JP3370697B2 - 診断試験系における一定の融合パートナーおよび可変抗原部分から成る組換え融合タンパク質での画定されたコーティング - Google Patents
診断試験系における一定の融合パートナーおよび可変抗原部分から成る組換え融合タンパク質での画定されたコーティングInfo
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Description
【０００１】本発明は、固体の支持材料、例えばマイク
ロタイタープレート、ビーズまたはマイクロビーズ、磁
気粒子、フィルム、濾紙等の、組換え融合タンパク質に
対する抗体をコーティングしたもの、およびこのような
組換え融合タンパク質でこれらの表面を再現可能且つ画
定されたコーティングのための方法に関する。組換え融
合タンパク質は、一定の融合パートナーおよびアッセイ
系の特異性を構成する可変抗原部分を含んでいる。前記
の抗体はこの一定の融合パートナー、すなわち本質的に
は分析上の関係および均質性がないそれぞれの融合タン
パク質の部分に向けられている。
ロタイタープレート、ビーズまたはマイクロビーズ、磁
気粒子、フィルム、濾紙等の、組換え融合タンパク質に
対する抗体をコーティングしたもの、およびこのような
組換え融合タンパク質でこれらの表面を再現可能且つ画
定されたコーティングのための方法に関する。組換え融
合タンパク質は、一定の融合パートナーおよびアッセイ
系の特異性を構成する可変抗原部分を含んでいる。前記
の抗体はこの一定の融合パートナー、すなわち本質的に
は分析上の関係および均質性がないそれぞれの融合タン
パク質の部分に向けられている。
【０００２】表面を、抗原例えばＥＬＩＳＡ、ラテック
ス凝集試験等の診断試験系に用いられるタンパク質でコ
ーティングするときには、抗原の化学的親和性が、特に
抗原が精製された形態であるときには表面を均一にコー
ティングする上で重要である。コーティングの均質性
は、就中抗原の化学的特性、例えば疎水性または極性に
よって変わり、これらはまたｐＨ、イオン強度、分子
量、分配係数または溶解度特性のような物理化学的パラ
メーターによっても変わる。
ス凝集試験等の診断試験系に用いられるタンパク質でコ
ーティングするときには、抗原の化学的親和性が、特に
抗原が精製された形態であるときには表面を均一にコー
ティングする上で重要である。コーティングの均質性
は、就中抗原の化学的特性、例えば疎水性または極性に
よって変わり、これらはまたｐＨ、イオン強度、分子
量、分配係数または溶解度特性のような物理化学的パラ
メーターによっても変わる。
【０００３】更に、他の成分もコーティング系に含まれ
る場合には、利用可能な結合部位に対する競合のために
反応機構の複雑さが増加する。また、この競合は、コー
ティング抗原の各種の化学的特性によっても変化し、コ
ーティング濃度、ｐＨおよびイオン濃度のようなコーテ
ィング条件またはコーティング緩衝液の組成の選択によ
って或いは逐次コーティングによっても部分的には制御
することができる。しかしながら、弱くおよび強く反応
する成分を同時にコーティングするときには、それらの
濃度を増加させることによってしか反応を弱くするよう
に競合を移行させることができないので、この際に系の
個々の成分がかなり損失することが常に予想される。タ
ンパク質の分配係数の違いがそれらの結合特性を決定す
るので、ネルンストの分配則によってそれらの混合物を
記載することも可能である。
る場合には、利用可能な結合部位に対する競合のために
反応機構の複雑さが増加する。また、この競合は、コー
ティング抗原の各種の化学的特性によっても変化し、コ
ーティング濃度、ｐＨおよびイオン濃度のようなコーテ
ィング条件またはコーティング緩衝液の組成の選択によ
って或いは逐次コーティングによっても部分的には制御
することができる。しかしながら、弱くおよび強く反応
する成分を同時にコーティングするときには、それらの
濃度を増加させることによってしか反応を弱くするよう
に競合を移行させることができないので、この際に系の
個々の成分がかなり損失することが常に予想される。タ
ンパク質の分配係数の違いがそれらの結合特性を決定す
るので、ネルンストの分配則によってそれらの混合物を
記載することも可能である。
【０００４】今日までのところ、診断用の検出法に用い
られる表面のコーティングの際の数種類の組換え抗原の
競合の問題は、部分的には個々の組換えタンパク質で時
間的におよび／または空間的に別々の順序でコーティン
グすることによって回避されてきた。例えば、ビーズを
組換え抗原でコーティングする場合には、第一の半球Ａ
を抗原１でコーティングした後、次の段階で半球Ｂを抗
原２でコーティングしていた。この原理は様々な技術的
な問題点を引き起こし、多元的成分系の場合には、非常
な困難を伴ってしか用いることができないのである。
られる表面のコーティングの際の数種類の組換え抗原の
競合の問題は、部分的には個々の組換えタンパク質で時
間的におよび／または空間的に別々の順序でコーティン
グすることによって回避されてきた。例えば、ビーズを
組換え抗原でコーティングする場合には、第一の半球Ａ
を抗原１でコーティングした後、次の段階で半球Ｂを抗
原２でコーティングしていた。この原理は様々な技術的
な問題点を引き起こし、多元的成分系の場合には、非常
な困難を伴ってしか用いることができないのである。
【０００５】ＥＬＩＳＡ用のマイクロタイタープレート
のコーティングでは、第一の抗原１を例えば５０μｌの
容積を満たすために挿入した後、抗原２を挿入して７５
μｌの容積を満たす等のやり方での、キャビティの個々
のタンパク質での逐次コーティングが考えられる。
のコーティングでは、第一の抗原１を例えば５０μｌの
容積を満たすために挿入した後、抗原２を挿入して７５
μｌの容積を満たす等のやり方での、キャビティの個々
のタンパク質での逐次コーティングが考えられる。
【０００６】この方法も、時間のかかるキャビティの逐
次コーティングの本質的な不都合な点を有しており、念
