JP3363466B2 - 酵素結合体を安定化する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【従来の技術および解決するための課題】１．

【発明の技術分野】本発明はとりわけ酵素を特異的結合
対の構成要素に結合させる（酵素結合体）場合の酵素の
安定化に関する。免疫検定やＤＮＡプローブ検定といっ
た検定法は臨床的診断における重要な手段として発展し
た。一つの典型的検定法においては、特異的結合対の構
成員ｓｂｐ構成要素）、例えば抗体または抗原またはポ
リヌクレオチドを酵素と結合させて酵素結合体をつく
る。この酵素結合体を多種多様な実験計画において検定
に用いることにより分析対象の存在および（または）量
を検知することができる。分析対象はハプテン、抗原ま
たは抗体、あるいは生物学的標品、例えば血漿、血清、
脊髄液、唾液、精液、糞便物質、子宮頚部やペニスの分
泌物、羊膜液などから調製された試験試料中に見出され
るポリヌクレオチドでよい。

【０００２】免疫検定においては、第二の特異的結合対
（ｓｂｐ）の構成要素、例えば酵素結合体のｓｂｐ構成
要素に対する受容体、例えば抗体の間で、免疫複合体の
形成を測定することによって、分析対象の存在および
（または）量を決定できる。ＤＮＡプローブ検定におい
ては、酵素結合体を含むハイブリッド形成種をつくるこ
とにより分析対象を測定できる。酵素結合体における酵
素は、例えば基質に対して作用して着色物質、例えば染
料を生成し、これは染料溶液の吸光度を測定することに
より機器的に、ある場合には視覚的に測定できる比色変
化を生じ分析対象の表示を得ることができる。

【０００３】上記の通り、ハプテン、抗原および抗体は
これら免疫検定手順によって検出でき、これらに一般的
な名称である酵素免疫検定法（ＥＩＡ）が与えられた。
ポリヌクレオチドに対する若干の検定法はポリヌクレオ
チド、例えばＤＮＡプローブに、あるいはハプテン、抗
原、または受容体、例えば抗体に結合させた酵素を利用
している。

【０００４】一つの検定法として使用される酵素結合体
の開発においては、試薬の安定性が重要な問題となる。
検定法に用いられる酵素結合体組成物は、その検定手順
を実行する時間に十分先んじて調製するのが普通であ
る。これら酵素結合体組成物を貯蔵すると、酵素の不安
定さのために、ある時間を越えると酵素活性を失なうこ
とがある。この不安定性は、輸送、取引先への配達、お
よび在庫品としての貯蔵が酵素結合体の製造と使用の間
に相当な時間差を含むのが普通であるので重大な欠点で
ある。

【０００５】更にまた、酵素結合体は温度の広い変動や
酵素活性の損失を促進する他の条件にさらされることも
ある。従って公知の組成物と比較して相当に改善された
安定度特性を示す酵素結合体組成物は検定分野における
有用な改良である。

【０００６】均一酵素免疫検定（例えば、米国特許第
３，８１７，８３７号明細書参照）は、分光光度計によ
る定量を可能にする点できわめて融通性に富む。この検
定法は測定すべき分析対象、例えば薬物を結合させた酵
素を使用する。分析対象の類縁体は、その同種の抗体に
結合するとき、酵素の活性が相当に低下する位置で酵素
に結合される。未知試料が分析対象をどの程度含むかに
より、酵素に結合した分析対象類縁体への結合に利用さ
れる抗体の量は減少する。それ故に、酵素活性について
分析を行なうと、未知材料の欠如下でその酵素活性を越
える有意な酵素活性増加は未知材料中の分析対象の存在
を示す。

【０００７】とりわけ均一酵素免疫検定および一般に酵
素を利用する検定法の感度は、かなりの程度まで、結合
体をつくるときの酵素の活性および酵素へ結合させた分
子に抗体を結合させるときの阻害能の程度に基づいてい
る。それ故に、最初に高い代謝回転速度をもつだけでな
く、結合体形成および貯蔵の後もこの代謝回転速度の実
質的な割合を留め、そして酵素に結合される分子に抗体
を結合させるとき強く阻害される酵素を使用することが
望ましい。また酵素は結合した有機化合物への抗体の強
い特異的結合を許すべきである。

【０００８】２． 関連技術の説明米国特許第４，２３
３，４０１号明細書は抗酵素均一競合結合検定法を記載
している。この検定法は、緩衝した水性媒質中通常は一
定温度において、分析対象、酵素結合リガンド、リガン
ド受容体（抗リガンド）、酵素阻害剤（抗酵素）、およ
び酵素基質を検定媒質中で合わせることにより行なわ
れ、次に検定媒質中の酵素活性を測定する。観察された
酵素活性を、既知量の分析対象を含む検定媒質で観察さ
れた酵素活性未知のものと比較することにより分析対象
の量を定量できる。

【０００９】米国特許第４，４９３，８９０号明細書
は、アポグルコースオキシダーゼとグルコースオキシダ
ーゼに対して特異的な結合親和性をもつ免疫学的に誘導
された結合性物質、例えば抗体またはそのフラグメント
との相互作用により、アポグルコースオキシダーゼがフ
ラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）およびその誘
導体と結合して活性グルコースオキシダーゼを生ずる能
力を増加させる方法を記載している。

【００１０】米国特許第３，８７５，０１１号明細書は
均一酵素免疫検定に使用するための結合酵素組成物を開
示している。この酵素結合体の酵素はグルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）である。

【００１１】米国特許第４，６８６，１８１号明細書は
標識として抗グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
（抗−Ｇ６ＰＤＨ）を用いる特異的結合検定を記載して
いる。Ｇ６ＰＤＨを阻害する能力によってこの標識をモ
ニターする。

【００１２】米国特許第４，７８２，０２３号明細書は
酵素結合体、カルシウム塩およびポリエチレングリコー
ルからなる安定化されたセイヨウワサビペルオキシダー
ゼ結合体組成物を記載している。

【００１３】米国特許第４，４５４，２２６号明細書
は、封鎖剤としてフェニルイソチオシアネートを用いそ
して滴定による還元を用いて、ペルオキシダーゼとアレ
ルゲン、非免疫グロブリンタンパク質または第１級アミ
ノ基含有薬物およびその製剤との安定な結合体を述べて
いる。

【００１４】Ｓｋｏｌｄ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１
９８７）１３８（１０）：３４０８−３４１４は、Ｇ６
ＰＤＨと環状１：１複合体を形成し、調節サブユニット
として作用するＧ６ＰＤＨに対するモノクローン抗体を
記載している。これら複合体はグルコース−６−リン酸
（Ｇ６Ｐ）存在下で安定化され、著しく減少した酵素活
性をもつ。この１：１複合体はＧ６Ｐの存在でより活性
な多量体形に徐々に変わる。

【００１５】抗体の使用による生物学的に活性なタンパ
ク質、例えば酵素の安定化がＳｈａｍｉ等、（１９８
９）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７
（７）：１８６−１９０に記載されている。生物活性を
保護したりまたは調節するために抗体／抗原相互作用を
利用することが欧州特許願第０，２９８，６５４号明細
書に開示されている。

【００１６】上記のように、酵素は阻害物質、酵素基質
または生成物、または補酵素の添加によっても安定化さ
れて来た。

【００１７】課題を解決するための手段

【００１８】本発明の一面は酵素と特異的結合対の構成
要素との結合体（酵素結合体）を安定化する方法に関す
る。本法は酵素結合体を酵素に対する有効量の抗体（こ
の抗体は酵素の活性を実質的に阻害しない）と合わせる
工程を含む。

【００１９】本法の他の面は分析対象の検定法における
改良であって、この検定法は（イ）分析対象または分析
対象を立証する作用因子を含むと思われる媒質を、特異
的結合対の第一の構成要素と酵素との結合体である試薬
と合わせ、（ロ）第一のｓｂｐ構成要素と結合できる第
二のｓｂｐ構成要素および分析対象の存在あるいは量の
しるしとして該酵素に対する基質を用いることにより酵
素の酵素活性を測定するという工程からなる。本改良は
試薬として結合体と酵素に対する抗体（この抗体は酵素
の活性を実質的に阻害しない）との免疫複合体使用する
ものである。

【００２０】本発明のもう一つの具体例においては、
（イ）（１）分析対象を含むと思われる媒質、（２）酵
素に対する抗体（これは酵素の活性を実質的に阻害しな
い）に結合させた酵素および分析対象類縁体からなる結
合体、（３）前記結合体と結合して酵素活性を変化させ
る、即ち阻害または高揚させる分析対象の抗体をコンビ
ネーションとして提供し、そして（ロ）酵素の酵素活性
を測定するという工程からなる方法により分析対象を定
量する。

【００２１】本発明のもう一つの面は（１）酵素と特異
的結合対の構成要素との結合体および（２）酵素に対す
る抗体（この抗体は酵素を実質的に阻害しない）からな
る免疫複合体を含有してなる組成物に関する。この組成
物は特異的結合対の第二の構成要素を更に含むことがで
き、そしてこの第二の要素は結合体の構成要素と結合し
うるのが普通である。

【００２２】本発明のもう一つの面は（イ）（１）酵素
と特異的結合対の構成要素との結合体および（２）酵素
に対する抗体（この抗体は酵素の活性を実質的に阻害し
ない）からなる免疫複合体と（ロ）酵素に対する基質と
を包装されたコンビネーションとして含有するキットに
関する。このキットは他の検定試薬も含みうる。

【００２３】特別な具体例の説明酵素に対する抗体は酵
素を実質的に阻害しないものであって、酵素結合体を酵
素検定法においてその利用性を損なうことなく安定化さ
せる。酵素結合体における酵素の高められた安定性によ
って、検査下の特定の分析対象のより正確な測定が可能
となる。この安定化は、結合体のｓｂｐ構成要素と相補
的なｓｂｐ構成要素の結合形成によって、結合体におけ
る酵素の活性を変化させる能力を保持したまま達成でき
る。

【００２４】本発明の特別な具体例についての説明を更
に進める前に幾つかの用語を定義することにする：

【００２５】分析対象−−検出すべき化合物または組成
物。分析対象は特異的結合対（ｓｂｐ）の構成要素から
なることができ、１価（モノエピトープ）または多価
（ポリエピトープ）のリガンドでよく（通常は抗原性ま
たはハプテン性）、そして単一化合物か複数の化合物
（少なくとも一つの共通のエピトープ部位、あるいは抗
原決定部位を共有する）である。分析対象は細胞、例え
ば細菌の一部のこともあれば、血液型抗原、例えばＡ，
Ｂ，ＤなどまたはＨＬＡ抗原をもつ細胞、または微生
物、例えば細菌、真菌、原虫、またはウイルスのことも
ある。

【００２６】多価リガンド分析対象は、普通にはポリ
（アミノ酸）、即ち、ポリペプチドおよびタンパク質、
多糖類、核酸、およびその組み合わせであろう。このよ
うなコンビネーションには細菌、ウイルス、クロモソー
ム、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜などの成分が
含まれる。

【００２７】大抵の場合に、本発明を適用できるポリエ
ピトープリガント分析対象は少なくとも約５，０００、
もっと一般的には少なくとも約１０，０００の分子量を
有するであろう。ポリ（アミノ酸）の部類の中で興味あ
るポリ（アミノ酸）は一般に約５，０００から５，００
０，０００の分子量、もっと一般的には約２０，０００
から１，０００，０００の分子量を有するものであり、
興味あるホルモンの分子量は通常は約５，０００から６
０，０００の分子量にわたるであろう。

【００２８】同様な構造上の特徴をもつタンパク質、特
定の生物学的機能をもつタンパク質、特定の微生物、と
りわけ病原性微生物に関係するタンパク質などタンパク
質の部類に関して多種多様なタンパク質を考えることが
できる。

【００２９】モノエピトープリガンド分析対象は一般に
約１００から２，０００の分子量、もっと一般的には１
２５から１，０００の分子量をもつであろう。これら分
析対象には薬物、代謝産物、有害生物防除剤、汚染物質
などが含まれる。興味ある薬物にはアルカロイドが含ま
れる。それらアルカロイドにはモルヒネアルカロイド
（モルヒネ、コデイン、ヘロイン、デキストロメトルフ
ァン、それらの誘導体および代謝産物を包含する）；コ
カインアルカロイド（コカインおよびベンゾイルエクゴ
ニン、それらの誘導体および代謝産物を包含する）、麦
角アルカロイド（リセルグ酸のジエチルアミドを包含す
る）；ステロイドアルカロイド；イミナゾイルアルカロ
イド；キナゾリンアルカロイド、イソキノリンアルカロ
イド；キノリンアルカロイド（キニーネおよびキニジン
を包含する）；ジテルペンアルカロイド、それらの誘導
体および代謝産物が含まれる。

【００３０】薬物の次の群はステロイド類を包含し、そ
れらにはエストロゲン、エストゲン、アンドロゲン、副
腎皮質ステロイド、胆汁酸、強心性配糖体およびアグリ
コン（これはジゴキシンおよびジゴキシゲニンを含
む）、サポニンおよびサポゲニン、それらの誘導体およ
び代謝産物が包含される。またジエチルスチルベストロ
ールのようなステロイド擬似物質も含まれる。

【００３１】薬物の次の群は５から６環員をもつラクタ
ム類であり、それらにはバルビツエート、例えばフェノ
バルビタールおよびセコバルビタール、ジフェニルヒダ
ントニン、プリミドン、エトスクシミド、およびそれら
の代謝産物が含まれる。

