JP3360736B2

JP3360736B2 - ミコバクテリア属微生物を特異的に認識するプローブ及びミコバクテリア属微生物の検出方法

Info

Publication number: JP3360736B2
Application number: JP8630492A
Authority: JP
Inventors: 俊一竹脇; 良三永井; 捷子奥住; 昭行大久保
Original assignee: 株式会社ヤトロン
Priority date: 1992-03-10
Filing date: 1992-03-10
Publication date: 2002-12-24
Anticipated expiration: 2017-12-24
Also published as: JPH06133775A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ミコバクテリア（Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属に属する微生物を特異的に認
識するプローブ及びミコバクテリア属に属する微生物の
検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】結核をはじめとする抗酸菌感染症は、有
効な化学治療薬の開発、栄養状態の改善と生活の向上に
より、順調にその数が減少した。しかし、近年、その減
少傾向が鈍化している。１９８８年の結核症の登録患者
数は５万人を越えており、またＡＩＤＳや免疫低下時の
日和見感染症として、トリ型結核菌（ミコバクテリウム
・アビウム；Ｍ．ａｖｉｕｍ）などの非定型抗酸菌に感
染する例が数多く報告されている。そのため、各種抗酸
菌を個々に分別して感度良く検出し、迅速に鑑別するこ
とは治療方針を決定するうえで非常に重要である。

【０００３】従来、抗酸菌の検出は主に塗抹染色と培養
法によって行われてきた。塗抹染色は簡便ではあるが、
感度が低く、菌の同定ができない。これに対し、培養法
は高感度で抗酸菌を検出し、生化学的同定法により菌の
鑑別ができるという利点がある。しかし、抗酸菌は分裂
速度が非常に遅く、培養に３〜８週間の期間が必要であ
り、更に最終的な同定まで２〜４週間かかる。従って、
早期診断には不都合であった。

【０００４】一方、早期診断方法として、特開昭63-180
859 号公報には、ヒト型結核菌（ミコバクテリウム・ツ
ベルキュロシス；Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に特
異的なモノクローナル抗体をハイブリドーマ細胞ライン
によって産生させ、このモノクローナル抗体を用いる測
定方法が記載されている。しかし、この方法では被検試
料の前処理が煩雑であった。また、各種の結核菌に特異
的なＩ¹²⁵ラベル化ＤＮＡプローブを用いるハイブリダ
イゼーション法も開発されている（例えば、Ｄｉａｇ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８７；８：６９−７
８）。しかしながら、この方法は放射性物質を用いるの
で特殊な設備を必要とし、更に、臨床試料からヒト型結
核菌を直接的に検出・同定することが必ずしも常に可能
なわけではなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者は、臨床試料
中に含まれるヒト型結核菌及び非定型抗酸菌のＤＮＡを
特定のＤＮＡプライマーで高感度に増幅させ、その増幅
ＤＮＡを特定の制限酵素で消化し、その電気泳動パター
ンで抗酸菌を鑑別する方法を考案しすでに特開平４−３
６１９９号公報において開示した。その後、更に精度良
く迅速な診断を実現するために研究を重ねた結果、ミコ
バクテリア属に属する微生物１９種類のｄｎａＪタンパ
ク質をコードするＤＮＡの塩基配列における１４１４位
〜１６０９位の全塩基配列を確定し、１９種類の菌種に
特有な塩基配列が存在することを見い出した。そして、
それらの塩基配列を基にして各菌種を特異的に認識する
各種プローブを作成し、これらのプローブを用いること
によって、高感度で、しかも迅速にミコバクテリア属に
属する微生物を検出しそして分別することが可能となっ
た。従って、本発明の目的は、ミコバクテリア属に属す
る微生物を特異的に、高感度で、しかも迅速に検出し、
鑑別する手段を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、配列
番号５〜１９で表される塩基配列のいずれか１つの塩基
配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを用いること
を特徴とする、ミコバクテリア属に属する微生物の検出
方法に関する。また、本発明は、配列番号５〜１９で表
される塩基配列のいずれか１つの塩基配列からなるオリ
ゴヌクレオチドプローブにも関する。更に、本発明は、
配列番号３で表される塩基配列を含む第１のオリゴヌク
レオチドプライマーと、配列番号４で表される塩基配列
を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーとからなる
ことを特徴とする、前記検出方法用のプライマーセット
にも関する。