入りな洗浄およびコーティング段階は特に誤差を生じや
すいのである。更に、この方法では、成分が実際に固相
に必要な濃度で結合するという確実性はないのである。
次コーティングの本質的な不都合な点を有しており、念
入りな洗浄およびコーティング段階は特に誤差を生じや
すいのである。更に、この方法では、成分が実際に固相
に必要な濃度で結合するという確実性はないのである。
【０００７】本発明の目的は、少なくとも１つの特異性
を有し且つ組換え融合タンパク質中で一つの融合パート
ナーに対するものである単クローン性または多クローン
性トラッピング抗体をコーティングした固体支持材料を
提供することである。この支持材料は、その表面上に融
合パートナーによって組換えタンパク質を明確に整列し
て固定し、組換えタンパク質試料も外来成分で汚染する
程度は微々たるものであるようにすることができる。本
発明のもう一つの目的は、請求項５および６に記載され
ているように、更に組換え抗原または組換えタンパク質
またはタンパク質フラグメントの混合物であって、例え
ば感染性疾患の診断に重要であり、組換え抗原がそれぞ
れの場合に少なくとも実質的に一定の融合パートナーに
結合しているものでコーティングされている固体支持体
を提供することである。融合パートナーに単一特異的な
抗体の使用による標準化から、次のような利点が得られ
る。 １． 異なる特異性に対して共通の固相がある。 ２． 異なる組換え抗原を任意の所望な混合比で適用し
て、化学量論を調整して生体内に存在する条件に対応さ
せるようにすることも可能である。 ３． 組換え融合タンパク質でのコーティングはその物
理化学的特性に依存はしないが、抗体−抗原反応のみに
依存する。 ４． 特異抗体を支持体に適用するかぎり、組換えタン
パク質と異なる融合パートナーとの混合物も可能であ
る。 ５． コーティングの均質性は、好適な検出法、例えば
コーティング抗体に対するものであって、それ故固体支
持体と反応する抗体によって確認することができる。こ
の確認によって、コーティングが再現可能であり且つ一
定の品質のものであることを確実にすることが可能であ
る。 ６． 抗原として用いられるまたは抗原を含む組換え融
合タンパク質は必ずしも極めて純粋な形で存在しなけれ
ばならないということはないので、精巧な精製法を行う
ことができる。
を有し且つ組換え融合タンパク質中で一つの融合パート
ナーに対するものである単クローン性または多クローン
性トラッピング抗体をコーティングした固体支持材料を
提供することである。この支持材料は、その表面上に融
合パートナーによって組換えタンパク質を明確に整列し
て固定し、組換えタンパク質試料も外来成分で汚染する
程度は微々たるものであるようにすることができる。本
発明のもう一つの目的は、請求項５および６に記載され
ているように、更に組換え抗原または組換えタンパク質
またはタンパク質フラグメントの混合物であって、例え
ば感染性疾患の診断に重要であり、組換え抗原がそれぞ
れの場合に少なくとも実質的に一定の融合パートナーに
結合しているものでコーティングされている固体支持体
を提供することである。融合パートナーに単一特異的な
抗体の使用による標準化から、次のような利点が得られ
る。 １． 異なる特異性に対して共通の固相がある。 ２． 異なる組換え抗原を任意の所望な混合比で適用し
て、化学量論を調整して生体内に存在する条件に対応さ
せるようにすることも可能である。 ３． 組換え融合タンパク質でのコーティングはその物
理化学的特性に依存はしないが、抗体−抗原反応のみに
依存する。 ４． 特異抗体を支持体に適用するかぎり、組換えタン
パク質と異なる融合パートナーとの混合物も可能であ
る。 ５． コーティングの均質性は、好適な検出法、例えば
コーティング抗体に対するものであって、それ故固体支
持体と反応する抗体によって確認することができる。こ
の確認によって、コーティングが再現可能であり且つ一
定の品質のものであることを確実にすることが可能であ
る。 ６． 抗原として用いられるまたは抗原を含む組換え融
合タンパク質は必ずしも極めて純粋な形で存在しなけれ
ばならないということはないので、精巧な精製法を行う
ことができる。
【０００８】この目的の達成は、請求項１〜６から明ら
かである。
かである。
【０００９】好適な融合タンパク質は、共通のセグメン
トである融合パートナーおよび組換えＤＮＡ技術によっ
てそれに融合したタンパク質またはタンパク質フラグメ
ントから成るタンパク質であって、融合がＮ−末端であ
るかＣ−末端であるかは重要ではない。融合するタンパ
ク質またはタンパク質フラグメントの数が大きければ、
複数の融合パートナーを選択するのが好都合であること
があるが、融合パートナーは通常は一定である。いくつ
かの種類の異なる融合パートナーがあるときには、固相
を適当な特異性を有する抗体でコーティングしなければ
ならない。前記のタンパク質またはタンパク質フラグメ
ントは診断または治療に関連したタンパク質であり、前
者の場合にはウイルス、細菌または寄生虫によって引き
起こされる疾患を検出するのに用いられ、第二の場合に
は例えば投与量を規定し、体液に投与される治療薬を監
視するのに用いることができる。感染性疾患の場合に
は、個々のタンパク質で感染の信頼性のある診断を行う
ことが可能である（例えば、Ｂ型肝炎−ＨＢｓＡｇ、Ｈ
ＩＶ１−ｐ２４、サイトメガロウイルス−ｐｐ１５０タ
ンパク質、梅毒トレポネーマ−ＴＭＰＡタンパク質、ト
キソプラスマ・ゴンディイ(Toxoplasma gondii) −ｐ６
１タンパク質）。これらのタンパク質の融合パートナー
の由来はこの点については重要ではないので、ＭＳ２ポ
リメラーゼ融合物並びにｔｒｐ融合物を用いることが可
能である。好ましい融合パートナーは大腸菌由来のβ−
ガラクトシダーゼであり、特にアミノ酸１〜３７５を有
するこのタンパク質のセグメントである。好ましい支持
体はマイクロタイタープレートおよび磁気粒子である
が、フィルム、ビーズ、マイクロビーズなどを用いるこ