【００３２】薬物の次の群は２から３炭素原子のアルキ
ルを有するアミノアルキルベンゼンであり、それらには
アムフェタミン、カテコールアミン（エフェドリン、Ｌ
−ドーパ、エピネフリン、ナルセイン、パパベリンおよ
びこれらの代謝産物が含まれる）が包含される。

【００３３】薬物の次の群はベンゾ複素環化合物であ
り、それらにはオキサゼパム、クロロプロマジン、テグ
レトール、イミプラミン、それらの誘導体および代謝産
物が含まれる。これらの複素環はアゼピン、ジアゼピン
およびフェノチアジンである。

【００３４】薬物の次の群はプリン類で、それらにはテ
オフィリン、カフェイン、それらの代謝産物および誘導
体が含まれる。

【００３５】薬物の次の群はマリファナから誘導される
ものを含み、カンナビノールとテトラヒドロカンナビノ
ールが包含される。

【００３６】薬物の次の群はビタミン類、例えばＡ、Ｂ
（例えばＢ_１２）、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＫ、葉酸、サイア
ミンを包含する。薬物の次の群はプロスタグランジン
で、これらはヒドロキシル化および不飽和の程度と部位
により異なる。

【００３７】薬物の次の群は抗生物質であり、これらに
はペニシリン、クロロマイセチン、アクチノマイセチ
ン、テトラサイクリン、テラマイシン、代謝産物および
誘導体が含まれる。

【００３８】薬物の次の群はヌクレオシドおよびヌクレ
オチドであり、それらにはＡＴＰ、ＮＡＤ、ＦＭＮ、ア
デノシン、グアノシン、チミジンおよびシチジン（適当
な糖およびホスフェート置換基を有する）が含まれる。

【００３９】薬物の次の群は種々雑多な個々の薬剤であ
り、それらにはメタドン、メプロバメート、セロトニ
ン、メペリジン、アミトリプチリン、ノルトリプチリ
ン、リドカイン、プロカインアミド、アセチルプロカイ
ンアミド、プロプラノロール、グリセオフルビン、バル
プロン酸、ブチロフェノン、抗ヒスタミン剤、抗コリン
作動薬、例えばアトロピン、それらの代謝産物および誘
導体が包含される。

【００４０】病気に罹った状態に関係する代謝産物には
スペルミン、ガラクトース、フェニルピルビン酸、およ
びポルフィリン １型が含まれる。

【００４１】薬物の次の群はアミノグリコシド、例えば
ゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、およ
びアミカシンである。興味ある有害生物防除剤にはポリ
ハロゲン化ビフェニル、ホスフェートエステル、チオホ
スフェート、カルバメート、ポリハロゲン化スルフェン
アミド、それらの代謝産物および誘導体である。

【００４２】受容体分析対象に対する分子量は一般に１
０，０００から２×１０^８、更に普通には１０，０００
から１０^６にわたるであろう。免疫クロブリン、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＭに対する分子量は一般
に約１４０，０００から約１０^６を変化するであろう。
酵素は、通常分子量が約１０，０００から１，０００，
０００にわたるであろう。天然受容体の分子量は広く変
化し、一般に少なくとも約２５，０００の分子量である
が、１０^６あるいはもっと高分子量のこともあり、それ
らにはアビジン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、チロキシン結合グロ
ブリン、チロキシン結合プリアルブミン、トランスコル
チンなどが含まれる。

【００４３】代表的微生物には次のものが包含される： Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｕｓ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｉａｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ 大腸菌形細菌 Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｏｓａ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ サルモネラ属 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｃｈｍｉｔｚｉｉ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ａｒａｂｉｎｏｔａｒｄａ シゲラ属 Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ 他の腸内細菌 Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｈｓ プロテウス 種 Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｏｒｇａｎｉ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ

【００４４】 Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ−Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ群 Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，Ｈ．ｄｕｃｒｙｉ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕａ Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｇｒｉｃａｎｓ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｃｕｓ Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ Ｓｃｈｅｎｋｉｉ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｆｌｏｎｓｅｃａｅａ ｐｅｄｒｏｓｏｉ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｆｏｎｓｅｃａｃｅａ ｃｏｍｐａｃｔ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｅ Ｆｏｎｓｅｃａｃｅａ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｅｓｔｉｓ Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｒｉｏｎｉｉ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｕｓｉｓ Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ Ｂｒｕｃｅｌｌａｅ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ Ｍａｄｕｒｅｌｌａ ｍｙｃｅｔｏｍｉ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ Ｍａｄｕｒｅｌｌａ ｇｒｉｓｅａ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ Ａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ 好気性胞子形成桿菌 Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｇｙｐｓｅｕｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ｋｅｒａｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｊｅｌｌｏｉ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ 嫌気性胞子形成桿菌 Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ａｄｏｕｉｎｉ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ ウイルス Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓｅｓ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｅｐｔｉｃｕｍ Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｖａｒｉｃｅｌｌａ（Ｃｈｉｃｋｅｎ ｐｏｘ） Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｒｔｉｕｍ Ｈｅｒｐｅｓ Ｚｏｓｔｅｒ （Ｓｈｉｎｇｌｅｓ） Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ウイルスＢ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ サイトメガロウイルス Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ポックスウイルス Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ Ｖａｒｉｏｌａ（天然痘） Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ Ｐｏｘｖｉｒｕｓ ｂｏｖｉｓ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ Ｐａｒａｖａｃｃｉｎｉａ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ（真菌様細菌） Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓｅｓ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ Ｉｓａｅｌｉ Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｂｏｖｉｓ Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓｅｓ

【００４５】 Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓｅｓ Ｎｏｃａｒｄｉａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ Ｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ スピロヘータ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（Ａ，Ｂ，Ｃ） Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍｉｎｕｓ Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ（１−４） Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｍｕｍｐｓ Ｖｉｒｕｓ ｍｏｎｏｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ニューカッスル病 Ｖｉｒｕｓ Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｃａｒａｔｅｕｍ Ｍｅａｓｌｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ Ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ Ｖｉｒｕｓ Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ イヌジステンパー Ｖｉｒｕｓ Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ 呼吸性 シンシチウム ウイルス Ｔｒｙｐａｎａｓｏｍｅｓ Ｒｕｂｅｌｌａ Ｖｉｒｕｓ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ Ａｒｂｏｖｉｒｕｓｅｓ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ

【００４６】 他の病原体 Ｅａｓｔｅｒｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｕｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｕｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ Ｓｉｎｄｂｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ Ｃｈｉｋｕｇｕｎｙａ Ｖｉｒｕｓ Ｄｏｎｖａｎｉａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ Ｖｉｒｕｓ Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ Ｍａｙｏｒａ Ｖｉｒｕｓ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ（細菌様 セントルイス Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ 寄生虫） Ｖｉｒｕｓ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ カリフォルニア Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｍｏｏｓｅｒｉ コロラドチックフィーバー Ｖｉｒｕｓ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ 黄熱病ウイルス Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｃｏｎｏｒｉ Ｄｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ Ｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ Ｒｅｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅｓ １−３ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ ヒト Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓｅｓ（ＨＩＶ） Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ ヒトＴ−細胞 向リンパ性 Ｖｉｒｕｓ Ｉ ＆ ＩＩ （ＨＴＬＶ） Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ 肝炎 Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｑｕｉｎｔａｎａ Ａ型肝炎ウイルス

【００４７】 Ｃｈｌａｍｙｄｉａ（分類不可能な寄生虫 Ｂ型肝炎ウイルス 細菌／ウイルス） 非Ａ−非Ｂ型肝炎 Ｖｉｒｕｓ Ｃｈｌａｍｙｄｉａエージェント（命名は不確実） 腫瘍ウイルス 真菌 Ｒａｕｓｃｈｅｒ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ Ｇｒｏｓｓ Ｖｉｒｕｓ Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ Ｍａｌｏｎｅｙ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ Ｈｉｓｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ ヒト乳頭腫 Ｖｉｒｕｓ Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ Ｍｕｃｏｒ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅ ｒａ）

【００４８】分析対象という用語はポリヌクレオチド分
析対象、例えば下に定義されたポリヌクレオチドを更に
包含する。これらにはｍ−ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡ，ｔ−Ｒ
ＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖などが含まれる。

【００４９】上記のように、用語分析対象はタンパク質
分析対象、例えば抗体、例えば免疫グロブリン、抗原、
タンパク質ホルモンなどを更に包含する。例えば分析対
象は抗体、および酵素結合体、酵素標識抗体でよい。こ
の酵素結合体は次に抗酵素、即ち酵素に対する抗体を用
いることにより安定化される。

【００５０】分析対象は例えば宿主からの体液といった
試料中に直接見出される分子のことがある。この試料は
直接検査できるが、あるいはもっと容易に分析対象を検
出できるように前処理してもよい。更にまた、関心をも
たれた分析対象は、その関心ある分析対象を立証する作
用因子、例えば関心ある分析対象と相補的なｓｐｂ構成
要素（その存在は関心ある分析対象が試料中に存在する
場合にのみ検出されるであろう）を検出することにより
測定できる。従って、その分析対象を立証する作用因子
が検定において検出される分析対象となる。

【００５１】特異的結合対の構成要素（“ｓｂｐ構成要
素”）――二つの異なる分子の一つであって、表面上に
あるいは空隙中にある領域を有し、もう一つの分子の特
定の空間的かつ極性的な構造に特異的に結合し、よっ
て、もう一つの分子の同構造と相補的と定義される、二
つの異なる分子の一つ。特異的結合対の構成要素はリガ
ンドおよび受容体（抗リガンド）と呼ばれる。これらは
通常は免疫学的な対の構成員、例えば、抗原−抗体であ
る。他の特異的結合対、例えば、ビオチン−アビジン、
ホ

【００５２】ルモン−ホルモン受容体、核酸の二本鎖、
ＩｇＧ−タンパク質Ａ、ポリヌクレオチドの対、例えば
ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡなどは免疫学的な対で
はないが本発明およびｓｐｂ構成要素の定義に包含され
る。

【００５３】ポリヌクレオチド−−自然の状態で約５０
から５００，０００個以上のヌクレオチドを有し、また
単離状態で約１５から５０，０００個以上のヌクレオチ
ド、通常は約１５から２０，０００個のヌクレオチド、
更にしばしば１５から１０，０００個のヌクレオチドを
有する重合体ヌクレオチドである化合物あるいは組成
物。ポリヌクレオチドには天然産あるいは合成的につく
られた精製または未精製の形にある何等かの給源から得
られる核酸、例えばＤＮＡ（ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮ
Ａ）およびＲＮＡ、通常はＤＮＡを包含し、ｔ−ＲＮ
Ａ、ｍ−ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡお
よびＲＮＡ、クロロプラストＤＮＡおよびＲＮＡ、ＤＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはその混合物、遺伝
子、クロモソーム、プラスミド、生物学的材料の、例え
ば微生物、例えば細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、
カビ、真菌、植物、動物、ヒト、およびその断片のゲノ
ムなどでよい。

【００５４】リガンド−−受容体が天然に存在するかあ
るいは調製できる有機化合物。

【００５５】リガンド類縁体−−類似リガンドと受容体
を競合しうる修飾されたリガンドで、この修飾はリガン
ド類縁体を他の分子に結合させる手段を与える。リガン
ド類縁体はリガンド類縁体をハブあるいは標識につなぐ
結合で水素を置換することによりリガンドと異なるのが
普通であるが必要ではない。このリガンド類縁体はリガ
ンドと同様の仕方で受容体に結合できる。類縁体は、例
えばリガンドに対する抗体のイデイオタイプに向かって
指向した抗体でもよいであろう。

【００５６】受容体（“抗リガンド”）−−分子の特定
の空間的および極性的な組織、例えばエピトープまたは
決定基部位を認識することのできる化合物または組成
物。代表的受容体は天然に生ずる受容体、例えばチロキ
シン結合性グロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメン
ト、レクチン、核酸、タンパク質Ａ、相補成分Ｃｌｑ、
などを包含する。

【００５７】特異的結合性−−二つの異なる分子の一方
を他の分子を排除して他に対して特異的に認識するこ
と。一般にこれら分子は表面にあるいは空隙中に二つの
分子の間を特異的に認識する領域をもつ。主要な結合の
影響は水素結合から生ずる。特異的結合の例示として抗
体、抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ヌクレオチド
相互作用などがある。

【００５８】非特異的結合性−−特定の表面構造とは比
較的無関係な分子間の非共有結合。このような非特異的
結合は反対に荷電した分子間の電荷または電子的相互作
用から生ずるのが普通である。非特異的結合はまた分子
間の疎水的相互作用からも生じうる。

【００５９】補助物質−−種々な補助的物質がしばしば
本発明に係るキットおよび方法に使用されるであろう。
例えば、液体媒質中にしばしば緩衝剤が存在し、また液
体媒質および他の成分に対する安定剤が存在するであろ
う。これら添加物に加えて、しばしば更に他のタンパク
質、例えばアルブミンあるいは界面活性剤、とりわけ非
イオン界面活性剤、結合促進剤、例えばポリアルキレン
グリコールなどを含めることができる。

