JP3393652B2

JP3393652B2 - ガマリンから誘導された新規プロテアーゼ阻害剤

Info

Publication number: JP3393652B2
Application number: JP51250498A
Authority: JP
Inventors: ケウォンカン; ドンリョウンキム
Original assignee: コリアアドバンスドインスティチュートオブサイエンスアンドテクノロジィ
Priority date: 1996-09-09
Filing date: 1997-03-11
Publication date: 2003-04-07
Anticipated expiration: 2017-03-11
Also published as: JPH11507082A; KR100224383B1; AU2234497A; KR19980020377A; WO1998009993A1; US6184346B1

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景技術分野本発明は、ガマリン（Guamerin）から誘導され、プロ
テアーゼ活性を阻害するペプチドに関するものであっ
て、より具体的には、韓国産ヒルであるガマリ（Guamer
i,Hirudo nipponia）から単離されたエラスターゼ阻害
性蛋白であるガマリン（Guamerin）から誘導され、エラ
スターゼ及びサブチリシンの活性を阻害するペプチドに
関する。

従来技術エラスターゼは主にエラスチンを分解し、さらにコラ
ーゲン、軟骨、フィブロネクチンのような結合組織蛋白
を分解することができるセリンプロテアーゼである（参
照:Reilly,C.et al.,Biochem.Biophys.Acta.,621:147
−167（1980）;Mainardi,C.L.et al.,J.Biol.Chem.,25
5:5436−5441（1980））。

ヒト白血球エラスターゼは主に好中球に貯蔵されてお
り、好中球が血液中で外部からの病原体又は抗原に遭遇
すると、貯蔵されていたエラスターゼが放出されて、こ
れら病原体や抗原を分解することにより、身体を有害因
子から保護する（参照:Weisemann,G.et al.,New Eng
l.J.Med.,303:27−34（1980））。しかしながら、細胞
の老化又は遺伝的疾患などの原因によってしばしば起こ
るような正常に調節されていないエラスターゼ分泌によ
り非特異的な蛋白分解が起こり、リューマチ性関節炎、
肺気腫、乾せんのような種々の慢性疾患を伴う破壊的プ
ロセスを誘発することがある（参照:Glinski,W.et a
l.,J.Invest.Dermatol.,75:481−487（1980）;Snider,
G.L.,Med.Clin.North.Am.,65:647−666（1981））。

医学界では上記のような疾患の治療を目的として、関
節軟骨、肺、皮膚などの組織から異常に過剰分泌された
エラスターゼの活性を効果的に抑制することができる薬
剤を開発すべく精力的な努力がなされてきた。その結
果、七面鳥又はアヒルを含む鳥類、ヨーロッパ産ヒル及
びヒトの皮膚のような各種の生体材料からエラスターゼ
阻害蛋白が単離され（参照:Schlwijk,J.et al.,Br.J.D
ermatol.,1512:181−186（1986）;Wlodow,O.et al.,J.
Biol.Chem.,165:14791−14796（1990）;Hochstrasser,
K.et al.,Hopps−Seyler′ｓ Z.Physiol.Chem.,362:1
369−1375（1981）;Seemuller,U.et al.,Hopps−Seyle
r′ｓ Z.Physiol.Chem.,361:1841−1846（1980））、
とりわけ上記蛋白を有効成分として含有する薬剤を直接
患部に投与することにより上記の疾患の治療に効果があ
ることが見出された。

しかしながら、先行技術によるエラスターゼ阻害蛋白
はヒトの皮膚から単離されたもの以外はエラスターゼに
対する特異性が低いために他の酵素活性も阻害する可能
性があり、医薬品として使用するには問題があった。さ
らに、ヒトの皮膚から単離されたものを含めて、上記の
エラスターゼ阻害蛋白は分子量があまりに大きいので、
加熱により容易に変性してしまい、その活性が急激に低
下するという重大な問題にしばしば直面してきた。