ともできる。これらの試験系の利点は、用いられる試料
を速やかに処理することができることである。用いられ
る好ましいトラッピング抗体はβ−ガラクトシダーゼの
Ｎ−末端セグメント（アミノ酸１〜３７５）に対する単
クローン性抗体であり、成功の可能性は大きくはない
が、多クローン性抗体が融合パートナーと特異的反応性
を有するかぎり、多クローン性抗体をこれに用いること
も可能である。
トである融合パートナーおよび組換えＤＮＡ技術によっ
てそれに融合したタンパク質またはタンパク質フラグメ
ントから成るタンパク質であって、融合がＮ−末端であ
るかＣ−末端であるかは重要ではない。融合するタンパ
ク質またはタンパク質フラグメントの数が大きければ、
複数の融合パートナーを選択するのが好都合であること
があるが、融合パートナーは通常は一定である。いくつ
かの種類の異なる融合パートナーがあるときには、固相
を適当な特異性を有する抗体でコーティングしなければ
ならない。前記のタンパク質またはタンパク質フラグメ
ントは診断または治療に関連したタンパク質であり、前
者の場合にはウイルス、細菌または寄生虫によって引き
起こされる疾患を検出するのに用いられ、第二の場合に
は例えば投与量を規定し、体液に投与される治療薬を監
視するのに用いることができる。感染性疾患の場合に
は、個々のタンパク質で感染の信頼性のある診断を行う
ことが可能である（例えば、Ｂ型肝炎−ＨＢｓＡｇ、Ｈ
ＩＶ１−ｐ２４、サイトメガロウイルス−ｐｐ１５０タ
ンパク質、梅毒トレポネーマ−ＴＭＰＡタンパク質、ト
キソプラスマ・ゴンディイ(Toxoplasma gondii) −ｐ６
１タンパク質）。これらのタンパク質の融合パートナー
の由来はこの点については重要ではないので、ＭＳ２ポ
リメラーゼ融合物並びにｔｒｐ融合物を用いることが可
能である。好ましい融合パートナーは大腸菌由来のβ−
ガラクトシダーゼであり、特にアミノ酸１〜３７５を有
するこのタンパク質のセグメントである。好ましい支持
体はマイクロタイタープレートおよび磁気粒子である
が、フィルム、ビーズ、マイクロビーズなどを用いるこ
ともできる。これらの試験系の利点は、用いられる試料
を速やかに処理することができることである。用いられ
る好ましいトラッピング抗体はβ−ガラクトシダーゼの
Ｎ−末端セグメント（アミノ酸１〜３７５）に対する単
クローン性抗体であり、成功の可能性は大きくはない
が、多クローン性抗体が融合パートナーと特異的反応性
を有するかぎり、多クローン性抗体をこれに用いること
も可能である。
【００１０】
１． 組換え融合タンパク質の調製
例として本明細書に挙げる融合タンパク質は、β−ガラ
クトシダーゼのアミノ酸１〜３７５のＮ−末端セグメン
トを含むｐＳＥＭプラスミドベクター系（図１；エス・
クナップ(S. Knapp)ら、BioTechniques 8 (3), 280 (19
90) ）で発現させた。重要なＤＮＡフラグメントに対す
る診断用の遺伝子生成物を挿入することが可能なポリリ
ンカーＤＮＡ配列は、それをコードするＤＮＡ配列に連
結されていた。図２は、ヒトサイトメガロウイルスのゲ
ノム由来の画定したＤＮＡセグメントを含み且つ大腸菌
で発現する組換え融合タンパク質の例を示している。
クトシダーゼのアミノ酸１〜３７５のＮ−末端セグメン
トを含むｐＳＥＭプラスミドベクター系（図１；エス・
クナップ(S. Knapp)ら、BioTechniques 8 (3), 280 (19
90) ）で発現させた。重要なＤＮＡフラグメントに対す
る診断用の遺伝子生成物を挿入することが可能なポリリ
ンカーＤＮＡ配列は、それをコードするＤＮＡ配列に連
結されていた。図２は、ヒトサイトメガロウイルスのゲ
ノム由来の画定したＤＮＡセグメントを含み且つ大腸菌
で発現する組換え融合タンパク質の例を示している。
【００１１】２． 大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ
に対する単クローン性抗体の調製 大腸菌由来の完全なβ−ガラクトシダーゼに対する単ク
ローン性抗体を調製するために、Ｂａｌｂ／ｃマウス、
６〜８週齢を免疫した。このために、完全フロイントの
アジュバントに乳化させた酵素約１０μｇをそれぞれの
マウスに皮下投与し、第二の場合には腹腔内に投与し
た。第二および第三の免疫感作は、それぞれの場合に４
〜８週間後に行った。実際の融合の直前に、実験動物に
４日連続して静脈内に追加免疫を投与した。融合の日
に、脾臓を無菌条件下にて取り出して、懸濁し、単一細
胞を得た。１０８個の脾臓細胞を骨髄腫セルラインＳＰ
２／０またはセルラインＸ６３Ａｇ８６５３（Journal
of Immunol., 173 (1979), 1548-1550）と融合させたと
ころ、ハイブリッド細胞を生成し、これを次に２４穴
（キャビティー）を有する培養プレート（コスター(Cos
tar)製）上で、選択培地（２０％ウシ胎児血清ＦＣＳ、
０．１ミリモル／リットルのヒポキサンチン、０．４ミ
リモル／リットルのアミノプテリンおよび１６ミリモル
／リットルのチミジンを追加したダルベッコーの最少必
須培地、ＤＭＥＭ）に１０６個／穴の濃度で接種した。
２〜３週間後に、個々の細胞コロニーをキャビティから
単離して、それぞれを新しい培養プレートの一つのキャ
ビティに移した。更に２〜３週間後に、培養上澄液をβ
−ガラクトシダーゼ特異抗体の存在についてエンザイム
イムノアッセイを用いてスクリーニングした。上澄液を
β−ガラクトシダーゼをコーティングしたマイクロタイ
タープレートでインキュベーションし、存在する特異抗
体を抗−マウス／ペルオキシダーゼ免疫グロブリン複合
体反応によって検出した。陽性のセルラインを、ＩＦＡ
（不完全フロイントアジュバント）で前処理したＢａｌ
ｂ／ｃマウス中で腹水として増殖させた。精製は、硫酸
アンモニウム沈澱およびプロテインＡクロマトグラフィ
によって行った。純度はＨＰＬＣおよびゲル電気泳動に
よってチェックし、免疫グロブリンのクラスをオクター
ローニー免疫拡散法によって決定した。