【０００７】本発明により、ｄｎａＪタンパク質をコー
ドするＤＮＡの塩基配列が確定した、１９種類のミコバ
クテリア属に属する微生物は以下のリスト１のとおりで
ある。また、それら１９種類の微生物の学名の後に、本
発明で用いた標準菌株の由来を示す（実施例２及び実施
例４参照）。ＮＩＨＪは国立予防衛生研究所（National
Institute of Health, Japan ）、ＡＴＣＣはAmerican
Type Culrture Collection 、ＮＣＴＣはNational Col
lection of Type Cultures、そしてＫＫは結核研究所で
ある。リスト１（１）ヒト型結核菌（ミコバクテリウム・ツベルキュロ
シス：M.tuberculosis;NIHJ 1633 ）（２）ウシ型結核菌ＢＣＧ（ミコバクテリウム・ボビス
ＢＣＧ：M.bovis BCG; KK 12-02 ）（３）ウシ型結核菌（ミコバクテリウム・ボビス：M.bo
vis; NIHJ 1607）（４）ミコバクテリウム・アフリカヌム（M.africanum;
NIHJ 1602）（５）ミコバクテリウム・ミクロチ（M.microti; KK 14
-01 ）（６）ミコバクテリウム・マリーナム（M.marinum; NIH
J 1620）（７）ミコバクテリウム・シミアエ（M.simiae; NIHJ 1
627 ）（８）ミコバクテリウム・スクロフラセウム（M.scrofu
laceum; NIHJ 1626 ）（９）ミコバクテリウム・スツルガイ（M.szulgai; NCT
C 10831 ）（１０）ミコバクテリウム・ゴルドネアー（M.gordona
e; NIHJ 1617 ）（１１）トリ型結核菌（ミコバクテリウム・アビウム：
M.avium; NIHJ 1605）（１２）ミコバクテリウム・イントラセルラーレ（M.in
tracellulare; ATCC 13950）（１３）ミコバクテリウム・ゼノピ（M.xenopi; NIHJ 1
638 ）（１４）ミコバクテリウム・ガストリ（M.gastri; NIHJ
1616 ）（１５）ミコバクテリウム・カンサシー（M.kansasii;
ATCC 12478）（１６）ミコバクテリウム・フォートゥイタム（M.fort
uitum; NIHJ 1615）（１７）ミコバクテリウム・チェロナイ（M.chelonei;
NIHJ 1611 ）（１８）ミコバクテリウム・ヘモフィルム（M.hemophil
um; KK 49-01）（１９）ミコバクテリウム・パラツベルキュロシス（M.
paratuberculosis; ATCC19698）。

【０００８】前記の１９種類の抗酸菌はそれぞれ、特異
的タンパク質であるｄｎａＪタンパク質を有しており、
それらのアミノ酸配列もほぼ共通していると考えられ
る。そこで本発明者は、各抗酸菌のｄｎａＪタンパク質
をコードするＤＮＡに着目し、該タンパク質をコードす
るＤＮＡの塩基配列を決定することとした。まず、該Ｄ
ＮＡを増幅するためにＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法を用いた。ＰＣＲ法
を利用すると、微量の細胞ＤＮＡから、目的とするＤＮ
Ａ領域のみを自動的に約１００万倍にまで増幅すること
ができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７−４９１，
１９８８）。ＰＣＲ法では、増幅させるＤＮＡ領域を挟
んで＋鎖および−鎖に対する２種類のＤＮＡプライマー
と、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅サイクルを
繰り返す。

【０００９】ｄｎａＪタンパク質をコードするＤＮＡを
増幅するためのプライマーとしては、特開平４−３６１
９９号公報に開示されているプライマーを使用すること
ができる。即ち、プライマー１として配列表の配列番号
１の配列に記載の塩基配列の少なくとも１０塩基のオリ
ゴヌクレオチド部分を含有するＤＮＡプライマーを用
い、プライマー２として配列表の配列番号２の配列に記
載の塩基配列の少なくとも１０塩基のオリゴヌクレオチ
ド部分を含有するＤＮＡプライマーを用いることによ
り、各抗酸菌のｄｎａＪタンパク質をコードするＤＮＡ
の第１４１４番目の塩基から第１６０９番目の塩基まで
の１９６ｂｐ（全体としては前後にプライマー部分を含
むので、２０塩基からなる各プライマーを用いれば、第
１３９４番目の塩基から第１６２９番目の塩基までの２
３６ｂｐ）の部分を特異的に増幅することができる。

【００１０】しかし、ミコバクテリウム・チェロナイ
（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎｅｉ）に対しては、前記のプライマ
ーセットでは増幅が行われないため、別のプライマーセ
ット、即ち、プライマー３として配列表の配列番号３の
配列に記載の塩基配列の少なくとも１０塩基のオリゴヌ
クレオチド部分を含有するＤＮＡプライマーを用い、プ
ライマー４として配列表の配列番号４の配列に記載の塩
基配列の少なくとも１０塩基のオリゴヌクレオチド部分
を含有するＤＮＡプライマーを用いることにより、１８
５ｂｐ（全体としては前後にプライマー部分を含むの
で、２０塩基からなる各プライマーを用いれば、２２５
ｂｐ）の部分を特異的に増幅することができる。塩基配
列の分析の結果、ミコバクテリウム・チェロナイではｄ
ｎａＪ遺伝子の１４０９位〜１４１８位の間で欠損が起
こっているために、プライマー１とプライマー２の組合
せでは増幅されないものと考えられる。