このような状況下で、エラスターゼの活性を特異的に
阻害する他の蛋白を調査開発する必要性が生じている。
これに関して、本発明者らは韓国産ヒルであるガマリ
（Guameri,Hirudo nipponia）から新規のエラスターゼ
阻害蛋白である「ガマリン」（Guamerin）を単離し、ガ
マリンがエラスターゼ活性を特異的に阻害し、その活性
が従来のエラスターゼ阻害蛋白よりも強く、また、強酸
及び強塩基条件下でも安定であることを見出した（参
照:UK Patent Application GB 2300190A;H.I.Jung
et al.,J.Biol.Chem.,270（23）:13879−13884（199
5））。すなわち、ガマリンは次のような点で従来のエ
ラスターゼ阻害蛋白と明確に区別される：ガマリンは医
薬品として投与する場合に有害作用を起こしにくい；ま
た、化学的性質が安定しているので大量生産、貯蔵及び
輸送などの過程において容易に変性することがなく実用
化に有利である。

しかしながら、ガマリンは医学的用途に用いるには依
然として大きな分子であるため、本発明者らはエラスタ
ーゼ阻害活性を示すガマリンの活性部位を含み、合成及
び使用に都合がよいペプチドを開発すべく研究努力して
きた。

発明の要約本発明により、本発明者らはガマリンの活性部位であ
る36番メチオニンを含む19個のアミノ酸から成るペプチ
ドがエラスターゼ阻害活性を示すことを見出し、併せ
て、上記ペプチドは完全な（intact）ガマリンとは異な
りエラスターゼ阻害活性以外にサブチリシン活性も阻害
することを見出した。

従って、本発明の第一の目的は、ガマリンから誘導さ
れ、エラスターゼ及びサブチリシンの活性を阻害するペ
プチドを提供することにある。

また、本発明の他の目的は上記ペプチドの間に分子間
ジスルフィド結合が形成された二量体ペプチドであって
同様にエラスターゼ及びサブチリシン活性を阻害するペ
プチドを提供することにある。

図面の簡単な説明本発明の前述及び他の目的、並びに内容は本明細書に
添付された下記図面に関する以下の説明から明らかにな
る。

図１は、ガマリン（Guamerin,SEQ ID NO:1）及びガ
マリンから誘導された２種類のペプチド、すなわちpM及
びpR（SEQ ID NO:2及びSEQ ID NO:3）のアミノ酸配
列を示す。

図２（Ａ）及び２（Ｂ）は、本発明の２種類の合成ペ
プチド、すなわちpM及びpRの酸化還元反応後のHPLCパタ
ーンを表す。

発明の詳細な説明本発明者らは、大韓民国で採集した成熟したヒルか
ら、アセトン抽出、ゲル濾過、陰イオン交換クロマトグ
ラフィー及び逆相HPLC（高速液体クロマトグラフィー）
を含む一連の単離工程により、エラスターゼ阻害蛋白、
すなわちガマリン（Guamerin）を精製した。ガマリンは
57個のアミノ酸残基を含む分子量6,110Daの蛋白である
ことが見出された（参照：図１）。さらに、ガマリンは
蛋白の構造を堅固にするジスルフィド結合の形成に必要
なシステイン残基を10個も含み、その活性部位が36番メ
チオニン残基と37番イソロイシン残基で占められている
ことをそれぞれ確認した（参照:UK Patent Applicati
on GB 2300190A;H.I.Jung et al.,J.Biol.Chem.,27
0（23）:13879−13884（1995））。

本発明者らは、合成と使用に都合がよく、同時にガマ
リンと同等の活性を有する短いペプチドを開発すべく、
以下のような２個のペプチドを合成した：ガマリンの活
性部位である36番メチオニンが中央に位置する19個のア
ミノ酸から成るペプチド（pM）、及び当該pMの36番メチ
オニンがアルギニンで置換されている以外は同等のアミ
ノ酸配列を有するペプチド（pR）。上記ペプチド類は当
技術分野において従来行われている化学合成法又はDNA
操作技法によって合成することもできる。

生化学的活性測定から以下のことが判明している：上
記の２種類の合成ペプチドは様々なプロテアーゼの中で
エラスターゼとサブチリシンに対してのみ阻害活性を示
す；また、36番メチオニンが他のアミノ酸に置換されて
いても、短いペプチドの阻害活性には変化がない。従っ
て、上記ペプチドは有望なエラスターゼ及びサブチリシ
ン阻害剤の有効成分として使用できるという結論が得ら
れた。