に対する単クローン性抗体の調製 大腸菌由来の完全なβ−ガラクトシダーゼに対する単ク
ローン性抗体を調製するために、Ｂａｌｂ／ｃマウス、
６〜８週齢を免疫した。このために、完全フロイントの
アジュバントに乳化させた酵素約１０μｇをそれぞれの
マウスに皮下投与し、第二の場合には腹腔内に投与し
た。第二および第三の免疫感作は、それぞれの場合に４
〜８週間後に行った。実際の融合の直前に、実験動物に
４日連続して静脈内に追加免疫を投与した。融合の日
に、脾臓を無菌条件下にて取り出して、懸濁し、単一細
胞を得た。１０８個の脾臓細胞を骨髄腫セルラインＳＰ
２／０またはセルラインＸ６３Ａｇ８６５３（Journal
of Immunol., 173 (1979), 1548-1550）と融合させたと
ころ、ハイブリッド細胞を生成し、これを次に２４穴
（キャビティー）を有する培養プレート（コスター(Cos
tar)製）上で、選択培地（２０％ウシ胎児血清ＦＣＳ、
０．１ミリモル／リットルのヒポキサンチン、０．４ミ
リモル／リットルのアミノプテリンおよび１６ミリモル
／リットルのチミジンを追加したダルベッコーの最少必
須培地、ＤＭＥＭ）に１０６個／穴の濃度で接種した。
２〜３週間後に、個々の細胞コロニーをキャビティから
単離して、それぞれを新しい培養プレートの一つのキャ
ビティに移した。更に２〜３週間後に、培養上澄液をβ
−ガラクトシダーゼ特異抗体の存在についてエンザイム
イムノアッセイを用いてスクリーニングした。上澄液を
β−ガラクトシダーゼをコーティングしたマイクロタイ
タープレートでインキュベーションし、存在する特異抗
体を抗−マウス／ペルオキシダーゼ免疫グロブリン複合
体反応によって検出した。陽性のセルラインを、ＩＦＡ
（不完全フロイントアジュバント）で前処理したＢａｌ
ｂ／ｃマウス中で腹水として増殖させた。精製は、硫酸
アンモニウム沈澱およびプロテインＡクロマトグラフィ
によって行った。純度はＨＰＬＣおよびゲル電気泳動に
よってチェックし、免疫グロブリンのクラスをオクター
ローニー免疫拡散法によって決定した。
【００１２】３． 単クローン性抗体の特性決定
形質転換体の細胞抽出液およびプラスミド不含でβ−ガ
ラクトシダーゼ欠損大腸菌ＭＣ４１００株（エム・ジェ
イ・カサダバン(M.J. Casadaban)、J. Mol.Biol., 104,
p. 541-555 (1976) ）の抽出液および分子量決定のた
めのタンパク質混合物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル
中で変性条件下で分画した後、ニトロセルロース濾紙に
移した。個々のブロットをインキュベーションして、様
々な単クローン性抗体で展開した。例えば、単クローン
性抗体８７−５５／６０は、この系ではβ−ガラクトシ
ダーゼの領域１〜３７５からの配列を含むポリペプチド
のみを認識したが、β−ガラクトシダーゼの領域３７６
〜１０２１からのポリペプチドも大腸菌ＭＣ４１００株
によって記載されるポリペプチドも認識しなかった。し
たがって、画定されたβ−ガラクトシダーゼフラグメン
トを有する反応パターンに基づいて、単クローン性抗体
８７−５５／６０が、セリン１からアスパラギン酸３７
５までのβ−ガラクトシダーゼのアミノ末端領域におけ
る抗原決定基と反応することを示すことが可能であっ
た。
ラクトシダーゼ欠損大腸菌ＭＣ４１００株（エム・ジェ
イ・カサダバン(M.J. Casadaban)、J. Mol.Biol., 104,
p. 541-555 (1976) ）の抽出液および分子量決定のた
めのタンパク質混合物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル
中で変性条件下で分画した後、ニトロセルロース濾紙に
移した。個々のブロットをインキュベーションして、様
々な単クローン性抗体で展開した。例えば、単クローン
性抗体８７−５５／６０は、この系ではβ−ガラクトシ
ダーゼの領域１〜３７５からの配列を含むポリペプチド
のみを認識したが、β−ガラクトシダーゼの領域３７６
〜１０２１からのポリペプチドも大腸菌ＭＣ４１００株
によって記載されるポリペプチドも認識しなかった。し
たがって、画定されたβ−ガラクトシダーゼフラグメン
トを有する反応パターンに基づいて、単クローン性抗体
８７−５５／６０が、セリン１からアスパラギン酸３７
５までのβ−ガラクトシダーゼのアミノ末端領域におけ
る抗原決定基と反応することを示すことが可能であっ
た。
【００１３】４． ｍＡｂをコーティングしたマイクロ
タイタープレートの調製 βガラクトシダーゼのＮ−末端領域に対する好適な単ク
ローン性抗体の濃度を生理リン酸緩衝液（ＰＢＳ）の溶
液１ｍｌ当たりタンパク質０．１μｇに調整し、１００
μｌの容量をマイクロタイタープレートのそれぞれのキ
ャビティに適用する。このプレートを＋４℃で１６時間
インキュベーションして吸着させた後、コーティング溶
液を吸引によって除去する。次に、表面を５０ｍＭトリ
ス／６０ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄し
た後、防御タンパク質、例えばラクトフェリン、ヒト血
清アルブミン、ウシ血清アルブミンまたは他の洗浄剤、
例えばツウィーン(Tween) 、コール酸およびその誘導
体、アミンオキシド等の溶液と共に４５分〜２時間イン
キュベーションして、飽和していない結合部位をブロッ
クする。次に、表面をＰＢＳで２回洗浄して、乾燥し、
直ちにこの形態で用いることができ、または保存するこ
とができる。
タイタープレートの調製 βガラクトシダーゼのＮ−末端領域に対する好適な単ク
ローン性抗体の濃度を生理リン酸緩衝液（ＰＢＳ）の溶
液１ｍｌ当たりタンパク質０．１μｇに調整し、１００
μｌの容量をマイクロタイタープレートのそれぞれのキ
ャビティに適用する。このプレートを＋４℃で１６時間
インキュベーションして吸着させた後、コーティング溶
液を吸引によって除去する。次に、表面を５０ｍＭトリ