【００１１】これらのプライマー１〜４は、通常のＤＮ
Ａ自動合成機（例えば、アプライドバイオシステムズ社
の自動合成機）を用いて、公知のＤＮＡ合成法（例え
ば、ホスホアミダイト法）によって調製することができ
る。本発明では、ＤＮＡポリメラーゼとして、耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、特に約９５℃までの温度で活性を維
持することのできる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば
市販のＴａｑポリメラーゼを用いることができる。

【００１２】具体的には、前記特開昭４−３６１９９号
公報に記載の方法と同様に、前記リスト１に記載の１９
種類の抗酸菌の各培養菌体からＤＮＡを公知の技術によ
り抽出し、前記のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、又
は場合により緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液）、安
定化剤（例えば、ゼラチン）、又は塩類（例えば、塩化
ナトリウム）を含有させ、この混合液を用いてＰＣＲ法
の増幅サイクルを実施する。こうして増幅された各抗酸
菌のｄｎａＪ遺伝子について、従来公知のマクサム・ギ
ルバート法（ＭＧ法）、ダイデオキシ法、ゲノミック・
シークエンス法等によりＤＮＡ塩基配列を決定する。

【００１３】決定された塩基配列から、それぞれに特異
的な部分を選定し、１５〜４０塩基からなるオリゴヌク
レオチドのプローブを作成した。好適なプローブは、例
えば、以下のリスト２のとおりである。リスト２（１）ヒト型結核菌（M.tuberculosis）配列表の配列番号５の配列に記載の塩基配列の少なくと
も１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（２）ミコバクテリウム・カンサシー（M.kansasii）配列表の配列番号６の配列に記載の塩基配列の少なくと
も１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（３）トリ型結核菌（M.avium ）配列表の配列番号７の配列に記載の塩基配列の少なくと
も１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（４）ミコバクテリウム・イントラセルラーレ（M.intr
acellulare）配列表の配列番号８の配列に記載の塩基配列の少なくと
も１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（５）ミコバクテリウム・マリーナム（M.marinum ）配列表の配列番号９の配列に記載の塩基配列の少なくと
も１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（６）ミコバクテリウム・ガストリ（M.gastri）配列表の配列番号１０の配列に記載の塩基配列の少なく
とも１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（７）ミコバクテリウム・スクロフラセウム（M.scrofu
laceum）配列表の配列番号１１の配列に記載の塩基配列の少なく
とも１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（８）ミコバクテリウム・スツルガイ（M.szulgai ）配列表の配列番号１２の配列に記載の塩基配列の少なく
とも１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（９）ミコバクテリウム・ゴルドネアー（M.gordonae）配列表の配列番号１３の配列に記載の塩基配列の少なく
とも１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（１０）ミコバクテリウム・ゼノピ（M.xenopi）配列表の配列番号１４の配列に記載の塩基配列の少なく
とも１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（１１）ミコバクテリウム・シミアエ（M.simiae）配列表の配列番号１５の配列に記載の塩基配列の少なく
とも１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（１２）ミコバクテリウム・フォートゥイタム（M.fort
uitum ）配列表の配列番号１６の配列に記載の塩基配列の少なく
とも１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（１３）ミコバクテリウム・チェロナイ（M.chelonei）配列表の配列番号１７の配列に記載の塩基配列の少なく
とも１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（１４）ミコバクテリウム・ヘモフィルム（M.hemophil
um）配列表の配列番号１８の配列に記載の塩基配列の少なく
とも１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（１５）ミコバクテリウム・パラツベルキュロシス（M.
paratuberculosis）配列表の配列番号１９の配列に記載の塩基配列の少なく
とも１５塩基からなるオリゴヌクレオチド

【００１４】なお、ウシ型結核菌ＢＣＧ（M.bovis BCG
）、ウシ型結核菌（M.bovis ）、ミコバクテリウム・
アフリカヌム（M.africanum ）及びミコバクテリウム・
ミクロチ（M.microti ）のｄｎａＪ遺伝子の塩基配列
は、ヒト型結核菌のｄｎａＪ遺伝子の塩基配列と完全に
一致するので、これらを他の抗酸菌と分別するには、ヒ
ト型結核菌の場合と同じプローブを用いることができ
る。前記リスト２に記載のプローブは、前記のプライマ
ー１〜４と同様に、従来公知の手段により合成すること
ができる。