一方、システインが交差結合して形成されるジスルフ
ィド結合は、活性に極めて重要な蛋白構造に影響を与え
ることがあるために、上記で合成されたペプチドを酸化
還元反応（oxidoreductive reaction）させジスルフィ
ド結合を形成させた。その後、酸化還元処理したペプチ
ドを単離してプロテアーゼ阻害活性及び分子量を測定し
た。その結果、酸化還元反応により単量体の間に分子間
ジスルフィド結合が形成されてできた二量体は単量体よ
りエラスターゼ及びサブチリシンに対する阻害活性が非
常に強いことが判明した。特に、二量体ペプチドはエラ
スターゼ阻害活性についてはガマリンとほぼ同等であ
り、サブチリシン阻害活性はガマリンも及ばない極めて
高いものであることがわかった。

従って、本発明の二量体ペプチドはエラスターゼ及び
サブチリシンに対する強い阻害活性と合成の容易さによ
り、エラスターゼ及びサブチリシン関連の疾患の治療剤
としての利用可能性がガマリンよりも高いと考えられ
る。さらに、分子量が相対的に小さいので、薬物として
使用しても人体に悪影響を及ぼす可能性が少ない。

以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する
が、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものと考
えるべきではない。特に、本発明の目的に従い、下記の
実施例に記述されたエラスターゼ及びサブチリシン阻害
活性を有するpM及びpRの単量体と二量体のみならず、ガ
マリンから誘導されプロテアーゼ阻害活性を有する全て
の単量体及び二量体も本発明の範囲に包含されると理解
すべきである。

実施例1:ガマリンの精製及び特性分析大韓民国で採集した成熟ヒルを95％（v/v）エチルア
ルコールで処理し、腹内の不純物と血塊を除去した。次
いで、80％（v/v）アセトン中に入れてホモジナイズし
アセトン抽出物を調製した。このアセトン抽出物を濃縮
し、セファデックスＧ−75（Siguma,USA）カラムにのせ
た。カラムを洗浄後、エラスターゼ阻害活性を示す分画
を集めた後、DEAE−セファロース（Sigma,USA）カラム
にのせた。カラムを洗浄及び溶出した後、エラスターゼ
阻害活性を示す分画を集めて濃縮し、逆相HPLCカラム
（Delta−pak C18,Millipore,USA）にのせた。このよ
うにしてエラスターゼ阻害蛋白であるガマリンを調製し
た。

分子量及びアミノ酸配列を分析した結果、ガマリンは
57個のアミノ酸残基を含む分子量6,110Daの蛋白であ
り、蛋白構造を堅固にするジスルフィド結合の形成に必
要なシステイン残基が10個も含まれていることがわかっ
た（図１を参照）。また、ガマリンの活性部位には36番
メチオニン及び37番イソロイシンが含まれ、ガマリンが
エラスターゼに対して特異性の高い阻害活性を保持して
いることが判明した。さらにガマリンは強酸と強塩基に
対して安定であると同時に加熱に対しても安定性を示す
ことがわかった。

実施例2:ガマリンから誘導されたペプチドの化学合成及
びその活性測定ガマリンと同等の活性を有する短いペプチドを合成す
るために、ガマリンの活性部位である36番メチオニン残
基が中心に位置する19個のアミノ酸からなるペプチドを
設計した。次いで、２個のペプチド、すなわちpM及びpR
を図１に開示されたガマリンのアミノ酸配列（配列番号
１）に基づいて化学合成した。図１において、pMはガマ
リンの31番スレオニンから49番グリシンまでのアミノ酸
配列を有するペプチドであり（配列番号２）、pRは36番
メチオニンがアルギニンに置換されている点を除けばpM
と同等のアミノ酸配列を有するペプチドである（配列番
号３）。これらの二つのペプチドは、活性部位の近くに
システイン２個を含みそれらが交差結合することによっ
てジスルフィド結合が形成されて安定な化学構造を有す
る望ましい活性製品が得られるように設計された。

