codees par un gene env mute de lentivirus, fragments peptidiques inclus dans lesdites proteines, vecteurs d'expression exprimant lesdites proteines mutees et leurs applications |
| US5849303A (en) * | 1995-06-07 | 1998-12-15 | American Home Products Corporation | Recombinant feline Immunodeficiency virus subunit vaccines employing baculoviral-expressed envelope glycoproteins derived from isolate NCSU-1 and their use against feline immunodeficiency virus infection |
| US6458528B1 (en) | 1998-05-15 | 2002-10-01 | Idexx Laboratories, Inc. | Diagnosis of feline immunodeficiency virus infection using ENV/GAG polypeptide markers |
| US7094884B2 (en) | 2001-06-22 | 2006-08-22 | Roche Diagnostics Corporation | Soluble complexes of amylod β peptide and peptidyl prolyl isomerase chaperone and methods of making and using them |
| US6962982B2 (en) | 2001-06-22 | 2005-11-08 | Roche Diagnostics Corporation | Soluble complexes of target proteins and peptidyl prolyl isomerase chaperones and methods of making and using them |
| US7094757B2 (en) | 2001-06-22 | 2006-08-22 | Roche Diagnostics Corporation | Complexes comprising a prion protein and a peptidyl prolyl isomerase chaperone, and method for producing and using them |
| MXPA03011455A (es) | 2001-06-22 | 2004-04-05 | Hoffmann La Roche | Complejo soluble que comprende glucoproteina de superficie retroviral. |
| FR2828687B1 (fr) * | 2001-08-17 | 2003-12-12 | Hippocampe | Nouveaux peptides et leur utilisation comme medicaments contre l'infection par le fiv chez le chat |
| ATE435425T1 (de) * | 2003-09-11 | 2009-07-15 | Idexx Lab Inc | Verfahren zum nachweis des felinen immunschwächevirus |
| AU2005267607B8 (en) * | 2003-09-11 | 2009-07-16 | Idexx Laboratories, Inc. | Method and device for detecting feline immunodeficiency virus |
| WO2005062053A2 (en) | 2003-12-18 | 2005-07-07 | Idexx Laboratories, Inc. | Method and device for detecting feline immunodeficiency virus |
| WO2005080939A2 (en) | 2004-02-19 | 2005-09-01 | Idexx Laboratories, Inc. | Method and device for detecting feline immunodeficiency virus |
| AU2005267605B2 (en) * | 2004-06-30 | 2009-03-26 | Idexx Laboratories, Inc. | Method and device for detecting feline immunodeficiency virus |
| JP4866848B2 (ja) | 2004-06-30 | 2012-02-01 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド | ネコ免疫不全ウイルス（ｆｉｖ）のｅｎｖタンパク質のｖ３領域に由来するペプチドの使用を含むｆｉｖを検出するための方法および装置 |
| US7291338B2 (en) | 2005-03-09 | 2007-11-06 | Idexx Laboratories, Inc. | Method and device for detecting feline immunodeficiency virus |
| WO2011123781A1 (en) | 2010-04-02 | 2011-10-06 | Idexx Laboratories, Inc. | Detection of feline immunodeficiency virus |
Citations (1)
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| WO1990013573A1 (en) | 1989-05-08 | 1990-11-15 | Idexx Corporation | Polypeptides of feline t-cell lymphotropic lentivirus |
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| US5086002A (en) * | 1987-09-07 | 1992-02-04 | Agen Biomedical, Ltd. | Erythrocyte agglutination assay |
| US4894347A (en) * | 1987-09-17 | 1990-01-16 | Agen Limited | Erythrocyte agglutination assay |
| US5177014A (en) * | 1988-12-05 | 1993-01-05 | Idexx Laboratories, Inc. | Monoclonal antibodies to feline-T-lymphotropic lentivirus |
| US5219725A (en) * | 1988-12-05 | 1993-06-15 | Idexx Laboratories Incorporated | Monoclonal antibodies to feline-t-lymphotropic lentivirus |
| US5380830A (en) * | 1989-09-18 | 1995-01-10 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Molecular clones of bovine immunodeficiency-like virus |
| FR2669338A1 (fr) * | 1990-11-21 | 1992-05-22 | Centre Nat Rech Scient | Fragments peptidiques issus de la proteine externe du vif, anticorps antifragments, application de ceux-ci au diagnostic et/ou au traitement de l'immunodeficience feline. |
| WO1993001304A1 (en) * | 1991-07-10 | 1993-01-21 | Synbiotics Corporation | Synthetic peptides related to fiv-env proteins |
-
1992
- 1992-06-12 AT AT92912386T patent/ATE160358T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1992-06-12 US US08/157,141 patent/US5591572A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-12 JP JP51101692A patent/JP3356280B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-12 AU AU19739/92A patent/AU667669B2/en not_active Expired
- 1992-06-12 DE DE69223250T patent/DE69223250T3/de not_active Expired - Lifetime
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- 1992-06-12 WO PCT/AU1992/000280 patent/WO1992022573A1/en not_active Ceased
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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| CA2111325A1 (en) | 1992-12-23 |
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