ス／６０ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄し
た後、防御タンパク質、例えばラクトフェリン、ヒト血
清アルブミン、ウシ血清アルブミンまたは他の洗浄剤、
例えばツウィーン(Tween) 、コール酸およびその誘導
体、アミンオキシド等の溶液と共に４５分〜２時間イン
キュベーションして、飽和していない結合部位をブロッ
クする。次に、表面をＰＢＳで２回洗浄して、乾燥し、
直ちにこの形態で用いることができ、または保存するこ
とができる。
【００１４】５． 抗原を含む組換え融合タンパク質に
よるマイクロタイタープレートのコーティング ４と同様に、β−ガラクトシダーゼのＮ−末端領域に対
する好適な単クローン性マウス抗体の濃度を生理リン酸
緩衝液（ＰＢＳ）中でキャビティ当たり０．１μｇまで
希釈して、ＥＬＩＳＡプレートに適用する。抗体を吸着
した後、コーティング溶液を取り除いて、表面を洗浄
し、防御タンパク質、例えばラクトフェリン、ヒト血清
アルブミン、ウシ血清アルブミンまたは洗浄剤、例えば
ツウィーン(Tween) 、デオキシコレート、アミンオキシ
ド等の０．１〜５％強度の溶液で４５分〜２時間インキ
ュベーションして、飽和していない結合部位をブロック
する。次に、表面をＰＢＳで２回洗浄し、融合タンパク
質または混合物を好適な希釈液に適用する。融合タンパ
ク質と単クローン性抗体との反応は、２時間インキュベ
ーションすると完結する。Ｎ−末端β−ガラクトシダー
ゼフラグメントの、単クローン性抗体に関するエピトー
プ部分が、用いられる融合タンパク質に対して共通であ
るかぎり、抗原の性状はこの点では重要ではない。用い
られるタンパク質物理化学的特性、例えばその電荷、疎
水性などの差異は、反応性成分がハイブリッドタンパク
質の外来部分によってではなく共通のβ−ガラクトシダ
ーゼ成分によって与えられるので、組換えタンパク質の
混合物の場合には重要ではない。これによって、明白に
結合速度論を確定し且つハイブリッドタンパク質のβ−
ガラクトシダーゼ部分によってのみ決定される均一な結
合性が生じる。単クローン性抗体は個々のタンパク質に
対して等しい親和性を有するので、抗原の抗体への結合
は純粋に統計学的に決定される過程と考えるべきであ
る。タンパク質の異なる領域からの合成ペプチドまたは
細胞からのホモジネートのような異種成分でのコーティ
ングとは対照的に、この場合には個々の成分の結合特性
が著しく強く且つ他の必須成分は競合によって置換され
てしまっているので、個々の成分が過剰表示される(ove
rrepresented) 危険性はない。表１は、３７の血清（９
個のＣＭＶ陰性、２８個のＣＭＶ陽性）に基づくアッセ
イデザインをを実行する基本的な可能性を示す。
よるマイクロタイタープレートのコーティング ４と同様に、β−ガラクトシダーゼのＮ−末端領域に対
する好適な単クローン性マウス抗体の濃度を生理リン酸
緩衝液（ＰＢＳ）中でキャビティ当たり０．１μｇまで
希釈して、ＥＬＩＳＡプレートに適用する。抗体を吸着
した後、コーティング溶液を取り除いて、表面を洗浄
し、防御タンパク質、例えばラクトフェリン、ヒト血清
アルブミン、ウシ血清アルブミンまたは洗浄剤、例えば
ツウィーン(Tween) 、デオキシコレート、アミンオキシ
ド等の０．１〜５％強度の溶液で４５分〜２時間インキ
ュベーションして、飽和していない結合部位をブロック
する。次に、表面をＰＢＳで２回洗浄し、融合タンパク
質または混合物を好適な希釈液に適用する。融合タンパ
ク質と単クローン性抗体との反応は、２時間インキュベ
ーションすると完結する。Ｎ−末端β−ガラクトシダー
ゼフラグメントの、単クローン性抗体に関するエピトー
プ部分が、用いられる融合タンパク質に対して共通であ
るかぎり、抗原の性状はこの点では重要ではない。用い
られるタンパク質物理化学的特性、例えばその電荷、疎
水性などの差異は、反応性成分がハイブリッドタンパク
質の外来部分によってではなく共通のβ−ガラクトシダ
ーゼ成分によって与えられるので、組換えタンパク質の
混合物の場合には重要ではない。これによって、明白に
結合速度論を確定し且つハイブリッドタンパク質のβ−
ガラクトシダーゼ部分によってのみ決定される均一な結
合性が生じる。単クローン性抗体は個々のタンパク質に
対して等しい親和性を有するので、抗原の抗体への結合
は純粋に統計学的に決定される過程と考えるべきであ
る。タンパク質の異なる領域からの合成ペプチドまたは
細胞からのホモジネートのような異種成分でのコーティ
ングとは対照的に、この場合には個々の成分の結合特性
が著しく強く且つ他の必須成分は競合によって置換され
てしまっているので、個々の成分が過剰表示される(ove
rrepresented) 危険性はない。表１は、３７の血清（９
個のＣＭＶ陰性、２８個のＣＭＶ陽性）に基づくアッセ
イデザインをを実行する基本的な可能性を示す。
【００１５】６． ２種類の抗原の混合物によるマイク
ロタイタープレートの画定されたコーティング マイクロタイタープレートを、単クローン性の抗−β−
ガラクトシダーゼ抗体０．１μｇを含む１５０μｌに一
晩吸着することによってコーティングし、５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌと５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）で２回
洗浄した後、それぞれの場合に第一の組換え融合タンパ
ク質としてｐＸＰ１タンパク質（図２および図３）およ
び第二の組換えタンパク質としてｐＳＥＭＬ３タンパク
質（図２）をコーティングする。コーティングは、全量
が５０ｎｇの融合タンパク質混合物を用いて、ｐＸＰ１
タンパク質の百分率含量が１００％から２０％ずつ０％
まで減少させ、混合物中のｐＳＥＭＬ３タンパク質の含
量は同様に増加させる方法で行う。３７℃で１時間イン
キュベーションした後、キャビティを空にして、前記の
洗浄溶液で２回洗浄し、２種類のヒト血清、主としてそ