上記の合成ペプチドを逆相HPLCカラムにのせ、0.1％
トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの線型濃度勾配
を用いて溶出することにより精製した。精製ペプチドの
活性は、トリプシン、キモトリプシン、サブチリシン及
びエラスターゼのような様々な種類のプロテアーゼによ
る基質、すなわちアゾカゼインの分解に対する阻害活性
に基づいて測定した。この際、ペプチドとプロテアーゼ
の濃度は20:1（w/v）の比率に調整して測定した。その
結果、合成ペプチドはエラスターゼとサブチリシンに対
してのみ阻害活性を示し、最大阻害パーセントは７ない
し９％であることがわかった（表２を参照）。

実施例3:ジスルフィド結合により形成されたペプチド二
量体の活性測定合成ペプチドの２個のシステインがこのペプチドの活
性に影響を与えるようなので、システイン残基の酸化還
元反応を行った後のこれらの合成ペプチド（すなわち、
pM及びpR）中のジスルフィド結合の効果を調べた。この
際、酸化還元反応は0.1M塩酸グアニジンを含む0.1M酢酸
ナトリウム緩衝液（pH7.8）に0.2mM酸化型グルタチオン
（GSSG）及び1mM還元型グルタチオン（GSH）と共にペプ
チドを入れて37℃で２時間インキュベートすることによ
り行った。

酸化還元反応ペプチドを実施例２で用いたHPLCカラム
を使用して単離した（参照：図２（Ａ）及び図２
（Ｂ））。図２（Ａ）及び図２（Ｂ）は酸化還元反応後
の合成ペプチド、すなわちそれぞれpM及びpRの、HPLCパ
ターンを表している。図２（Ａ）及び図２（Ｂ）に示す
ように、合成ペプチドpMから誘導されたペプチドは５つ
あり、各ピークに該当するペプチドをpM（１）、pM
（２）、pM（３）、pM（４）及びpM（５）とそれぞれ命
名した。また、合成ペプチドpRから誘導されたペプチド
は７つあり、各ピークに該当するペプチドをpR（１）、
pR（２）、pR（３）、pR（４）、pR（５）、pR（６）及
びpR（７）とそれぞれ命名した。

単離した各ペプチドのエラスターゼ阻害活性及びサブ
チリシン阻害活性をアッセイし、また、各ペプチドの分
子タイプをマトリックス−アシステッド・レーザー・デ
ソープション・オナイゼーション（MALDI）質量分析器
を用いて調べた。結果を下記の表１に示す。

表１に示すように、エラスターゼ及びサブチリシンに
対して強い阻害活性を示すペプチドは、それぞれ合成ペ
プチドから誘導されたpM及びpRペプチドの二量体である
ことが判明した。従って、単量体ペプチドpM及びpRの酸
化還元反応により二量体が形成され、この二量体は単量
体よりもはるかに強いエラスターゼ及びサブチリシンの
に対する阻害活性を持つようになることが明らかにされ
た。

さらに、上記二量体の様々なプロテアーゼ阻害活性を
ガマリン及びガマリンから誘導された単量体ペプチド
（すなわち、pM及びpR）と比較するために、実施例１と
同様の方法でトリプシン、キモトリプシン、サブチリシ
ン及びエラスターゼに対する阻害活性を測定した（参
照：表２）。表２中、pM−Ｄ及びpR−ＤはpM及びpRの二
量体をそれぞれ示し、pM−PEはpMペプチド中のシステイ
ンの−SH基をピリジルエチル化したペプチドを示す。

表２に示すように、二量体ペプチドは単量体よりエラ
スターゼ及びサブチリシンの阻害活性が極めて強いこと
が見出され、最大阻害％は82から97％と測定された。特
に、二量体ペプチドはガマリンとほぼ同等のエラスター
ゼ阻害活性を有し、ガマリンも凌駕するほどの極めて高
いサブチリシン阻害活性を有することが判明した。