【００１５】本発明の各プローブは、前記リスト１に記
載の１９種類の抗酸菌の中から１５種類の抗酸菌を特異
的に認識することができる。ヒト型結核菌、ウシ型結核
菌ＢＣＧ、ウシ型結核菌、ミコバクテリウム・アフリカ
ヌム及びミコバクテリウム・ミクロチのｄｎａＪ遺伝子
塩基配列は完全に一致しているので、互いに識別できな
いが、結核菌群として一群を形成しているので臨床上支
障はない。即ち、本発明において、或る特定の１種類の
抗酸菌を特異的に認識するプローブは、その特定の抗酸
菌のｄｎａＪタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列
と一致する少なくとも１５塩基を含み、しかもその１５
塩基の配列が他の１４種の抗酸菌のｄｎａＪタンパク質
をコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも２個異なる
オリゴヌクレオチドを含むものである。ハイブリダイゼ
ーションの条件を適切に調整すれば、プローブの塩基配
列中の１塩基を変化させただけで、プローブとＤＮＡと
のハイブリダイズを起こさせないことも可能である。し
かしながら、信頼性や再現性の観点から、他の１４種の
抗酸菌のｄｎａＪタンパク質をコードするＤＮＡの塩基
配列と少なくとも２塩基が異なる塩基配列領域を特異プ
ローブ領域とする。従って、前記リスト２に示した塩基
配列は代表例の１つであり、この領域に限定されるもの
ではない。

【００１６】前記プローブを用いると、前記リスト１に
記載のミコバクテリア属に属する１５種類の微生物を特
異的に検出することができる。即ち、前記プローブに適
切な標識を付し、被検試料と接触させ、前記標識からの
信号を検出することにより、目的の微生物を特異的に検
出することができる。標識としては、放射性物質、より
好ましくは非放射性物質（例えば、酵素、ビオチン、蛍
光物質、発光物質）を用いることができる。

【００１７】検体は、ミコバクテリア属に属する微生物
を含有する恐れのある検体であれば特に制限されない
が、特には臨床試料、例えば、喀痰、胃吸引液、気管支
肺胞線状液、便、尿、髄液又は血液である。これらの検
体から抗酸菌のｄｎａＪタンパク質をコードするＤＮＡ
を公知の方法で取り出し、前記の各プローブとハイブリ
ダイズさせることのできる被検試料を作成する。ＤＮＡ
を取り出すには、例えば、プロテアーゼＫを含むＳＤＳ
溶液で前記検体を処理した後、更にクロロホルム／フェ
ノールで処理し、ＤＮＡをエタノール沈殿させる。採集
したＤＮＡをそのまま適当な担体（例えば、ナイロンフ
ィルター）に固定し、ドットブロットハイブリダイゼー
ション用の被検試料を作成するか、あるいは適当な制限
酵素で消化し、サザンブロッティングによって被検試料
を作成することができる。必要により、検体中のＤＮＡ
を、例えば前記のプライマー１〜４を用いてＰＣＲ法に
よって増幅させることもできる。

【００１８】本発明方法において、標識担持プローブと
被検試料中のＤＮＡとの接触は従来公知の方法、例えば
電気泳動後のフィルター上で、あるいは細胞を固定した
スライドグラス上で両者を合わせることにより行うこと
ができる。即ち、溶液中で両鎖が分子運動中に相補鎖と
出合うと、相互の塩基が水素結合することで２重鎖が形
成される。

【００１９】プローブに結合されている標識から信号を
発生させ、さらにその信号を測定する方法も、従来から
公知の任意の方法を用いることができる。例えば、標識
として放射性同位体を使用する場合には、ハイブリダイ
ズさせた後に放射線用乳剤あるいはＸ線フィルム上で露
光し、現像してその信号を検出する。また、標識として
ビオチンを使用する場合には、ハイブリダイズさせた後
にパーオキシダーゼ標識アビジンを反応させてビオチン
−アビジン複合体を形成させ、パーオキシダーゼの発色
を検出する。こうして結核菌群と非定型抗酸菌、更には
非定型抗酸菌の型別の検出が可能となる。

【００２０】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：プライマーの合成配列表の配列番号１の配列で表される２０塩基のオリゴ
ヌクレオチド（プライマー１）、配列表の配列番号２の
配列で表される２０塩基のオリゴヌクレオチド（プライ
マー２）、配列表の配列番号３の配列で表される２０塩
基のオリゴヌクレオチド（プライマー３）、及び配列表
の配列番号４の配列で表される２０塩基のオリゴヌクレ
オチド（プライマー４）を、それぞれ３８０Ａ−ＤＮＡ
合成装置（アプライドバイオシステムズ社）により、ト
リチル−オンの条件下で合成した。２７％アンモニア水
溶液でカラムから切り出し、５５℃で１晩加熱した。得
られた溶液２mlをイオン交換水１mlで希釈し、希釈液を
ＯＰＣ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎｃｏｌｕｍｎ）カートリッジ（アプラ
イドバイオシステムズ社）に１〜２滴／秒の速度で加え
た。溶出液を希釈アンモニア水溶液５mlで３回、イオン
交換水５mlで２回、２％ＴＦＡ溶液５mlで２回、そして
更にイオン交換水５mlで２回洗浄した。吸着したヌクレ
オチドを２０％アセトニトリル溶液１mlで３回溶出して
精製オリゴヌクレオチドを得た。こうして得られたプラ
イマー１〜４を用いて以下の実施例２及び実施例４を実
施した。