【００６０】酵素−−本発明に使用される酵素の代表的
なものは次の通りである：

【表１】

【００６１】種々な酵素のうち、下記の表はＩ．Ｕ．
Ｂ．分類に従って述べた特に興味ある酵素を示す。

【表２】 １． オキシドリダクターゼ １．１ 供与体のＣＨ−ＯＨ基に作用するもの １．１．１ 受容体としてＮＡＤまたはＮＡＤＰをもつもの １． アルコールデヒドロゲナーゼ ６． グリセリンデヒドロゲナーゼ ２６． グリオキシレートリダクターゼ ２７． Ｌ−ラクテートデヒドロゲナーゼ ３７． マレートデヒドロゲナーゼ ４９． グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ １７． マンニトール−１−リン酸デヒドロゲナーゼ １．１．２ 受容体としてシトクロムをもつもの ３． Ｌ−ラクテートデヒドロゲナーゼ １．１．３ 受容体としてＯ_２を利用するもの ４． グルコースオキシダーゼ ９． ガラクトースオキシダーゼ １．９ 供与体のＣＨ−ＮＨ_２基に作用するもの １．４．３ 受容体としてＯ_２を利用するもの ２． Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ ３． Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ １．６ 供与体として還元ＮＡＤまたはＮＡＤＤに作用するもの １．６．９９ 他の受容体を利用するもの ジアホラーゼ １．１０ 供与体としてジフェノールおよび関連物質に作用するもの １．１０．３ 受容体としてＯ_２を利用するもの １． ポリフェノールオキシダーゼ ３． アスコルベートオキシダーゼ １．１１ 受容体としてＨ_２Ｏ_２に作用するもの １．１１．１ ６． カタラーゼ ７． ペルオキシダーゼ ３． ヒドロラーゼ ３．１ エステル結合に作用するもの ３．１．１ カルボン酸エステルヒドロラーゼ ７． コリンエステラーゼ ３．１．３ リン酸モノエステルヒドロラーゼ １． アルカリ性ホスホラーゼ ３．１．４ リン酸ジエステルヒドロラーゼ ３． ホスホリパーゼＣ ３．２ グリコシル化合物に作用するもの ３．２．１ グリコシドヒドロラーゼ １． α−アミラーゼ ４． セルラーゼ １７． リソザイム ２３． β−ガラクトシダーゼ ２７． アミログルコシダーゼ ３１． β−グルクロニダーゼ ３．４ ペプチド結合に作用するもの ３．４．２ ペプチジル−アミノ酸ヒドロラーゼ １． カルボキシペプチダーゼ ３．４．４ ペプチジル−ペプチドヒドロラーゼ ５． α−キモトリプシン １０． パパイン ３．５ ペプチド結合より外のＣ−Ｎ結合に作用するもの ３．５．１ 線状アミド ５・ ウレアーゼ ３．６ 酸無水物結合に作用するもの ３．６．１．ホスホリル含有無水物 １・ 無機ピロホスファターゼ ４． リアーゼ ４．１ 炭素−炭素リアーゼ ４．１．２ アルデヒドリアーゼ ７． アルドラーゼ ４．２ 炭素−酸素リアーゼ ４．２．１ ヒドロラーゼ １． 炭酸無水物 ４．３ 炭素−窒素リアーゼ ４．３．１ アンモニアリアーゼ ３． ヒスチダーゼ

【００６２】特に関心をもたれる酵素はグルコース−６
−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、セイヨウワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファ
ターゼおよびガラクトシダーゼである。

【００６３】完全酵素以外に、酵素フラグメントが安定
化を必要とする場合には酵素フラグメントを使用でき
る。このような酵素フラグメントはそれ自身活性がある
こともあれば、後で他の酵素フラグメントと再結合させ
て活性のあるホロ酵素、例えばガラクトシダーゼフラグ
メントをつくることもある。

【００６４】グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
（Ｇ６ＰＤＨ）−−基質としてグルコース−６−リン酸
を有する供与体のＣＨ−ＯＨ基に作用するオキシドリダ
クターゼの１．Ｕ．Ｂ．分類酵素。一般に如何なる給源
あるいは形のＧ６ＰＤＨも使用できる。しかし、哺乳動
物体液のような試験試料に内因性のＧ６ＰＤＨに対して
効果的でない補因子を使用できる酵素を産生する微生物
源を選ぶのが特によい。Ｇ６ＰＤＨの微生物

【００６５】源には、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓ
ｅｎｔｅｒｉｏｄｅｓ， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａ
ｅｕｒｏｇｉｎｏｓａ， Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｍｏｎａ
ｓＨ１６， Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏ
ｘｉｄａｎｓ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ， Ｂａｃｉｌｌｕｓｍａｇｅｒ
ａｔｕｍ， Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓな
どが含まれる。ＮＡＤＰおよびＮＡＤの両方を利用でき
るＧ６ＰＤＨ分子が特によい。動物源由来のＧ６ＰＤＨ
は通常ＮＡＤＰのみを利用しうるので、酵素結合体を免
疫検定に使用する場合、補因子としてＮＡＤを用いるこ
とにより内因性Ｇ６ＰＤＨによる干渉を制限できる。Ｌ
ｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｏｄｅｓや
Ｚ ｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ由来のＧ６ＰＤＨ
はこの理由のため特に適当である。

【００６６】抗体−−他の分子の特別な空間的および極
性的組織に特異的に結合し、従って相補的であると定義
される免疫グロブリン。抗体はモノクローンでもポリク
ローンでもよく、この分野で公知の技術、例えば宿主の
免疫化および血清（ポリクローン）の収集により、ある
いは連続雑種細胞系をつくりそして分泌されたタンパク
質（モノクローン）を収集することにより、あるいはヌ
クレオチド順序またはその突然変異を起こさせた変種を
クローン化し、発現させそして少なくとも自然の抗体の
特異的結合に要求されるアミノ酸配列に対してコード化
することにより調製できる。抗体は完全な免疫グロブリ
ンまたはそのフラグメントを含むことができ、そしてこ
の免疫グロブリンは種々な分類およびイソタイプ、

【００６７】例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ
１、ＩｇＧ_２ａ、ＩｇＧ_２ｂおよびＩｇＧ_３、ＩｇＭな
どを含む。そのフラグメントはＦａｂ、ＦｖおよびＦ
（ａｂ′）_２、Ｆａｂ′などを含みうる。更にまた、特
定分子に対する結合親和性が保たれる限り、免疫グロブ
リンまたはそのフラグメントの凝集体、重合体、および
結合体を必要に応じ使用できる。

【００６８】酵素に対する抗体−−酵素に対し特異的な
抗体。このような抗体は利用できる技術のいずれかによ
って完全酵素または修飾された酵素に対し免疫化するこ
とによりつくりうる。このようにして、適当な抗体源を
刺激して、完全酵素、凝集した酵素または他の仕方で重
合した酵素、酵素フラグメント（例えば酵素から生じた
抗原決定基を選ぶことにより）、合成的につくられた抗
原決定基などで免疫化することにより抗−酵素をつくる
ことができる。

【００６９】普通は、通常の抗血清技術、モノクローン
技術、または組換え体ヌクレオチドクローン化技術によ
り抗体が得られるであろう。抗酵素を含む抗血清は、家
兎、モルモット、または山羊のような動物を適当な免疫
原で免疫化し、適当な待ち時間後に免疫化された動物の
血液から抗血清を得ることからなる確立された技術によ
り得られる。最高技術水準の論評はＰａｒｋｅｒ，Ｒａ
ｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｐｒ
ｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ（イングルウッド クリフス、
ニュージャージー州、Ｕ．Ｓ．，１９７６）、Ｂｕｔｌ
ｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．７：１−２４
（１９７５）；ＷｅｉｎｒｙｂおよびＳｈｒｏｆｆ，Ｄ
ｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．１０：２７１〜２８３
（１９７５）；ＢｒｏｕｇｈｔｏｎおよびＳｔｒｏｎ
ｇ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２２：７２６−７３２（１９
７６）；およびＰｌａｙｆａｉｒ等，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂ
ｕｌｌ．３０：２４−３１（１９７４）により提供され
る。

【００７０】このような抗体はまた体細胞ハイブリッド
形成技術によっても得ることができ、このような抗体は
一般にモノクローン抗体と呼ばれる。本発明方法に役立
つモノクローン抗体はＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔ
ｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２６５：４９５−４９７，１９７
５の標準技術に従ってつくりうる。モノクローン抗体技
術の論評はＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ
ｓ，Ｍｅｌｃｈｅｒｓ等編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒ
ｌａｇ（ニューヨーク１９７８）、Ｎａｔｕｒｅ２６
６：４９５（１９７７）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０８：６
９２（１９８０）、およびＭｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ ７３（Ｂの部）：３−４６（１９８
１）に見られる。例えば、完全酵素または修飾酵

【００７１】素を免疫原として使用できる。抗原製剤の
試料をマウスのような動物に注射し、十分な時間後、動
物を殺し、脾臓細胞を得る。別法として、非免疫化動物
の脾臓細胞を容器内で免疫源に対し感作してもよい。望
む免疫グロブリンに対する基本配列をコード化する脾臓
細胞クロモソームを、一般に非イオン洗浄剤、例えばポ
リエチレングリコールの存在下に、脾臓細胞を骨髄腫細
胞系と融合することにより圧縮する。融合ハイブリドー
マを含む得られた細胞を選択的培地、例えばＨＡＴ−培
地で培養し、生存する不死化した細胞をこのような培地
で制限希釈条件を用いて培養する。これら細胞を適当な
容器、例えばミクロタイターウェルで発育させ、望む特
異性をもつモノクローン抗体について上澄液をスクリー
ニングする。別法として、抗体結合部位をコード化した
配列をクロモソームＤＮＡから切除し、クローンベクタ
ーに挿入でき、そして後者を細菌に発現させて対応する
抗体結合部位をもつ組換えタンパク質をつくることもで
きる。

【００７２】モノクローン抗体の収量を高める種々な技
術、例えばハイブリドーマ細胞を細胞を受ける哺乳動物
宿主の腹腔の中に注射し、腹水を採取する方法が現存す
る。腹水に集まったモノクローン抗体の量が不十分であ
る場合には、抗体を宿主の血液から採取する。モノクロ
ーン抗体を他のタンパク質および他の夾雑物から単離し
精製するための種々な通常の方法がある（Ｋｏｅｈｌｅ
ｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（前出）参照）。

【００７３】モノクローン抗体の有用な結合性フラグメ
ント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）_２、Ｆｖなども本発
明の範囲ならびにモノクローン抗体の定義の中に包含さ
れる。この抗体フラグメントは通常の技術により得られ
る。例えば、有用な結合性フラグメントはパパインまた
はペプシンを用いる抗体のペプチダーゼ消化により調製
できる。

【００７４】抗体はネズミ給源から、他の哺乳動物源、
例えばヒト、ラットから、または他の給源あるいはその
組合わせから得ることができる。ＩｇＧおよびＩｇＭ群
の抗体、ならびに他の群、例えばＩｇＡ、ＩｇＥなど
（このような群中にイソタイプを、またＩｇＧおよびＩ
ｇＭ群内に他のイソタイプを含む）を使用できる。

【００７５】Ｇ６ＰＤＨに対する抗体−−本明細書中で
使用している用語「抗−Ｇ６ＰＤＨ」はＧ６ＰＤＨと結
合しうる抗体あるいはＧ６ＰＤＨとの結合能力を保持し
たかかる抗体の誘導体または変形を意味するものとす
る。従って、一般に抗体由来の一つ以上のＧ６ＰＤＨ特
異的結合部位を含有する物質はいずれも使用できる。

【００７６】普通は、検定に使用されるＧ６ＰＤＨは免
疫原として用いられるが、関連生物から得られるＧ６Ｐ
ＤＨもある場合には使用できる。別法として、ハプテン
とのＧ６ＰＤＨ結合体も使用できる。

【００７７】上記のように、本発明の一面は、酵素と特
異的結合対の構成要素との結合体（酵素結合体）を安定
化させる方法に関する。本法は酵素結合体を酵素に対す
る抗体（この場合、抗体は酵素の活性を実質的に阻害し
ない）の有効量と合わせる工程を含む。一般に、酵素に
対する抗体の有効量は、長期に及ぶ貯蔵や取扱いおよ
び、例えば高温度などといった不利な貯蔵および取扱い
条件の間の結合体における酵素活性の損失を最小にする
ように、酵素結合体の酵素を相当に安定化する量であ
る。通常は、少なくともほぼ等モル濃度の抗体と酵素を
使用する。なるべくは、抗体が５倍から１０倍あるいは
もっと過剰に存在するのがよく、そして一般には抗体−
酵素複合体の解離定数に少なくとも等しく、なるべくは
５倍から１０倍大きい濃度で存在するのがよい。一般
に、酵素結合体の少なくとも９０％、なるべくは９５
％、通常は少なくとも９７％と結合するのに十分な抗体
濃度が使用される。

【００７８】本発明に係る抗体は上記技術のいずれかに
より調製できる。次にこの抗体調製物をスクリーニング
して酵素に対するそれぞれの結合親和力および特異性な
らびにこのような抗体が酵素の活性を阻害するかしない
かを測定する。使用するスクリーニングの手順はこの分
野で公知であり、支持体に結合させた問題の酵素を利用
するＥＬＩＳＡ検定法および抗−酵素抗体を酵素結合体
と合わせ、このコンビネーションをインキュベーション
し、そして酵素活性を測定することからなる酵素熱保護
検定法が含まれるが、これら検定法は例示したのであっ
てこれに制限されることはない。更にまた、酵素に対す
る抗体は相補的ｓｂｐ構成要素を含む酵素結合体におけ
るこのような相補的ｓｂｐ構成要素と一ｓｂｐ構成要素
との結合形成をこのような抗体が妨害するかどうか決定
するよう調べることができる。

