JP3396129B2 - 免疫賦活剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、糖類、特に、オリ
ゴ糖類を有効成分とする免疫賦活剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含む糖類がい
くつか知られている。例えば、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコ
ピラノシル−Ｄ−グルコースを構成糖として含む多糖と
して、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）
の菌糸中に含有されるニゲラン、そのニゲランの部分酸
加水分解等によって得られるα−Ｄ−グルコピラノース
−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノース−（１→４）
−α−Ｄ−グルコピラノース−（１→３）−α−Ｄ−グ
ルコース（以下、ニゲランテトラサッカライドと称す
る）をはじめとする様々な３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有するオリ
ゴ糖、さらには、上記のニゲランの加水分解によっても
得ることが可能であり、また、蜂蜜、麹汁、ビール等に
も含有される、ニゲロースと称される３−Ｏ−α−Ｄ−
グルコピラノシル−Ｄ−グルコース（図解糖質便覧 ７
０頁）などである。しかし、これらの糖類が免疫賦活効
果を有することは未だ報告されていない。

【０００３】一方、生体内の免疫系は、細菌、酵母、カ
ビ、ウイルスなどの微生物による感染や、腫瘍に対する
防御に重要な役割を果しており、その主要な機構は、Ｔ
リンパ球およびＢリンパ球が、これらの微生物や腫瘍
を、抗原受容体を介して認識することにより刺激を受
け、抗原特異的に活性化し、これらの異物を排除する能
力を高めることである。常に微生物に曝され、また、細
胞が変異している生体内では、こうしたＴリンパ球およ
びＢリンパ球の活性化は常時起こっている。また、抗原
特異的な活性化の他に、Ｔリンパ球およびＢリンパ球の
活性化には、菌体成分やレクチン等を認識する受容体を
介する抗原非特異的な活性化がある。抗原特異的および
抗原非特異的のいずれの活性化においても、他からの刺
激、すなわち、共刺激が加わるとＴリンパ球およびＢリ
ンパ球の活性化はさらに上昇する。現在の免疫賦活剤
は、免疫担当細胞を非特異的に活性化することにより、
微生物感染および腫瘍に対する生体の防御機構を高めて
いるが、有効性において満足しうるものは少なく、ま
た、これらの免疫賦活剤は、単独で免疫担当細胞を活性
化するため、生体にとって好ましくない免疫応答を誘導
し、種々のアレルギー反応の憎悪をはじめとする副作用
を引き起こす。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、免疫賦活作
用が高く、さらに他の免疫賦活物質と併用することによ
り、より強い免疫賦活作用を示し、副作用がなく、食品
にも利用可能な免疫賦活剤を提供することを目的とす
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、糖類と免
疫に関して研究を重ねる間に、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコ
ピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する
糖類が、リンパ球共刺激作用を示すことを見いだした。
さらに詳しくは、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−
Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類は、抗原
受容体を介する刺激により活性化されたＴリンパ球およ
びＢリンパ球の活性をさらに上昇させ、また、菌体成分
またはレクチンを認識する受容体を介する刺激により、
抗原非特異的に活性化されたＴリンパ球およびＢリンパ
球の活性をさらに上昇させることが判明した。しかし、
３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを
構成単位として含有する糖類単独ではＴリンパ球および
Ｂリンパ球を活性しなかった。

【０００６】すなわち、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノ
シル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類
は、抗原受容体を介するＴリンパ球およびＢリンパ球の
活性化を上昇させることから、生体内で常時起こってい
る微生物および腫瘍細胞に対する排除反応を高め、単独
でＴリンパ球およびＢリンパ球を活性しないことから、
生体にとって好ましくない免疫応答を誘導せず、抗原非
特異的なＴリンパ球およびＢリンパ球の活性化上昇させ
ることから、他の免疫賦活剤との併用が有効であり、３
−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構
成単位として含有する糖類が、副作用がなく常用に適し
た免疫賦活剤であることを見いだし、本発明を完成する
に至った。

【０００７】かくして、本発明は、３−Ｏ−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有
する糖類を有効成分とする免疫賦活剤を提供するもので
ある。

【０００８】本発明の免疫賦活剤の有効成分として用い
る３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコース
を構成単位として含有する糖類は、上記したニゲロー
ス、ニゲランテトラサッカライド、ニゲロトリオースか
ら選ばれる糖類であり、これらは単独でも、２種以上の
併用または混合でもよい。