れぞれの場合に前記の組換えタンパク質の一方を１：５
０に希釈したものと共に１時間インキュベーションす
る。次いで、血清試料を再度キャビティから取り除い
て、前記の緩衝液で２回洗浄した後、好適な抗−ヒト免
疫グロブリンＧ−ペルオキシダーゼ複合体を加える。次
に、免疫反応を、好適な基質、例えばテトラメチルベン
ジジンを用いて光度測定法によって検出する。血清反応
性によって記録される特異的な信号は、混合物中の一つ
の組換えタンパク質の含量が減少するのと同じ程度まで
減少する。他の血清は、これに対応して反対の挙動を示
す。この方法で、２つのタイトレーションプロットの遮
断で、 ａ） 融合タンパク質の最適コーティング比率を決定
し、 ｂ） マイクロタイタープレート上で抗原混合物の実際
のコーティング挙動を理解し、且つ ｃ） 用いられる血清を標準化するとき、再現可能なコ
ーティング品質を確保することが可能である。
ロタイタープレートの画定されたコーティング マイクロタイタープレートを、単クローン性の抗−β−
ガラクトシダーゼ抗体０．１μｇを含む１５０μｌに一
晩吸着することによってコーティングし、５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌと５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）で２回
洗浄した後、それぞれの場合に第一の組換え融合タンパ
ク質としてｐＸＰ１タンパク質（図２および図３）およ
び第二の組換えタンパク質としてｐＳＥＭＬ３タンパク
質（図２）をコーティングする。コーティングは、全量
が５０ｎｇの融合タンパク質混合物を用いて、ｐＸＰ１
タンパク質の百分率含量が１００％から２０％ずつ０％
まで減少させ、混合物中のｐＳＥＭＬ３タンパク質の含
量は同様に増加させる方法で行う。３７℃で１時間イン
キュベーションした後、キャビティを空にして、前記の
洗浄溶液で２回洗浄し、２種類のヒト血清、主としてそ
れぞれの場合に前記の組換えタンパク質の一方を１：５
０に希釈したものと共に１時間インキュベーションす
る。次いで、血清試料を再度キャビティから取り除い
て、前記の緩衝液で２回洗浄した後、好適な抗−ヒト免
疫グロブリンＧ−ペルオキシダーゼ複合体を加える。次
に、免疫反応を、好適な基質、例えばテトラメチルベン
ジジンを用いて光度測定法によって検出する。血清反応
性によって記録される特異的な信号は、混合物中の一つ
の組換えタンパク質の含量が減少するのと同じ程度まで
減少する。他の血清は、これに対応して反対の挙動を示
す。この方法で、２つのタイトレーションプロットの遮
断で、 ａ） 融合タンパク質の最適コーティング比率を決定
し、 ｂ） マイクロタイタープレート上で抗原混合物の実際
のコーティング挙動を理解し、且つ ｃ） 用いられる血清を標準化するとき、再現可能なコ
ーティング品質を確保することが可能である。
【００１６】７． ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレー
トのコーティングのチェック ＥＬＩＳＡプレートを組換え融合タンパク質でコーティ
ングするときには、コーティング濃度はタンパク質濃度
によって調整する。β−ガラクトシダーゼに対する好適
なネズミ単クローン性抗体では、対照としての較正プロ
ットによってコーティングの実際の抗原濃度を決定し、
コーティング濃度を最適にすることが可能である。更
に、信号の損失または品質管理の尺度の部分としての保
存プレートの品質の同様な損失を検出し、使用できない
製造バッチを不合格にすることが可能である。これは、
試験法の標準化によりマイクロタイタープレートの配送
バッチの長期間に亙る品質監視のチェックを行うことも
可能であることを意味する。この手順を、以下において
組換えＣＭＶタンパク質ｐＸＰ１を例として記載する。
マイクロタイタープレートに、正確な濃度が製造に用い
た過程と同様に画定された希釈段階で知られている組換
えタンパク質の測定溶液をコーティングする。希釈段階
は、それらが製造に用いた濃度の上下少なくとも１のオ
ーダーの大きさとなるように調整する。次のＥＬＩＳＡ
法で見られる値は、同時に行われるブランクに関する
（試験抗原なしのコーティング緩衝液でのコーティング
手順に対応する）ものであり、これは統計学的な有効性
を得るための多数回の測定を行うのに好適である。ＥＬ
ＩＳＡ評価において見られる吸光度は、未知の試料に対
する濃度対照系として用いることができる希釈較正プロ
ットの過程に対応する。チェックされるマイクロタイタ
ープレートの正確なコーティング濃度は、ＥＬＩＳＡに
おいて展開した後に見出される値を内挿することによっ
て調べることができる。更に、コーティング過程、標準
溶液に基づいて用いられる試薬の品質およびそれらの安
定性および保存性を検討することも可能である。
トのコーティングのチェック ＥＬＩＳＡプレートを組換え融合タンパク質でコーティ
ングするときには、コーティング濃度はタンパク質濃度
によって調整する。β−ガラクトシダーゼに対する好適
なネズミ単クローン性抗体では、対照としての較正プロ
ットによってコーティングの実際の抗原濃度を決定し、
コーティング濃度を最適にすることが可能である。更
に、信号の損失または品質管理の尺度の部分としての保
存プレートの品質の同様な損失を検出し、使用できない
製造バッチを不合格にすることが可能である。これは、
試験法の標準化によりマイクロタイタープレートの配送
バッチの長期間に亙る品質監視のチェックを行うことも
可能であることを意味する。この手順を、以下において
組換えＣＭＶタンパク質ｐＸＰ１を例として記載する。
マイクロタイタープレートに、正確な濃度が製造に用い
た過程と同様に画定された希釈段階で知られている組換
えタンパク質の測定溶液をコーティングする。希釈段階
は、それらが製造に用いた濃度の上下少なくとも１のオ
ーダーの大きさとなるように調整する。次のＥＬＩＳＡ
法で見られる値は、同時に行われるブランクに関する