【００７９】酵素に対する抗体は酵素の活性を実質的に
阻害してはならない。このことはその酵素に対する抗体
が酵素の活性を２５パーセントより多く減少させてはな
らず（なるべくは活性低下が５パーセント以下）、最も
好ましくは酵素活性に何等低下を起こしてはならないこ
とを意味する。更にまた、酵素に対する特に適当な抗体
はｓｂｐ構成要素の酵素結合体が相補的ｓｂｐ構成要
素、例えば抗体に結合する能力、あるいはｓｂｐ構成要
素がポリヌクレオチドである場合にｓｂｐ構成要素に対
して相補的なポリヌクレオチドにハイブリッド形成する
能力を実質的に阻害しない。従って、酵素に対する抗体
はｓｂｐ構成要素が酵素結合体の活性を調節する能力を
５０パーセントより多く阻害すべきでなく（２５パーセ
ント以下が好ましい）、望ましくは活性調節に影響すべ
きでない。

【００８０】酵素に対する抗体と酵素結合体とのコンビ
ネーションは凍結乾燥状態か乾燥状態にあることもあれ
ば、液体媒質、通常は水性媒質中にあってもよいが、４
０容量パーセントまでの有機共溶媒を含むこともある。
媒質のｐＨは通常は４から１１の範囲内、更に普通には
約５から１０の範囲内にあり、なるべくは約６．５から
９．５の範囲内がよい。望むｐＨを達成するために種々
な緩衝剤を使用できる。一般に、媒質および緩衝剤など
は本明細書中で本発明に係る検定法の実行性について述
べたものと同様である。

【００８１】本発明はまた分析対象に対する検定を行な
う際の改良法をも提供するものである。この検定法は分
析対象を含むと思われる媒質あるいは分析対象を立証す
る作用因子を酵素結合体である試薬と一緒にし、構成要
素に対する抗体および酵素に対する基質を用いることに
より分析対象の存在または量の表示として酵素の酵素活
性を測定するという諸工程からなる。また改良法は試薬
として酵素結合体および酵素に対する抗体の免疫複合体
を使用することからなるが、この場合抗体は酵素の活性
を実質的に阻害しない。

【００８２】本発明方法ならびに組成物はｓｂｐ構成要
素、例えばリガンド−受容体、例えば抗原−抗体反応、
ポリヌクレオチド結合検定などを含む大抵の検定に適合
させることができる。この検定法は均一でも不均一法で
もよい。均一検定法においては、試料を必要に応じ前処
理して望まない物質を除く。免疫学的反応は分析対象
（これはｓｂｐ構成要素である）と相補的なｓｂｐ構成
要素、酵素標識したｓｂｐ構成要素（酵素結合体）およ
び関心のある試料を含むのが普通である。通常、酵素を
ハプテン（普通は分析対象の誘導体である）に結合さ
せ、そして分析対象と相補的なｓｂｐ構成要素は抗体で
ある。標識から生ずる信号は、標識した分析対象に抗体
が結合すると直接的あるいは間接的に修飾される。免疫
学的反応およびその程度の検出は均一溶液中で行なわれ
る。

【００８３】本発明によると酵素標識したｓｂｐ構成要
素の代りに組成物が使用される。この組成物は酵素標識
したｓｂｐ構成要素および酵素に対する抗体からなり、
そして抗体は酵素の活性を実質的に阻害せず、また酵素
標識したｓｂｐ構成要素と相補的ｓｂｐ構成要素とが結
合したとき酵素活性の阻害を実質的に妨げないものであ
る。均一検定の例示は米国特許第３，８１７，８３７号
明細書などに記載された酵素活性調節免疫検定技術（Ｅ
ＭＩＴ^▲Ｒ▼）である。

【００８４】酵素活性調節免疫検定技術に特に適した酵
素は米国特許第３，８７５，０１１号明細書に記載のよ
うにＧ６ＰＤＨである。このＧ６ＰＤＨを分析対象類縁
体に結合させて酵素結合体をつくり、次にこれを一つの
試薬として分析対象の検定に使用するのが普通である。
他の特に適当な酵素にはマレートデヒドロゲナーゼおよ
びグルコースデヒドロゲナーゼ、ガラクトシダーゼ、ト
リオースホスフェートメラーゼが含まれる。

【００８５】不均一検定法における試薬は分析対象（こ
れはｓｂｐ構成要素である）を含むと思われる試料、相
補的ｓｂｐ構成要素、および酵素結合体を含む検知可能
な信号を発生させる手段からなる。これら化合物を一般
に支持体、例えばプレートまたはスライドと接触させて
置き、これに試料中の分析対象の存在と関連して結合体
が結合する。次に支持体を液相から分離し、支持体相か
液体相のいずれかを、このような信号を発生する手段を
用いて検出可能な信号について調べる。例えば、相互的
ｓｂｐ構成要素または分析対象に類似のｓｂｐ構成要素
を酵素に結合させ、そして分析対象と相

【００８６】補的な第二のｓｂｐ構成要素を支持体に結
合させることができる。このようないずれの場合におい
ても、酵素結合体試薬の代りに本発明に係る組成物を使
用できる。不均一免疫検定法の例は酵素と組み合わせた
免疫検定法、例えば酵素と組み合わせた免疫吸着検定法
（ＥＬＩＳＡ、米国特許第３，６５４，０９０号、第
３，８３９，１５３号、第３，８５０，７５２号、第
４，０１６，０４３号明細書；ならびに再発行米国特許
第２９，１６９号明細書参照）などである。

【００８７】上記免疫検定技術の更に詳細な論議につい
ては「Ｅｎｚｙｍｅ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」、Ｅｄ
ｗａｒｄ Ｔ．Ｍａｇｇｉｏ著、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，
Ｉｎｃ．，ボカ ラートン、フロリダ州１９８０参照。

【００８８】分析対象の検定は水性緩衝媒質中中程度の
ｐＨで、一般に最適の検定感度を与えるｐＨで行なうの
が普通である。上で説明したように、この検定は検定成
分あるいは生成物のいずれかを分離せずに（均一）また
は分離して（不均一）行なうことができる。

【００８９】水性媒質は水だけのこともあれば０から４
０容量パーセントの共溶媒を含むこともある。媒質のｐ
Ｈは通常は約４から１１、更に普通には約５から１０の
範囲内、そして好ましくは約６．５から９．５の範囲内
にあるであろう。このｐＨは結合する構成要素の最適な
結合と信号発生系の要素のような検定の他の試薬に対し
て最適なｐＨとの間の妥協点であるのが普通であろう。

【００９０】望むｐＨを達成しかつ測定中をそのｐＨを
保持するために種々な緩衝剤を使用できる。代表的緩衝
剤の例としてホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バ
ルビタールなどがあげられる。使用する特定の緩衝剤は
本発明にとって特に制限はないが、個々の検定において
は特に適したものが選ばれる。

【００９１】検定法の実施に対しては中程度の温度を用
いるのが普通であり、通常は測定時間中、とりわけ反応
速度の測定に対しては一定温度を使用する。インキュベ
ーション温度は通常は約５°から４５℃、もっと普通に
は約１５°から４０℃にわたるであろう。測定中の温度
は一般に約１０°から５０°、もっと普通には約１５°
から４０℃にわたるであろう。

【００９２】検定される分析対象の濃度は一般に約１０
^−４から１０^−１５Ｍ、更に普通には約１０^−６から１
０^−１４Ｍを変化する。その検定が定性的なものか、半
定量的か、あるいは定量的なものかどうか、特定の検出
技術および関心をもたれる分析対象の濃度はどうかとい
った考慮により種々な試薬の濃度が決まるのが普通であ
る。

【００９３】検定媒質中の種々な試薬の濃度は一般に分
析対象の興味ある濃度範囲によって決まるが、各試薬の
最終濃度はその範囲にわたり検定の感度を最適化するた
めに経験的に決めるのが普通であろう。即ち、重要な意
味をもつ分析対象の濃度の変動は正確に測定できる信号
に当然差異を与えるであろう。

【００９４】添加順序は広く変化しうるが、検定の性質
によって幾つかの優先性がある。最も簡単な添加順序は
全材料を同時に加え、均一検定法におけるように信号発
生系に及ぼす検定媒質の効果を測定することである。別
法として試薬を順次に合わせることもできる。各添加後
に一般に約３０秒から６時間、もっと普通には約２分か
ら１時間にわたるインキュベーション段階を任意に取り
入れることができる。

【００９５】均一検定法においては、すべての試薬を同
時にあるいは順次に合わせた後、信号発生系に及ぼす検
定媒質の影響を測定する。信号発生系に及ぼす検定媒質
の効果は、被検試料中のモノエピトープ分析対象の量と
関係づけられる。この目的に対しては、本発明に係る新
規試薬は水性媒質中に溶けねばならず、なるべくは試料
および分析対象と相補的なｓｂｐ構成要素と共に合わせ
て加えるのがよい。均一検定法に用いられる本発明試薬
の量は分析対象および他の試薬の性質に左右される。試
薬のこのような量の一例は米国特許第３，８１７，８３
７号明細書の特にコラム４に述べられている。当面のこ
とと関係するその開示は参考のため本明細書中に取り入
れてある。均一検定法に本発明試薬を用いると、貯蔵中
酵素試薬の酵素の活性を保持することにより検定の感度
が増す。

【００９６】本発明は（１）酵素と特異的結合対の構成
要素との結合体および（２）酵素に対する抗体（酵素を
実質的に阻害しないもの）からなる免疫複合体からなる
組成物を更に包含する。

【００９７】本発明の特別な応用例を次に示す。これら
例は本発明の範囲の制限と見做すべきでない。

【００９８】シクロスポリンおよびガラクトシダーゼの
結合体を本発明により以下のように安定化できる。シク
ロスポリンに対するモノクローン抗体を標準の雑種細胞
技術によって調製し、Ｓｅｅｇａｎ等、Ｐｒｏｃｅｅｄ
ｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄ
ｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，７６：９０７（１９７
９）に記載の方法と同様の手順に従って還元しアルキル
化することによって還元、アルキル化モノクローン抗−
シクロスポリン抗体を得る。無秩序に標識された抗−シ
クロスポリン抗体−阻害剤結合体を、最初デオキシガラ
クトスタチン阻害物質（Ｂｅｒｎｏｔａｓ等、Ｃａｒｂ
ｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｃｈ，１６７：３０５−
３１１（１９８７）により記述された方法により得られ
る）をカルボキシル化することによりつくる。このカル
ボキシル化は、Ｈｅｔｔｋａｍｐ等、Ｅｕｒｏｐｅａｎ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
１４２：８５−９０（１９８４）記載の方法と同様にし
て行なう。上記のカルボキシル化されたデオキシガラク
トスタチン阻害物質をＧｒｅｔｃｈ等、Ａｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６３：２７０
（１９８７）記載の方法と同様の手順に従い抗−シクロ
スポリン抗体に結合させる。

【００９９】シクロスポリンに対する検定は次のように
実施できる。少量の洗剤を含むＴｒｉｓ緩衝液中に溶か
したシクロスポリンの試料溶液および前記抗体−阻害物
質結合体を検定緩衝液と混合し、室温で２分間インキュ
ベーションする。アミン標識したシクロスポリン−ガラ
クトシダーゼ結合体を、Ｐｆｌａｎｚ等、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１８：２４１（１９８８）
により、あるいはＱｕｅｓｎｉａｕｘ等、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２４：１１５９（１９
８７）により記述された方法と同様にして最初シクロス
ポリンをカルボキシル化することによりつくる。このカ
ルボキシル化されたシクロスポリンを、次にＨｏｓｏｄ
ａ等、Ｃｈｅｍ．ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２７：２１
４７（１９７９）により記述された方法と同様の手順に
よりガラクトシダーゼのアミン基に結合させる。標準雑
種細胞系技術に従ってつくられた安定化量の、ガラ

【０１００】クトシダーゼに対するモノクローン抗体を
含有するアミン標識されたシクロスポリン−ガラクトシ
ダーゼ結合体の水性緩衝溶液および更に検定緩衝液を加
え、得られた溶液を室温で１５分インキュベーションし
た。水性クロロフェノール赤ガラクトシドおよび更に検
定緩衝液を加え、サーモスタット付き分光光度計で５７
５ｎｍにおける吸光度の増加速度を測定することにより
３７℃での酵素活性を決定する。この酵素活性はシクロ
スポリン濃度の関数である。

【０１０１】本発明のもう一つの特別な応用は次の通り
である。下記のように本発明に従いアルカリ性ホスファ
ターゼおよびその結合体を安定化することができる。天
然アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）を、２ｇ／リット
ルのウシγ−グロブリン（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｓ、不安
定酵素含まず）含有の０．１Ｍ ＮａＨ_２ ＰＯ_４／
０．２Ｍ ＮａＣｌ中１μｇ／ｍｌに希釈する。後述の
例１記載の方法と同様にして標準雑種細胞系技術に従い
モノクローン抗−ＡＰを含む腹水をつくり、酵素溶液の
一部分に加える（酵素溶液１ｍｌ当り腹水１０μｌ）。
２２℃で１時間平衡化させた後、これら部分を６５℃の
水中に置き、熱的不活性化の速度を決定する。種々な時
間に一部分を水浴に移し不活性化を止める。その後、各
部分のＡＰ活性を測定する。これらの実験条件下でＡＰ
に対する抗