【０００９】本発明の免疫賦活剤は、上記の有効成分
を、自体公知の食品あるいは食品成分、医薬担体または
賦形剤と自体公知の方法で合して、免疫力を高める食品
や医薬品とすることができる。用いる食品あるいは食品
成分、医薬担体または賦形剤は特に限定でするものでは
なく、目的とする免疫賦活剤の具体的用途に応じて当業
者が適宜選択できる。また、免疫賦活剤の形態も特に限
定する物ではなく、具体的用途に応じて、種々の個体や
液体の形態とすることができる。本発明の免疫賦活剤
は、特に、リンパ球共刺激作用、とりわけ、Ｔリンパ球
共刺激作用、Ｂリンパ球共刺激作用を発揮させるために
使用でき、医薬として用いる場合、経口または非経口投
与することができ、その投与量は、例えば、経口投与の
場合、成人に対して１日当たり、有効成分として４mg〜
４０gであり、これを１日１〜数回に分けて投与するこ
とにより、副作用なく所望の免疫賦活作用を発揮させる
ことができる。

【００１０】本発明の免疫賦活剤を食品として用いる場
合、調味料、畜肉加工品、水産加工品、農産加工品、ス
テープル、調味食品、調理済食品、デザート類、乳油製
品、菓子、スナック菓子等の形態で提供することも可能
である。

【００１１】

【実施例】つぎに、試験例および実施例を挙げて本発明
を具体的に説明するが、本発明は、これらに限定される
ものではない。なお、以下、「％」は、いずれも、重量
％を意味する。 試験例１ 本試験例では、ニゲロースおよびニゲランテトラサッカ
ライドを用いて、マウス脾臓リンパ球抗原特異的増殖反
応に対するニゲロース、ニゲランテトラサッカライドの
リンパ球共刺激効果を試験した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／
６、雌、１０週齢）から無菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭ
Ｉ １６４０培地中で脾臓を押しつぶし、２００メッシ
ュのスクリーンに通し、脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細
胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置により測定した
後、細胞数を１×１０⁷／mlの濃度にＲＰＭＩ １６４
０培地で調整し、９６穴組織培養プレート１穴当たり５
０μlを播種した。抗Ｂリンパ球抗原受容体イムノグロ
ブリンＭ（anti−ＩgＭ）を２００μg／mlの濃度でＲＰ
ＭＩ １６４０培地に溶解した液、あるいはＲＰＭＩ
１６４０培地を、それぞれ１穴当たり５０μl播種した
脾臓細胞浮遊液に加えて、Ｂリンパ球刺激群および無刺
激群とした。

【００１２】Ｔリンパ球刺激群は、細胞播種前に、抗Ｔ
リンパ球抗原受容体モノクローナル抗体（anti−ＣＤ
３）を１０μg／mlの濃度でホウ酸緩衝液に溶解した液
を１穴当たり１００μl加え３７℃で３時間放置しanti
−ＣＤ３を各穴に付着させ、３時間後に各穴をＲＰＭＩ
１６４０培地で洗浄後、ＲＰＭＩ １６４０培地を１
穴当たり５０μl加えた穴に、細胞を播種した。この３
群にＲＰＭＩ １６４０培地（対照）、ニゲロースを４
mg／mlの濃度でＲＰＭＩ １６４０培地に溶解した液お
よびニゲランテトラサッカライドを４mg／mlの濃度でＲ
ＰＭＩ １６４０培地に溶解した液をそれぞれ１穴当た
り１００μl加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２
日間培養した。培養を終わる３時間前に臭化３−（４,
５−ジメチル−２−チアゾリル）−２,５−ジフェニル
−２Ｈテトラゾリウムを５mg／mlの濃度でＲＰＭＩ １
６４０培地に溶解した液を１穴当たり１０μl加え、培
養終了時に２０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１穴当
たり５０μl加え、３７℃で１日放置後、脾臓細胞の増
殖反応をマイクロプレートリーダーで培養液の吸光度５
５０nmを測定することにより求めた。その結果を表１に
示す。

【００１３】

【表１】

【００１４】表１から明らかなごとく、ニゲロースおよ
びニゲランテトラサッカライドは抗原特異的なＴリンパ
球増殖反応を強力に促進し、抗原特異的なＢリンパ球増
殖反応も促進し、ニゲロース、ニゲランテトラサッカラ
イドの抗原特異的リンパ球増殖に対する共刺激効果が認
められた。また、ニゲロース、ニゲランテトラサッカラ
イド単独ではリンパ球増殖反応を促進しなかった。