（試験抗原なしのコーティング緩衝液でのコーティング
手順に対応する）ものであり、これは統計学的な有効性
を得るための多数回の測定を行うのに好適である。ＥＬ
ＩＳＡ評価において見られる吸光度は、未知の試料に対
する濃度対照系として用いることができる希釈較正プロ
ットの過程に対応する。チェックされるマイクロタイタ
ープレートの正確なコーティング濃度は、ＥＬＩＳＡに
おいて展開した後に見出される値を内挿することによっ
て調べることができる。更に、コーティング過程、標準
溶液に基づいて用いられる試薬の品質およびそれらの安
定性および保存性を検討することも可能である。
【表１】
【図１】大腸菌由来の融合タンパク質の発現ベクターを
示す説明図。大腸菌プラスミドベクターｐＳＥＭ−１、
ｐＳＥＭ−２およびｐＳＥＭ−３を用いて細菌における
タンパク質ドメインを発現させる。これらのベクター
は、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）のＮ−末端ア
ミノ酸１〜３７５のみをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝
子（ｌａｃＺ′）の未成熟型を含んでいる。これに結合
して３つの可能な読取り枠に数個のクローニング部位を
有するポリリンカー領域によって、ｌａｃＺ′に基づい
て融合タンパク質を構成することが可能である。融合遺
伝子の転写はｌａｃプロモーター（ｐｌａｃ）の抑制解
除によって制御され、ポリリンカー領域の付近のｒｒｎ
Ｂ転写ターミネーターＴ１およびＴ２によって停止され
る。更に、翻訳停止（＊）は、ポリリンカー領域の直後
に総ての３つの読み取り枠に挿入されている（エス・ク
ナップ(S. Knapp)、エム・ブレーカー(M. Broeker)、イ
ー・アマン(E. Amann)Biotechniques, 8, 280-281 (199
0)）。
示す説明図。大腸菌プラスミドベクターｐＳＥＭ−１、
ｐＳＥＭ−２およびｐＳＥＭ−３を用いて細菌における
タンパク質ドメインを発現させる。これらのベクター
は、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）のＮ−末端ア
ミノ酸１〜３７５のみをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝
子（ｌａｃＺ′）の未成熟型を含んでいる。これに結合
して３つの可能な読取り枠に数個のクローニング部位を
有するポリリンカー領域によって、ｌａｃＺ′に基づい
て融合タンパク質を構成することが可能である。融合遺
伝子の転写はｌａｃプロモーター（ｐｌａｃ）の抑制解
除によって制御され、ポリリンカー領域の付近のｒｒｎ
Ｂ転写ターミネーターＴ１およびＴ２によって停止され
る。更に、翻訳停止（＊）は、ポリリンカー領域の直後
に総ての３つの読み取り枠に挿入されている（エス・ク
ナップ(S. Knapp)、エム・ブレーカー(M. Broeker)、イ
ー・アマン(E. Amann)Biotechniques, 8, 280-281 (199
0)）。
【図２】ｌａｃＺ′融合タンパク質の図式的構造を示す
説明図。総ての前記の融合タンパク質はβ−ガラクトシ
ダーゼのアミノ酸１〜３７５（ｌａｃＺ′）と、これに
結合したポリリンカー領域によってコードされる追加の
アミノ酸と、所望により関連のクローニングされたタン
パク質ドメインを含む。ここでは、例として異なる遺伝
子セグメント、 １． ｐＳＥＭ−１／２／３ 外来部分のない基本的構
造体、 ２． ｐＸＰ１ ＨＣＭＶ遺伝子ｐｐ１５
０の外来部分ヌクレオチド配列１６３２〜２１１８であ
って、１６２個のアミノ酸に対応する、 ３． ｐＳＥＭＬ３ ＨＣＭＶ遺伝子ｐｐ１５
０の外来部分ヌクレオチド配列２６８６〜２９４６であ
って、８７個のアミノ酸に対応する、 ４． ｐＳＥＭＬ１Ｖ２ ＨＣＭＶ遺伝子ｐｐ１５
０の外来部分ヌクレオチド配列８７３〜１５１４であっ
て、２１３個のアミノ酸に対応する、 ５． ｐＨＥ６８−１ ＨＣＭＶ遺伝子ｐｐ６５
の外来部分ヌクレオチドド配列５４８〜１１３６であっ
て、１９６個のアミノ酸に対応する、 ６． ｐＰＳ２８ ＨＣＭＶ遺伝子ｐｐ２８
の外来部分ヌクレオチドド配列４０〜５４０であって、
１６７個のアミノ酸に対応するもの からの外来部分を有するヒトサイトメガロウイルスの構
造体が挙げらている。
説明図。総ての前記の融合タンパク質はβ−ガラクトシ
ダーゼのアミノ酸１〜３７５（ｌａｃＺ′）と、これに
結合したポリリンカー領域によってコードされる追加の
アミノ酸と、所望により関連のクローニングされたタン
パク質ドメインを含む。ここでは、例として異なる遺伝
子セグメント、 １． ｐＳＥＭ−１／２／３ 外来部分のない基本的構
造体、 ２． ｐＸＰ１ ＨＣＭＶ遺伝子ｐｐ１５
０の外来部分ヌクレオチド配列１６３２〜２１１８であ
って、１６２個のアミノ酸に対応する、 ３． ｐＳＥＭＬ３ ＨＣＭＶ遺伝子ｐｐ１５
０の外来部分ヌクレオチド配列２６８６〜２９４６であ
って、８７個のアミノ酸に対応する、 ４． ｐＳＥＭＬ１Ｖ２ ＨＣＭＶ遺伝子ｐｐ１５
０の外来部分ヌクレオチド配列８７３〜１５１４であっ
て、２１３個のアミノ酸に対応する、 ５． ｐＨＥ６８−１ ＨＣＭＶ遺伝子ｐｐ６５
の外来部分ヌクレオチドド配列５４８〜１１３６であっ
て、１９６個のアミノ酸に対応する、 ６． ｐＰＳ２８ ＨＣＭＶ遺伝子ｐｐ２８
の外来部分ヌクレオチドド配列４０〜５４０であって、
１６７個のアミノ酸に対応するもの からの外来部分を有するヒトサイトメガロウイルスの構
造体が挙げらている。
【図３】ｐＸＰ１タンパク質の図式的構造を示す説明
図。組換えｐＸＰ１タンパク質は未成熟なβ−ガラクト
シダーゼ（ｌａｃＺ′；大腸菌）のアミノ酸１〜３７４
とポリリンカー領域によってコードされるアミノ酸の外
に、ヒトサイトメガロウイルスのｐｐ１５０タンパク質
からのタンパク質ドメインであって、そのＤＮＡフラグ
メント（塩基対１６３２〜２１１８；１６２個のアミノ