【０１０２】体欠如下でのＡＰは、ＡＰに対する抗体存
在下でのそれより３倍から４倍少ない６５℃半減期を示
す。下記のように抗−ＡＰを検定に用いる。米国特許第
４，６６１，４０８号明細書記載のように二酸化クロム
ビーズをつくり、これを米国特許第４，６６１，４０８
号明細書記載の技術に従いＢ−ヒト絨毛性性腺刺激ホル
モン（Ｂ−ＨＣＧ）に対するモノクローン抗体で被覆す
る。アルカリ性ホスファターゼとＢ−ＨＣＧに対するモ
ノクローン抗体の（Ｆ（ａｂ）_２フラグメントとの結合
体をＶｏｎｋ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ，１３７：１３３（１９９１）記載の方法と同
様の手順に従

【０１０３】いつくる。この結合体試薬を十分量のモノ
クローン抗−ＡＰと合わせて結合体試薬を安定化させ
る。このビーズ、Ｂ−ＨＣＧを含むと思われる尿試料、
および結合体試薬を合わせ、３７℃で３０分インキュベ
ーションする。磁場をかけてビーズを反応容器中に保持
し、ビーズをリン酸塩緩衝食塩水で洗浄する。このビー
ズへ、欧州特許願第８９１１６５９０．４号明細書記載
の方法と同様にして調製した

【０１０４】メチルウムベリフェニルホスフェート（Ｍ
ＵＰ）を含む水性緩衝溶液を加える。３７℃で５分後媒
質を３８０ｎｍで照射し、４５０ｎｍで読み取る。この
読みを既知量のＢ−ＨＣＧを含み上記と同じ方法で実験
した校正対照と比較して尿試料中のＢ−ＨＣＧの存在お
よび（または）量を決定する。

【０１０５】本発明のもう一つの面は、分析対象を含む
と思われる試料中の分析対象の存在あるいは量を決定す
るための、本発明に係る検定法を便利に実行するのに役
立つキットに関するものである。本発明の多様な応用性
を更に高めるため、試薬類を同一または別個の容器に入
れた包装コンビネーションとして提供し、それら試薬の
割合が方法と検定の実質的な最適化をもたらすようにで
きる。試薬類を各々別個の容器に入れてもよいし、ある
いは各種試薬を一つ以上の容器に合わせてもよく、これ
は試薬の交差反応性と安定性によって左右される。

【０１０６】このキットは包装されたコンビネーション
として（イ）（１）酵素と特異的結合対の構成要素との
結合体および（２）前記酵素に対する抗体（この抗体は
前記酵素の活性を実質的に阻害しない）からなる免疫複
合体と（ロ）前記酵素に対する基質とを含有してなる。
酵素に対する前記抗体は、酵素結合体が前記構成要素に
対する抗体と結合する能力を実質的に阻害しないことが
好ましい。キットは一つの試薬として本発明に係る組成
物を含有する。上記の通り、均一免疫検定に対して酵素
結合体

【０１０７】の特に適当な酵素はデヒドロゲナーゼ、な
るべくはＧ６ＰＤＨ、マレートデヒドロゲナーゼ、セイ
ヨウワサビペルオキシダーゼ、およびグルコースデヒド
ロゲナーゼである。構成要素はポリヌクレオチド、抗原
またはハプテン、あるいは抗体でよい。酵素は例えば濫
用薬物あるいは治療薬のような薬物の類縁体との結合体
とし、そして抗−酵素抗体、通常はモノクローン抗−酵
素抗体に結合させるのがよい。

【０１０８】キットは酵素基質、ＥＬＩＳＡ検定やＤＮ
Ａプローブ検定におけるような支持体、補助的試薬など
のような、信号発生系の構成要素を含めて検定を行なう
ための他の別個に包装された試薬を更に含むことができ
る。支持体は多孔質または非多孔質の水に不溶の材料で
よい。この支持体は親水性でもよいし、または親水性を
与えうるものでもよく、そして無機粉末、天然重合体材
料；合成重合体か変性天然重合体、例えばプラスチッ
ク、ガラス、セラミックス；金属などを包含する。本発
明に係るキットに各種の補助的材料がしばしば使われ
る。

【０１０９】

【実施例】以下の代表的な例により本発明を更に説明す
る。本明細書中で用いた部数および百分率は特に断らな
い限り重量で表わしてある。温度は摂氏度（℃）であ
る。

【０１１０】例１ Ｇ６ＰＤＨに対するモノクローン抗体の調製 Ａ． 略号と定義 ΔＡ_ｏ Ｓｔａｓａｒ装置での最初の吸光度の読み ΔＡ_ｆ Ｓｔａｓａｒ装置での最終吸光度の読み（１０秒の 遅れの後１０秒毎の四つの読みの合計） Ａｂ（ｓ），ＭＡｂ（ｓ） 抗体（複数）、モノクローン抗体（複数） Ａｇ８．６５３ Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．から得た非分泌骨髄腫細胞系 ＣＦＡ 完全フロイントアジュバント

【０１１１】 ＤＨ_２Ｏ ミリポア脱イオン水 希釈剤Ａ 試薬Ａ ＥＭＩＴ▲Ｒ▼検定緩衝液、家兎血清アル ブミン１０ｇ／リットル、Ｔｒｉｚｍａベース６． ６６ｇ／リットル、アジ化ナトリウム０．５ｇ／リ ットル、チメロサール０．０５ｇ／リットル、ニコ チンアデニンジヌクレオチド２６．５４ｇ／リット ル、グルコース−６−リン酸１８．６２ｇ／リット ル ＤＭＥＭ Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地 ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド ジエタノールアミン ジエタノールアミン９６ｍｌ／リットル、塩化マグ 緩衝剤 ネシウム６Ｈ_２Ｏ ４９ｇ／リットル；ｐＨを９． ８に調整 ＥＬＩＳＡ 酵素と組み合わせた免疫吸着検定 ＦＣＳ ウシ胎児血清 Ｇ６ＰＤＨ グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ ＨＡＴ ０．１ｍＭヒポキサンチン、１６μＭチミジン、０ ．８μＭアミノプテリンを添加したスーパーＤＭＥ Ｍ ＨＢＳＳ ハンクス液 ＨＴ ０．１ｍＭヒポキサンチン、１６μＭチミジン添加 スーパーＤＭＥＭ ＩＦＡ 不完全フロイントアジュバント ＮＳＳ 正常ヒツジ血清 ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水、０．０１Ｍリン酸塩、０．１５ Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、 ｐＨ７．２

【０１１２】 ＰＥＧ ポリエチレングリコール ＱＵＮ キニジン ＲＢＦ／Ｄｎ系 Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから得たＲＢＦ／Ｄｎマ ウス〔Ｐｂ（１．３）１ＢｎｒＲｂ（８．１２） ５Ｂｎｒ、Ｒｂ（９．１４）６８ｎｒ〕； 参考文献−Ｔａｇｇａｒｔ等、（１９８３）Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ，２１９，１２２８−１２３０。 ＨＬ−１骨髄腫（Ｖｅｎｔｒｅｘ Ｎｏ．ＶＢＰＧ ００７−６５３、ロット０１４１５Ａ） ＨＬ−１培地（Ｖｅｎｔｒｅｘ Ｎｏ．ＶＢＰＧ０ ０１） ＲＳＡ 家兎血清アルブミン ＲＴ 室温 スーパーＤＭＥＭ １０％ＦＣＳ、１０％ＮＣＴＣ １０９、５０ｍｇ ／ｍｌゲンタマイシン、４．０ｍＭ Ｌ−グルタミ ン、１．０ｍＭオキサロ酢酸、０．４５ｍＭピルベ ート、１０μｇ／ｍｌウシインシュリン、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ＴＨＰ テオフィリン Ｔｒｉｓ ０．０５５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０（Ｓｉｇｍａ ＃Ｔ−１５０３） 洗浄緩衝液 ＰＢＳ中０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５５Ｍ Ｔｒｉｓ， ２４．２２８ｇ／１００ｍｌ Ｔｒｉｓ（ＭＷ１２ ｐＨ８．０ １．４）、９．７１ｍｌ／１００ｍｌ １２ＮＨＣ ｌ、ｐＨを８．０に調整。

【０１１３】Ｂ． 実験材料および方法 １． 免疫化 最初に２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを１００μｇ（「高
用量」マウス１２匹）または１０μｇ（「低用量」マウ
ス１２匹）のＧ６ＰＤＨで腹腔内に免疫化した。免疫原
はＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ（ＵＳＢ）カタログＮｏ．１６１９０およびＣｏｏ
ｐｅｒカタログＮｏ．９８６９のＣＦＡ中Ｇ６ＰＤＨ５
０：５０混合物であり、２週目にＩＦＡ中１００μｇま
たは１０μｇ（高用量または低用量マウス）で１回追加
免疫し、その後月１回の間隔で追加免疫した。種々な間
隔でマウスから得た血清について、Ｃｏｏｐｅｒおよび
ＵＳＢ両方のＧ６ＰＤＨｌおよび３ｍｇ／ｍｌに対しＯ
ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｇ二重免疫拡散法によりタイターを
チェックした。

【０１１４】８匹のＣＢ６／Ｆｌマウスからなる第二の
組をＣＦＡ中１００μｇのＧ６ＰＤＨ（Ｃｏｏｐｅｒ：
ＵＳＢ５０：５０）で免疫化し、２週間間隔でＩＦＡ中
１００μｇで２回、次にその後月１回追加免疫した。

【０１１５】８匹のＲＢＦ／Ｄｎマウス〔Ｒｂ（１．
３）１ ＢｎｒＲｂ（８．１２）５Ｂｎｒ、Ｒｂ（９．
１４）６Ｂｎｒ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから得た〕
の最後の組はＣＦＡ中１００μｇ５０：５０ Ｇ６ＰＤ
Ｈで免疫化し、次に２週から３週間隔でＩＦＡ中１００
ｍｇで２回追加免疫し、次にその後月１回追加免疫した
〔Ｔａｇｇａｒｔ等、（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
１９：１２２８〜１２３０〕。

【０１１６】２． 融合 １３回の融合を完了させた。下記の標準ＰＥＧ融合手順
により融合１から１１に対し親骨髄腫Ｐ３Ｘ６３ Ａｇ
８．６５３（８．６５３）を使用した。融合１２と１３
は下記のようにＲＢＦ／ＤｎマウスおよびＨＬ−１骨髄
腫（Ｖｅｎｔｒｅｘ カタログＮｏ．ＶＢＰＧ００７−
６５３、ロットＮｏ．０１４１５Ａ）を用いて行なっ
た。

【０１１７】８．６５３融合は次のように行なった： 免疫化したマウスから脾臓を無菌的に取り出し、無関係
な組織を切り取り、次に滅菌したホモジナイザー中に薄
切りして入れ、スーパーＤＭＥＭ中で５回から７回通し
て均質化した。この脾臓細胞浮遊液をＤＭＥＭ（ＦＣＳ
なし）中２．５×１０^７個の８．６５３細胞／脾臓とな
るように管中に注ぎ出し、毎分１０００回転で５分間延
伸した。細胞を２０ｍｌのＤＭＥＭ（ＦＣＳなし）で１
回洗浄し、次に２ｍｌのＰＥＧ／脾臓中におだやかに再
浮遊させた。管をおだやかに手で１分間回し、次に１ｍ
ｌのＤＭＥＭ（ＦＣＳなし）を加え、混合し、続いて５
〜７ｍｌのスーパーＤＭＥＭを加えた。管を６分間静置
し、次に毎分８００−１０００回転で５分間遠心した。
細胞を１２０ｍｌのスーパーＨＡＴ培地／脾臓中に再浮
遊させ、６枚のＣｏｓｔａｒ ９６−ウエル組織培養プ
レート／脾臓中に２００μＬ／ウェルで塗布した。これ
らプレートを７％ＣＯ_２中３７℃でインキュベーション
し、３〜７日後に、次に毎日ハイブリドーマの発育につ
いて観察した。４日または５日目に腹腔の浸出性供給細
胞を含むスーパーＨＡＴを培養に供給し、次に７日また
は８日目およひ１０日目に１５０μｌの廃培地を取り除
き、それを１７５μｌの新しい培地で置き換えることに
よりスーパーＨＴ（アミノプテリンなし）を供給した。

【０１１８】 ＲＢＦ／Ｄｎ×ＨＬ−１融合は次のように行なった： ８．６５３融合（上記）の場合と同様に脾臓を取り出し
て処理するが、ただしスーパーＤＭＥＭの代りにＨＬ−
１培地（ＶｅｎｔｒｅｘカタログＮｏ．ＶＢＰＧ００
１、血清含まず、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび５０μ
ｇ／ｍｌのゲンタマイシン添加）を用いた。この脾臓細
胞をＨＬ−１培地中約７×１０^６から１×１０^７ＨＬ−
１骨髄腫細胞／脾臓に加え、１ｍｌのＨＬ−１培地／脾
臓、続いてＰＥＧ添加後１％ＦＣＳを含む５ｍｌのＨＬ
−１培地を使用して前記のように融合を完了させた。遠
心後細胞を、ＡＡＴ（７．５×１０^−５Ｍアデニン、
０．８μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン）を含む
１２０ｍｌのＨＬ−１培地／脾臓中に再浮遊させた。最
初のときはＡＡＴを含むＨＬ−１（融合１２に対して供
給細胞なし、融合１３の半分に対し供給細胞添加、また
半分に対し１％ＦＣＳ添加）を、次にその後ＡＴ（アミ
ノプテリンなし）を含むＨＬ−１を用いて前記のように
融合物をを培養した。