【００１５】試験例２ 本試験例では、ニゲロースを用いて、マウス脾臓リンパ
球抗原非特異的増殖反応に対するニゲロースのリンパ球
共刺激効果を試験した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、
９週齢）から無菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０
培地中で脾臓を押しつぶし、２００メッシュのスクリー
ンに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞
数を自動血球計測装置により測定した後、細胞数を１×
１０⁷／mlの濃度にＲＰＭＩ １６４０培地で調整し、
９６穴組織培養プレート１穴当たり５０μlを播種し
た。Ｔリンパ球増殖刺激物質のコンカナバリンＡ（Ｃon
Ａ）を８μg／mlの濃度でＲＰＭＩ １６４０培地に溶
解した液、Ｂリンパ球増殖刺激物質のリポポリサッカラ
イド（ＬＰＳ）を２００μg／mlの濃度でＲＰＭＩ １
６４０培地に溶解した液およびＲＰＭＩ １６４０培地
を、それぞれ１穴当たり５０マイクロリットル播種した
脾臓細胞浮遊液に加えて、Ｔリンパ球刺激群、Ｂリンパ
球刺激群および無刺激群とした。この３群にＲＰＭＩ
１６４０培地（対照）およびニゲロースを２mg／mlの濃
度でＲＰＭＩ １６４０培地に溶解した液をそれぞれ１
穴当たり１００マイクロリットル加え、３７℃の５％炭
酸ガス培養器内で２日間培養した。培養を終わる３時間
前に臭化３−（４,５−ジメチル−２−チアゾリル）−
２,５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムを５mg／mlの
濃度でＲＰＭＩ １６４０培地に溶解した液を１穴当た
り１０μl加え、培養終了時に２０％ドデシル硫酸ナト
リウム溶液を１穴当たり５０μl加え、３７℃で１日放
置後、脾臓細胞の増殖反応をマイクロプレートリーダー
で培養液の吸光度５５０nmを測定することにより求め
た。その結果を表２に示す。

【００１６】

【表２】

【００１７】表２から明らかなごとく、ニゲロースは抗
原非特異的なＴリンパ球増殖反応および抗原非特異的な
Ｂリンパ球増殖反応を促進し、ニゲロースの抗原非特異
的リンパ球活性化に対する共刺激効果が認められた。

【００１８】試験例３ 本試験例では、ニゲロースを用いて、マウスの免疫応答
反応におけるニゲロースの抗体産生促進作用を試験し
た。１３週齢、雌性のＣ５７ＢＬ／６マウス（１群６
匹）に、生理食塩水で２×１０⁸／mlに調製した羊赤血
球溶液をマウス１匹当たり０.５ml腹腔内投与し、マウ
スを羊赤血球で一次免疫した。一次免疫の３日後に生理
食塩水で２×１０⁹／mlに調製した羊赤血球溶液をマウ
ス１匹当たり５０μl足蹠内投与し、マウスを羊赤血球
で二次免疫した。二次免疫の４日後にマウスの眼底静脈
から採血し、血漿を分離し、抗羊赤血球ＩgＭ抗体価お
よび抗羊赤血球ＩgＧ抗体価をエンザイムイムノアッセ
イにより測定した。ニゲロースは、羊赤血球の一次免疫
当日から連続して５日間毎日、ニゲロースを２０mg／ml
あるいは１００mg／mlの濃度に生理食塩水で調製した溶
液をマウス一匹当たり０.５ml腹腔内投与した。対照群
には同様のスケジュールで生理食塩水をマウス１匹当た
り０.５ml腹腔内投与した。エンザイムイムノアッセイ
は、羊赤血球をホウ酸緩衝液で１×１０⁸／mlに調製し
た溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当たり１００μ
l加え５℃で３日間放置し羊赤血球を各穴に付着させた
プレートを用いて行った。分離した血漿をウシ血清アル
ブミンを１％含有するホウ酸緩衝液で１０倍希釈し１穴
当たり５０μl加え室温で９０分間放置し、血漿の抗羊
赤血球抗体をプレートに付着した羊赤血球と結合させ
た。洗浄後、ペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩg
Ｍ抗体あるいは抗マウスＩgＧ抗体を加え、プレートに
結合させた抗羊赤血球抗体のＩgＭ抗体あるいはＩgＧ抗
体に結合させた。洗浄後、過酸化水素０.００６％とオ
ルトフェニレンジアミン０.１％を含有するリン酸緩衝
液を１穴当たり１００μl加え３７℃で３０分間反応さ
せ、反応を１.５Ｎ硫酸で停止し、マイクロプレートリ
ーダーで吸光度４９２nmを測定することにより血漿抗羊
赤血球ＩgＭ抗体価あるいはＩgＧ抗体価を求めた。その
結果を表３に示す。表３から明らかなごとく、ニゲロー
スを投与したマウスの血漿抗羊赤血球ＩgＭ抗体価ある
いはＩgＧ抗体価はニゲロースの用量に依存して上昇し
た。ニゲロースは、Ｔリンパ球に依存しないＢリンパ球
のＩgＭ抗体産生およびＴリンパ球に依存したＢリンパ
球のＩgＧ抗体産生のいずれも上昇させたことから、ニ
ゲロースのＢリンパ球賦活作用およびＴリンパ球賦活作
用が認められた。