【００２１】実施例２：各種微生物ＤＮＡの増幅と塩基
配列の決定（１）前記した抗酸菌１９種類の標準菌株の各培養菌体
からフェノール／クロロホルムでＤＮＡを抽出した。続
いて、５００μｌのエッペンドルフチューブ中で、表１
に示す反応液１００μｌを調製し、実施例１で調製した
プライマー１〜４を用いてＤＮＡを増幅した。表１にお
いて、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとしては、Ａｍｐｌ
ｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（シータス社）を用い
た。また、ミコバクテリウム・チェロナイ（M.chelone
i）については、表１記載のプライマー１及び２をプラ
イマー３及び４に変更した。

【００２２】

【表１】

【００２３】次に、反応液をミネラルオイル（Ｓｉｇｍ
ａＣａｌＭ−３５１６）１００μｌで覆った。得ら
れた試料をＤＮＡＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（Ｐ
ｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ社）に入れた。
（ｉ）９４℃で１分間、（ii）６５℃で２分間及び（ii
i)７２℃で２分間の３工程からなる増幅サイクルを２５
回繰り返した。なお、２５回目の最後のサイクルでは、
工程（iii)を５分間で行った。前記のＤＮＡ増幅操作に
よって得られた反応液各１０μｌについて、エチジウム
ブロマイド（０．５μｇ／ml）含有の２％アガロースゲ
ルで電気泳動を実施した。結果を図１に示す。図１にお
いて、最上段の「ＴＢｃｏｍｐｌｅｘ」は結核菌群を
示し、「Ｉ」はＲｕｎｙｏｎの分類によるＩ型であり、
「II」はＲｕｎｙｏｎの分類によるII型であり、「III
」はＲｕｎｙｏｎの分類によるIII 型であり、「IV」
はＲｕｎｙｏｎの分類による迅速発育菌であり、「ｏｔ
ｈｅｒｓ」は上記分類には属さない菌種であり、中段は
それぞれ微生物の種類を示し、右側の数値（２３６ｂ
ｐ）は塩基対の大きさを意味する。図１から明らかなよ
うに、ミコバクテリウム・チェロナイを除いた１８種類
の全ての抗菌酸においてＤＮＡが増幅され、２３６ｂｐ
にバンドが現れた。ミコバクテリウム・チェロナイにつ
いてはプライマー３及び４を用いた結果、２２５ｂｐに
バンドが現れ、増幅されていることを確認した。

【００２４】（２）塩基配列の決定は、Ｓａｎｇｅｒ等
の方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ７４：５４６３−５４６７，１９７７）に準じて行っ
た。即ち、ｄｎａＪ遺伝子プライマーの上流側プライマ
ー５’末端にＥｃｏＲＩサイト（ＧＡＴＧＡＡＴＴＣ）
を、下流側プライマーにはＨｉｎｄIII サイト（ＧＡＴ
ＡＡＧＣＴＴ）を添加し、ＰＣＲを行い、増幅されたＤ
ＮＡを２％アガロースゲルで確認した。オイルを除く目
的でクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿後、−８０
℃で３０分間放置し、その後遠心分離し、水洗し、乾燥
してＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII の２種の制限酵素で消化
した。反応物の全量を２％アガロースゲルで流し、ＰＣ
Ｒ増幅物を含むゲルを切り出し、ＤＮＡは、ゲルをヨウ
化ナトリウム水溶液で溶解した後、シリカビーズで精製
した（ＤＮＡＰｒｅｐ；ダイアヤトロン）。一方、シー
クエンスベクターであるＭ１３ｍｐ１８を、前記と同じ
ようにＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII で３７℃にて１時間
消化した。制限酵素で消化したＰＣＲ増幅物をＭ１３ｍ
ｐ１８と１：４の割合で混合し、Ｔ４リガーゼで１６℃
にて１時間ライゲーションを行い、大腸菌に塩化カルシ
ウム法にてトランスフォームした後、Ｘ−Ｇａｌ及びＩ
ＰＴＧで選択した。白色プラークを選んだ後、３７℃で
５時間振盪培養した。上清中の一本鎖ＤＮＡを精製し、
ダイデオキシ法にて塩基配列を決定した。結果を表２〜
表８に示す。