【０１１９】３． スクリーニング プレート被覆としてＵＳＢおよびＰｏｏｐｅｒ Ｇ６Ｐ
ＤＨの５０：５０混合物を使用してＦｏｒｗａｒｄ Ｅ
ＬＩＳＡにより融合物を先ずスクリーニングした。この
最初のスクリーニングに続いて下記の酵素熱保護検定法
を行なった。保護を示すウエルをクローン化し、ＥＬＩ
ＳＡによりスクリーニングした。クローンが安定化した
とき最後の保護検定を行なった。ＭＡｂｓのこれ以上の
研究はＥＭＩＴ▲Ｒ▼検定により行なった。 （イ） Ｆｏｒｗａｒｄ ＥＬＩＳＡ （１）Ｃｏｓｔａｒ ＥＩＡプレートを、ＰＢＳ（ｐＨ
７．２）中ＣｏｏｐｅｒおよびＵＳＢ Ｇ６ＰＤＨの５
０μｇ／ｍｌ等量混合物５０μＬ／ウエルで１〜２時間
３７℃で被覆した。これらプレートを室温（ＲＴ）で１
〜４時間、４℃で一晩 、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中１％
ＮＳＳ ２００μＬ／ウエルで阻止した。使用に先立
ち、これらをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で１回洗浄した。

【０１２０】（２）腹水Ａｂの培養上澄５０μｌ／ウエ
ルをこれらウエルに加え、プレートを３７℃で１時間イ
ンキュベーションした。

【０１２１】（３）プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で
３回洗浄し、次に５０μＬ／ウエルの１０００倍希釈ヤ
ギ抗−マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（γ＋μ＋軽鎖特異的）−
アルカリ性ホスファターゼ結合体（ＴａｇｏカタログＮ
ｏ．６５４３）（ＰＢＳ、ｐＨ７．２中）をウエルに加
え、プレートを３７℃で１時間インキュベーションし
た。

【０１２２】（４）プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で
５回洗浄し、次にこれらウエルに７５〜１００μｌ／ウ
エルの基質、ｐ−ニトロフェニルホスフェート二ナトリ
ウム（ＳｉｇｍａカタログＮｏ．１０４０、６０ｍｇ／
１００ｍｌ）をジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．
８）に溶かして加えた。

【０１２３】（５）プレートを３０〜９０分間振盪し、
次に４０５ｎｍで読みを取った。バックグランドの２倍
より大きいＯＤをもつウエルをこれ以上の研究あるいは
クローン化に選んだ。

【０１２４】（ロ）Ｇ６ＰＤＨ酵素熱保護検定法 （１）２００μｌの試料（上澄あるいは希釈腹水）、Ｔ
ｒｉｓ−ＲＳＡ緩衝液（５５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１％ＲＳ
Ａ、ｐＨ８．０）、スーパーＤＭＥＭ、および１：１０
希釈Ｇ６ＰＩＩＩＥ２腹水Ａｂ対照を、Ｓｙｖａ Ｃｏ
ｍｐａｎｙから販売されているＥＭＩＴ▲Ｒ▼キニジン
検定に利用されるＱＵＮ−Ｇ６ＰＤＨ結合体４００μｌ
（５ｍｌＴｒｉｓ−ＲＳＡ緩衝液中１μｌ）と共に管に
入れ、混合した。

【０１２５】（２）工程（ロ）（１）における各管から
の重複する２００μｌ試料を２組の管に入れ、１０分イ
ンキュベーションした（１組は水浴中４０℃で、また他
の組はＲＴで）。

【０１２６】（３）管を直ちに氷水浴に入れた。 （４）下記のように組み立てたＳｔａｓａｒシステムで
３４０ｎｍにおける吸光度を読んだ：

【０１２７】（イ）Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）３０
０μｌを用いてＣｒｏｈｎカップをつくる。（ロ）この
カップへ試料（５０μｌ）をピペッター−希釈器を使用
して２５０μｌのＴｒｉｓと共に加えた。

【０１２８】（ハ）基質濃縮物（５０μｌ；２×希釈剤
Ａ、Ｓｙｖａ ＣｏｍｐａｎｙＮｏ．６Ａ３５３＋２５
０μｌＴｒｉｓをピペッター−希釈器で加え、試料を読
んだ。

【０１２９】（ニ）二点測定法で吸光度をセットしたＳ
ｔａｓａｒを用いて１０秒遅れて読み（Ａ。）をとり、
次に４０秒後（ΔＡ_ｆ）に読みをとった。

【０１３０】（５）結果を次のように計算した： （イ）ＲＴおよび４０℃における各試料のΔＡ_ｆを記録
した。ＲＴでのＴｒｉｓ緩衝液のパーセント（％）酵素
速度１００％の値とした（対照、ｃ−ＲＴ）。 （ロ）全試料およびＲＴと４０℃での対照の速度％を、
これらのΔＡ_ｆ値を対照の値で割って１００倍すること
により決定した：（ΔＡ_ｆ試料／ΔＡ_ｆＣ−ＲＴ）１０
０。 （ハ）次に４０℃における試料の酵素速度％を、４０℃
におけるＴｒｉｓおよびＳｕｐｅｒ ＤＭＥＭに対する
速度％ならびにＲＴにおけるその試料の速度％と比較し
た。大きい百分率の活性残留（即ち、４０℃で５０％よ
り大きい％）を示したものを選んだ。

【０１３１】４． クローン化 すべてのハイブリドーマを安定化に先立ち連続希釈によ
り３回から４回クローン化した。陽性ウエルからの細胞
を細胞密度（少数の細胞を含むハイブリドーマはクロー
ン化に先立ち２４ウエル培養でより高い密度まで発育さ
せた）により１：１０または１：１００に希釈してＣｏ
ｓｔａｒ ２４−ウエル培養プレートに入れた。この希
釈液５０μｌを２００μｌスーパーＤＭＥＭ／ウエルを
含むミクロタイタープレートの最初のウエルに入れた。
マルチチャンネル ピペッターで混合後、この列から５
０μｌを２番目の列に移し、この手順を４列（１枚のプ
レートの半分）か８列（プレート全部）いずれかに対し
続けた。視覚による検査で最初の列は５から２０個の細
胞／ウエルを含み、三番目か四番目の列はせいぜい僅か
１個か２個の細胞／ウエルを含んでいた。プレートを７
％ＣＯ_２中３７℃でインキュベーションし、５から１０
日後ＥＬＩＳＡにより再スクリーニングした。

【０１３２】５． 凍 結 安定なハイブリドーマを下記のように、４個の冷凍びん
／ハイブリドーマを用いて凍結し、重要なハイブリドー
マに対してはもっと大量を凍結した。簡単に言えば、細
胞を９６−ウエル培養から２４−ウエル培養、Ｔ−２５
フラスコ、そして最後にＴ−７５フラスコに膨張させ
た。対数期培養からの細胞をＴｒｙｐａｎＢｌｕｅ中血
球計で計数し、望む数の生活力ある細胞（通常は１０^６
〜１０^７／びん）をＢｅｃｋｍａｎ ＴＪ−６遠心器で
毎分１０００回転で１０分間延伸した。上澄を注ぎ出
し、細胞ペレットを氷浴に入れた。細胞を冷無菌１０％
ＤＭＳＯ−９０％スーパーＤＭＥＭ中に再浮遊させ、レ
ッテ

【０１３３】ルを貼った２ｍｌ Ｎｕｎｃびん、１ｍｌ
びんに小分けし、氷浴に入れた。これらびんを発泡ポリ
スチレン容器中Ｑｕｅｕｅ−１２０℃フリーザーに一晩
置くことにより細胞を冷凍した。前記フリーザーはおよ
そ−１゜／分の冷却速度をもつ。次にびんを液体窒素容
器中に貯蔵した。

【０１３４】６． 腹 水 表２に掲げた６ハイブリドーマに対して腹水をつくり、
これらのＡｂｓを酵素保護およびＥＭＩＴ検定の実行に
ついて再試験をした。ハイブリドーマを注射する１週間
から４週間前に０．５ｍｌプリスタン（Ｓｉｇｍａ カ
タログＮｏ．Ｔ−７６４０；２，６，１０，１４−テト
ラメチルペンタデカン）／マウスで処置したＢａｌｂ／
ｃマウスで腹水をつくった。凍結のときと同様に細胞を
膨張させ、次に１０^６から１０^７個の細胞／マウスを毎
分１００回転で１０分間Ｂｅｃｋｍａｎ ＴＪ−６遠心
機で遠心した。上澄を注ぎ出し、必要な体積のスーパー
ＤＭＥＭ（０．５ｍｌ／マウス、通常はマウス２〜４匹
／細胞

【０１３５】系）中に細胞を再浮遊させた。これら細胞
をプリスタン処置マウスに腹腔内注射し、次に腫瘍の発
現について観察した。腫瘍は普通１０〜１４日後明瞭に
なった。１６−または１８−ゲージの針を腹の側部に挿
入し、試験管の中に液体を集めることによって腹水を穿
刺した。他のおよそどの日もマウスを穿刺した。

【０１３６】腹水を３０分から１時間ＲＴで凝固させ、
次にＢｅｃｋｍａｎ ＴＪ−６遠心機で１５から３０分
間毎分２５００回転で４℃において遠心した。この透明
液をレッテルを貼った管の中に移し、−２０℃で貯蔵し
た。

【０１３７】７． 特性づけ Ｚｙｍｅｄ Ｍｏｎｏ Ａｂ ＩＤ ＥＩＡキット（Ｎ
ｏ．９０−６５５０、融合物１〜７）かＳｏｕｔｈｅｒ
ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＳＢＡ Ｃｌｏｎｏ
ｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉキット（Ｎｏ．５０１
０−ＡＰ、融合物８〜１０）のいずれかを用いてそれら
の使用説明書に記載のようにハイブリドーマＡｂｓの下
位分類を決定した。

【０１３８】サイムドのキットに対する手順は標準ＥＬ
ＩＳＡに対する手順と同様にＧ６ＰＤＨで被覆したプレ
ートを使用した。消耗培養上澄５０μｌ／ウエルをプレ
ートに結合させ、続いて５０μｌ／ウエルの正常家兎血
清対照か家兎抗−マウス下位分類の特異的Ａｂｓ（Ｉｇ
Ｇ_１、ＩｇＧ_２ａ、ＩｇＧ_２ｂ、ＩｇＧ_３、ＩｇＭ、Ｉ
ｇＡ、およびκおよびλ軽鎖）のいずれかをプレートに
結合させた。これに続いてヤギ抗−家兎ペルオキシダー
ゼ結合体およびＡＢＴＳ−ペルオキシド基質（キットで
供給される）を結合させた。ＯＤ_４１４を読み、下位分
類を決定した。

【０１３９】Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙキットに対する手順も同様で、Ｇ６ＰＤＨ被覆Ｅ
ＬＩＳＡプレートおよび５０μｌ／ウエルの上澄Ａｂを
使用した。これに続いて、５０μｌ／ウエルのヤギ抗−
マウスＩｇＧ Ａｂ−アルカリ性ホスファターゼ結合体
（特異的下位分類ではない）かヤギ抗−マウス下位分類
−特異的Ａｂ−アルカリ性ホスファターゼ結合体（Ｉｇ
Ｇ_１、ＩｇＧ_２ａ、ＩｇＧ_２ｂ、ＩｇＧ_３、ＩｇＭ、お
よびκおよびλ軽鎖）のいずれかを用い、次にｐ−ニト
ロフェニルホスフェート基質を用いた。ＯＤ_４０５を読
み、下位分類を決定した。

【０１４０】Ｇ６ＰＤＨ源特異性 ＭＡｂｓが二つのＧ６ＰＤＨ酵素（ＵＳＢまたはＣｏｏ
ｐｅｒ）のいずれかに結合する能力をＦｏｒｗａｒｄ
ＥＬＩＳＡにより試験した。標準ＥＬＩＳＡは下記の変
更を与えて実施した：

【０１４１】（イ）ＥＩＡプレートをＦｏｒｗａｒｄ
ＥＬＩＳＡの場合と同様にＰＢＳ（ｐＨ７．２）中Ｃｏ
ｏｐｅｒかＵＳＢいずれかのＧ６ＰＤＨの１００μｇ／
ｍｌ溶液５０μｌ／ウエルで被覆した。 （ロ）希釈腹水Ａｂ５０μｌ／ウエルをプレートのウエ
ルへ１：２段階で１：１００希釈から１：２０４，８０
０希釈までウエル１２個／Ａｂで加え、プレートを３７
℃で１時間インキュベーションした。各Ａｂを両方の酵
素に暴露した。

【０１４２】（ハ）ヤギ抗−マウスアルカリ性ホスファ
ターゼ結合体をＦｏｒｗａｒｄ ＥＬＩＳＡの場合と同
様に加えた。 （ニ）基質をＦｏｒｗａｒｄ ＥＬＩＳＡの場合と同様
に加えた。 （ホ）プレートをＦｏｒｗａｒｄ ＥＬＩＳＡの場合と
同様に読んだ。

【０１４３】プレート被覆として用いたＵＳＢまたはＣ
ｏｏｐｅｒいずれかのＧ６ＰＤＨ酵素に対し、抗−Ｇ６
ＰＤＨ ＭＡｂｓの種々な希釈（ＥＬＩＳＡプレートを
横切って１：１００から１：２０４，８００までの腹水
Ａｂの１：２希釈）についてＥＬＩＳＡ結合曲線を測定
した。１０−４Ｄ６Ａｂだけが二つの酵素間で結合に有
意差を示し、ＵＳＢ Ｇ６ＰＤＨに対する優先性を表示
した。