酸残基）がベクターフラグメントに対するＣ−末端遺伝
子融合としてクローニングされているものを含む。
図。組換えｐＸＰ１タンパク質は未成熟なβ−ガラクト
シダーゼ（ｌａｃＺ′；大腸菌）のアミノ酸１〜３７４
とポリリンカー領域によってコードされるアミノ酸の外
に、ヒトサイトメガロウイルスのｐｐ１５０タンパク質
からのタンパク質ドメインであって、そのＤＮＡフラグ
メント（塩基対１６３２〜２１１８；１６２個のアミノ
酸残基）がベクターフラグメントに対するＣ−末端遺伝
子融合としてクローニングされているものを含む。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ウド、クルプカ
ドイツ連邦共和国マールブルク、オーベ
ラー、アイヒウェーク、29
(56)参考文献 特開 昭64−16583（ＪＰ，Ａ)
特開 平１−262471（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 17/02
C07K 17/14
G01N 33/53
G01N 33/547
C12P 21/08
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (7)
- 【請求項１】単クローン性または多クローン性トラッピ
ング抗体と、それに結合した少なくとも二つの異なる融
合タンパク質をコーティングした固体支持材料であっ
て、各融合タンパ質が一定の融合パートナーと可変抗原
部分とを含んでなり、ここでトラッピング抗体が一定の
融合パートナーに対するものであり、可変抗原部分が診
断上関係ある少なくとも二つの異なる抗原を表すことを
特徴とする、固体支持材料。 - 【請求項２】マイクロタイタープレートのキャビティを
含むか、またはビーズ、マイクロビーズ、フィルター、
フィルムまたは磁気粒子の形態である、請求項１に記載
の固体支持材料。 - 【請求項３】キャビティが、キャビティ当たり０．０５
〜０．５μｇ／ｃｍ2のトラッピング抗体でコーティン
グされているマイクロタイタープレートである、請求項
２に記載の固体支持材料。 - 【請求項４】０．００５〜０．５μｇ／ｃｍ2のトラッ
ピング抗体でコーティングされている磁気粒子の形態で
ある、請求項２に記載の固体支持材料。 - 【請求項５】融合タンパ質または融合タンパ質の混合物
に対する特異抗体を検出するための、請求項１〜４のい
ずれか１項に記載の固体支持材料の使用方法。 - 【請求項６】検出が全血、血漿、血清、脳脊髄液、唾
液、または尿で行なわれる、請求項５に記載の使用方
法。 - 【請求項７】固体支持材料に、診断上関係ある少なくと
も二つの異なる抗原をコーティングする方法であって、 ａ）単クローン性または多クローン性トラッピング抗体
を、共有結合によりまたは吸着により支持材料に固定す
ること、および ｂ）少なくとも二つの異なる融合タンパ質を、抗原−抗
体結合を介してトラッピング抗体に結合すること、によ
るものであり、 ここでトラッピング抗体が、一定の融合パートナーに融
合タンパ質の一定部分で結合され、これにより診断上関
係ある物質が融合タンパク質の可変抗原部分に結合でき
ることを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4105400.8 | 1991-02-21 | ||
| DE4105400A DE4105400A1 (de) | 1991-02-21 | 1991-02-21 | Definierte beschichtung mit rekombinanten fusionsproteinen aus konstantem fusionspartner und variablem antigenanteil in diagnostischen testsystemen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06172400A JPH06172400A (ja) | 1994-06-21 |
| JP3370697B2 true JP3370697B2 (ja) | 2003-01-27 |
Family
ID=6425554
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP07251892A Expired - Fee Related JP3370697B2 (ja) | 1991-02-21 | 1992-02-21 | 診断試験系における一定の融合パートナーおよび可変抗原部分から成る組換え融合タンパク質での画定されたコーティング |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0499837B1 (ja) |
| JP (1) | JP3370697B2 (ja) |
| AT (1) | ATE138202T1 (ja) |
| AU (1) | AU663481B2 (ja) |
| CA (1) | CA2061574A1 (ja) |
| DE (2) | DE4105400A1 (ja) |
| DK (1) | DK0499837T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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- 1992-01-28 EP EP92101324A patent/EP0499837B1/de not_active Expired - Lifetime
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|---|---|
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| CA2061574A1 (en) | 1992-08-22 |
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