【００２５】表２〜表８において、ヒト型結核菌（M.tu
berculosis）のｄｎａＪ遺伝子の１４１４番目の塩基か
ら１６０３番目の塩基までの塩基配列をＡ（アデニン残
基）、Ｔ（チミン残基）、Ｇ（グアニン残基）及びＣ
（シトシン残基）で示し、その塩基配列から演繹される
アミノ酸配列を１文字表記で示す（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
ＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＲｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉ
ｏｎによる）。また、その他の抗酸菌の塩基配列では、
ヒト型結核菌の塩基配列と異なる場合にのみそれらの塩
基を示し、同じ場合には「−」を記載した。また、その
他の抗酸菌のアミノ酸配列においては、ヒト型結核菌の
アミノ配列と異なる場合にのみそれらのアミノ酸を示
し、同じ場合には記載を省略した。なお、「＊」は欠落
を意味する。

【００２６】表２〜表８から明らかなように、ヒト型結
核菌（M.tuberculosis）、ウシ型結核菌ＢＣＧ（M.bovi
s BCG ）、ウシ型結核菌（M.bovis ）、ミコバクテリウ
ム・アフリカヌム（M.africanum ）及びミコバクテリウ
ム・ミクロチ（M.microti ）のｄｎａＪ遺伝子の１４１
４番目から第１６０９番目の塩基配列は完全に一致し
た。ａｖｉｕｍｕｃｏｍｐｌｅｘとして知られ、生化
学的同定法では鑑別できないトリ型結核菌（M.avium ）
とミコバクテリウム・イントラセルラーレ（M.intracel
lulare）は、ヌクレオチドレベルで９４％の一致率とい
う高い相同性を示した。ヒト型結核菌に対するトリ型結
核菌とミコバクテリウム・イントラセルラーレは、ヌク
レオチドレベルで前者が８８％、後者が８６％、またア
ミノ酸レベルで、前者が９７％、後者が９４％、それぞ
れ相同性を有していた。また、トリ型結核菌は、ミコバ
クテリウム・パラツベルキュロシス（M.paratuberculos
is）ともヌクレオチドレベルで９９％の極めて高い相同
性を示し、アミノ酸レベルでは完全に一致する。更に、
病原性や抗結核剤に対する感受性では似ていると考えら
れている、ミコバクテリウム・カンサシー（M.kansasi
i）とヒト型結核菌との相同性はヌクレオチドレベルで
７４％、アミノ酸レベルで７２％とかなり低いものであ
った。

【００２７】実施例３：プローブの作成実施例２の結果から、それぞれの抗酸菌に特異的な部位
を選別し、以下の１５種類のプローブ１〜１５を実施例
１と同様に合成した。プローブ１：ヒト型結核菌（M.tuberculosis）に特異
的：配列表の配列番号５の配列に記載の２０塩基からなるオ
リゴヌクレオチドプローブ２：ミコバクテリウム・カンサシー（M.kansas
ii）に特異的：配列表の配列番号６の配列に記載の２０塩基からなるオ
リゴヌクレオチドプローブ３：トリ型結核菌（M.avium ）に特異的：配列表の配列番号７の配列に記載の２０塩基からなるオ
リゴヌクレオチドプローブ４：ミコバクテリウム・イントラセルラーレ
（M.intracellulare）に特異的：配列表の配列番号８の配列に記載の２０塩基からなるオ
リゴヌクレオチドプローブ５：ミコバクテリウム・マリーナム（M.marinu
m ）に特異的：配列表の配列番号９の配列に記載の２０塩基からなるオ
リゴヌクレオチドプローブ６：ミコバクテリウム・ガストリ（M.gastri）
に特異的：配列表の配列番号１０の配列に記載の２０塩基からなる
オリゴヌクレオチドプローブ７：ミコバクテリウム・スクロフラセウム（M.
scrofulaceum）に特異的：配列表の配列番号１１の配列に記載の２０塩基からなる
オリゴヌクレオチドプローブ８：ミコバクテリウム・スツルガイ（M.szulga
i ）に特異的：配列表の配列番号１２の配列に記載の２０塩基からなる
オリゴヌクレオチドプローブ９：ミコバクテリウム・ゴルドネアー（M.gord
onae）に特異的：配列表の配列番号１３の配列に記載の２０塩基からなる
オリゴヌクレオチドプローブ１０：ミコバクテリウム・ゼノピ（M.xenopi）
に特異的：配列表の配列番号１４の配列に記載の２０塩基からなる
オリゴヌクレオチドプローブ１１：ミコバクテリウム・シミアエ（M.simia
e）に特異的：配列表の配列番号１５の配列に記載の２０塩基からなる
オリゴヌクレオチドプローブ１２：ミコバクテリウム・フォートゥイタム
（M.fortuitum ）に特異的：配列表の配列番号１６の配列に記載の２０塩基からなる
オリゴヌクレオチドプローブ１３：ミコバクテリウム・チェロナイ（M.chel
onei）に特異的：配列表の配列番号１７の配列に記載の２０塩基からなる
オリゴヌクレオチドプローブ１４：ミコバクテリウム・ヘモフィルム（M.he
mophilum）に特異的：配列表の配列番号１８の配列に記載の２０塩基からなる
オリゴヌクレオチドプローブ１５：ミコバクテリウム・パラツベルキュロシ
ス（M.paratuberculosis）に特異的：配列表の配列番号１９の配列に記載の２０塩基からなる
オリゴヌクレオチド