【０１４４】Ｃ． 結 果 １． 卑疫化 ２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスの第一の組から得たタイタ
ーを、第４週免疫化の７日後Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ二
重免疫拡散により調べたところ、高投与量（１００μ
ｇ）マウスだけが目に見えるプレシピチン帯を示した。
融合１と２はこれらのマウスを用いて行なった。８週間
目の追加免疫後１０日で血清タイターを再び調べたとこ
ろ低投与量（１０μｇ）マウスにも今度は若干の応答が
見られた。この点で低投与量マウスの９匹を１００μｇ
追加免疫に切り換えた。融合３と４は再び高投与量マウ
スで行なった。１２週目の追加免疫後８日で血清タイタ
ーを再チェックしたところ３匹（低用量から高用量へと
切換えたもの）を除く全部が良好なプレシピチン反応を
示した。融合５と６は本来の高投与量マウスで行ない、
融合７は低用量だけを投与されたマウスで行なった。融
合９は低用量の次に高用量を投与されたマウスで行なっ
た。

【０１４５】８匹のＣＢ６／Ｆ１マウスの第二の組から
得たタイターを、Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ二重免疫拡散
により、６週間目の免疫化後６日のマウスから得た血清
についてチェックした。全マウスが非常に良い反応を示
した。融合８，１０および１１はこれらマウスを用いて
行なった。

【０１４６】８匹のＲＢＦ／Ｄｎマウスの最後の組から
のタイターを、６週間目の免疫化後６日のマウスから得
た血清についてＯｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙによりチェック
した。すべてのマウスが非常に良いタイターを示した。
融合１２と１３はこれらのマウスで行なった。

【０１４７】２． 融 合 融合の要約を表１に示す。Ｂａｌｂ／ｃまたはＣｂ６／
Ｆ１マウスを用いた融合だけが最初のスクリーニングで
Ａｂ−産細胞を生じた（融合１，３，４，５，６，７，
８，１０および１１）。これらから８ハイブリドーマだ
けを安定化した（表２）。最もうまく行った融合は、高
用量（１００μｇ）のＧ６ＰＤＨで免疫化したマウスを
用いた場合であった（融合１，３，４，５，６，８，１
０および１１）。低用量（１０μｇ）マ

【０１４８】ウスあるいは最初１０μｇ次に１００μｇ
のＧ６ＰＤＨを受けたマウスを用いて行なった融合は一
般に最初のＡｂ−陽性ウエルあるいは安定化されたハイ
ブリドーマをつくり出す上で不成功だった（融合７と
９）。融合７は一つの安定化された細胞系を生じ、その
Ａｂは保護性もなく救助もしなかった。ＲＢＦ／Ｄｎ系
はハイブリドーマを生じなかった。これに対する理由は
不明である。

【表３】

【表４】

【０１４９】 ３． スクリーニング、クローン化、特性づけ 一次ＥＬＩＳＡ後の二次スクリーニング、熱的保護検定
の使用はクローンの数を熱的ストレスからＧ６ＰＤＨを
保護するものに効果的にせばめることができた。１３の
融合から、８ハイブリドーマが安定化され（表１は行な
われたすべての融合を要約している）、そのうち４ハイ
ブリドーマは酵素保護を示した。クローン８−１０Ｂ３
の場合には、７７−８１％の酵素活性が保持されるのに
対し、これと比較してＡｂを含まない対照では僅かに４
５から５０％の酵素活性が保持された。８−１０Ｃ７に
ついては８０％の酵素活性が保持され、８−１２Ｂ４に
ついては７８〜８４％の活性が保持され、また１０−４
Ｄ６については８５〜８７％の活性が保持されている。
これらの実験は一つの時点（１０分）だけ見ているの
で、保持される活性パーセントは高い温度にもっと長く
暴露した後では一層高いかもしれない。

【０１５０】例２酵素活性を阻害することなくＧ６ＰＤＨ結合体を安定化
する抗−Ｇ６ＰＤＨ抗体 例１で前述した方法と同様の方法でつくられた種々なモ
ノクローン抗−Ｇ６ＰＤＨ抗体を試験して、これらがＳ
ｙｖａ社により販売されているＥＭＩＴ▲Ｒ▼キニジン
検定に利用されるキニジン−Ｇ６ＰＤＨ結合体の熱的安
定性を高めるかどうかを測定した。種々なモノクローン
抗−Ｇ６ＰＤＨ抗体とキニジン−Ｇ６ＰＤＨ結合体との
複合体を次のようにして調製した。キニジン−Ｇ６ＰＤ
Ｈ（〜０．２ｍｇ／ｍｌ）を

【０１５１】モル過剰の抗体（〜３ｍｇ／ｍｌ）と混合
した。活性を測定する前に混合物を４５°で１０分イン
キュベーションした。対照試料は冷却状態に保った。４
５℃で１０分間それ自身を加熱することは酵素を部分的
に不活性化することが知られている条件である。結果を
表３に要約する。ＩＩＩＦ２およびＶＩＩＦ９は酵素の
安定性を著しく向上させるのに対し、他の抗体が酵素を
安定化する程度は低いことがわかる。

【表５】

【０１５２】次に抗−ジゴキシンによるジゴキシン−Ｇ
６ＰＤＨの阻害の程度に及ぼすモノクローン抗−Ｇ６Ｐ
ＤＨ抗体の効果を測定した。

【０１５３】前記のモノクローン抗体の若干、即ちＶＩ
ＩＦ９、ＨＩＩＦ２およびＩＩＩＥ１を研究した。これ
らモノクローン抗−Ｇ６ＰＤＨ抗体とジゴキシン−Ｇ６
ＰＤＨ結合体との複合体をつくった。ジゴキシン−Ｇ６
ＰＤＨ結合体１５０ｎｇを０．５ｍｌの緩衝液中指示さ
れたモノクローン抗体５μｇと３０分以上インキュベー
ションした。緩衝液２００μｌ中ヒツジ抗−ジゴキシン
抗血清の指示された希釈液５０μｌを次に加え、続いて
直ちに酵素基質を含む緩衝液２５０μｌを加えた。３０
秒間にわたり３４０ｎｍにおける吸光度の増加を１５秒
遅れて測定することにより酵素活性を３７°で測定し
た。複合体の酵素活性をヒツジ抗−ジ

【０１５４】ゴキシンの種々な希釈液の存在下に測定し
てこれら２組の抗体間の相互作用があるかどうかを調べ
た。下記の表４から分かるように、種々のモノクローン
抗体の挙動は相違する。抗体ＩＩＩＥ１は高度に阻害性
があり、ＩＩＩＦ２は有意に阻害的ではないが抗−ジゴ
キシンによる阻害の程度を減少させ、そしてＶＩＩＦ９
は阻害性がなくまた抗−ジゴキシンによる阻害に影響を
もたなかった。それ故に、ＶＩＩＦ９はジゴキシン検定
に使用するためのＧ６ＰＤＨとジゴキシンとの結合体に
於けるＧ６ＰＤＨを安定化する特に適当な抗体である。

【表６】

【０１５５】例３抗−ＨＲＰを利用するＨＲＰの安定化 自然のままのセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）を２ｇ／リットルのウシγ−グロブリン（Ｍｉｌｅ
ｓ Ｌａｂｓ，不安定酵素を含まず）を含む０．１Ｍ
ＮａＨ_２ＰＯ_４／０．２Ｍ ＮａＣｌ中に１μｇ／ｍｌ
まで希釈した。モノクローン抗−ＨＲＰを含む腹水（例
１記載の方法と同様にしてつくった細胞系ＨＲＰ−ＰＥ
Ｎ８Ｇ９から得たもの）を酵素溶液の部分ヘ加えた（酵
素溶液１ｍｌ当り１０μｌの腹水）。２２℃で１時間の
平衡化の後、これらの溶液を６５℃の水中に置き、熱的
不活性化の反応速度を測定した。種々な時間でこの部分
を氷浴へ取り出し不活性化を停止させた。各部分のＨＲ
Ｐ活性をその後測定した。

【０１５６】これらの実験条件下で、ＨＲＰに対する抗
体欠如下でのＨＲＰは６５℃で５６分の半減期を示し、
抗体存在下での半減期は６５℃で２１４分と算定され
た。

【０１５７】抗−ＨＲＰが検定と両立しうることを実証
するため、次の実験を行なった。テオフィリン酵素試薬
（Ｓｙｖａ社の臨床用ロット×０１、０．１Ｍ ＮａＨ
_２ＰＯ_４／０．２Ｍ ＮａＣｌ中０．４ｍｇ／リットル
のＨＲＰ−テオフィリン、ウシγ−グロブリン２ｇ／リ
ットル、グルコースオキシダーゼ１００ｍｇ／リットル
＋洗浄剤および安定剤を含む）を抗−ＨＲＰ腹水（細胞
系８Ｇ９から、酵素試薬１ｍｌ当り腹水１０μｌ）で補
充し、Ｓｙｖａ社のＡｃｃｕｌｖｅｌ▲Ｒ▼検定実験計
画のためのテオフィリン校正曲線を引くために用いた。
小片はその上に抗−テオフィリンＭＡｂを固定化したも
のである。未処理酵素試薬も対照として実験を行なっ
た。

【０１５８】校正曲線は色のついたバーの高さに関して
実質的に同一であった。抗テオフィリンとＨＲＰ−テオ
フィリンとの間の結合の効果的親和性は抗−ＨＲＰ存在
下で幾分減少し、幾分か一層拡散した色の先端がその現
われであるという何らかの証拠がある。

【０１５９】例４抗−Ｇ６ＰＤＨを用いるＥＭＩＴ▲Ｒ▼検定 例１で調製された保護効果を示すＭＡｂｓ ８−１０Ｂ
３、８−１０Ｃ７、８−１２Ｂ４および１０−４０６を
そのＥＭＩＴ▲Ｒ▼検定における効果について更に試験
した。ＭＡｂｓをテオフィリンおよびキニジンＥＭＩＴ
▲ｒ▼検定（ＳｙｖａＣｏｍｐａｎｙ，パロ アルト、
カリホルニア州）に加えた。

【０１６０】Ａ． ＥＭＩＴ検定計画 Ｓｔａｓａｒ組み立て： 濃モード、３４０ｎｍ、３０℃ セット時間モード、１５秒遅れ、３０秒読み 検定：ＥＭＩＴキット試薬を使用。

【０１６１】（イ）試薬Ｂ５０μｌ＋希釈腹水Ａｂ（検
定緩衝液中１：１０）５０μｌあるいは対照としての緩
衝液＋検定緩衝液２００μｌを、ピペットマンを用いて
Ｃｒｏｈｎカップに入れた。カップをＲＴで１０分イン
キュベーションした。キャリブレーター毎にあるいは検
定で用いた試料毎に１個のカップをつくった（即ち、７
本のキャリブレターは各ＭＡｂの７個のカップを意味す
る）。

【０１６２】（ロ）各キャリブレーターあるいは他の試
料５０μｌ＋検定緩衝液２５０μｌをピペッター希釈器
を用いてもう一つのカップに入れた。

【０１６３】（ハ）工程（ロ）からの５０μｌ＋検定緩
衝液２５０μｌをピペッター希釈器を用いて検定カップ
に入れた。（ニ）試薬Ａ５０μｌ＋検定緩衝液２５０μ
ｌをピペッター希釈器を用いて検定カップに加えた。こ
の添加はＳｔａｓａｒがフローセルを清掃しているとき
行なった。

【０１６４】（ホ）ピペットマンを用いて工程（イ）の
カップから３００μｌを検定カップに加え、混合物をＳ
ｔａｓａｒで読んだ。 （ヘ）この過程を全キャリブレーターあるいは各腹水Ａ
ｂに対する試料および緩衝液対照について繰り返した。

【０１６５】（ト）各キャリブレーターに対するΔＡ−
ΔＡ。を、異なるキャリブレーター間の隔たりの変化
（例えば、Ｎｅｇから０．５）と共に計算し、ＭＡｂｓ
で与えられた値を緩衝液対照のそれと比較した。もしＡ
ｂが検定で妨害にならなかったならば、その値は等価と
なる筈である。

【０１６６】試薬Ｂに抗−Ｇ６ＰＤＨ ＭＡｂ（１：１
０腹水Ａｂ５０μｌ）を添加したときと添加しない場合
とで、種々なキャリブレーター濃度（ＴＨＰに対しては
Ｎｅｇ、２．５、５、１０、２０、および４０μｇ／ｍ
ｌ；ＱＵＮに対してはＮｅｇ、０．５、１、２、４およ
び８μｇ／ｍｌ）を用いた。

【０１６７】Ｂ． 結 果 四つのＭＡｂｓをＱＵＮまたはＴＨＰ ＥＭＩＴ検定に
加えることの効果を測定した。保護ＭＡｂまたは緩衝液
対照の存在でＥＭＩＴ検定標準曲線を引いたときに得ら
れる吸光度の読みを測定した。ＴＨＰ ＥＭＩＴ検定に
対して、８−１０Ｂ３、８−１０Ｃ７および１８−１２
Ｂ４の存在はキャリブレーターにより与えられた結果を
変化させず、それらの曲線は平行であり、殆ど重なっ
た。１０−４Ｄ６に対しては、ＭＡｂの存在は標準曲線
に信号の改善が得られるようであり、吸光度の読みは幾
分か高く、曲線の傾斜はやや急勾配になった。