さらに、二量体のエラスターゼに対する阻害定数を求
めるために、発色体ペプチド基質であるＮ−サクシニル
−Ｌ−Ala−Ala−ｐ−ニトロアニリドのエラスターゼに
よる分解に対する二量体の阻害活性を測定した。その結
果、二量体、すなわちpM−Ｄ及びpR−Ｄの阻害定数はそ
れぞれ49nM及び54nMであることがわかった（表２を参
照）。また、二量体のサブチリシンに対する阻害定数を
Ｎ−サクシニル−Ｌ−Ala−Ala−Pro−Phe−ｐ−ニトロ
アニリドを発色体ペプチド基質に用いて同様の方法で測
定した。その結果、pM−Ｄ及びpR−Ｄの阻害定数は31nM
及び38nMであることがわかった（参照：表２）。これら
の二量体のエラスターゼ及びサブチリシンに対する阻害
定数はガマリンのエラスターゼに対する阻害定数（0.81
fM）よりも高い値ではあったが、従来の阻害剤の阻害定
数と比較すると意義ある値を示している。

以上、詳細に説明及び立証されているように、本発明
は韓国産ヒルであるガマリン（Guameri,Hirudo nippon
ia）から単離されたガマリンから誘導され、エラスター
ゼ及びサブチリシンの活性を阻害するペプチドを提供す
るものである。本発明のペプチドは合成及び使用に好適
であり、エラスターゼ及びサブチリシンの阻害剤の開発
に利用できる。また、本発明の二量体ペプチドはエラス
ターゼ及びサブチリシンに対する強い阻害活性を有する
ことから、エラスターゼ及びサブチリシンに関連した疾
患の治療に実用性が高い。さらに、分子量が相対的に小
さいために、薬物として使用しても人体に悪影響を及ぼ
す可能性が少ない。

配列表（１）一般的情報：（ｉ）出願人：（Ａ）名称：韓国科学技術院ほか（ii）発明の名称：ガマリン由来の新規プロテアー
ゼ阻害剤（iii）配列の数:3 （iv）コンピュータで読み取り可能な形態：（Ａ）媒体：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター:IBM PC互換機（Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃1.0,
バージョン＃1.30 （２）配列番号１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:57アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：不明（Ｄ）トポロジー：不明（ii）配列の種類：蛋白質（vi）起源：（Ａ）生物名：ヒルド・ニポニア（Hirudo nipponi
a）（xi）配列の記述：配列番号１（２）配列番号２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:19アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：不明（Ｄ）トポロジー：不明（ii）配列の種類：ペプチド（vi）起源：（Ａ）生物名：ヒルド・ニポニア（Hirudo nipponi
a）（xi）配列の記述：配列番号２（２）配列番号３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:19アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：不明（Ｄ）トポロジー：不明（ii）配列の種類：ペプチド（vi）起源：（Ａ）生物名：ヒルド・ニポニア（Hirudo nipponi
a）（xi）配列の記述：配列番号３

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特許2678152（ＪＰ，Ｂ２) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，1995年, Ｖｏｌ．270，Ｎｏ．23，ｐ．13879− 13884 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，1987年, Ｖｏｌ．262，Ｎｏ．30，ｐ．14606− 14611 Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，1992年，Ｖｏｌ．112，Ｎｏ．２，ｐ．204−211 ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，1994年, Ｖｏｌ．349，Ｎｏ．２，ｐ．265−269 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 1/00 - 14/815 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ガマリ（Guameri,Hirudo nipponia）から
単離されたエラスターゼ阻害性蛋白であるガマリン（Gu
amerin）から誘導され、中心にメチオニン残基を有し、
ガマリンの31番スレオニンから49番グリシンまでのアミ
ノ酸配列（配列番号２）からなるペプチドの分子間のジ
スルフィド結合によって形成されたエラスターゼ及びサ
ブチリシン活性を阻害する二量体ペプチド。
【請求項２】ガマリ（Guameri,Hirudo nipponia）から
単離されたエラスターゼ阻害性蛋白であるガマリン（Gu
amerin）から誘導され、中心のメチオニン残基がアルギ
ニンに置換された残基を有し、ガマリンの31番スレオニ
ンから49番グリシンまでのアミノ酸配列（配列番号３）
からなるペプチドの分子間のスルフィド結合によって形
成されたエラスターゼ及びサブチリシン活性を阻害する
二量体ペプチド。