【００２８】前記の２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを
合成し、ＯＰＣカートリッジで精製した。精製オリゴヌ
クレオチド１０ｐモル、λ−³²ＰＡＴＰ及びポリヌクレ
オチドキナーゼを緩衝液中で混合し、３７℃で３０分間
反応させ、５’末端に³²Ｐラベルを付加した。未反応の
アイソトープをスピンカラムで分離してから、以下のド
ットハイブリダイゼイションに使用した。

【００２９】実施例４：ハイブリダイゼイション（プロ
ーブの特異性）前記リスト１に記載した標準株の中から、結核菌群とし
てヒト型結核菌（M.tuberculosis）及びウシ型結核菌
（M.bovis ）の２種類と、１４種類の非定型抗酸菌標準
株について、実施例２と同様の操作によってＰＣＲを行
った。それとは別に、ヒト型結核菌（M.tuberculosi
s）、ミコバクテリウム・カンサシー（M.kansasii）、
ミコバクテリウム・スクロフラセウム（M.scrofulaceu
m）、ミコバクテリウム・イントラセルラーレ（M.intra
cellulare）、ミコバクテリウム・シミアエ（M.simia
e）及びトリ型結核菌（M.avium ）の臨床分離培養株の
ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、実施例２
と同様の操作によってＰＣＲで増幅した。それぞれＰＣ
Ｒ増幅物２μｌにアルカリ変性液１００μｌを添加し、
５分間放置した後、ドットハイブリダイゼイション装置
で吸引した。ナイロンメンブレンを中和してから風乾
し、ＵＶランプで固定した。実施例３で調製したラベル
化プローブ（１０^-6ＣＰＭ／ml）を加え、、トリメチル
アンモニウムクロライドを含むハイブリダイゼイション
バッファーで６２℃にて２時間ハイブリダイゼイション
を行った。６×ＳＳＣで３回洗浄した後に風乾し、オー
トラジオグラフィーを行った。その結果を図２〜図４及
び図６に示す。図５は図２〜図４における各ＰＣＲ増幅
物の位置を示し、図７は図６における各ＰＣＲ増幅物の
位置を示すものであり、図５及び図７の記号は以下のと
おりである。Ａ：ヒト型結核菌（ミコバクテリウム・ツベルキュロシ
ス：M.tuberculosis; NIHJ 1633 ）Ｂ：対照（ブランク）Ｃ：ウシ型結核菌（ミコバクテリウム・ボビス：M.bovi
s; NIHJ 1607）Ｄ：ミコバクテリウム・カンサシー（M.kansasii; ATCC
12478）Ｅ：ミコバクテリウム・マリーナム（M.marinum; NIHJ
1620）Ｆ：ミコバクテリウム・シミアエ（M.simiae; NIHJ 162
7 ）Ｇ：ミコバクテリウム・スクロフラセウム（M.scrofula
ceum; NIHJ 1626 ）Ｈ：ミコバクテリウム・スツルガイ（M.szulgai; NCTC
10831 ）Ｉ：ミコバクテリウム・ゴルドネアー（M.gordonae; NI
HJ 1617 ）Ｊ：ミコバクテリウム・イントラセルラーレ（M.intrac
ellulare; ATCC 13950）Ｋ：トリ型結核菌（ミコバクテリウム・アビウム：M.av
ium; NIHJ 1605）Ｌ：ミコバクテリウム・ゼノピ（M.xenopi; NIHJ 1638
）Ｍ：ミコバクテリウム・ガストリ（M.gastri; NIHJ 161
6 ）Ｎ：ミコバクテリウム・フォートゥイタム（M.fortuitu
m; NIHJ 1615）Ｏ：ミコバクテリウム・チェロナイ（M.chelonei; NIHJ
1611 ）Ｐ：ミコバクテリウム・ヘモフィルム（M.hemophilum;
KK 49-01）Ｑ：ミコバクテリウム・パラツベルキュロシス（M.para
tuberculosis; ATCC 19698）１〜６：ヒト型結核菌（臨床分離株）７〜１１：ミコバクテリウム・カンサシー（臨床分離
株）１２：ミコバクテリウム・スクロフラセウム（臨床分離
株）１３〜１７：ミコバクテリウム・イントラセルラーレ
（臨床分離株）１８：ミコバクテリウム・シミアエ（臨床分離株）１９〜２３：トリ型結核菌（臨床分離株）