【０１６８】ＱＵＮ ＥＭＩＴ標準曲線に及ぼすＭＡｂ
ｓの効果はやや異なった。８−１０Ｃ７および８−１２
Ｂ４に対しては、曲線は再び殆ど同一になった。８−１
０Ｂ３の場合には、曲線の傾斜を平等化することにより
示されるように、曲線の上端のところでの隔たりに減少
があるようであった。ＭＡｂ１０−４Ｄ６は緩衝液で与
えられた曲線と平行の曲線を与えたが、キャリブレータ
ーに対する吸光度の読みはすべてこのＭＡｂによって幾
分かより高くなった。上澄および腹水ＭＡｂの両方に関
して、１０−４Ｄ６は四つのＭＡｂｓの酵素活性の最大
の保護パーセント（８５〜８７％）を示した。

【０１６９】例５シクロスポリンＥＭＩＴ▲Ｒ▼検定 ＥＭＩＴ▲Ｒ▼検定実験計画の詳細が米国特許第３，８
１７，８３７号明細書（１９７４）に記載されている。
シクロスポリンＡを認識しうる抗体は、グリシルグリシ
ン延長パラーカルボキシベンジル結合基を介して、シク
ロスポリンＡのアミノ酸残基Ｎｏ．７とＮｏ．８のアラ
ニン窒素原子のところでキーホールリンペットヘモシア
ニンへ結合したシクロスポリンＡの混合物を用いて日常
的ハイブリドーマ技術によりつくられ、そして本例に対
しては、抗−ＣｓＡモノクローン抗体と呼ぶ。アセトカ
ルバメート延長ヒドロキシエチル結合基を介して、シク
ロスポリンＡアミノ酸残基Ｎｏ．７のアラニン窒素原子
のところでグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼに
結合させたシクロスポリンＡからなるＧ６ＰＤＨ−シク
ロスポリンＡ結合体を調製した。本例に対して、このも
のをＣｓＡ−Ｇ６ＰＤＨ結合体と呼ぶ。シクロスポリン
Ａ代謝産物Ｍｌ（Ｍａｕｒｅｒ，Ｇ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔ
ａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ １
９８４，１２（１），１２０−６）を認識することはで
きるが、シクロスポリンＡあるいはこのＧ６ＰＤＨ−シ
クロスポリンＡ結合体を大体において認識できない抗体
は、オキシ酢酸イミノ結合基を介してキーホールリンペ
ットヘモシアニンへ結合させた抗シクロスポリンカルボ
キシアルデヒド（Ｍ１のオゾン／ジメチルスルフィド開
裂により調製）を使用して日常的なハイブリドーマ技術
によりつくられ、本例に対してこれを抗−Ｍ１抗体と呼
ぶ。検定法はＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ分析計で行なった。

【０１７０】全血試料１００μｌおよび６個のキャリブ
レーターを別々に２００μｌのメタノールと渦巻き状に
かきまぜた。このメタノールは細胞を溶解し、シクロス
ポリンＡを可溶化し、血中タンパク質の大部分を沈殿さ
せる。１分間のインキュベーション後、混合物を遠心し
た。上澄を前処理した希釈剤で１対３に希釈した。得ら
れた前処理試料３６μｌを分析計でモノクローン抗−Ｃ
ｓＡ抗体試薬（これは基質および補因子を含む）１５５
μｌと７５秒間インキュベーションした。その後、７５
μｌのＣｓＡ−Ｇ６ＰＤＨ結合体試薬を加えた。１７５
秒のインキュベーション後、ＮＡＤＨの精製を３４０ｎ
ｍで分光光度法により１００秒間追跡することにより酵
素活性（これは薬物濃度の関数である）をモニターし
た。

【０１７１】モノクローン抗−ＣｓＡ抗体試薬はモノク
ローン抗−ＣｓＡ抗体、ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド、グルコース−６−リン酸、抗−Ｍ１抗体（代
謝産物交差反応性の測定のために含める）、塩化ナトリ
ウム、充填剤、界面活性剤および防腐剤を含有する。

【０１７２】ＣｓＡ−Ｇ６ＰＤＨ結合体試薬は酵素結合
体、トリス緩衝剤、充填剤、安定剤および防腐剤を含有
する。

【０１７３】希釈剤はトリス緩衝剤、界面活性剤および
防腐剤を含有する。

【０１７４】各試薬は標準ＥＭＩＴ技術と一致するよう
に処方した。試薬の使用および貯蔵を容易にする充填
剤、界面活性剤および防腐剤を選択した。

【０１７５】ＣｓＡ−Ｇ６ＰＤＨ結合体試薬をグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼに対する抗体（この抗
体は例１記載のようにして調製した）で安定化した。こ
の抗−Ｇ６ＰＤＨ抗体はＣｓＡ−Ｇ６ＰＤＨ結合体試薬
に対する安定剤として用いた

【０１７６】２０本の試料と６種類のキャリブレーター
を２時間未満にこの実験計画の下で前処理し検定した。

【０１７７】検定標準曲線の範囲を５００ｎｇ／ｍｌま
で広げた。この曲線範囲内での分析回収率は９５から１
０４％を変化した。三段階での実験精度内で対照は５．
０から７．１％ＣＶにわたった。同じ対照について実験
精度間で４．９から７．４％ＣＶにわたった。結果を表
５に要約する。

【表７】

【０１７８】三つの濃度のシクロスポリンＡを１０本の
新鮮なシクロスポリンＡ−陰性全血試料へ添加した。こ
れら試料を重複して検定した。結果を表６に要約する。

【表８】

【０１７９】５通りの濃度のシクロスポリンＡを新鮮な
シクロスポリンＡ陰性全値の二つの別個の試料中へ添加
した。これら試料を重複して検定した。結果を表７に要
約する

【表９】

【０１８０】３通りの濃度の各々で２０本の別個の試料
抽出物について実験内精度測定を行なった。３通りの濃
度の各々で２台の分析計により計２０回の実験で実験間
精度測定を行なった。個々の試料抽出物を各実験で検定
し、同時に得た標準曲線から定量化を行なった。結果を
表８に要約する。

【表１０】

【０１８１】例６フェノバルビタール−Ｇ６ＰＤＨ結合体の安定化と検定 フェノバルビタール−Ｇ６ＰＤＨ結合体（Ｓｙｖａ Ｃ
ｏｍｐａｎｙにより販売されているＥＭＩＴフェノバル
ビタール検定に利用）を３０℃で充填剤および防腐剤を
含む水性緩衝媒質中または同じ媒質であるが例１記載の
ようにして調製したモノクローン抗−Ｇ６ＰＤＨ １０
Ｃ７を含有する媒質中に貯蔵した。種々な時間に酵素活
性を測定し、その結果を表９に要約する。

【表１１】

【０１８２】例５記載のシクロスポリンの検定に用いた
方法と同様にしてフェノバルビタールに対し検定を行な
ったが、ただし用いた試料は種々な量のフェノバルビタ
ールを含む血清である。この検定は結合体またはモノク
ローン抗−Ｇ６ＰＤＨと混合した結合体のいずれかを用
いて行なった。分析対象存在下では酵素速度が欠如下で
観察された（Ｒ−ＲＯ）より以上に増加することが確か
められ、これを表１０に示す。

【表１２】

【０１８３】例７カルバマゼピン−Ｇ６ＰＤＨ結合体の安定化と検定 カルバマゼピン結合体（Ｓｙｖａ Ｃｏｍｐａｎｙによ
り販売されているＥＭＩＴカルバマゼピン検定に利用）
を充填剤および防腐剤を含む水性緩衝媒質中または同じ
媒質であるが例１記載のようにして調製したモノクロー
ン抗−Ｇ６ＰＤＨ ４Ｄ６を含有する媒質中に３０℃で
貯蔵した。種々な時間に酵素活性を測定し、表１１に要
約する。

【表１３】

【０１８４】例５記載のシクロスポリンの検定に用いた
方法と同様にしてフェノバルビタールに対し検定を行な
ったが、ただし用いた試料は種々な量のフェノバルビタ
ールを含む血清である。この検定は結合体または抗−Ｇ
６ＰＤＨ ４Ｄ６と混合した結合体のいずれかを用いて
行なった。分析対象存在下では酵素速度が分析対象欠如
下で観察された（Ｒ−ＲＯ）より以上に増加することが
確かめられ、これを表１２に示す。

【表１４】

【０１８５】明確さと理解し易さを目的として上記発明
を例示によりある程度詳細に説明したが、幾つかの変更
あるいは修飾が特許請求の範囲内で実施できることは明
白である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/32 Ｃ１２Ｑ 1/32 1/68 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ (72)発明者 トーマス エム．ハウツ アメリカ合衆国カリフォルニア州マウン テン ビュー，アルビン ストリート 2418 (72)発明者 イアン ギボンズ アメリカ合衆国カリフォルニア州ポート ラ バレー，ラ メサ ドライブ 831 (56)参考文献 特開 平２−2936（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 9/96 G01N 33/535 G01N 33/542 G01N 33/577 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (22)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵素と特異的結合対の構成要素との結合
   体（酵素結合体）を安定化する方法において、前記酵素
   結合体を前記酵素に対する有効量の抗体と結合させる工
   程を含み、そして前記抗体は前記酵素の活性を実質的に
   阻害しないものである上記方法。
2. 【請求項２】 前記酵素はデヒドロゲナーゼ、グルコー
   ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、マレートデヒドロゲ
   ナーゼ、ペルオキシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシ
   ダーゼ、およびグルコースオキシダーゼから選ばれる、
   請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 特異的結合対の構成要素はポリヌクレオ
   チド、抗原またはハプテン、および抗体から選ばれる、
   請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 酵素に対する抗体はモノクローン抗体で
   ある、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 前記酵素に対する抗体が、前記酵素結合
   体が前記特異的結合対の構成要素と相補的な特異的結合
   対の構成要素と結合する能力を実質的に阻害しない、請
   求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 (イ）分析対象あるいは前記分析対象の存
   在を示す物質を含むことが予想される媒質を、酵素と特
   異的結合対の一方の構成要素との結合体である試薬と合
   わせ、(ロ) 前記構成要素に対して相補的な特異的結合対
   のもう一方の構成要素および前記酵素に対する基質の使
   用により、前記酵素の酵素活性を前記分析対象の存在ま
   たは量の指標として測定する工程からなる分析対象の検
   定法において、前記結合体および前記酵素に対する抗体
   の免疫複合体を前記試薬の改良試薬として使用すること
   からなり、同抗体は前記酵素の活性を実質的に阻害しな
   い、改良法。
7. 【請求項７】 酵素はデヒドロゲナーゼ、グルコース−
   ６−リン酸デヒドロゲナーゼ、マレートデヒドロゲナー
   ゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびグルコース
   オキシダーゼから選ばれる、請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 特異的結合対の構成要素はポリヌクレオ
   チド、抗原またはハプテン、および抗体から選ばれる、
   請求項６記載の方法。
9. 【請求項９】 酵素に対する抗体はモノクローン抗体で
   ある、請求項６記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記酵素に対する抗体が、前記酵素結
    合体が前記の相補的な特異的結合対の構成要素に結合す
    る能力を実質的に阻害しない、請求項６記載の方法。
11. 【請求項１１】 分析対象の測定方法において、 (イ）(1) 前記分析対象を含むことが予想される媒質、
    (2) 酵素と分析対象類似体とからなる結合体、(3) 前記
    酵素の活性を実質的に阻害しない、前記酵素に対する抗
    体、(4) 前記結合体に結合し、前記酵素の活性を変化さ
    せる、前記分析対象に対する抗体、を組合わせて提供
    し、そして (ロ) 前記酵素の酵素活性を測定する、 工程からなる上記方法。
12. 【請求項１２】 酵素はデヒドロゲナーゼ、グルコース
    −６−リン酸デヒドロゲナーゼ、マレートデヒドロゲナ
    ーゼ、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼから選ば
    れる、請求項１１記載の方法。
13. 【請求項１３】 分析対象は濫用される薬物または治療
    薬である、請求項１１記載の方法。
14. 【請求項１４】 酵素に対する抗体はモノクローン抗体
    である、請求項１１記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記項目(2) と(3) はあらかじめつく
    られた免疫複合体として提供される、請求項１１記載の
    方法。
16. 【請求項１６】 前記組合わせが酵素に対する基質を含
    む、請求項１１記載の方法。
17. 【請求項１７】 (1) 酵素と特異的結合対の構成要素と
    の結合体および(2)前記酵素を実質的に阻害しない、前
    記酵素に対する抗体から構成された免疫複合体からなる
    組成物。
18. 【請求項１８】 酵素はデヒドロゲナーゼ、グルコース
    −６−リン酸デヒドロゲナーゼ、マレートデヒドロゲナ
    ーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびグルコー
    スオキシダーゼから選ばれる、請求項１７記載の組成
    物。
19. 【請求項１９】 特異的結合対の構成要素はポリヌクレ
    オチド、抗原またはハプテン、および抗体から選ばれ
    る、請求項１７記載の組成物。
20. 【請求項２０】 酵素に対する抗体はモノクローン抗体
    である、請求項１７記載の組成物。
21. 【請求項２１】 酵素に対する抗体は前記酵素結合体が
    前記構成要素に対する抗体に結合する能力を実質的に阻
    害しない、請求項１７記載の組成物。
22. 【請求項２２】 包装された組合わせとして、(イ)(1)酵
    素と特異的結合対の構成要素との結合体および(2) 前記
    酵素の活性を実質的に阻害しない、前記酵素に対する抗
    体から構成される免疫複合体および(ロ) 前記酵素に対す
    る基質からなるキット。