【００１９】

【表３】

【００２０】実施例１ ニゲロース、レモン果汁、グラニュー糖、果糖ブドウ糖
液糖、精製ハチミツ、クエン酸レモンフレーバーを以下
に示した配合量で純水に撹拌、溶解し１０００mlに調整
した後、６５℃で１０分間殺菌して清涼飲料水を得た。
得られた清涼飲料水は、ニゲロースを約１％含有する。 ニゲロース １０．０ g レモン果汁 ９．４ g グラニュー糖 １５．４ g 果糖ブドウ糖液糖 ７４．０ g 精製ハチミツ ２２．２ ｇ クエン酸 １．５ ｇ レモンフレーバー １．６ g

【００２１】実施例２ 以下に示した配合量にて各原料をよく混合後、直接加圧
することにより錠剤を製造した。得られた錠剤は、一錠
（７００mg）当たり、ニゲランテトラサッカライドを約
９８mg含有する。 ニゲランテトラサッカライド ３０ g 乳糖 １７５ g 結晶セルロース １．２g タルク ８ g

【００２２】実施例３ 以下に示した配合量にて各原料をよく混合した後、１１
５０gまで濃縮し、フォンダントクリーム８０gとシュガ
ーエステル２gをよく混合した物をさらに加え、よく練
合した後、１粒当たり５gに成形したソフトキャンデー
は、ニゲロースを１粒当たり約０．８g含有する。 ニゲロース ２００ g グラニュー糖 ２００ g 水飴 ５００ g 牛乳 １２００ g 生クリーム ２００ g

【００２３】

【発明の効果】本発明によれば、免疫賦活作用が高く、
さらに他の免疫賦活物質と併用することにより、より強
い免疫賦活作用を示し、副作用がなく、食品にも利用可
能な免疫賦活剤が提供できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ａ２３Ｌ 1/30 Ａ２３Ｌ 1/30 Ｚ 2/52 Ｃ０７Ｈ 3/04 Ｃ０７Ｈ 3/04 3/06 3/06 Ａ２３Ｌ 2/00 Ｆ (72)発明者 室山 幸太郎 兵庫県伊丹市鋳物師２丁目20番地 武田 食品工業株式会社男子寮 (72)発明者 日下 博昭 兵庫県宝塚市安倉南３丁目３番１−202 号 (56)参考文献 ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，1971年, Ｖｏｌ．10，Ｎｏ．18，ｐ．3457−3460 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 31/7016,31/702 C07H 3/04,3/06 ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ニゲロース、ニゲランテトラサッカライ
   ド、ニゲロトリオースから選ばれる３−Ｏ−α−Ｄ−グ
   ルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位とする糖類
   を有効成分とする免疫賦活剤。
2. 【請求項２】 糖類がニゲロースである請求項１記載の
   免疫賦活剤。
3. 【請求項３】 糖類がα−Ｄ−グルコピラノース−（１
   →３）−α−Ｄ−グルコピラノース−（１→４）−α−
   Ｄ−グルコピラノース−（１→３）−α−Ｄ−グルコー
   ス（ニゲランテトラサッカライド）である請求項１記載
   の免疫賦活剤。
4. 【請求項４】 免疫賦活作用がＴリンパ球共刺激作用で
   ある請求項１〜３いずれか１項記載の免疫賦活剤。
5. 【請求項５】 免疫賦活作用がＢリンパ球共刺激作用で
   ある請求項１〜３いずれか１項記載の免疫賦活剤。
6. 【請求項６】 微生物または腫瘍細胞に対する排除反応
   を高める請求項１〜５いずれか１項記載の免疫賦活剤。
7. 【請求項７】 ニゲロース、ニゲランテトラサッカライ
   ド、ニゲロトリオースから選ばれる３−Ｏ−α−Ｄ−グ
   ルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位とする糖類
   を有効成分とする、微生物または腫瘍細胞に対する排除
   反応向上剤。