【００３０】実施例３で調製したプローブ１（ヒト型結
核菌に特異的）を用いた結果を図２に示す。結核菌群の
ヒト型結核菌標準株及びウシ型結核菌標準菌株並びにヒ
ト型結核菌臨床分離株と特異的に反応していることが確
認できた。実施例３で調製したプローブ２（ミコバクテ
リウム・カンサシーに特異的）を用いた結果を図３に示
す。ミコバクテリウム・カンサシーの標準菌株及び臨床
分離株と特異的に反応していることが確認できた。実施
例３で調製したプローブ４（ミコバクテリウム・イント
ラセルラーレに特異的）を用いた結果を図４に示す。ミ
コバクテリウム・イントラセルラーレの標準菌株と臨床
分離株と特異的に反応していることが確認できた。実施
例３で調製したプローブ３（トリ型結核菌に特異的）を
用いた結果を図６に示す。９４％の相同性を示すミコバ
クテリウム・イントラセルラーレとは反応せず、トリ型
結核菌を特異的に認識できることが確認できた。

【００３１】

【発明の効果】ミコバクテリア属に属する微生物１９種
類のｄｎａＪタンパク質をコードするＤＮＡの全塩基配
列が確定し、それらの塩基配列を基にして各菌種を特異
的に認識する各種プローブを作成し、これらのプローブ
を用いることによって、高感度で、しかも迅速にミコバ
クテリア属に属する微生物を特異的に検出しそして分別
することが可能となった。

【００３２】

【表２】

【００３３】

【表３】

【００３４】

【表４】

【００３５】

【表５】

【００３６】

【表６】

【００３７】

【表７】

【００３８】

【表８】

【００３２】

【配列表】

【００３３】配列番号：１配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列：GGGTGACGCG GCATGGCCCA

【００３４】配列番号：２配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列：CGGGTTTCGT CGTACTCCTT

【００３５】配列番号：３配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列：AGAGGGGGTG ACGCGACATG

【００３６】配列番号：４配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列：TCGTCGTACT CCTTGCGCTT

【００３７】配列番号：５配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列：AAGGGAATGG GTCGAAAAAG

【００３８】配列番号：６配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列：AATCAAGCGA GTGGCTCGAA

【００３９】配列番号：７配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列：GCTGCCGGCG AACGATTCAA

【００４０】配列番号：８配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列：GCCGCCGGTG AACGATTCAA

【００４１】配列番号：９配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列：TATCCGAGGC CAAAGAGGTG

【００４２】配列番号：１０配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列：GTCTCCTCTG ACGCCACCGC

【００４３】配列番号：１１配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列：AGCGGTCTCC GAGGCCTACT

【００４４】配列番号：１２配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列：GGCTTACCGC AAGCTGGCTT

【００４５】配列番号：１３配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列：CTCCGATGCC GACGCCAAGC

【００４６】配列番号：１４配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列：CAACGATCCG CGCGCTGCAG

【００４７】配列番号：１５配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列：AGCGCGTGAT CTGCACCCGG

【００４８】配列番号：１６配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列：CGATGCGGGA GCGGCGGAGC

【００４９】配列番号：１７配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列：ACCGTTACAA GGCCGTCAGC

【００５０】配列番号：１８配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列：CCTACATCCC GACGCGAACC

【００５１】配列番号：１９配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列：CGATTCAAGG CGGTGTCCGA

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＣＲ法によって増幅されたＤＮＡの電気泳動
の結果を示す図面に代わる写真である。

【図２】ヒト型結核菌に特異的なプローブを用いてドッ
トハイブリダイゼイションを実施した結果を示す図面に
代わる写真である。

【図３】ミコバクテリウム・カンサシーに特異的なプロ
ーブを用いてドットハイブリダイゼイションを実施した
結果を示す図面に代わる写真である。

【図４】ミコバクテリウム・イントラセルラーレに特異
的なプローブを用いてドットハイブリダイゼイションを
実施した結果を示す図面に代わる写真である。

【図５】図２〜図４における各ＰＣＲ増幅物の位置を示
す説明図である。

【図６】トリ型結核菌に特異的なプローブを用いてドッ
トハイブリダイゼイションを実施した結果を示す図面に
代わる写真である。

【図７】図６における各ＰＣＲ増幅物の位置を示す説明
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開平４−36199（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00 - 15/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号５〜１９で表される塩基配列の
いずれか１つの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いることを特徴とする、ミコバクテリア属に
属する微生物の検出方法。
【請求項２】配列番号５〜１９で表される塩基配列の
いずれか１つの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプ
ローブ。
【請求項３】配列番号３で表される塩基配列を含む第
１のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号４で表
される塩基配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライ
マーとからなることを特徴とする、請求項１に記載の検
出方法用のプライマーセット。